DE60014960T2

DE60014960T2 - Alizarin-derivate als neue chromogene substrate

Info

Publication number: DE60014960T2
Application number: DE60014960T
Authority: DE
Inventors: Lyle Ashington ARMSTRONG; Arthur Jesmond JAMES
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 2000-12-11
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2020-12-12
Also published as: JP4638645B2; AU2685801A; BRPI0016249A; US7052863B2; US20060172364A1; WO2001042490A2; BRPI0016249B1; ES2230179T3; WO2001042490A3; FR2802214A1; BRPI0016249B8; EP1235928A2; EP1235928B1; US7563592B2; AU781844B2; US20030082667A1; CN1408027A; ATE279529T1; FR2802214B1; DE60014960D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis von Enzymen des Typs Hydrolase, insbesondere Osidase, Esterase oder Peptidase, unter Verwendung von effizienten chromogenen Substraten.
Seit vielen Jahren werden besondere Substrate verwendet, um die Bestimmung der Anwesenheit oder der Abwesenheit von für Mikroorganismen charakteristischen enzymatischen Aktivitäten zu ermöglichen. Durch die Wahl der Substrate, gemäß der es eine Reaktion oder keine Reaktion gibt, ist es möglich, die Natur einer Art von Mikroorganismen zu charakterisieren oder die Stämme und/oder die Spezies einer gegebenen mikrobiellen Art zu unterscheiden.
Die synthetischen Substrate von Enzymen sind aus zwei Teilen zusammengesetzt, einem ersten Teil, der die zu offenbarende enzymatische Aktivität spezifiziert, im Folgenden Zielteil genannt, und einem zweiten Teil, der als Marker dient, im Folgenden Markerteil genannt.
Diese besonderen Substrate können fluoreszierend oder chromogen sein. Tatsächlich ist es der zweite Markerteil oder das Produkt seiner Reaktion mit einer oder mehreren anderen Zusammensetzungen, siehe dazu die im Namen der Anmelderin eingereichte Patentanmeldung PCT/FR99/00781, der fluoreszierend oder chromogen ist, wenn er nicht mehr mit dem ersten Zielteil assoziiert ist.
Im vorliegenden Fall handelt es sich um chromogene Substrate auf der Basis von Alizarinen oder Anthrarobinen, die, in dieser Substratform, im Allgemeinen leicht farbig sind. Dennoch wird die auf Grund des Markerteils vorliegende Färbung, und daher die Trennung des Zielteils hinsichtlich des Markerteils, durch Hydrolyse verstärkt und/oder modifiziert. Vorzugsweise verbessert die Anwesenheit eines Entwicklers, wie eines Metallsalzes, eines alkalischen pH-Werts, die Farbcharakteristika des erhaltenen Produkts weiter.
Die Fähigkeit der Alizarine, farbige Metallchelate zu bilden, ist im neunzehnten Jahrhundert entdeckt worden. Seit 1826, als die Alizarine zum ersten Mal aus der Pflanze Rubia tinctorum isoliert worden waren, ist ihre Eigenschaft als farbgebender Stoff bei der Einfärbung von Kleidungsstücken verwendet worden.
Die globale Synthese der Alizarine wurde 1869 von Graebe und Liebermann beschrieben. Im gleichen Jahr vergrößerte W. H. Perkin die Anzahl von Alizarinen, die synthetisiert werden können, indem er unterschiedliche Substituenten an den Positionen R₃, R₄, R₅, R₆, R₇ und R₈ des nachfolgenden Anthracenkerns vorschlug:
Alizarine sind keine Farbstoffe per se, aber sie können mit Metalloxiden unlösliche Pigmente bilden. Zum Beispiel ergibt die Chelation mit einem Aluminiumsalz, wenn die Position R₃ durch eine Schwefelgruppe substituiert wird, eine leuchtende scharlachrote Farbe, wohingegen die Chelation mit einem Chromsalz ein Bordeauxrot ergibt. Als ein anderes Beispiel ergeben 3-Nitroalizarin und 4-Nitroalizarin Chelate mit unterschiedlichen Färbungen je nach den mit ihnen assoziierten Metallsalzen. Das Interesse, das die Alizarine in der Einfärbung hervorrufen, liegt zum großen Teil an der Stabilität der derart gebildeten Metallchelate, sei es gegenüber Seifen, Säuren und Hydroxiden von alkalischen Metallen.
Unter den Alizarinderivaten, die ohne weiteres synthetisiert werden können, fällt auf, dass von 3-Nitroalizarin und 4-Nitroalizarin 3-Aminoalizarin und 4-Aminoalizarin erhalten werden. 4-Aminoalizarin ist nachstehend dargestellt:
Dieses Molekül ist besonders interessant, da es bei Anwesenheit von Aluminium eine purpurrote Farbe ergibt. Zudem dient es als Ausgangspunkt für die Synthese, mit Hilfe einer dem Fachmann wohl bekannten Skraup-Reaktion, von Alizarinchinolinen, wovon ein Beispiel, Alizarin-α-chinolin von grüner Farbe, nachfolgend dargestellt ist:
Die Substitutions- und Zyklisierungsreaktionen ermöglichen den Erhalt eines breiten Spektrums an modifizierten Alizarinen mit unterschiedlichen Eigenschaften.
Der Stand der Technik zeigt ebenfalls, dass bereits biologische und biomedizinische Anwendungen existieren. Auf Grund der Schnelligkeit, mit der die Hydroxyanthrachinone in Anwesenheit von Chelaten reagieren, haben diese als Test zur Ermittlung der Anwesenheit oder Abwesenheit von Metallen in biologischen Proben bevorzugt Anwendung gefunden.
Die Anthrarobine, auch Desoxyalizarin oder Anthracen-1,2,10-triol genannt, die reduzierte Produkte von Alizarin sind, sind dem Fachmann bereits wohl bekannt. Diese Reduktion erfolgt durch die Wirkung von Zinkhydroxid oder ammoniakhaltiger Lösung, Zinndichloridsäure etc. Die allgemeine Formel dieser Zusammensetzung ist Folgende:
Jedoch hat bis heute keine Information die durchführbare Verwendung von Alizarinen, Anthrachinonderivaten oder Anthrarobinen als Substrate zur Ermittlung einer enzymatischen Aktivität nachgewiesen. Dies erfordert also eine Synthese von Substraten, wobei mindestens ein Zielteil auf Alizarin fixiert wird. Diese Substrate haben den Vorteil, dass sie in Anwesenheit von Metallionen nicht reagieren, von dem Moment an, wo die Hydrolyse in zwei Teilen, Marker und Ziel, nicht stattfindet. Trotzdem bietet die Bildung von unlöslichen Chelaten wesentliche Vorteile, wie im Folgenden:

– eine große Empfindlichkeit, selbst bei schwacher Konzentration, und daher eine geringe notwendige Menge an Substrat,
– eine leicht an die Bedürfnisse der Anwendung anpassbare Farbe des Produkts der Hydrolyse, durch die verwendete Zusammensetzung des Reaktionsmediums und namentlich die verwendeten polyvalenten Kationen (deren Definition in den besonderen Punkten am Ende der Beschreibung gegeben wird) und/oder den verwendeten pH-Wert,
– eine einfache Synthese und geringe notwendige Menge an Substrat (auf Grund der erwähnten höheren großen Empfindlichkeit), was die Herstellungskosten vermindert,
– eine sehr schwache Diffusion der Färbung, was es ermöglicht, die Kolonien leicht zu isolieren und zu unterscheiden, und
– eine schwache Hemmung, da eine geringe Menge an Substrat verwendet wird (auf Grund der erwähnten höheren großen Empfindlichkeit).

