DE602004010364T2 - Enzymsubstrate, diese enthaltende kulturmedien und deren verwendung zum nachweis von aminopeptidaseaktivität und/oder zur differenzierung von grampositiven bakterien von gramnegativenbakterien - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue chromogene Enzymsubstrate zum Nachweis einer Aminopeptidaseaktivität. Diese Substrate sind in Anwendungen verwendbar, die einen Schritt der enzymatischen Hydrolyse aufweisen, wobei ein physikalisch-chemisches Signal erzeugt wird, insbesondere in der Mikrobiologie, Biochemie Immunologie, Molekularbiologie, Histologie usw. Die Erfindung betrifft ebenfalls Kulturmedien, die derartige Substrate umfassen, die Verwendung der Substrate oder der Medien für den Nachweis von Aminopeptidaseaktivitäten und/oder der Unterscheidung grampositiver Bakterien von gramnegativen Bakterien sowie Verfahren der Verwendung.
  • Im Vergleich zu den bestehenden Substraten, die zumeist fluorogen sind, können diese neuen Substrate insbesondere in Gelmedien zum Nachweis von Mikroorganismen verwendet werden, da sie eine Färbung erzeugen, die im Reaktionsmedium nicht diffundiert und somit auf der Ebene der Kolonien konzentriert ist.
  • Chromogene Enzymsubstrate zum Nachweis einer Aminopeptidaseaktivität, die nicht diffundieren, sind nach dem Stand der Technik bereits bekannt. Derartige Substrate werden in den Patentanmeldungen WO-A-98/04735 und WO-A-99/38995 , eingereicht von der Anmelderin, behandelt. Trotzdem weisen diese Substrate Nachteile auf: ihre Synthese gestaltet sich schwierig, die Reinheit ist mäßig und die Ausbeute gering. Außerdem muß zur Verwendung in einem Kulturmedium die Zusammensetzung des Mediums äußerst genau definiert sein, um eine Farbe feststellen zu können. Einige andere Substrate, die beschrieben werden, können nicht zum Nachweis von Mikroorganismen in Mischkulturen auf festen Medien verwendet werden.
  • Andererseits sind Moleküle auf Acridinbasis bekannt. Sie werden verwendet aufgrund:
    • • ihrer Eigenschaften als Farbmittel, vergleiche dazu beispielsweise Rapposch et al., J. Dairy Sci., Dez. 2000, 83 (12):2753–2758, oder beispielsweise Giorgio A. et al., Microbiologia, Jan. 1989, 12 (1):97–100,
    • • ihrer chemotherapeutischen Eigenschaften, beispielsweise in Costes N. et al.,
    • J. Med. Chem., 15. Juni 2000, 43 (12):2395–2402, oder
    • • ihrer Eignung zur Durchführung von DNA-Interkalation, beispielsweise in Okwumabua O. et al., Res. Microbiol., Feb. 1992, 143 (2):183–189, oder beispielsweise in Schellhorn T. et al., Cell. Mol. Biol., Juli 1992, 38 (4):345–365.
  • Die Patentschrift EP-B-0 270 946 schlägt chromogene Enzymsubstrate auf der Basis von Acridinon, einem Acridinderivat, vor. Der Rest, der mittels eines Enzyms gespaltet werden kann, liegt an der 7er-Position der Acridingruppe vor. Seine Struktur ermöglicht ausschließlich den Nachweis der folgenden Enzymaktivitäten: Esterase und Glykosidase.
  • Das US-Patent Nr. 4,457,866 beschreibt chromogene Peptide und deren Verwendung als Enzymsubstrate für den Nachweis von proteolytischen Enzymen. Die Spezifizität dieser Substrate kann in Abhängigkeit der Aminosäuren, die in die Peptide eingeführt werden, moduliert werden.
  • Das Dokument WO 01/09372 schlägt chemolumineszente Verbindungen auf der Basis von Acridin oder Derivaten davon vor, die als hydrolytische Enzymsubstrate verwendet werden können.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind neue chromogene Enzymsubstrate zum Nachweis einer Aminopeptidaseaktivität bei Mikroorganismen und zum Definieren der Zugehörigkeit mindestens einer Bakterie zur Gruppe der Grampositiven oder der Gramnegativen entsprechend ihrer Färbung vorgeschlagen. Die Erfindung betrifft ebenfalls Kulturmedien, die derartige Substrate enthalten, die Verwendung von Substraten oder Kulturmedien für den Nachweis von Aminopeptidaseaktivitäten und/oder das Unterscheiden von grampositiven Bakterien von gramnegativen Bakterien und Verfahren der Verwendung.
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung chromogene Enzymsubstrate zum Nachweis einer Aminopeptidaseaktivität bei Mikroorganismen oder zum Definieren der Zugehörigkeit mindestens einer Bakterie zur Gruppe der Grampositiven oder der Gramnegativen entsprechend ihrer Färbung. Sie weisen die folgende Formel (I) auf:
    Figure 00030001
    in der:
    • – R1 nichts oder eine Alkyl-, Allyl-, Arylgruppe ist,
    • – R2 aus mindestens einer Aminosäure, vorzugsweise Alanin, aufgebaut ist,
    • – R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander aus H- oder -O-Alkyl, vorzugsweise -O-CH3, aufgebaut sind,
    • – R7 aus H, O-CH3, Alkyl oder Halogen aufgebaut ist,
    • – R8 aus H oder Cl aufgebaut ist, und
    • – n eine ganze Zahl ist, die 0 oder 1 entspricht.
  • Gemäß der Erfindung ist unter Aryl insbesondere ein aromatischer C6-C10-Kern, insbesondere Phenyl, Benzyl, 1-Naphthyl oder 2-Naphthyl zu verstehen.
  • Unter Alkyl ist ein C1-C6-Alkyl, d. h. ein unverzweigtes oder verzweigtes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, zu verstehen. Als Beispiele können Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, t-Butyl, Pentyl, Isopentyl und Hexyl angeführt werden.
  • Unter Halogenatom ist Chlor, Brom, Iod und Fluor zu verstehen.
  • Die in der Erfindung verwendeten Aminosäuren sind beliebige, Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Aminosäuren.
  • Unter mindestens einer Aminosäure sind eine oder mehrere Aminosäuren zu verstehen.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung steht R2 für eine Aminosäure oder ein Peptid mit höchstens 10 Aminosäuren, wobei die Aminosäuren gleich oder verschieden sind. Aus Gründen der Substratkosten steht A vorzugsweise für eine Aminosäure oder ein Peptid mit höchstens 4 Aminosäuren, wobei die Aminosäuren gleich oder verschieden sind.
  • Die Aminosäure(n) R2 können an einen Blocker gekoppelt sein, was eine weitere Ausführungsform der Erfindung bildet.
  • Diese Blocker umfassen alle Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Blocker, die zum Schutz der Amine fähig sind. Als Beispiele können t-Butoxycarbonyl (N-t-BOC), 9-Fluorenyloxycarbonyl, ein Lösungsvermittler, wie etwa Succinyl oder eine nicht metabolisierbare Aminosäure, d. h. nicht natürliche Aminosäure, wie etwa Pipecolinsäure, angegeben werden.
  • Gemäß einer Ausführungsform weist das Substrat die folgende Formel (Ia) auf:
    Figure 00040001
    oder die folgende Formel (Ib) auf:
    Figure 00050001
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform entspricht das Substrat der obigen Formel (I), in der R1 eine Methyl- oder Allylgruppe ist.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform entspricht das Substrat der obigen Formel (I), in der R1 eine Alkylgruppe, vorzugsweise eine Methylgruppe, oder eine Allylgruppe ist, R2 mindestens eine Aminosäure, gegebenenfalls mit einem Blocker geblockt, vorzugsweise mindestens ein Alanin ist, R3, R4, R5, R6, R7 und R8 für H stehen und n gleich 0 oder 1 ist.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das Substrat die folgende Formel (Ic) auf:
    Figure 00050002
    oder die folgende Formel (Id) auf:
    Figure 00060001
  • Die Verbindungen der Erfindung können in Abhängigkeit des Werts von n wie folgt hergestellt werden:
    • (1) Gilt n = 0, so wird ein geeignetes Acridinhydrochlorid (R8 ist H oder Cl) mit geeignetem Anilin (R3, R4, R5 und R6 entsprechen der obigen Definition) und Schwefel umgesetzt, um geeignetes 9-(4-Aminophenyl)acridin zu erhalten. Dieses wird anschließend mit mindestens einer Aminosäure, die an einen Blocker gekoppelt ist, umgesetzt, und der Schutz der erhaltenen Verbindung wird aufgehoben, um den Blocker von der Verbindung der Erfindung abzuspalten. Soll eine Verbindung erhalten werden, bei der der Stickstoff an der 10er-Position quaternisiert ist, so wird die erhaltene Verbindung mit XR1 umgesetzt, in der X ein Halogen ist und R1 der obigen Definition entspricht.