Die Alizarinderivate sind also synthetisiert worden, hauptsächlich assoziiert mit Glykosiden, mittels einer recht klassischen Methode, Koenigs-Knorr-Methode genannt (Koenigs, W. und Knorr, E., Ber., 34, 957, 1901). Was die α-Glykoside betrifft, so wird ihre Synthese verwirklicht, indem die Helferich-Methode (Helferich B. et al., Ber., 66, 378 (1933) und Ber., 77, 194 (1944)) modifiziert wird. Andere Derivate werden mit kurzkettigen Fettsäureestern und Phosphor- oder Schwefelsäureestern assoziiert.
Bis heute sind die verwendeten Substrate zum Beispiel 5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-D-galaktosid, die ferner Thema einer vergleichenden Studie mit einem der Substrate gemäß der Erfindung, Alizarin-β-D-galaktosid, sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Substrate gemäß der Erfindung deutlich wirksamer als jene, die vom Stand der Technik beschrieben werden. So ermitteln sie eine größere Anzahl von Spezies und/oder Stämmen von Mikroorganismen für ein und dieselbe untersuchte enzymatische Aktivität.
Substrate gemäß der Erfindung sind mehr oder weniger in anderen Dokumenten beschrieben.
So betrifft ein Artikel von Masawaki, Teruyuki of al. „Selective solvent extraction of ruberythric acid from madder roots and subsequent hydrolysis with β-glucosidase", J. Ferment. Bioeng. (1996), 81(6), 567–569, eine Extraktion von Anthrachinonen von Färberrötewurzeln unter Verwendung eines selektiven Lösungsmittels im Hinblick auf ihre Verwendung als Farbstoff. Das Ziel ist es, unter denen mit Zuckern assoziierten Anthrachinonen unter anderem die Alizarine zu extrahieren, darunter das Alizarin-2-o-primverosid. Dafür hydrolysieren sie Alizarin-2-o-primverosid mittels β-Glykosidase.
Ein anderer Artikel stammt von de Van der Plas. Linus H. W. et al., „Anthraquinone glycosylation and hydrolysis in Morinda citrifolia cell suspensions. Regulation and function"; J. Plant Physiol., (1998), 152(2/3), 235–241, der eine biologische Erklärung für die Anwesenheit eines Zuckers, das glykosylierte Primverosid, in den Zellen von Pflanzen vorschlägt (siehe Seite 240, Spalte 1, 3. Abschnitt). Diese Quelle ist auf die Hydrolyse bestimmter Anthrachinone zurückzuführen.
Ein letzter Artikel rührt von Mateju, J. al. „Microbial glucosidation if dihydroxyanthraquinones. General properties of glucosidation system"; Folia Microbiol. (Prag) (1974), 19(4), 307–316, der die mutierende Spezies Streptomyces aureofaciens B96 mit „Glykosidation" behandelt hat.
Dennoch stehen diese mit der Erfindung der Anmelderin nur entfernt in Beziehung. Zwar sprechen alle drei von Substraten auf der Basis von Alizarin (oder anderen Anthrachinonen), aber diese Substrate sind in ihrer Diversität begrenzt (wenige Moleküle erwähnt) und werden alle durch Biosynthese erhalten (ein Primverosid assoziierende Substrate und Produkte durch Pflanzen bei den ersten beiden Artikeln, diverse Glukoside assoziierende Substrate und Produkte durch das Bakterium Streptomyces griseus beim dritten Artikel. Außerdem dienen diese Substrate nicht der Erzeugung von Diagnosetests, die auf der Ermittlung von Enzymen beruhen.
Zu diesem Zweck betrifft die vorliegende Erfindung ein chromogenes Substrat, das es ermöglicht, die Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität zu ermitteln, mit folgender allgemeiner Formel:

wobei:
– R₁ ein Zielteil oder H ist und R₂ ein Zielteil oder H ist, wobei mindestens R₁ oder R₂ ein Zielteil ist,
– R₃ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl und Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist,
– R₄ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, OH, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist,
– R₃ und R₄ gemäß einer Variante miteinander verbunden sind, um einen Zyklus zu bilden, der mindestens fünf Seiten und vorzugsweise sechs Seiten aufweist,
– R₅, R₆, R₇ und R₈ jeweils aus einem der folgenden Atome oder einer der folgenden Atomgruppen zusammengesetzt sind: H, Halogen, insbesondere Cl oder Br, OH, SO₃H, Alkyl oder Alkoxy, und
– R₉ und R₁₀ unabhängig aus Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl zusammengesetzt sind, oder eines, R₉ oder R₁₀, aus einem Zyklus (Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin etc.) zusammengesetzt ist, und das andere, R₁₀ oder R₉, aus einem Wasserstoffatom zusammengesetzt ist.

In einem besonderen Fall werden die Ketone des mittleren Zyklus in Form von Hydroxidgruppen reduziert, wobei mindestens eines der Wasserstoffatome letztendlich durch eine Gruppe aus Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl ersetzt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein chromogenes Substrat, das es ermöglicht, die Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität zu ermitteln, mit folgender allgemeiner Formel:

wobei:
– R₁ ein Zielteil oder H ist und R₂ ein Zielteil oder H ist, wobei mindestens R₁ oder R₂ ein Zielteil ist,
– R₃ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist,
– R₄ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, OH, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist,
– R₃ und R₄ gemäß einer Variante miteinander verbunden sind, um einen Zyklus zu bilden, der mindestens fünf Seiten und vorzugsweise sechs Seiten aufweist,
– R₅, R₆, R₇ und R₈ jeweils aus einem der folgenden Atome oder einer der folgenden Atomgruppen zusammengesetzt sind: H, Halogen, insbesondere Cl oder Br, OH, SO₃H, Alkyl oder Alkoxy,
– R₉ und R₁₀ unabhängig aus Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl zusammengesetzt sind, oder eines, R₉ oder R₁₀, aus einem Zyklus (Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin etc.) zusammengesetzt ist, und das andere, R₁₀ oder R₉, aus einem Wasserstoffatom zusammengesetzt ist,
– R₁₁ aus einem der folgenden Atome oder einer der folgenden Atomgruppen zusammengesetzt ist: H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, Alkyl, Aryl, Aralkyl, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand ist, und
– R₁₂ aus H, Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl zusammengesetzt ist.

In einem besonderen Fall, bei dem eines der unten angeführten Substrate hydrolysiert wird, setzt sich der Markerteil aus Alizarin zusammen, das zwei Hydroxylgruppen auf Positionen 1 und 2 beinhaltet. Dieses Molekül heißt auch 1,2-Dihydroxyanthrachinon-β-D-galaktosid, dessen allgemeine Formel, die mit einem Zielteil, der aus Galaktose zusammengesetzt ist, assoziiert ist, Folgende ist:
Das Produkt seiner Hydrolyse durch eine β-Galaktosidase bildet ein Chelat in Anwesenheit eines Eisensalzes, welches das Folgende ist:
Bei allen oben entwickelten Möglichkeiten und vorzugsweise ist R₁ H und R₂ ist der Zielteil.
Genauer ist der Zielteil aus einem der folgenden Moleküle zusammengesetzt:

– einem Glykosid, das aus Mono-, Di- und/oder Polysaccharideinheiten zusammengesetzt ist, die durch α oder β mit der Hydroxylfunktion verbunden sind,
– einer α-Aminosäure oder einem Peptid,
– einer organischen Säure, wie -O-CO-(CH₂)_n-CH₃, wobei n zwischen 0 und 20 liegt, oder
– einem Sulfat, einem Phosphat, einem Pyrosulfat, einem Pyrophosphat oder einem Phosphodiester.

In einem besonderen Fall sind R₃ und R₄ aus einer substituierten oder nicht substituierten C₃N-Kette, wobei N vorzugsweise an R₃ oder R₄ angrenzt, zusammengesetzt und durch diese miteinander verbunden, um einen Zyklus mit sechs Seiten zu bilden.
Gemäß einer ersten Verwendungsform von mindestens einem Substrat, wie oben beschrieben, zum Ermöglichen des Ermittelns der Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität, besteht sie aus Folgendem:

– Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, dessen Zielteil mit der zu ermittelnden enzymatischen Aktivität in Verbindung steht, mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens einen Mikroorganismus mit einer derartigen enzymatischen Aktivität enthält, und mit mindestens einer Kationenart, und
– Beobachten der Bildung eines unlöslichen und farbigen Chelats.