    • (2) Gilt n = 1, so wird 9-Methylacridin, hergestellt nach dem Verfahren von Campbell et al. (1958, supra), oder 9-Chloracridin, hergestellt nach dem Verfahren von Lehmstedt und Schrader (Albert, 1996, supra), mit geeignetem Nitrobenzaldehyd (R3, R4, R5 und R6 entsprechen der obigen Definition) und Zinkchlorid umgesetzt, um geeignetes 9-(4-Nitrostyryl)acridin zu erhalten. Die Nitro-Gruppe wird anschließend entweder durch Zinn-(II)-chlorid in einem Gemisch aus Ethylacetat und Ethanol oder durch Natriumborhydrat und Kupferacetylacetonat reduziert, um 9-(4-Aminostyryl)acridin zu erhalten. Dieses wird anschließend mit mindestens einer Aminosäure, die an einen Blocker gekoppelt ist, umgesetzt, und der Schutz der erhaltenen Verbindung wird aufgehoben, um den Blocker von der Verbindung der Erfindung abzuspalten. Soll eine Verbindung erhalten werden, bei der der Stickstoff an der 10er-Position quaternisiert ist, so wird die erhaltene Verbindung mit XR1 umgesetzt, in der X ein Halogen ist und R1 der obigen Definition entspricht.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein Kulturmedium, das mindestens ein chromogenes Enzymsubstrat, so wie oben beschrieben, einzeln oder in Kombination mit mindestens einem anderen Enzymsubstrat verwendet, das für eine andere Enzymaktivität als die vom Substrat gemäß der Erfindung nachgewiesene Aktivität spezifisch ist.
  • In der Tat wird, wenn Mikroorganismen, die eine Peptidaseaktivität exprimieren, in ein Reaktionsmedium, das die Verbindungen gemäß der Erfindung enthält, eingeimpft werden, eine Färbung erzeugt, die im Reaktionsmedium nicht diffundiert und somit auf der Ebene der Kolonien konzentriert ist.
  • Unter Reaktionsmedium gemäß der Erfindung ist ein Medium zu verstehen, das die Entwicklung von mindestens einer Enzymaktivität von mindestens einem Mikroorganismus ermöglicht.
  • Dieses Reaktionsmedium kann entweder nur als Nachweismedium oder als Kultur- und Nachweismedium dienen. Im ersteren Fall wird die Kultur des Mikroorganismus vor dem Beimpfen erzeugt, während im zweiten Fall das Reaktionsmedium auch das Kulturmedium bildet.
  • Das Reaktionsmedium kann fest, halbfest oder flüssig sein. Unter festem Medium ist beispielsweise ein Gelmedium zu verstehen.
  • Vorzugsweise ist das Medium aus einem Gelmedium gebildet.
  • Agar ist der herkömmliche Gelbildner in der Mikrobiologie für die Kultur von Mikroorganismen, es können aber auch Gelatine oder Agarose verwendet werden.
  • Eine gewissen Anzahl an Produkten sind auf dem Markt erhältlich, beispielsweise Columbia-Agar, Trypcase-Soja-Agar, MacConkey-Agar, Sabouraud-Agar oder allgemeiner noch die im Handbook of Microbiological Media (CRC Press) beschriebenen.
  • Die Menge an Agar im Reaktionsmedium beträgt 2 bis 40 g/l, vorzugsweise 9 bis 25 g/l.
  • Die Enzymsubstrate der Erfindung können in einer großen Bandbreite an pH-Werten verwendet werden, insbesondere zwischen pH-Werten von 5,5 und 10.
  • Die Konzentration des Enzymsubstrats der Erfindung im Reaktionsmedium beträgt zwischen 0,025 und 1,0 g/l, und vorteilhafterweise beträgt sie 0,3 g/l. Mit dieser Substratkonzentration wird ein besserer Farbkontrast erzielt.
  • Das Reaktionsmedium kann mindestens ein anderes Substrat umfassen, das für eine andere Enzymaktivität spezifisch ist als jene, die vom Substrat gemäß der Erfindung nachgewiesen wird. Die enzymatische Hydrolyse des oder der anderen Substrate erzeugt ein nachweisbares Signal, das sich von dem vom Substrat der Erfindung nachgewiesenen Signal unterscheidet, wie etwa andere Farb- oder Fluoreszenzprodukte, um eine Sichtbarmachung, wie etwa den Nachweis und/oder die Identifizierung und/oder die Quantifizierung eines oder mehrerer Mikroorganismen, zuzulassen.
  • Als anderes spezifisches Substrat kann ein beliebiges anderes Substrat verwendet werden, das herkömmlicherweise zum Nachweis von Mikroorganismen verwendet wird.
  • Die Konzentration des anderen spezifischen Enzymsubstrats liegt im Allgemeinen zwischen 0,01 und 2 g/l. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können eine derartige Konzentration einfach in Abhängigkeit des verwendeten Substrats festlegen.
  • Das Reaktionsmedium kann ebenfalls ein oder mehrere Elemente kombiniert umfassen, wie etwa Aminosäuren, Peptone, Kohlenhydrate, Nukleotide, Mineralien, Vitamine, Antibiotika, Tenside, Puffer, Phosphatsalze, Ammonium, Natrium und Metalle. Beispiele für Medien sind in den Patentanmeldungen der Anmelderin EP 656 421 und WO 99/09 207 beschrieben.
  • Die Enzymsubstrate und Reaktionsmedien der Erfindung sind somit in der Diagnostik von Mikroorganismen mit Peptidaseaktivität von Nutzen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf die Verwendung von chromogenen Enzymsubstraten, so wie oben beschrieben, oder eines Kulturmediums, ebenfalls so wie oben beschrieben, zum Nachweis von mindestens einer Aminopeptidaseaktivität bei Mikroorganismen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von chromogenen Enzymsubstraten, so wie oben beschrieben, oder eines Kulturmediums, ebenfalls so wie oben beschrieben, zur Trennung von gefärbten grampositiven Bakterien und gefärbten gramnegativen Bakterien.
  • Schlußendlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von mindestens einer Aminopeptidaseaktivität bei Mikroorganismen, wobei dieses Verfahren aus Folgendem besteht:
    • – Bereitstellen eines Kulturmediums so wie oben definiert,
    • – Beimpfen des Mediums mit einer zu testenden biologischen Probe,
    • – Inkubierenlassen, und
    • – Sichtbarmachen des Vorhandenseins mindestens einer Aminopeptidaseaktivität, allein oder in Kombination mit mindestens einer weiteren, unterschiedlichen Enzymaktivität.
  • Die Erfindung betrifft ferner ein weiteres Verfahren zum Differenzieren von Bakterien nach ihrer Zugehörigkeit zu Keimen vom grampositiven Typ oder zu Keimen vom gramnegativen Typ, wobei dieses Verfahren aus Folgendem besteht:
    • – Bereitstellen eines Kulturmediums so wie oben definiert,
    • – Beimpfen des Mediums mit einer zu testenden biologischen Probe,
    • – Inkubierenlassen, und
    • – Sichtbarmachen des Vorhandenseins mindestens einer Färbung, die gleichbedeutend mit dem Vorhandensein von einem Keim bzw. von Keimen vom gramnegativen Typ ist.
  • Unabhängig vom verwendeten Verfahren wird dann, wenn der Stickstoff an der 10er-Position der Acridingruppe nicht quaternisiert ist, das Sichtbarmachen des Vorhandenseins mindestens einer Aminopeptidaseaktivität durch Zugabe von Säure, vorzugsweise Salzsäure, Essigsäure oder Citronensäure, zu der Kultur erreicht. Unter quaternisiert ist ein Stickstoff an der 10er-Position der Acridingruppe zu verstehen, der vierwertig ist, d. h. er durch drei klassische Bindungen mit dem Phenylring und durch eine Komplementärbindung mit einem Rest verbunden ist, so daß das Stickstoffatom eine positive Ladung trägt und somit kationisch ist. In diesem Fall liegt das Molekül in Form eines Salzes, beispielsweise eines Chlorid-, Bromid- oder Trifluoracetatsalzes, vor.
  • Alle nachstehend in den Beispielen beschriebenen Reaktionen wurden mittels Dünnschichtchromatographie (DC) überprüft, und die Strukturen der erhaltenen Produkte wurden mittels Massenspektrometrie (MS) und Kernmagnetresonanz (NMR) bestätigt.
  • Beispiel 1: Sichtbarmachen der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels nicht quaternisierter Substrate
  • 1.1. Verwendete Moleküle
  • Eine Vergleichsstudie von zwei Substraten auf Acridinbasis, L-Alanyl-9-(4-aminostyryl)acridin, in der Folge als L-Ala-4-ASA bezeichnet, und L-Alanylaminophenylacridin (nicht quaternisierte Substrate), in der Folge als L-Ala-APA bezeichnet, wurde durchgeführt, wobei diese die folgenden Formeln aufwiesen:
    Figure 00110001
  • 1.2. Synthese der Substrate
  • 1.2.1. Synthese von L-Ala-4-ASA
  • Diese Synthese erfolgt in mehreren Schritten.
  • Herstellung von 9-Chloracridin
  • Die Herstellung erfolgt nach dem Verfahren von Lehmstedt und Schrader, das von Albert in seinem Buch „The Acridines", Arnold, Second Edition (1966), Seite 33, angeführt ist.
  • Herstellung von 9-Methylacridin
  • Das Verfahren nach Campbell, Franklin, Morgan und Tivey (vgl. Chem. Soc., 1958, 1145) wurde herangezogen. Die Ausbeuten erreichten 90%.
  • Herstellung von 9-(4-Nitrostyryl)acridin durch Mischen
  • Ein Gemisch aus 9-Methylacridin (4,83 g, 25,0 mmol), 4-Nitrobenzaldehyd (4,23 g, 31,25 mmol) und Zinkchlorid (5,06 g, 31,25 mmol) wird 3 Stunden lang mit einem Ölbad auf 130°C erhitzt. Der gewonnene Feststoff wird in einer Natriummetabisulfitlösung erhitzt, um den Aldehydüberschuß zu beseitigen, und das heiße Gemisch wird filtriert. Erhaltene Präzipitate werden in einer Mindestmenge an Tetrahydrofuran gelöst, und der Lösung wird Wasser zugesetzt, um das Produkt in Form von Präzipitaten zu haben. Diese Präzipitate werden durch Filtration gewonnen und getrocknet. Das Produkt kann in Ethanol rekristallisiert werden. Die Ausbeute beträgt 35%.
  • Herstellung von 9-(4-Aminostyryl)acridin
  • Das Produkt 9-(4-Nitrostyryl)acridin (2,86 g, 10,0 mmol) wird in Ethylacetat (250 ml) gelöst und anschließend unter Rückfluß erhitzt. Eine Lösung von Zinn-(II)-Chloriddihydrat (9,0 g, 40 mmol) in erhitztem Ethanol (150 ml) wird abgekühlt und der 9-(4-Nitrostyryl)acridinlösung zugesetzt. Das Ganze wird unter Rückfluß und unter Rühren 5 Stunden lang reagieren gelassen. Nach dem Abkühlen wird das 9-(4-Aminostyryl)acridinpräzipitat durch Vakuumfiltration isoliert. Das Filtrat wird durch Verdampfung getrocknet und in Wasser (500 ml) unter Rühren aufgenommen. Die Lösung wird mit einer Sodalösung alkalisiert (pH-Wert 13–14). Die zuvor isolierte 9-(4-Aminostyryl)acridinfraktion, die einen hohen Anteil an Zinnsalz enthält, wird ebenfalls alkalisiert. Das 9-(4-Aminostyryl)acridin wird durch Filtration getrennt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es ist ausreichend rein, um im nächsten Schritt verwendet zu werden.
  • Herstellung von t-Boc-alanyl-9-(4-aminostyryl)acridin
  • Das Produkt t-Boc-alanin (3,79 g, 20,0 mmol) wird in einer Mindestmenge an Tetrahydrofuran-(THF-)Anhydrid gelöst und die Lösung mithilfe eines Gemischs aus Ethylenglykol/Trockeneis in einem Bad auf –15°C abgekühlt. N-Methylmorpholin (NMM) (2,02 g, 20 mmol) wird dem Gemisch zugetropft. Anschließend wird dem Reaktionsgemisch Isobutylchloroformiat (IBCF) (2,53 g, 20,0 mmol) zugetropft. Die Temperatur muß unter –10°C liegen. Nach etwa 3 Minuten wird das 9-(4-Aminostyryl)acridin (5,4 g, 20 mmol), das in einer Mindestmenge an Tetrahydrofuran-(THF-)Anhydrid gelöst und auf –15°C abgekühlt ist, eingetragen. Das Reaktionsgemisch wird gerührt und auf Raumtemperatur zurückkehren gelassen. Das Salz von N-Methylmorpholin wird durch Filtration mit einem Trichter mit Filterplatte beseitigt. Das Gemisch wird mit einem Rotationsverdampfer bis auf ein Viertel seines ursprünglichen Volumens eingedampft. Das Filtrat wird einem Gemisch aus Wasser und Eis in großen Mengen unter Rühren zugetropft. Gelbe Präzipitate, die gebildet wurden, werden durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt kann in Methanol rekristallisiert werden. Die Ausbeute beträgt im Wesentlichen 75%.
  • Weitere Aminosäureanaloge, die mittels t-Boc geschützt sind, wurden ebenfalls zur Bildung neuer Produkte verwendet werden. Diese Aminosäuren sind: Prolin, Glycin, Serin und β-Alanin. Die Ausbeuten für diese Produkte liegen im Bereich von 60 bis 80%, wobei die Resultate im Allgemeinen für die Analogen von β-Alanin am besten und für die Analogen von Serin am schlechtesten sind.
  • 1.2.2. Synthese von L-Ala-APA
  • Die Herstellung von 9-(4-Aminophenyl)acridin durch eine Reaktion von geschmolzenem Schwefel kann durch zwei verschiedene Verfahren erfolgen:
  • VERFAHREN A:
  • Acridinhydrochlorid (9,7 g, 45,0 mmol), Anilin (8,37 g, 90,0 mmol) und 10,0 g Schwefel werden gut gemischt und unter einem wirksamen Abzug 4 Stunden auf 130°C erhitzt. Das Reaktionsmedium im Kolben wird auf Raumtemperatur gekühlt und in heißem Methanol gelöst, um eine blutrote Lösung zu erhalten. Die Lösung wird abgekühlt und der Schwefel abfiltriert. Die Alkalisierung des Filtrats erfolgt mithilfe einer konzentrierten Ammoniaklösung. Leichte gelbe Präzipitate, die gebildet wurden, werden filtriert und anschließend mit kaltem Methanol gewaschen. Die Ausbeute beträgt 65%.
  • VERFAHREN B:
  • Acridin (8,06 g, 45,0 mmol), Anilinhydrochlorid (11,61 g, 90 mmol) und 10,0 g Schwefel werden gut gemischt und 4 Stunden auf 130°C erhitzt. Das Reaktionsmedium wird anschließend so wie im oben beschriebenen Verfahren A behandelt.
  • Anschließend wird ein Herstellungsverfahren auf der Grundlage des einen und/oder des anderen der zwei obigen Verfahren durchgeführt.