Vorzugsweise wird das Substrat mit mindestens einer hinsichtlich des Markerteils, der durch die enzymatische Aktivität freigesetzt wurde, geeigneten Kationenart zusammengebracht.
Noch immer vorzugsweise ist eine Kationenart, die zum Bilden eines unlöslichen Chelats verwendet werden kann, aus Folgendem zusammengesetzt: Fe²⁺, Al³⁺, Mn²⁺, Sn²⁺ oder Cu²⁺.
Im Fall einer Verwendung von mindestens zwei Substraten, wie vorher beschrieben, zum Ermöglichen des Ermittelns der Anwesenheit von mindestens zwei unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten, besteht die Verwendung aus Folgendem:

– Zusammenbringen von mindestens zwei Substraten, deren Zielteile mit den mindestens zwei zu ermittelnden enzymatischen Aktivitäten in Verbindung stehen, mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens einen Mikroorganismus mit derartigen enzymatischen Aktivitäten enthält, und mit mindestens einer Kationenart, und
– Beobachten der Bildung von mindestens zwei unterschiedlichen Färbungen oder einer dritten Färbung.

Gemäß diesem letzten Fall werden die Substrate mit mindestens einer Kationenart, vorzugsweise einer einzigen Kationenart, zusammengebracht, die hinsichtlich der Markerteile, die durch die enzymatische Aktivität freigesetzt wurden, geeignet ist.
Bei allen Möglichkeiten besteht die Verwendung von mindestens einem Substrat, wie weiter oben beschrieben, zum Ermöglichen des Ermittelns der Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität oder diese Verwendung in Kombination mit einer bereits vorher beschriebenen Verwendung aus Folgendem:

– Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, dessen Zielteil mit der zu ermittelnden enzymatischen Aktivität in Verbindung steht, mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens einen Mikroorganismus mit einer derartigen enzymatischen Aktivität enthält, in einem Reaktionsmedium mit einem geeigneten pH-Wert, und
– Beobachten der Bildung von mindestens einer Färbung.

Vorzugsweise, sobald mindestens zwei Substrate verwendet werden, erfolgt die Verwendung einer einzigen Kationenart, die hinsichtlich der Markerteile, die durch die enzymatischen Aktivitäten feigesetzt wurden, geeignet sind.
Gemäß einer bevorzugten Verwendungsform schließen die obigen Verwendungen einen intermediären Schritt ein, der aus dem Ermöglichen des Wachsens des Mikroorganismus oder der Mikroorganismen auf einem Nährmedium, welches das Substrat oder die Substrate enthält, besteht.
Wenn das Ermitteln einer enzymatischen Glykosidase-Aktivität erwünscht ist, werden, unter anderem, Folgende als Zielteil verwendet:

– Glukose,
– Galaktose,
– Mannose,
– Xylose,
– Glukuronsäure, oder
– N-Acetylglukosamin.

Wenn das Ermitteln einer enzymatischen Phosphatase-Aktivität erwünscht ist, werden, unter anderem, Phosphorsäure oder ein substituiertes Derivat als Zielteil verwendet.
Wenn das Ermitteln einer enzymatischen Sulfatase-Aktivität erwünscht ist, werden, unter anderem, Schwefelsäure oder ein substituiertes Derivat als Zielteil verwendet.
Wenn das Ermitteln einer enzymatischen Lipase-, Phospholipase- oder Esterase-Aktivität erwünscht ist, werden, unter anderem, Folgende als Zielteil verwendet:

– eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure oder ein substituiertes Derivat,
– Essigsäure oder ein substituiertes Derivat,
– Buttersäure oder ein substituiertes Derivat,
– Octansäure oder ein substituiertes Derivat, oder
– eine veresterte Phosphatgruppe, wie Inositol-1-Phosphat.

Die Erfindung betrifft ebenfalls eine Verbindung, die das Ermitteln von mindestens einem Stamm und/oder einer Spezies von Mikroorganismen ermöglicht, die mindestens ein Substrat, wie oben definiert, und ein Nährmedium umfasst.
Im Fall, wo die Verbindung mindestens zwei Substrate beinhaltet, weisen die Produkte nach der Reaktion unterschiedliche Farben auf, wodurch das Unterscheiden von offenbarten unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten von mindestens einem Mikroorganismenstamm und/oder mindestens einer Mikroorganismenspezies ermöglicht wird.
Vorzugsweise ist die Verbindung aus einem flüssigen, gelierten oder festen (zum Beispiel trockenen, das in eine geeignete Flüssigkeit wieder aufgenommen werden kann) Nährmedium zusammengesetzt.
Noch immer vorzugsweise liegt die Konzentration des Substrats zwischen 10 und 500 mg/l, vorzugsweise zwischen 30 und 150 mg/l und beträgt noch besser 50 mg/l.
Die vorliegende Erfindung betrifft also ein neues Substrat, das anfänglich leicht farbig ist, das in Anwesenheit einerseits eines Mikroorganismus oder eines Enzyms, dessen Anwesenheit ermittelt werden soll, und andererseits letztendlich eines Kations, eine besondere Färbung annimmt. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendungen, die dieses Substrat ermöglicht, sowie eine Verbindung, die dieses Substrat enthält.
Die Anwesenheit von Kationen ist besonders interessant, dennoch ist es möglich, auf sie zu verzichten; in diesem Fall kann man vorzugsweise eine Verbindung mit einem alkalischen pH-Wert verwenden. Es ist ebenfalls möglich, die zwei Bedingungen, das heißt die Anwesenheit von Kationen und einen alkalischen pH-Wert, zu kumulieren.
Variiert das verwendete Kation, ergeben die getesteten Kolonien von Mikroorganismen unterschiedliche Färbungen. Diese Kationen wie Eisen, Mangan, Zinn und Aluminium werden bei sehr schwachen Konzentrationen verwendet, um die Hemmung auf Grund von in der getesteten Probe anwesenden freien Ionen zu verhindern oder zu minimieren.
Allerdings ergeben höhere Konzentrationen von bestimmten Metallionen eine selektive Hemmung, die verwendet werden kann, um besondere mikrobielle Spezies auszuwählen, was einen zusätzlichen Vorteil darstellt.
SYNTHESE DER SUBSTRATE:
1) Synthese von Alizarin-2-β-D-glukosid:
Gemäß Robertson et al. (J. Chem. Soc. (1930), 1136 und (1933), 1167), wird Alizarin spezifisch an der Hydroxylgruppe auf Position 2 glykosyliert, selbst wenn es möglich ist, diese Fixierung auf der Position 1 durchzuführen. Dennoch ist die Kupplung auf Position 2 einfacher.
Dieses Substrat wird präpariert, indem die von Robertson (1933) beschriebene, aber modifizierte Methode verwendet wird. Eine Probe von 6 g Alizarin wird in 70 ml Aceton suspendiert und mit 70 ml Kaliumhydroxid von 0,28 mol/l gemischt, um ein Salz zu bilden. Mit diesem wird ein Gemisch von 40 ml, das in einem Verhältnis von 1:1 Ether und 6,6 g Acetobromglukose enthaltendes Aceton enthält, assoziiert. Es wird ungefähr 14 Stunden lang gerührt. Anschließend werden 7 ml Kaliumhydroxid von 1,25 mol/l zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 15 ml von 0,6 mol/l Acetobromglukose in Aceton. Das Vorgemisch wird noch einmal etwa zehn Stunden lang gerührt. Ether und Aceton werden unter reduziertem Druck entzogen und der pH-Wert wird durch Zugabe von eisgekühlter Essigsäure auf ungefähr 5,5 gebracht. Das Gemisch und das Alizarin, die keine Reaktion eingegangen sind, werden gefiltert und dann mit Wasser gewaschen, um anschließend die ganze Nacht lang bei 50 °C getrocknet zu werden.
Man erhält so einen gelben Feststoff, der in 70 ml eisgekühlter Essigsäure suspendiert wird und 5 Minuten lang rückfließen kann. Dies ermöglicht das Abkühlen, dann das Filtern und anschließend das Waschen mit Essigsäure. Das Filtrat wird anschließend eine Stunde lang beiseite gelegt und von verbliebenem Alizarin getrennt. Diese Prozedur wird bei 10 °C wiederholt, um ein dunkelgelbes Filtrat zu erhalten.
Das Erhaltene wird getrocknet und in 200 ml Dichlormethan gelöst, und es werden anschließend 2 ml Triethylamin zugegeben. Ein Aluminiumoxid wird in der Lösung vorgemischt, bis eine Testprobe bei Dünnschichtchromatographie (DC) zeigt, dass kein Alizarin verblieben ist.
Das Aluminiumoxid wird entzogen und die verbliebene Lösung wird durch Indrehungversetzen verdampft, um einen gelben Feststoff zu produzieren. Dieser Feststoff wird in Anwesenheit von einigen Tropfen Essigsäure aus heißem Ethanol rekristallisiert, um 2,02 g Alizarin-Tetraacetyl-glukosid zu erhalten.
Eine Menge von 1,1 g Alizarin-Tetraacetyl-glukosid wird in 60 ml Ethanol erneut suspendiert, dem werden 30 ml wässriges Natriumhydroxid von 0,125 mol/l zugegeben, um eine rote Lösung zu produzieren. Dieser Zustand wird während 10 Minuten bei 65 °C beibehalten und dann auf 0 °C abgekühlt. Das rote Natriumsalz des glykosylierten Alizarins wird anschließend durch Vakuumfiltration entzogen, mit Ether gewaschen und dann getrocknet. Dieser Prozess ermöglicht es, 0,9 g Alizarin-2-β-D-glukosid-Natriumsalz zu erhalten. Dieses Produkt kann gemäß dem Fachmann bekannten Techniken gereinigt werden, um Alizarin-2-β-D-glukosid zu erhalten.
2) Synthese von Alizarin-2-β-D-galaktosid:
Dieses Substrat wird ebenfalls präpariert, indem die von Robertson (1933) beschriebene, aber modifizierte Methode verwendet wird. Eine Probe von 6 g Allzarin wird in 70 ml Aceton suspendiert und mit 70 ml Kaliumhydroxid von 0,28 mol/l gemischt, um ein Salz zu bilden. Mit diesem wird ein Gemisch von 40 ml, das in einem Verhältnis von 1:1 Ether und 6,6 g Acetobromgalaktose enthaltendes Aceton enthält, assoziiert. Es wird ungefähr 14 Stunden lang gerührt. Dann werden 7 ml Kaliumhydroxid von 1,25 mol/l zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 15 ml von 0,6 mol/l Acetobromgalaktose in Aceton. Das Vorgemisch wird noch einmal etwa zehn Stunden lang gerührt. Ether und Aceton werden unter reduziertem Druck entzogen und der pH-Wert wird durch Zugabe von eisgekühlter Essigsäure auf ungefähr 5,5 gebracht. Das Gemisch und das Alzarin, die keine Reaktion eingegangen sind, werden gefiltert und dann mit Wasser gewaschen, um anschließend die ganze Nacht lang bei 50 °C getrocknet zu werden.
Das Erhaltene wird in 200 ml Dichlormethan gelöst und es werden anschließend 2 ml Triethylamin zugegeben. Ein Aluminiumoxid wird in der Lösung zugegeben, bis eine Testprobe bei DC zeigt, dass kein Alizarin verblieben ist. Das Aluminiumoxid wird entzogen und die verbliebene Lösung wird durch Indrehungversetzen verdampft, um einen gelben Feststoff zu produzieren. Dieser Feststoff wird in Anwesenheit von einigen Tropfen Essigsäure aus heißem Ethanol rekristallisiert, um 1,96 g Alizarin-Tetraacetyl-galaktosid zu erhalten.
Eine Menge von 1,1 g Alizarin-Tetraacetyl-galaktosid wird in 60 ml Ethanol erneut suspendiert, dem werden 30 ml wässriges Natriumhydroxid von 0,125 mol/l zugegeben, um eine rote Lösung zu produzieren. Dieser Zustand wird während 10 Minuten bei 65 °C beibehalten und dann auf 0 °C abgekühlt. Das rote Natriumsalz des glykosylierten Alizarin wird anschließend durch Vakuumfiltration entzogen, mit Ether gewaschen und dann getrocknet. Dieser Prozess ermöglicht es, 0,86 g Alizarin-2-β-D-galaktosid-Natriumsalz in Form von mikrokristallinem rotem Pulver zu erhalten.
3) Synthese von Alizarin-2-acetat:
Dieses Substrat wird anhand einer dem Fachmann wohl bekannten Technik präpariert. Zwei Gramm Alizarin werden in 5 ml Pyridin gelöst und mit einem Gemisch aus 2,5 ml Essigsäureanhydrid und 5 ml Pyridin behandelt. Nach 16 Stunden bei Umgebungstemperatur wird die gelbe Lösung in 100 ml Eis enthaltende Chlorwasserstoffsäure gegossen. Das Acetat-Präzipitat wird durch Saugfiltration entzogen und mit Wasser gewaschen. Die Rekristallisation von wässrigem Aceton ermöglicht es, 1,4 g Alizarin-2-acetat in Form von gelben Kristallen zu erhalten.
4) Synthese von Alizarin-2-sulfat:
Dieses Substrat wird durch Erhitzen von 2,4 g Alizarin, das heißt 10 mmol, in 10 ml Pyridin, das 4 g eines Sulfid-Pyridin-trioxid-Komplexes enthält, präpariert. Nach 2 Stunden bei 60 °C wird das Pyridin unter reduziertem Druck wieder aufgenommen. Das Sulfatester wird wie das Kaliumsalz durch sehr sorgfältige Zugabe eines Methanol-Kaliumcarbonats bei einem pH-Wert von 9 kristallisiert. Das Kaliumsalz bildet sich allmählich und wird durch Saugfiltration und Waschen mit einem Ether entzogen, damit sich 1,2 g eines weißen mikrokristallinen Pulvers, Alizarin-2-sulfat, ergeben.
5) Synthese von Alizarin-1-galaktosid:
Dieses Substrat wird aus Alizarin-2-acetat, das vorher im Kapitel 3) beschrieben wurde, präpariert. Diese 2,82 g Ester, das heißt 10 mmol, werden in Anwesenheit von 75 ml Dichlormethan gemischt und dem Gemisch werden 2 bis 3 ml 2,4,6-Collidin oder 2,6-Lutidin zugeben, um eine tief purpurrote Lösung zu erhalten. Nach einer Stunde folgt dem gemäß Wolfrom und Lineback, „Methods in Carbohydrate Chemistry 2" (1963), 342–43 präparierten Silbercarbonat die Zugabe von 5 g, das heißt 12,5 mmol, Acetobromgalaktose. Die Reaktion erfolgt bei Umgebungstemperatur, das heißt 10 bis 15 °C, während zwei Tagen unter Rühren in einem Behälter. Eine Dünnschichtchromatographie zeigt eine progressive Konversion in Tetraacetylgalaktosid, die in der Chromatographie schnell migriert. Die Suspension wird auf einem Bett aus Kieselerde oder grober Kieselgur gefiltert und der Zusatzstoff der Filtrierung wird mit Dichlormethan in erforderlicher Menge, das heißt annähernd 100 ml, gewaschen. Die Lösung der Dichlormethan zusammensetzung wird anschließend in Anwesenheit von 0,2 M Chlorwasserstoffsäure (3 × 100 ml) mit Wasser (× 2) gewaschen. Nach dem Trocknen (MgSO₄) wird der klare braune Extrakt unter reduziertem Druck verdampft, dann erneut in Methanol aufgelöst. Eine Dünnschichtchromatographie (Ethylacetat/Toluen 3:1) zeigt die Anwesenheit eines schnell migrierenden Bestandteils an und ergibt eine positive Reaktion gegenüber ultravioletter Strahlung und Schwefelsäure. Das geschützte Galaktosid wird anschließend desacetyliert, wie bereits beschrieben, indem Natriummethoxid in Methanol verwendet wird, damit sich 1,32 g Alizarin-1-galaktosid ergeben.
6) Synthese von Alizarin-1-phosphat-2-octanoat:
Dieses Substrat wird präpariert, indem 2,4 g, das heißt 10 mmol, in 100 ml Dichlormethan und 3 ml Triethylamin zur Reaktion gebracht werden. Darüber hinaus werden 1,62 g Octanoylchlorid, das heißt 10 mmol, langsam während 30 Minuten bei Umgebungstemperatur zu dieser Lösung im Verlauf des Mischens zugegeben. Das Octanoat wird gereinigt, indem es mit Aluminiumoxid behandelt wird, wie es bereits beschrieben wurde, und durch Entziehen des Lösungsmittels und Kristallisation im Methanol isoliert. Nach dem Abkühlen auf –12 °C wird eine Menge von 1,84 g Octanoat, das heißt 5 mmol, in 30 ml trockenem Acetonitril sukzessiv mit Folgendem behandelt:

– 3,6 g Tetrachlormethan,
– 1,6 g Di-isopropylethylamin, und
– 80 g 4-Dimethylaminopyridin.