  • Herstellung von t-Boc-alanyl-9-(4-aminophenyl)acridin
  • Das Produkt t-Boc-Alanin (3,79 g, 20,0 mmol) wird in einer Mindestmenge an Tetrahydrofuran-(THF-)Anhydrid gelöst und die Lösung mithilfe eines Gemischs aus Ethylenglykol/Trockeneis in einem Bad auf –15°C abgekühlt. N-Methylmorpholin (NMM) (2,02 g, 20 mmol) wird dem Gemisch zugetropft. Anschließend wird dem Reaktionsgemisch Isobutylchloroformiat (IBCF) (2,53 g, 20,0 mmol) zugetropft. Die Temperatur muß unter –10°C liegen. Nach etwa 3 Minuten wird das 9-(4-Aminophenyl)acridin (5,4 g, 20 mmol), das in einer Mindestmenge an Tetrahydrofuran-(THF-)Anhydrid gelöst und auf –15°C abgekühlt ist, eingetragen. Das Reaktionsgemisch wird gerührt und auf Raumtemperatur zurückkehren gelassen. Das Salz von N-Methylmorpholin wird durch Filtration mit einem Trichter mit Filterplatte beseitigt. Das Gemisch wird mit einem Rotationsverdampfer bis auf ein Viertel seines ursprünglichen Volumens eingedampft. Das Filtrat wird einem Gemisch aus Wasser und Eis in großen Mengen unter Rühren zugetropft. Gelbe Präzipitate, die gebildet wurden, werden durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Produkt kann in Methanol rekristallisiert werden. Die Ausbeute beträgt 75%.
  • Weitere Aminosäureanaloge, die mittels t-Boc geschützt sind, wurden ebenfalls zur Bildung neuer Produkte verwendet. Diese Aminosäuren sind: Prolin, Glycin, Serin und β-Alanin. Die Ausbeuten für diese Produkte liegen im Bereich von 60 bis 80%, wobei die Resultate im Allgemeinen für die Analogen von β-Alanin am besten und für die Analogen von Serin am schlechtesten sind.
  • 1.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das L-Alanyl-9-(4-aminostyryl)acridin (in Folge als L-Ala-4-ASA bezeichnet) oder L-Alanylaminophenylacridin (in Folge als L-Ala-APA bezeichnet) umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 46,37 g Columbia-Agar werden 1 Liter destilliertem Wasser zugesetzt und anschließend autoklaviert. Dieses Reaktionsmedium wird in zwei Medien mit gleichem Volumen aufgeteilt. Jedes Medium umfaßt: 0,3 g/l L-Ala-4-ASA, eingesetzt durch eine Stammlösung in DMSO, bzw. 0,3 g/l L-Ala-APA, ebenfalls eingesetzt durch eine Stammlösung in DMSO.
  • Mikroorganismen, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, wurden in jedes der Medien isoliert in drei Skalenscheiben, ausgehend von einer 0,5-McFarland-Suspension, eingeimpft. Die Schalen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 Stunden der Inkubation visuell geprüft. Die Färbung der Kolonien wurden vor und nach und dem Zusetzen eines Tropfens Salzsäure geprüft.
  • 1.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 angeführt. In Abwesenheit von HCl zeigten die Substrate keine Spontanfärbung. In Gegenwart eines Tropfens HCl verfärbten sich die Kolonien mit L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität grau-mauve bis mauve. Die Kolonien, die keine derartige Aktivität besaßen, blieben farblos. Diese Substrate sind somit empfindlich und spezifisch. Sie ermöglichen im Falle einer Mischkultur aus Grampositiven und Gramnegativen die Trennung dieser beiden Typen von Keimen.
    SPEZIES (interne Stamm-Nr.) 0,3 g/l L-Ala-4-ASA ohne HCl 0,3 g/l L-Ala-APA ohne HCl 0,3 g/l L-Ala-4-ASA mit HCl 0,3 g/l L-Ala-APA mit HCl
    Escherichia coli farblos farblos grau-mauve blaß mauve
    Proteus mirabills farblos farblos grau-mauve sehr blaß mauve
    Klebsiella pneumoniae farblos farblos grau-mauve mauve
    Enterobacter cloacae farblos farblos grau-mauve mauve
    Citrobacter koseri farblos farblos grau-mauve mauve
    Streptococcus agalactiae farblos farblos farblos farblos
    Enterococcus faecalis farblos farblos farblos farblos
    Staphylococcus aureus farblos farblos farblos farblos
    Listeria innocua farblos farblos farblos farblos
    Candida albicans farblos farblos farblos farblos
    TABELLE 1: Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen durch L-Ala-4-ASA und L-Ala-APA auf Gelmedium
  • Beispiel 2: Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels quaternisiertem Substrat
  • 2.1. Verwendetes Molekül
  • Die Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung von L-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-allylacridiniumchlorid (quaternisiertes Substrat), in Folge als L-Ala-4-AP-10-AA, bezeichnet, das die folgende Formel aufweist:
    Figure 00170001
    L-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-allylacridiniumchlorid
  • 2.2. Synthese von L-Ala-4-AP-10-AA
  • Die Ausgangsverbindung ist t-Boc-alanyl-9-(4-aminophenyl)acridin, dessen Synthese bereits im Absatz 1.2.2. (Synthese von L-Ala-APA) beschrieben wurde. In einem verschließbaren 10-ml-Kolben wird t-Boc-alanyl-9-(4-aminophenyl)acridin (0,88 g, 2,0 mmol) in Tetrahydrofurananhydrid (4,0 ml) eingetragen, und das Gemisch wird zum Sieden gebracht, um eine Teillösung zu erhalten. Die Lösung/Suspension wird abgekühlt und Allylbromid (2,0 ml) zugesetzt. Der Kolben wird anschließend 8 Stunden lang unter Rückfluß erhitzt, und die Reaktion wird regelmäßig durch Dünnschichtchromatographie (DC) überwacht. Nach Abkühlen und Beseitigen des Lösemittels wird das Quaternärsalz mit Diethylether gewaschen und getrocknet.
  • Das Produkt wird in einer Mindestmenge an Ethanol gelöst und mit Ethylacetat (10 ml), das mit HCl gesättigt ist, gerührt. Präzipitate, die sich nach einigen Stunden gebildet haben, werden durch Filtration unter vermindertem Druck gewonnen. Das Einführen von Ethylether in das Filtrat ermöglicht die Gewinnung des zusätzlichen Produkts. Die vereinigten Fraktionen des Produkts werden mit Ethylether gewaschen und rasch getrocknet, um die Absorption von Feuchtigkeit zu vermeiden.
  • 2.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das L-Ala-4-AP-10-AA als Substrat umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 46,37 g Columbia-Agar werden 1 Liter destilliertem Wasser zugesetzt und anschließend autoklaviert. Dieses Reaktionsmedium wird in drei Medien mit gleichem Volumen aufgeteilt. Jedes Medium umfaßt: 0,1 g/l, 0,2 g/l bzw. 0,4 g/l L-Ala-4-AP-10-AA, eingesetzt durch eine Stammlösung in DMSO.
  • Mikroorganismen, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, wurden in jedes der Medien isoliert in drei Skalenscheiben, ausgehend von einer 0,5-McFarland-Suspension, eingeimpft. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und nach 48 Stunden der Inkubation visuell geprüft. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität der Färbung wurden geprüft.
  • 2.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse hinsichtlich der Intensität der Färbung sind auf der Grundlage einer willkürlichen Skala von 0 bis 4 ausgedrückt. Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 aufgeführt.
  • Dieses Substrat ermöglicht die Sichtbarmachung einer L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von gramnegativen Bakterien durch Spontanauftreten (ohne Säurezusatz) einer konzentrierten Farbe auf der Ebene der Kolonien. Die Kolonien, die keine derartige Aktivität besaßen, blieben farblos. Dieses Substrat ist somit empfindlich und spezifisch. Es kann im Falle einer Mischkultur aus Grampositiven und Gramnegativen die Trennung dieser beiden Typen von Keimen ermöglichen. Das „Quaternisieren" des Stickstoffs an der 10er-Position der Acridingruppe ermöglicht den Erhalt einer Spontanreaktion ohne Zusetzen von Säure im Unterschied zum gleichen, aber nicht quaternisierten Molekül, das in Beispiel 1 beschrieben wurde.
    STÄMME Inkubationszeit 0,1 g/l L-Ala-4-AP-10-AA 0,2 g/l L-Ala-4-AP-10-AA 0,4 g/l L-Ala-4-AP-10-AA
    Farbe Intensität Farbe Intensität Farbe Intensität
    Escherichia coli (032) 24 h beige 0,5 rosa-orange 2 rosa-orange 2,5
    48 h beige 0,5 rosa-orange 2 rosa-orange 3
    Proteus mirabilis (103) 24 h beige Spuren rosa-orange 0,5 rosa-orange 3
    48 h beige Spuren rosa-orange 1 rosa-orange 3
    Klebsiella pneumoniae (023) 24 h beige Spuren rosa-orange 1 rosa-orange 3
    48 h beige Spuren rosa-orange 2 rosa-orange 3,5
    Citrobacter koseri (090) 24 h beige 0,5 rosa-orange 1 rosa-orange 3
    48 h beige 0,5 rosa-orange 2 rosa-orange 3,5
    Staphylococcus aureus (070) 24 h inhibiert - inhibiert - inhibiert -
    48 h inhibiert - inhibiert - inhibiert -
    Streptococcus pyogenes (067) 24 h inhibiert - inhibiert - inhibiert -
    48 h farblos - farblos - farblos -
    Enterococcus faecalis (075) 24 h farblos - orange Spuren orange Spuren
    48 h farblos - orange 0,5 orange 1
    Listeria innocua (036) 24 h farblos - farblos - farblos -
    48 h farblos - farblos - farblos -
    Candida albicans (056) 24 h farblos - farblos - farblos -
    48 h farblos - farblos - farblos -
    TABELLE 2: Einfluß der Konzentration im Substrat auf die Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen durch das jeweilige L-Ala-4-AP-10-AA
  • Beispiel 3: Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels eines anderen quaternisiertem Substrat
  • 3.1. Verwendetes Molekül
  • Die Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung von L-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridiniumchlorid (quaternisiertes Substrat), in Folge als L-Ala-4-AP-10-MA bezeichnet, das die folgende Formel aufweist:
    Figure 00200001
    L-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridiniumchlorid
  • 3.2. Synthese von L-Ala-4-AP-10-MA
  • Diese Synthese wurde bereits oben in Absatz 2.2. beschrieben, wobei das Allylbromid durch Methyliodid ersetzt wurde. Für die Synthese von L-Ala-4-AP-10-MA wird auf diesen Absatz verwiesen.
  • 3.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das 300 mg/l L-Ala-4-AP-10-MA umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 46,37 g Columbia-Agar werden 1 Liter destilliertem Wasser zugesetzt und anschließend autoklaviert, dann wird das Substrat durch eine Stammlösung in DMSO eingesetzt. Mikroorganismen, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, wurden in das Medium isoliert in drei Skalenscheiben, ausgehend von einer 0,5-McFarland-Suspension, eingeimpft. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und nach 48 Stunden der Inkubation visuell geprüft. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität der Färbung wurden geprüft.
  • 3.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 aufgeführt.
    STÄMME Inkubationszeit 0,3 g/l L-Ala-4-AP-10-MA
    Farbe Intensität
    Escherichia coli (032) 24 h rosa-orange 3,5
    48 h rosa-orange 3,5
    Proteus mirabilis (103) 24 h rosa-orange 1
    48 h rosa-orange 2
    Klebsiella pneumoniae (023) 24 h rosa-orange 3
    48 h rosa-orange 3
    Citrobacter koseri (090) 24 h rosa-orange 3
    48 h rosa-orange 3
    Staphylococcus aureus (070) 24 h inhibiert -
    48 h inhibiert -
    Streptococcus pyogenes (067) 24 h inhibiert -
    48 h inhibiert -
    Enterococcus faecalis (075) 24 h rosa Spuren
    48 h rosa-orange 0,5
    Listeria innocua (036) 24 h farblos -
    48 h rosa-orange Spuren
    Candida albicans (056) 24 h farblos -
    48 h farblos -
    TABELLE 3: Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen durch L-Ala-4-AP-10-AA, dessen Konzentration im Substrat optimiert wurde
  • Dieses Substrat ermöglicht die Sichtbarmachung einer L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von gramnegativen Bakterien durch Spontanauftreten (ohne Säurezusatz) einer konzentrierten rosa-orangen Farbe auf der Ebene der Kolonien. Die Kolonien, die keine derartige Aktivität besaßen, blieben farblos. Dieses Substrat ist somit empfindlich und spezifisch. Es kann im Falle einer Mischkultur aus Grampositiven und Gramnegativen die Trennung dieser beiden Typen von Keimen ermöglichen. Im Vergleich zu dem in Beispiel 2 beschriebenen Substrat scheint dieses bei den positiven Stämmen eine höhere Intensität der Färbung zu erzielen. Der Unterschied zwischen diesen beiden Substraten liegt im Typ der Gruppe an der 10er-Position am Stickstoff der Acridingruppe.
  • Beispiel 4: Sichtbarmachen der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels anderer nicht quaternisierter Substrate
  • 4.1. Verwendete Moleküle
  • Die Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung von zwei Substraten, L-Alanyl-2-methoxyaminophenylacridin, in der Folge als L-Ala-2-MeOAPA bezeichnet, und L-Alanyl-2,5-dimethoxyaminophenylacridin, in der Folge als L-Ala-2,5-diMeOAPA bezeichnet, wobei diese die folgenden Formeln aufwiesen:
    Figure 00240001
  • 4.2.1. Synthese von L-Ala-2-meoapa
  • Auf der Grundlage des oben im Absatz 1.2.2. Beschriebenen werden andere Anilinanaloge verwendet, um neue Produkte zu bilden, darunter auch Anisidin (3-Methoxyanilin), was 9-(4-Amino-2-methoxyphenyl)acridin ergibt.
  • 4.2.2. Synthese von L-Ala-2,5-diMeOAPA
  • Auf der Grundlage des oben im Absatz 1.2.2. Beschriebenen werden andere Anilinanaloge verwendet, um neue Produkte zu bilden, darunter auch 2,5-Dimethoxyanilin, was 9-(4-Amino-2,5-dimethoxyphenyl)acridin ergibt.
  • 4.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das L-Ala-2-MeOAPA und L-Ala-2,5-diMeOAPA umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 46,37 g Columbia-Agar werden 1 Liter destilliertem Wasser zugesetzt und anschließend autoklaviert. Dieses Reaktionsmedium wird in zwei Medien mit gleichem Volumen aufgeteilt. Die Medien umfassen: 0,3 g/l L-Ala-2-MeOAPA, eingesetzt durch eine Stammlösung in DMSO, bzw. 0,3 g/l L-Ala-2,5-diMeOAPA, eingesetzt durch eine Stammlösung in DMSO. Mikroorganismen, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, wurden in jedes der Medien isoliert in drei Skalenscheiben, ausgehend von einer 0,5-McFarland-Suspension, eingeimpft. Die Schalen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität der Färbung wurden nach Zugabe von HCl geprüft.
  • 4.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 aufgeführt:
    STÄMME Inkubationszeit L-Ala-2-MeOAPA L-Ala-2,5-diMeOAPA
    Farbe Intensität Farbe Intensität
    Escherichia coli (032) 24 h orange 0,5 gelb-orange 1,5
    48 h rosa 3,5 gelb-orange 2
    Proteus mirabilis (037) 24 h orange 1 farblos 0
    48 h orange 1,5 orange 0,5
    Klebsiella pneumoniae (023) 24 h rosa 3 orange 1
    48 h rosa 3,5 gelb-orange 2,5
    Citrobacter koseri (012) 24 h orange 2 orange 1
    48 h rosa 3,5 gelb-orange 2,5
    Enterobacter cloacae (061) 24 h rosa 2 gelb-orange 1,5
    48 h rosa 2 gelb-orange 2
    Staphylococcus aureus (035) 24 h farblos* 0 farblos 0
    48 h farblos* 0 farblos 0
    Streptococcus agalacticae (001) 24 h inhibiert - farblos 0
    48 h inhibiert - farblos 0
    Enterococcus faecalis (117) 24 h inhibiert - gelb-orange 0,5
    48 h inhibiert - gelb-orange 3
    Listeria innocua (036) 24 h farblos* 0 farblos 0
    48 h farblos* 0 farblos 0
    Candida albicans (077) 24 h inhibiert - farblos 0
    48 h inhibiert - farblos 0
    TABELLE 4: Sichtbarmachung der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen durch L-Ala-2-MeOAPA und L-Ala-2,5-diMeOAPA
    • * sehr geringes Wachstum
  • Diese beiden Substrate ermöglichen nach dem Zugeben eines Tropfens HCl die Sichtbarmachung einer L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von grampositiven Bakterien. Der Zusatz von (Methoxy-)-Substituenten an der Phenylgruppe ermöglicht außerdem die Reduktion der Toxizität der Substrate, insbesondere gegenüber grampositiven Bakterien. Dieser Gewinn hinsichtlich der Fertilität geht jedoch auf Kosten der Spezifizität, und in der Tat weist Enterococcus faecalis nach 48 Stunden der Inkubation eine Aktivität mit L-Ala-2,5-diMeOAPA auf.