Nach annähernd 2 Minuten bei niedrigen Temperaturen wird eine Lösung, die 2,2 g Dibenzyl-phosphit enthält, in 8 ml Acetonitril zugegeben, was einen signifikativen Anstieg der Temperatur verhindert. Nach einer Stunde wird das Gemisch wie von Silverberg L. J., Dillon J. L. und Vermeshetti P., Tet. Lett., 37 Nr. 6 (1996), beschrieben gewonnen und das Dibenzylphosphoryl-Ester wird zu Wasserstoff zerstört, indem 30 ml Ethylacetat als Lösungsmittel mit 0,4 g eines Palladium-Kohlenstoff-Katalysators (10 % Gew./Gew.) verwendet werden. Der Phosphatester wird anschließend, wie das Kaliumsalz, nach dem Entzug von Ethylacetat durch erneutes Inlösungbringen in Methanol und vorsichtige Zugabe einer Lösung aus Kaliumcarbonat in wässrigem Methanol bei pH-Wert 8 isoliert. Das Präzipitat aus Alizarin-1-phosphorsäure2-octanoat-Kaliumsalz wird aufgefangen, mit Methanol gewaschen, und die 2,05 g Ester werden im Vakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet.
7) Synthese von Desoxyalizarin:
Dieser Substrattyp wird gemäß der in Liebermann – Ber., 21 444 (1888), dargelegten Synthese präpariert. Für die Synthese der Derivate 9- bis 10-O-Methyl der reduzierten Anthrachinone wird die Gesamtheit der 1,2-Diol vor der Methylierung durch einen geeigneten Prozess, der dem Fachmann bekannt ist, das heißt durch Komplexierung mit Borat, wie in Scheline-Acta. Chem. Scand. 20 1182 (1966) beschrieben, oder durch Verwendung von Acetaldehyd-Dimethylacetat (Schutz durch Ethyliden) vorab geschützt.
ANWENDUNGEN
Zahlreiche Anwendungen sind möglich:

1. Ermittlung und Lokalisierung von spezifischen mikrobiellen Spezies in einem festen Medium oder auf Membran.
2. Ermittlung von enzymatischen Aktivitäten in Lösung aus Gewebe- oder Zellextrakten oder aus Eukaryonten- oder Prokaryontenzellsuspensionen.
3. Identifizierung von Organismen entsprechend der Anwesenheit von enzymatischen Aktivitäten.
4. Visualisierung und Lokalisierung einer spezifischen Reaktion zwischen Antigen und Antikörper, wie die ELISA-Technik. Zum Beispiel können Alizarin-β-galaktosid oder Alizarin-phosphat für Technologien verwendet werden, die dazu bestimmt sind, die Aktivitäten von β-Galaktosidase oder alkalische Phosphatase als Indikatorenzyme zu offenbaren. In diesem Fall werden die enzymatischen Substrate zuerst in Ermittlungsreaktionen, in denen es um enzymatische Aktivität (namentlich alkalische Phosphatase oder β-Galaktosidase) geht, wie die Reaktionen zum Ermitteln von Antikörpern oder Antigenen mit einem Format des Typs ELISA, zum Beispiel „Les immunodosages de la théorie à la pratique" koordiniert von Y. Barbier, ACOMEN-Verlag, Lyon, Seiten 109 bis 133 (1988); oder ferner beim Ermitteln von Nukleinsäuren, zum Beispiel „DNA probes" 2. Ausgabe, Keller G.H., Manak, M.M., Stockton press, Abschnitte 5 bis 9 (1993), verwendet.
5. Techniken der Molekularbiologie, bei denen es um das Aufzeigen der Anwesenheit eines Gens zum Beispiel der β-Galaktosidase und ihrer Verwendung „Molecular cloning a laboratory manual" 2. Ausgabe, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Abschnitte 16.56 und Abschnitt 1.85 (1989), geht.
6. Histochemische, cytochemische Techniken oder Techniken der Durchflusscytometrie. Die Verwendung derartiger Substrate, die mit spezifischen enzymatischen Aktivitäten in Verbindung stehen, weist Anwendungen in der medizinischen Diagnostik und anderen Bereichen auf, wie die Analyse von Wasser, Umwelt, Nahrungsmitteln etc.
7. Offenbarung von Enzymen auf Polyacrylamidgel-Profilen oder anderen verwendeten Materialien, um Elektrophoresen und andere Trennungsmethoden durchzuführen.