  • Beispiel 5: Sichtbarmachen der β-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium: Verwendung von β-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridiniumchlorid (quaternisiertes Substrat)
  • 5.1. Verwendetes Molekül
  • Das Sichtbarmachen der β-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung eines Substrats, β-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridiniumchlorid (quaternisiertes Substrat), in Folge als β-Ala-4-AP-10-MA bezeichnet, das die folgende Formel aufweist:
    Figure 00280001
  • β-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridiniumchlorid
  • 5.2. Synthese von β-Ala-4-AP-10-MA
  • Die Ausgangsverbindung ist t-Boc-alanyl-9-(4-aminophenyl)acridin, dessen Synthese bereits im Absatz 1.2.2. (Synthese von L-Ala-APA) beschrieben wurde. Das t-Boc-alanyl-9-(4-aminophenyl)acridin (0,67 g, 1,5 mmol) wird in Acetonitril (Mindestvolumen) gelöst und mit Methyliodid (4,0 ml) unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird der Kolben verschlossen und 100 Stunden lang bei 40°C inkubiert. Das feste Reagenz wird schrittweise gelöst und bildet dabei eine orange Lösung. Orange-schwarze Kristalle treten in dieser Lösung auf.
  • Nach 100 Stunden wird das Reaktionsgemisch unter Rühren in Ethylacetat (100 ml) überführt. Nach einem notwendigen Zeitraum wird das Quaternärsalz filtriert und mit Diethylether gewaschen.
  • Das Produkt wird in einer Mindestmenge an Ethanol gelöst und mit Ethylacetat (10 ml), das mit HCl gesättigt ist, gerührt. Präzipitate, die sich nach einigen Stunden gebildet haben, werden durch Filtration unter vermindertem Druck gewonnen. Das Einführen von Ethylether in das Filtrat ermöglicht die Gewinnung des zusätzlichen Produkts. Die vereinigten Fraktionen des Produkts werden mit Diethylether gewaschen und rasch getrocknet, um die Absorption von Feuchtigkeit zu vermeiden.
  • Die Abspaltung des Schutzes erfolgt auf die oben beschriebene Weise.
  • 5.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das 300 mg/l β-Ala-4-AP-10-MA umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 46,37 g Columbia-Agar werden 1 Liter destilliertem Wasser zugesetzt und anschließend autoklaviert, und dann wird das Substrat durch eine Stammlösung in DMSO eingesetzt. Mikroorganismen, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, wurden in das Medium isoliert in drei Skalenscheiben, ausgehend von einer 0,5-McFarland-Suspension, eingeimpft. Die Schalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 und nach 48 Stunden der Inkubation visuell geprüft. Die Färbung der Kolonien sowie die Intensität der Färbung wurden geprüft.
  • 5.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 aufgeführt.
  • Dieses Substrat ermöglicht die Sichtbarmachung einer β-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von gramnegativen Bakterien durch Spontanauftreten (ohne Säurezusatz) einer konzentrierten orangen Farbe auf der Ebene der Kolonien. Die Kolonien, die keine derartige Aktivität besaßen, bleiben farblos. Dieses Substrat ist somit empfindlich und spezifisch. Es kann die Identifizierung von Stämmen von Pseudomonas aeruginosa und insbesondere deren Unterscheidung von anderen Bakterien ermöglichen.
    STÄMME Inkubationszeit 0,3 g/l β-Ala-4-AP- 10-MA
    Farbe Intensität
    Pseudomonas aeruginosa (052) 24 h orange 2
    48 h orange 3
    Pseudomonas aeruginosa (165) 24 h orange 1,5
    48 h orange 3
    Burkholderia cepacia (004) 24 h farblos -
    48 h farblos -
    Pseudomonas fluorescens (016) 24 h inhibiert -
    48 h farblos -
    Pseudomonas stutzeri (073) 24 h inhibiert -
    48 h farblos -
    Pseudomonas putida (028) 24 h farblos -
    48 h farblos -
    Acinetobacter cal-coaceticus (034) 24 h farblos -
    48 h farblos -
    Escherichia coli (032) 24 h farblos -
    48 h farblos -
    Klebsiella pneumoniae (023) 24 h farblos -
    48 h farblos -
    Tabelle 5: Sichtbarmachung der β-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen durch β-Ala-4-AP-10-MA
  • Beispiel 6: Sichtbarmachen der L-Prolin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels eines nicht quaternisierten Substrats auf Prolinbasis
  • 6.1. Verwendetes Molekül
  • Das Sichtbarmachen der L-Prolin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung eines Substrats, L-Prolyl-9-(4-aminophenyl)acridin (nicht quaternisiertes Substrat), in Folge als L-Pro-4-APA bezeichnet, das die folgende Formel aufweist:
    Figure 00310001
    L-Prolyl-9-(4-aminophenyl)acridin
  • 6.2. Synthese von L-Pro-4-APA
  • Diese Synthese wurde nach einem der beiden oben in Absatz 1.2. beschriebenen Verfahren A und B durchgeführt, wobei die Aminosäure Alanin durch die Aminosäure Prolin ersetzt wurde. Für die Synthese von L-Pro-4-APA wird auf diesen Absatz verwiesen.
  • 6.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das L-Prolyl-9-(4-aminophenyl)acridin (nachstehend als L-Pro-4-APA bezeichnet) umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 45 g Sabouraud-Agar werden 1 Liter destilliertem Wasser zugesetzt und anschließend autoklaviert. Dieses Reaktionsmedium umfaßt 0,3 g/l L-Pro-4-APA, eingesetzt durch eine Stammlösung in DMSO eingesetzt.
  • Mikroorganismen, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, wurden in das Medium isoliert in drei Skalenscheiben, ausgehend von einer 0,5-McFarland-Suspension, eingeimpft. Die Schalen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 Stunden der Inkubation visuell geprüft. Die Färbung der Kolonien wurde vor und nach dem Zugeben eines Tropfens Essigsäure, in Folge als GAA (glacial acetic acid) bezeichnet, geprüft.
  • 6.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 6 aufgeführt.
    STÄMME Tropfen Essigsäure 0,3 g/l L-Pro-4-APA
    Farbe Intensität
    Candida albicans (138) vor GAA gelb 2
    nach GAA gelb 3
    Candida parapsilosis (040) vor GAA weiß -
    nach GAA gelb 2
    Candida lusitaniae (045) vor GAA kein Wachstum -
    nach GAA kein Wachstum -
    Candida guilliermondii (046) vor GAA kein Wachstum -
    nach GAA kein Wachstum -
    Candida krusei (026) vor GAA gelb 1
    nach GAA gelb 3
    Candida glabrata (051) vor GAA gelb 2
    nach GAA gelb 3
  • Tabelle 6: Sichtbarmachung der L-Prolin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen durch L-Pro-4-APA, dessen Konzentration im Substrat optimiert wurde
  • Bei gewissen Stämmen des Hefepilzes Candida zeigt sich die inhibierende Natur des Substrats. Einige Hefepilze erzeugten jedoch eine gelbe Färbung ohne Säurezugabe. Diese Färbung ist bei einigen Stämmen intensiver, insbesondere bei Candida albicans, und sie ist auch intensiver als in Abwesenheit der Kultur. Dies zeigt deutlich, daß das Substrat der Anmelderin, das Prolin als Aminosäure enthält, die Sichtbarmachung der L-Prolin-Aminopeptidaseaktivität bei Hefepilzen ermöglicht.