BEISPIELE
Beispiel 1: Einfluss der Konzentration von Alizarin-2-β-D-galaktosid auf die Offenbarung der β-Galaktosidase-Aktivität von Mikroorganismen auf geliertem Medium
In das nachfolgende Medium, Columbia-Basis mit einer Konzentration von 46,37 g/l, wurde entweder Alizarin-2-β-D-galaktosid von 0,01 g/l, 0,03 g/l, 0,05 g/l und 0,08 g/l in Anwesenheit von ammoniakhaltigem Eisenzitrat von 0,05 g/l oder 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid von 0,2 g/l ohne ammoniakhaltiges Eisenzitrat zugegeben. Diese vier Medien wurden in Petrischalen zu 20 ml Medium per Schale gespreitet. Dieses Medium wurde durch Isolierung in drei Skalen aus einer Suspension von 0,5 McFarland mit Mikroorganismen angeimpft. Die Schalen wurden bei 37 °C während 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 18, 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität dieser Färbung wurden vermerkt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 1 vorgestellt:
Tabelle 1: Einfluss der Konzentration des Substrats auf die Offenbarung der β-Galaktosidase-Aktivität von Mikroorganismen auf geliertem Medium
Das Symbol „=" in dieser Tabelle 1 bedeutet eine Abwesenheit von Färbung. Die so getesteten Stämme, die nur negative Ergebnisse aufweisen, dienen als negative Kontrolle.
Nach dieser Tabelle 1 ist es möglich festzustellen, dass die mit Alizarin-2-β-D-galaktosid erhaltenen Intensitäten von 0,03 g/l zu denen mit 6-Chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid, dessen Konzentration ungefähr sieben Mal höher ist, fast äquivalent sind. Die Konzentration an Allzarin-2-β-D-galaktosid, die es ermöglicht, interessante Färbungsintensitäten zu erhalten, liegt zwischen 0,03 g/l und 0,08 g/l, vorzugsweise 0,05 g/l.
Die Substrate auf Alizarinbasis sind also empfindlicher als die Substrate auf Indoxylbasis.
Beispiel 2: Offenbarung der β-Galaktosidase-Aktivität von Mikroorganismen auf geliertem Medium - Verwendung von Alizarin-2-β-D-galaktosid
Ein geliertes Medium, das Allzarin-2-β-D-galaktosid enthält, wird wie folgt präpariert: 46,37 g Columbia-Agar werden zu 1 Liter destilliertem Wasser mit 50 mg Alizarin-2-β-D-galaktosid, 500 mg ammoniakhaltigem Eisenzitrat und 30 mg Isopropyl-β-D-thiogalaktosid zugefügt, um die Induktion der β-Galaktosidase-Aktivität zu erleichtern. Der Agar wird durch Behandlung im Autoklav bei 116 °C während 10 min sterilisiert. Das Medium wird langsam auf 55 °C abgekühlt, bevor es in Petrischalen von 20 ml gespreitet wird. Dieses Medium wird dann mit einem präparierten festen Medium derselben Art, und welches auch 46,37 g Columbia-Agar mit 80 mg 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid und 30 mg Isopropyl-β-D- thiogalaktosid enthält, verglichen.
Dreihundertsiebenundsechzig (367) unterschiedliche Stämme sind aus klinischen Proben und Umweltproben gesammelt worden und durch die Galerie API (eingetragener Markenname) 20E (BioMérieux, Frankreich) als Referenzmethode identifiziert worden. Die Stämme werden auf einem Columbia-Agar-Medium bei 37 °C während 24 Stunden kultiviert und dann wird für jeden Stamm eine Impfkultur von ungefähr 10⁸ Organismen/ml (entspricht einem McFarland-Standard von 0,5) verwirklicht. Unter Verwendung eines Denley-Inokulators wird 1 Mikroliter jeder Suspension in einer Schale mit jedem der Medien beimpft: das Alizarin-2-β-D-galaktosid enthaltende Medium, das oben präpariert wurde, und das 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktoside enthaltende Medium. Alle Schalen werden bei 37 °C während 18 Stunden inkubiert.
Nach der Inkubation werden die gebildeten Kolonien visuell untersucht. Auf dem Alizarin-2-β-D-galaktosid enthaltenden Medium sind die Kolonien, die eine β-Galaktosidase-Aktivität aufweisen, purpurrot und auf dem 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid enthaltenden Medium sind sie türkisfarben. Jeder Stamm, der eine dieser Färbungen aufweist, wird hinsichtlich der β-Galaktosidase-Aktivität mit dem entsprechenden Substrat als positiv angesehen. Die Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 2 vorgestellt.
Tabelle 2: Offenbarung der β-Galaktosidase-Aktivität von Mikroorganismen auf geliertem Medium, das Alizarin-2-β-D-galaktosid enthält
Die in den mit Alizarin-2-β-D-galaktosid und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid assoziierten Spalten vorgelegten Zahlen entsprechen den Prozentsätzen von positiven Stämmen. Die große Mehrzahl der Stämme, das heißt 96,5 %, weist für die zwei Substrate eine identische Reaktivität, positiv oder negativ, auf. Acht Stämme hydrolysieren ausschließlich Alizarin-2-β-D-galaktosid. Nun weisen diese acht Stämme auf Grund der Tatsache des Ermittelns einer Fluoreszenz in Anwesenheit des Substrats 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid eine β-Galaktosidase-Aktivität auf. Diese Tabelle zeigt also eine gute Effizienz des Substrats als Indikator der β-Galaktosidase-Aktivität mit einer Empfindlichkeit, die der mit dem Referenzsubstrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid, beobachteten überlegen ist. Diese Substrate sind also sehr empfindlich und bei schwacher Konzentration verwendungsfähig.
Beispiel 3: Auswirkung unterschiedlicher Metallsalze auf die Färbung des Markerteils
In das Medium, Columbia-Basis (46,37 g/l) und Alizarin-2-β-D-glukosid (50 mg/l), wurden mit einer Konzentration von 50 mg/l entweder Manganchlorid, ammoniakhaltiges Eisenzitrat, Zinnchlorid oder Aluminiumsulfat zugegeben. Ein Vergleichsmedium ohne Metallsalze wurde ebenfalls untersucht. Diese unterschiedlichen Medien wurden nach Behandlung im Autoklav in Petrischalen zu 20 ml Medium per Schale gespreitet. Jedes dieser Medien wurde durch Isolierung in drei Skalen aus einer Suspension von 0,5 McFarland mit aus der Sammlung der Anmelderin stammenden Mikroorganismen angeimpft. Die Schalen wurden bei 37 °C während 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität dieser Färbung wurden vermerkt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 3 vorgestellt. Es ist zweckmäßig zu bemerken, dass die Intensitätswerte willkürlich gegeben werden; sie sollen lediglich den Vergleich der Intensität eines Stamms mit einem anderen ermöglichen. Dies trifft ebenfalls auf die folgenden Beispiele zu. Ebenso beinhalten die getesteten Stämme, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, ebne dieser Sammlung interne Nummer. Diese interne Nummerierung wird ebenfalls in bestimmten Beispielen verwendet, die in Folge dargelegt werden.
Tabelle 3: Auswirkung unterschiedlicher Metallsalze auf die Färbung des Markerteils
Gemäß dem getesteten Metallsalz ist die nach der Hydrolyse des Substrats erhaltene Farbe unterschiedlich. Es ist auch möglich, selbst bei Abwesenheit der Metallsalze (Vergleichsmedium) eine Färbung zu beobachten. Allerdings ist die Intensität der erhaltenen Färbung geringer als die beobachtete, zum Beispiel beim Eisensalz, ein Salz, das die Farbe nicht modifiziert.
Dies kann es ermöglichen, die Farbe und ihre Intensität je nach Bedürfnissen anzupassen (Assoziation mit anderen enzymatischen Substanzen, pH-Wert-Indikatoren).
Beispiel 4: Einfluss des pH-Werts auf die Offenbarung der R-D-Galaktosidase in Anwesenheit von Alizarin-2-β-D-galaktosid
In achtzehn Röhrchen, die 5 ml osmotisches Wasser bei einem pH-Wert von 7 enthalten, wurden Alizarin-2-β-D-galaktosid von 0,05 g/l, ammoniakhaltiges Eisenzitrat von 0,05 g/l in die Hälfte der Röhrchen und 5 μl β-Galaktosidase (EC 3.2.1.23 Sigma) in jedes Röhrchen zugegeben. Diese achtzehn Röhrchen wurden bei 37 °C während 4 h inkubiert. Nach der Inkubation war die erhaltene Färbung für die Röhrchen, die kein ammoniakhaltiges Eisenzitrat enthielten, ein blasses Rosa und für die Röhrchen, die ammoniakhaltiges Eisenzitrat enthielten, ein kräftigeres Rosa. Schließlich wurden diese unterschiedlichen Röhrchen bei 24 °C auf unterschiedliche pH-Werte (2 – 3 – 4 – 5 – 6 – 7 – 8 – 9 – 10) eingestellt. Die nach der Einstellung erhaltenen Färbungen werden in der nachfolgenden Tabelle 4 vorgestellt.
Tabelle 4: Einfluss des pH-Werts auf die Offenbarung der R-D-Galaktosidase in Anwesenheit von 2-Alizarin-β-D-galaktosid
Die Farbe variiert je nach pH-Wert. Im Allgemeinen ist sie bei saurem pH-Wert gelb und bei alkalischem pH-Wert rosa bis purpurrot. Dies kann es ermöglichen, die Farbe je nach Bedürfnissen anzupassen oder mehrere Metabolismen (enzymatische Hydrolyse und Variierung des pH-Werts) sichtbar zu machen. Dies beweist ebenfalls, dass es möglich ist, eine große Palette an pH-Werten zu verwenden.
Beispiel 5: Assoziation eines Substrats auf Alizarinbasis mit einem anderen enzymatischen Substrat in einem Agar-Medium - Ermitteln von mindestens zwei unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten
Das folgende Medium:

– Columbia-Basis mit einer Konzentration von 46,37 g/l,
– Alizarin-2-β-D-glukosid von 0,05 g/l,
– ammoniakhaltiges Eisenzitrat von 0,05 g/l,
– 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid von 0,05 g/l, und
– Isopropyl-β-D-thiogalaktosid von 30 mg/l zum Vereinfachen der Induktion der β-Galaktosidase-Aktivität

Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität dieser Färbung wurden vermerkt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 5 vorgestellt:
Tabelle 5: Assoziation von zwei Substraten, Alizarin-2-β-D-glukosid und 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid
Das Symbol „=" in dieser Tabelle 5 bedeutet eine Abwesenheit von Färbung. Die so getesteten Stämme, die nur negative Ergebnisse aufweisen, dienen als negative Kontrolle.
Auf Grund der Assoziation der zwei Substrate ist es möglich, vier unterschiedliche Gruppen von Mikroorganismen zu ermitteln:

– die erste, die eine türkisfarbene Färbung aufweist, entspricht Spezies, die ausschließlich β-Galaktosidase-Aktivität besitzen,
– die zweite, die eine purpurrote Färbung aufweist, entspricht Spezies, die ausschließlich β-Glukosidase-Aktivität besitzen,
– die dritte Gruppe, die eine Mischung aus den zwei vorhergehenden Färbungen aufweist, das heißt, die von blau zu blasslila variieren, entspricht Spezies, die beide ermittelten enzymatischen Aktivitäten besitzen, und
– die vierte, farblose Gruppe entspricht Spezies, die gar keine der beiden angeführten vorhergehenden Aktivitäten besitzen.

Es ist mit diesen Substraten auf Alizarinbasis also möglich, andere enzymatische Substrate zu assoziieren, um eine oder mehrere Gruppen von Mikroorganismen je nach den bei den Mikroorganismen vorhandenen biochemischen Aktivitäten zu unterscheiden.
Beispiel 6: Offenbarung der β-Glukosidase-Aktivität von Mikroorganismen in flüssigem Medium - Verwendung von Alizarin-2-β-D-glukosid
In einer Küvette der Galerie Typ API (eingetragener Markenname, bioMérieux, Frankreich) wurden 3 μl eines Gemischs aus Alizarin-2-β-D-glukosid von 0,12 g/l und ammoniakhaltigen Eisenzitrat von 0,05 g/l angeordnet, dann getrocknet. Eine Vergleichsküvette, die 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glukosid mit der endgültigen Konzentration von 0,4 g/l enthielt, wurde verwirklicht. Diese zwei Küvetten wurden dann mit 50 μl einer Columbia-Basis ohne Agar und 100 μl einer bakteriellen Suspension zu 2 McFarland beimpft. Nach 4 und 24 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde die in der Küvette erhaltene Färbung vermerkt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 6 vorgestellt:
Tabelle 6: Offenbarung der β-Glukosidase-Aktivität von Mikroorganismen in flüssigem Medium, das Alizarin-2-β-D-glukosid enthält
Das Symbol „=" in dieser Tabelle 6 bedeutet eine Abwesenheit von Färbung. Die so getesteten Stämme, die nur negative Ergebnisse aufweisen, dienen als negative Kontrolle.
Das Substrat auf Alizarinbasis ermöglicht es, für sieben (7) von acht (8) getesteten Spezies eine Aktivität zu ermitteln, wohingegen 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glukosid es nur ermöglicht, für sechs (6) dieser Spezies eine Aktivität zu ermitteln. Andererseits wird die Aktivität für zwei Stämme (Bacillus thuringiensis und Listeria seeligeri) mit dem Substrat auf Alizarinbasis früher ermittelt. Diese Substrate sind also einerseits im flüssigen Medium verwendungsfähig und andererseits empfindlicher als Substrate auf Indoxylbasis.
Beispiel 7: Vergleich von Alizarin-1-β-D-glukosid und Alizarin-2-β-D-alukosid im festen Medium
In das Medium, das Columbia-Basis mit einer Konzentration von 46,37 g/l enthielt, wurde wahlweise Folgendes zugegeben:

– Alizarin-2-β-D-glukosid von 0,05 g/l und ammoniakhaltiges Eisenzitrat von 0,05 g/l,
– Alizarin-1-β-D-glukosid von 0,05 g/l oder 0,1 g/l und, für diese zwei Konzentrationen, ammoniakhaltiges Eisenzitrat von 0,05 g/l,
– 6-Chlor-3-indolyl-β-D-glukosid von 0,15 g/l ohne ammoniakhaltiges Eisenzitrat.

Diese vier Medien wurden in Petrischalen zu 20 ml Medium per Schale gespreitet. Dieses Medium wurde durch Isolierung in drei Skalen aus einer Suspension von 0,5 McFarland mit Mikroorganismen angeimpft. Die Schalen wurden bei 37 °C während 48 Stunden inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 18, 24 und 48 Stunden Inkubation visuell untersucht. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität dieser Färbung wurden vermerkt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle 7 vorgestellt:
Tabelle 7: Vergleich von Allzarin-1-β-D-glukosid und Alizarin-2-β-D-alukosid im festen Medium
Das Symbol „=" in dieser Tabelle 7 bedeutet eine Abwesenheit von Färbung. Die so getesteten Stämme, die nur negative Ergebnisse aufweisen, dienen als negative Kontrolle.
Mit derselben Konzentration von 0,05 g/l ermöglichen die zwei Substrate es nicht, dieselben Färbungsintensitäten für zwei (2) von drei (3) Stämmen, die eine Aktivität ausweisen, zu erhalten. Alizarin-2-β-D-glukosid ist ein wenig empfindlicher als Allzarin-1-β-D-glukosid. Aber bei 0,1 g/l ermöglicht es Allzarin-1-β-D-glukosid, Farbintensitäten zu erhalten, die den mit Allzarin-2-β-D-glukosid beobachteten überlegen sind.
Nach dieser Tabelle ist es auch möglich, festzustellen, dass die mit Allzarin-1-β-D-glukosid von 0,05g/l erhaltenen Intensitäten für alle getesteten Stämme denen überlegen sind, die mit 6-Chloro-3-indolyl-β-D-glukosid, dessen Konzentration drei mal höher war als die von Alizarin-1-β-D-glukosid, beobachtet wurden.
Die Substrate auf Alizarinbasis sind also empfindlicher als die Substrate auf Indoxylbasis.
Die Wahl zwischen Allzarin-1-β-D-glukosid und Allzarin-2-β-D-glukosid könnte durch andere Kriterien, wie Kosten der Synthese, die Spezifität der Anwendung, die Stabilität etc. vorgeschrieben werden.
BESONDERE PUNKTE
Eine Methode zur Visualisierung und somit zur Identifizierung von bakteriellen Spezies, in Kolonien, erfolgt auf einem Medium auf Agarbasis durch Inkorporieren von mindestens einem Substrat, wie oben in Anwesenheit einer geringen Menge von mindestens einem geeigneten Kation synthetisiert. Die offenbarten Kolonien bilden dann sehr farbige Einheiten (rot, purpurrot, blau etc.) gemäß der Wahl des Substrats und des damit assoziierten Kations. Existiert dieses Verhältnis zwischen Substrat und Kation, liegt es zwischen 1/100 und 100/1, vorzugsweise zwischen 1/10 und 10/1 und noch besser zwischen 1/2 und 2/1.
Unter bestimmten Bedingungen ermöglicht es die Anwesenheit eines Substrats von SO₃H auf R₃, mit diesem Typ von Substraten verbundene Probleme der Instabilität oder Unlöslichkeit zu verhindern.
Unter „polyvalenten Kationen" sind mehrwertige Metallkationen der Form Xⁿ⁺, wobei n = 2, 3 oder 4 ist, zu verstehen. Verwendungsfähige Metalle sind Folgende: Mg, Al, Ca, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Sr, Zr, Sn, Sb, Ba, La, Hf sowie die Lanthanoidenreihe Ce, Sm, Eu, Gd und Tb.
Die Anthrarobine, auch Desoxyalizarin oder Anthracen-1,2,10-triol genannt, die reduzierte Produkte von Alizarinen sind, sind dem Fachmann bereits wohl bekannt. Diese Reduktion erfolgt durch die Wirkung von Zinkhydroxid oder ammoniakhaltiger Lösung, Zinndichloridsäure etc. Die allgemeine Formel dieser Zusammensetzung ist Folgende:
Auf Grund der Abwesenheit des mittleren Chinonzyklus von Anthrachinon weisen die Metallchelate des Systems 1,2-diol eine andere Reaktivität auf, zum Beispiel ist das Eisen(II)-Chelat schwarz. Da das Eisen(II)-Chelat der Alizarine rot ist, ist es möglich, zwei unterschiedliche Substrate mit derselben Kationenart zu verwenden, wodurch es ermöglicht wird, zwei unterschiedliche enzymatische Aktivitäten zu ermitteln. Diese zwei Substrate können zum Beispiel Folgende sein:

– Alizarin-2-β-D-glukosid zum Ermitteln einer Osidase-Aktivität, und
– Desoxyalizarin-2-β-D-phosphatase zum Ermitteln einer Phosphatase-Aktivität.

Es ist ebenfalls möglich, die Hydroxylgruppe auf Position 10 der Anthrarobine zu schützen, oder das Wasserstoffatom kann zum Beispiel durch eine Methylgruppe ersetzt werden, was ein Molekül der folgenden Form ergibt:
Ebenso können auch die Alizarine geschützt werden, indem die Ketone in der Alkoholform 9,10-diol, Alkoholfunktionen, die anschließend alkyliert werden, zum Beispiel in Form von 1,2-Dihydroxy-9,10-dimethoxyvanthracen, wie nachstehend dargestellt, reduziert werden:
Diese alkylierten Anthrarobine und Alizarine können durch Oxidation im Freien anschließend spontan in Alizarine umgewandelt werden und sind daher gute Anwärter auf Glykosidierungen der Substrate, vorzugsweise auf Position 2.