  • Beispiel 7: Sichtbarmachen der L-Serin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels eines nicht quaternisierten Substrats auf Serinbasis
  • 7.1. Verwendetes Molekül
  • Das Sichtbarmachen der L-Serin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung eines Substrats, L-Seryl-9-(4-aminophenyl)acridin (nicht quaternisiertes Substrat), in Folge als L-Ser-4-APA bezeichnet, das die folgende Formel aufweist:
    Figure 00340001
    L-Seryl-9-(4-aminophenyl)acridin
  • 7.2. Synthese von L-Ser-4-APA
  • Dem Muster des für L-Pro-4-APA folgend (obiger Absatz 6.2.) wurde diese Synthese nach einem der beiden oben in Absatz 1.2. beschriebenen Verfahren A und B durchgeführt, wobei die Aminosäure Alanin durch die Aminosäure Serin ersetzt wurde. Für die Synthese von L-Ser-4-APA wird auf diesen Absatz verwiesen.
  • 7.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das L-Seryl-9-(4-aminophenyl)acridin (nachstehend als L-Ser-4-APA bezeichnet) umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 30 Milligramm L-Ser-4-APA werden 4 g Columbia-Agar zugesetzt, 0,1 Liter destilliertem Wasser zugeführt und anschließend autoklaviert. Dieses Reaktionsmedium wird 20 Minuten lang bei 116°C autoklaviert. Der Großteil des Substrats ist ohne Restfärbung in Lösung.
  • Mikroorganismen, die aus der Sammlung der Anmelderin stammen, wurden in das Medium isoliert in drei Skalenscheiben, ausgehend von einer 0,5-McFarland-Suspension, eingeimpft. Die Schalen wurden 24 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Proben von 10 μl einer jeden Suspension werden anschließend kultiviert, um Kolonien zu erzeugen. Die gebildeten Kolonien wurden nach 18 bis 24 Stunden der Inkubation visuell geprüft.
  • Die Färbung der Kolonien wurde vor und nach dem Zugeben eines Tropfens Essigsäure, in Folge als GAA (glacial acetic acid) bezeichnet, geprüft.
  • 7.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 7 aufgeführt.
    STÄMME Tropfen Essigsäure 0,3 g/l L-Ser-4-APA
    Farbe Intensität
    Escherichia coli (009) vor GAA kremfarben -
    nach GAA blaß orange 2
    Klebsiella pneumoniae (012) vor GAA kremfarben -
    nach GAA blaß orange 2
    Yersinia enterocolitica (061) vor GAA kremfarben -
    nach GAA blaß orange 2
    Candida albicans (138) vor GAA kremfarben -
    nach GAA kremfarben -
    Staphylococcus aureus (008) vor GAA kremfarben -
    nach GAA kremfarben -
    Enterococcus faecalis (117) vor GAA kremfarben -
    nach GAA kremfarben -
    Tabelle 7: Sichtbarmachung der L-Serin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen durch L-Ser-4-APA, dessen Konzentration im Substrat optimiert wurde
  • Auch hier weisen erneut einige Stämme eine partielle Inhibition mit dem Substrat auf Acridinbasis auf. Die drei gramnegativen Stämme, die getestet wurden, erzeugten nach Zusatz von Essigsäure eine besondere Reaktionsfärbung.
  • Beispiel 8: Sichtbarmachen der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels eines quaternisierten Substrate auf der Basis von einem, zwei oder drei L-Alaninen
  • 8.1. Verwendetes Molekül
  • Das Sichtbarmachen der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung von drei Substraten, nämlich L-Ala-4-AP-10-MA, so wie in Beispiel 3 beschrieben, L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA, das ein zusätzliches L-Alanin umfaßt, und L-Ala-L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA, das noch ein weiteres zusätzliches L-Alanin umfaßt.
  • 8.2. Synthese der Substrate
  • Die Substrate wurden so wie unter Punkt 3.2. oben beschrieben hergestellt, ausgehend von der passenden Ausgangsverbindung, die ein, zwei oder drei L-Alanine aufweist.
  • 8.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das diese drei Substrate umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 30 mg eines jeden Substrats werden in 10 ml sterilem, destilliertem Wasser gelöst (Erhitzung). Zehn ml dieser Lösung werden anschließend 90 ml Columbia-Agar zugesetzt und das ganze bei 50°C in Unterkühlung gehalten.
  • Verschiedene Stämme von Mikroorganismen, die aus der NCTC-Sammlung stammen (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK), wurden durch Multipoint-Inokulation in die erhaltenen Medien eingeimpft: für jeden Stamm wird ein 10-μl-Tropfen einer 0,5-McFarland-Suspension auf jedes Kulturmedium aufgebracht.
  • Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 h und nach 48 h Stunden der Inkubation visuell geprüft. Färbung und Wachstum der Kolonien wurden geprüft.
  • 8.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 8 aufgeführt.
    STÄMME (Referenz) L-Ala-4-A P-10-MA L-Ala-L-Ala- MA 4-AP-10- L-Ala-L-Ala-L 10-MA -Ala-4-AP-
    24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
    E. coli O157 (NCTC 12079) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Salmonella typhimurium (NCTC 74) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Salmonella Poona (NCTC 4840) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Shigella sonnei (NCTC 9774) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Klebsiella penumoniae (NCTC 10896) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Enterobacter cloacae (NCTC 11936) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Burkholderia cepacia (NCTC 10743) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Serratia marcescens (NCTC 10211) orange orange orange orange orange orange
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Enterococcus faecalis (NCTC 755) PC PC farblos farblos farblos farblos
    (++) (++) (++) (++)
    Enterococcus faecalis (NCTC 12697) farblos farblos farblos farblos farblos farblos
    (+/–) (+/–) (++) (++) (++) (++)
    STÄMME (Referenz) L-Ala-4-AP-10-MA L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA L-Ala-L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA
    24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h
    Enterococcus faecium (NCTC 7171) farblos farblos farblos farblos farblos farblos
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Listeria monocytogenes (NCTC 11994) farblos farblos farblos farblos farblos farblos
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    Staphylococcus aureus (NCTC 6571) PC PC PC PC farblos farblos
    (++) (++)
    Staphylococcus aureus (NCTC 11939) farblos farblos farblos farblos farblos farblos
    (++) (++) (++) (++) (++) (++)
    • ++ steht für gutes Wachstum, + steht für mäßiges Wachstum, +/– steht für geringes Wachstum und PC steht für kein Wachstum
  • Auf den drei Medien bildeten die Stämme gramnegativer Bakterien orangefarbige Kolonien, während die Stämme grampositiver Bakterien farblose Kolonien bildeten oder sich gar nicht entwickelten. Diese drei Substrate ermöglichen somit die Unterscheidung gramnegativer Bakterien von grampositiven Bakterien, und je nach Medium das Wachstum aller oder eines Teils der getesteten Stämme.
  • Beispiel 9: Sichtbarmachen der Pyroglutamin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels quaternisierter Substrate auf der Basis von Hydrochloridsalz von Pyroglutamyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridin
  • 9.1. Verwendetes Molekül
  • Das Sichtbarmachen der Pyroglutamin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung von Pyroglutamyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridin, in der Folge als PG-4-AP-10-MA bezeichnet.
  • 9.2. Synthese des Substrats
  • Dieses Substrat wurde so wie unter Punkt 3.2. oben beschrieben hergestellt, wobei das L-Alanin durch Pyroglutamin ersetzt wurde.
  • 9.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das dieses Substrat umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 30 mg eines jeden Substrats werden in 10 ml sterilem, destilliertem Wasser gelöst (Erhitzung). Zehn ml dieser Lösung werden anschließend 90 ml Columbia-Agar zugesetzt und das Ganze bei 50°C in Unterkühlung gehalten.
  • Verschiedene Stämme von Mikroorganismen, die aus der NCTC-Sammlung (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK) stammen, wurden durch die im obigen Beispiel 8 beschriebene Multipoint-Inokulation in die erhaltenen Medien eingeimpft.
  • Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 h und nach 48 h Stunden der Inkubation visuell geprüft. Färbung und Wachstum der Kolonien wurden geprüft.
  • 9.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 9 aufgeführt.