Claims

Eine Verwendung eines chromogenen Substrats mit der allgemeinen Formel:
wobei: – R₁ ein Zielteil oder H ist und R₂ ein Zielteil oder H ist, wobei mindestens R₁ oder R₂ ein Zielteil ist, – R₃ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist, – R₄ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, OH, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist, – R₃ und R₄ gemäß einer Variante miteinander verbunden sind, um einen Zyklus zu bilden, der mindestens fünf Seiten und vorzugsweise sechs Seiten aufweist, – R₅, R₆, R₇ und R₈ jeweils aus einem der folgenden Atome oder einer der folgenden Atomgruppen zusammengesetzt sind: H, Halogen, insbesondere Cl oder Br, OH, SO₃H, Alkyl oder Alkoxy, und – R₉ und R₁₀ unabhängig aus Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl zusammengesetzt sind, oder eines, R₉ oder R₁₀, aus einem Zyklus (Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin etc.) zusammengesetzt ist, und das andere, R₁₀ oder R₉, aus einem Wasserstoffatom zusammengesetzt ist, um die Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität zu ermitteln.
Verwendung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ketone des mittleren Zyklus in Form von Hydroxidgruppen reduziert werden, wobei mindestens ein Wasserstoffatom letztendlich durch eine Gruppe aus Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl ersetzt wird.
Eine Verwendung eines chromogenen Substrats mit der allgemeinen Formel:
wobei: – R₁ ein Zielteil oder H ist und R₂ ein Zielteil oder H ist, wobei mindestens R₁ oder R₂ ein Zielteil ist, – R₃ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist, – R₄ H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, OH, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX ist, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist, – R₃ und R₄ gemäß einer Variante miteinander verbunden sind, um einen Zyklus zu bilden, der mindestens fünf Seiten und vorzugsweise sechs Seiten aufweist, – R₅, R₆, R₇ und R₈ jeweils aus einem der folgenden Atome oder einer der folgenden Atomgruppen zusammengesetzt sind: H, Halogen, insbesondere Cl oder Br, OH, SO₃H, Alkyl oder Alkoxy, – R₉ und R₁₀ unabhängig aus Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl zusammengesetzt sind, oder eines, R₉ oder R₁₀, aus einem Zyklus (Piperidin, Pyrrolidin, Morpholin etc.) zusammengesetzt ist und das andere, R₁₀ oder R₉, aus einem Wasserstoffatom zusammengesetzt ist, – R₁₁ aus einem der folgenden Atome oder einer der folgenden Atomgruppen zusammengesetzt ist: H, SO₃H, Cl, Br, F, I, NO₂, NH₂, NR₉R₁₀, Alkyl, Aryl, Aralkyl, Acylamin, Aminoaryl oder Aminoacylamin des Typs NHCOX, wobei X gleich Alkyl, Aryl, Aralkyl oder einem α-Aminosäurerückstand, wie Alanin, ist, und – R₁₂ aus H, Methyl, Alkyl, Aryl, Aralkyl zusammengesetzt ist, um die Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität zu ermitteln.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ H ist und R₂ ein Zielteil ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Zielteil aus einem der folgenden Moleküle zusammengesetzt ist: – einem Glykosid, das aus Mono-, Di- und/oder Polysaccharideinheiten zusammengesetzt ist, die durch α oder β mit der Hydroxylfunktion verbunden sind, – einer α-Aminosäure oder einem Peptid, – einer organischen Säure, wie -O-CO-(CH₂)_n-CH₃, wobei n zwischen 0 und 20 liegt, oder – einem Sulfat, einem Phosphat, einem Pyrosulfat, einem Pyrophosphat oder einem Phosphodiester.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass R₃ und R4 aus einer substituierten oder nicht substituierten C₃N-Kette, wobei N vorzugsweise an R₃ oder R₄ angrenzt, zusammengesetzt und durch diese miteinander verbunden sind, um einen Zyklus mit sechs Seiten zu bilden.
Verwendung von mindestens einem Substrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, um das Ermitteln der Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität zu ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Folgendem besteht: – Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, dessen Zielteil mit der zu ermittelnden enzymatischen Aktivität in Verbindung steht, mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens einen Mikroorganismus mit einer derartigen enzymatischen Aktivität enthält, und mit mindestens einer Kationenart, und – Beobachten der Bildung eines unlöslichen und farbigen Chelats.
Verwendung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat mit mindestens einer hinsichtlich des Markerteils, der durch die enzymatische Aktivität freigesetzt wurde, geeigneten Kationart zusammengebracht wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine Kationenart, die zum Bilden eines unlöslichen Chelats verwendet werden kann, aus Folgendem zusammengesetzt ist: Fe²⁺, Al³⁺, Mn²⁺, Sn²⁺ oder Cu²⁺.
Verwendung von mindestens zwei Substraten gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, um das Ermitteln der Anwesenheit von mindestens zwei unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten zu ermöglichen, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Folgendem besteht: – Zusammenbringen von mindestens zwei Substraten, deren Zielteile mit den mindestens zwei zu ermittelnden enzymatischen Aktivitäten in Verbindung stehen, mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens einen Mikroorganismus mit derartigen enzymatischen Aktivitäten enthält, und mit mindestens einer Kationart, und – Beobachten der Bildung von mindestens zwei unterschiedlichen Färbungen oder einer dritten Färbung.
Verwendung gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate mit mindestens einer Kationenart, vorzugsweise einer einzigen Kationart, zusammengebracht werden, die hinsichtlich der Markerteile, die durch die enzymatische Aktivität freigesetzt wurden, geeignet ist.
Verwendung von mindestens einem Substrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, um das Ermitteln der Anwesenheit einer enzymatischen Aktivität zu ermöglichen, oder in Kombination mit einer Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus Folgendem besteht: – Zusammenbringen von mindestens einem Substrat, dessen Zielteil mit der zu ermittelnden enzymatischen Aktivität in Verbindung steht, mit einer Probe, von der angenommen wird, dass sie mindestens einen Mikroorganismus mit einer derartigen enzymatischen Aktivität enthält, in einem Reaktionsmedium mit einem geeigneten pH-Wert, und – Beobachten der Bildung mindestens einer Färbung.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Verwendung von mindestens zwei Substraten die Verwendung einer einzigen Kationenart bedingt, die hinsichtlich der Markerteile, die durch die enzymatischen Aktivitäten freigesetzt wurden, geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 7 oder 10, dadurch gekennzeichnet dass sie aus dem Durchführen eines intermediären Schritts besteht, der aus dem Ermöglichen des Wachsens des/der Mikroorganismus/Mikroorganismen auf einem Nährmedium, das das/die Substrat(e) enthält, besteht.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Glykosidase-Aktivität ermittelt wird, indem, unter anderem, Folgende als Zielteil verwendet werden: – Glukose, – Galaktose, – Mannose, – Xylose, – Glukuronsäure, oder – N-Acetylglukosamin.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Phosphatase-Aktivität ermittelt wird, indem, unter anderem, Phosphorsäure oder ein substituiertes Derivat als Zielteil verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Sulfatase-Aktivität ermittelt wird, indem, unter anderem, Schwefelsäure oder ein substituiertes Derivat als Zielteil verwendet wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine enzymatische Lipase-, Phospholipase- oder Esterase-Aktivität ermittelt wird, indem, unter anderem, Folgende als Zielteil verwendet werden: – eine gesättigte oder ungesättigte Fettsäure oder ein substituiertes Derivat, – Essigsäure oder ein substituiertes Derivat, – Buttersäure oder ein substituiertes Derivat, – Octansäure oder ein substituiertes Derivat, oder – eine veresterte Phosphatgruppe, wie Inositol-1-Phosphat.
Eine Verbindung zum Ermöglichen des Ermittelns von mindestens einem Mikroorganismenstamm und/oder einer Mikroorganismenspezies, die mindestens ein Substrat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und ein Nährmedium umfasst.
Verbindung gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei Substrate umfasst, wobei die Substrate nach der Reaktion unterschiedliche Farben aufweisen, wodurch das Unterscheiden der offenbarten unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten des mindestens eines Mikroorganismenstamms und/oder der mindestens einen Mikroorganismenspezies ermöglicht wird.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem flüssigen, gelierten oder festen Nährmedium zusammengesetzt ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Substrats zwischen 10 und 500 mg/l, vorzugsweise zwischen 30 und 150 mg/l, liegt und noch besser 50 mg/l beträgt.