    STÄMME (Referenz) PG-4-AP-10-MA
    24 h 48 h
    Escherichia coli (NCTC 14018) farblos (++) farblos (++)
    Escherichia coli O157 (NCTC 12079) farblos (++) farblos (++)
    Salmonella typhimurium (NCTC 74) farblos (++) farblos (++)
    Salmonella Poona (NCTC 4840) farblos (++) farblos (++)
    Shigella sonnei (NCTC 9774) farblos (++) farblos (++)
    Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) farblos (++) orange (++)
    Klebsiella penumoniae (NCTC 10896) farblos (++) blaß orange (++)
    Enterobacter cloacae (NCTC 11936) farblos (++) blaß orange (++)
    Burkholderia cepacia (NCTC 10743) farblos (++) blaß orange (++)
    Serratia marcescens (NCTC 10211) farblos (++) blaß orange (++)
    • ++ steht für gutes Wachstum, + steht für mäßiges Wachstum, +/– steht für geringes Wachstum und PC steht für kein Wachstum
  • Das Medium der Beispiele ermöglicht die Unterscheidung von Bakterien, die eine Pyroglutamyl-Aminopeptidaseaktivität aufweisen, von jenen, die diese nicht exprimieren.
  • Beispiel 10: Sichtbarmachen der Glycin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels eines quaternisierten Substrats auf der Basis von Hydrochloridsalz von Glycyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridin
  • 10.1. Verwendetes Molekül
  • Das Sichtbarmachen der Glycin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung von Glycyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridin, in der Folge als G-4-AP-10-MA bezeichnet.
  • 10.2. Synthese des Substrats
  • Dieses Substrat wurde so wie unter Punkt 3.2. oben beschrieben hergestellt, wobei das L-Alanin durch Glycin ersetzt wurde.
  • 10.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das dieses Substrat umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 30 mg des Substrats werden in 10 ml sterilem, destilliertem Wasser gelöst (Erhitzung). Zehn ml dieser Lösung werden anschließend 90 ml Columbia-Agar zugesetzt und das Ganze bei 50°C in Unterkühlung gehalten.
  • Verschiedene Stämme von Mikroorganismen, die aus der NCTC-Sammlung (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK) stammen, wurden durch die im obigen Beispiel 8 beschriebene Multipoint-Inokulation in die erhaltenen Medien eingeimpft.
  • Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 h und nach 48 h Stunden der Inkubation visuell geprüft. Färbung und Wachstum der Kolonien wurden geprüft.
  • 10.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 10 aufgeführt.
    STÄMME (Referenz) G-4-AP-10-MA
    24 h 48 h
    Escherichia coli (NCTC 14018) PC PC
    Escherichia coli O157 (NCTC 12079) orange (++) orange (++)
    Salmonella typhimurium (NCTC 74) blaß orange (++) blaß orange (++)
    Salmonella poona (NCTC 4840) orange (++) orange (++)
    Shigella sonnei (NCTC 9774) orange (++) orange (++)
    Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) blaß orange (++) orange (++)
    Klebsiella penumoniae (NCTC 10896) orange (++) orange (++)
    Enterobacter cloacae (NCTC 11936) orange (++) orange (++)
    Burkholderia cepacia (NCTC 10743) orange (++) orange (++)
    Serratia marcescens (NCTC 10211) orange (++) orange (++)
    Enterococcus faecalis (NCTC 755) PC PC
    Enterococcus faecalis (NCTC 12697) farblos (+) farblos (+)
    Enterococcus faecium (NCTC 7171) farblos (+) farblos (+)
    Listeria monocytogenes (NCTC 11994) farblos (+) farblos (+)
    Staphylococcus aureus (NCTC 6571) PC PC
    Staphylococcus aureus (NCTC 11939) farblos (+) farblos (+)
    • ++ steht für gutes Wachstum, + steht für mäßiges Wachstum, +/– steht für geringes Wachstum und PC steht für kein Wachstum
  • Das Medium des Beispiels ermöglicht die Unterscheidung von Bakterien, die eine Glycylamyl-Aminopeptidaseaktivität aufweisen, von jenen, die diese nicht exprimieren.
  • Beispiel 11: Sichtbarmachen der t-BOC-L-alanyl-L-alanyl-L-alanyl-Peptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium mittels eines quaternisierten Substrats, bei dem die Aminosäure an einen Blocker gekoppelt ist, wobei das Substrat auf Hydrochloridsalz von t-BOC-L-alanyl-L-alanyl-L-alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridin basiert
  • 11.1. Verwendetes Molekül
  • Das Sichtbarmachen der L-Alanin-Aminopeptidaseaktivität von Mikroorganismen auf Gelmedium erfolgt durch die Verwendung von t-BOC-L-alanyl-L-alanyl-L-alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridin, in der Folge als t-BOC-L-Ala-4-AP-10-MA bezeichnet.
  • 11.2. Synthese des Substrats
  • Dieses Substrat wurde so wie unter Punkt 3.2. oben beschrieben hergestellt, wobei aber keine Abspaltung des Schutzes der Aminoverbindung vorgenommen wurde.
  • 11.3. Herstellung des Mediums
  • Ein Gelmedium, das dieses Substrat umfaßt, wird wie folgt hergestellt: 30 mg des Substrats werden in 10 ml sterilem, destilliertem Wasser gelöst (Erhitzung). Zehn ml dieser Lösung werden anschließend 90 ml Columbia-Agar zugesetzt und das Ganze bei 50°C in Unterkühlung gehalten.
  • Verschiedene Stämme von Mikroorganismen, die aus der NCTC-Sammlung (National Collection of Type Cultures, Colindales, UK) stammen, wurden durch die im obigen Beispiel 8 beschriebene Multipoint-Inokulation in die erhaltenen Medien eingeimpft.
  • Die gebildeten Kolonien wurden nach 24 h und nach 48 h Stunden der Inkubation visuell geprüft. Färbung und Wachstum der Kolonien wurden geprüft.
  • 11.4. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 11 aufgeführt.
    STÄMME (Referenz) t-BOC-L-Ala-Ala-Ala-4-AP-10-MA
    24 h 48 h
    Escherichia coli O157 (NCTC 12079) blaß orange (++) blaß orange (++)
    Salmonella typhimurium (NCTC 74) blaß orange (++) blaß orange (++)
    Salmonella poona (NCTC 4840) blaß orange (++) blaß orange (++)
    Shigella sonnei (NCTC 9774) blaß orange (++) blaß orange (++)
    Pseudomonas aeruginosa (NCTC 10662) blaß orange (++) blaß orange (++)
    Klebsiella penumoniae (NCTC 10896) orange (++) orange (++)
    Enterobacter cloacae (NCTC 11936) orange (++) orange (++)
    Burkholderia cepacia (NCTC 10743) orange (++) orange (++)
    Serratia marcescens (NCTC 10211) orange (++) orange (++)
    Enterococcus faecalis (NCTC 755) PC PC
    Enterococcus faecalis (NCTC 12697) farblos (+/–) farblos (+/–)
    Enterococcus faecium (NCTC 7171) farblos (+/–) farblos (++)
    Listeria monocytogenes (NCTC 11994) farblos (+/–) farblos (+)
    Staphylococcus aureus (NCTC 6571) PC PC
    Staphylococcus aureus (NCTC 11939) farblos (+) farblos (+)
    • ++ steht für gutes Wachstum, + steht für mäßiges Wachstum, +/– steht für geringes Wachstum und PC steht für kein Wachstum
  • Das Medium des Beispiels ermöglicht den Erhalt von vier Gruppen von Mikroorganismen:
    • • jene, die deutlich orangefarbige Kolonien bilden,
    • • jene, die blaß-orangefarbige Kolonien bilden,
    • • jene, die farblose Kolonien bilden,
    • • jene, die keine Kolonien bilden.
  • Unter den getesteten Stämmen gehören die gramnegativen Bakterien zu den ersten zwei Gruppen, während die grampositiven Bakterien zu den letzten zwei Gruppen gehören.
  • Die Gegenwart eines Blockers (t-Boc) ermöglicht die Modulierung der Aktivität in Bezug auf die mit dem ungeschützten Substrat (siehe obiges Beispiel 8) erhaltenen Ergebnisse.
  • Weitere gemachte Untersuchungen
  • Es wurden weitere Substrate getestet, die eine Bestätigung der hier angeführten Ergebnisse gestatten, wobei die folgenden Beispiele angeführt werden können:
    • • L-Alanyl-9-(4-amino-3-methoxyphenyl)-10-methylacridiniumchlorid,
    • • Hydrochlorid von L-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridiniumchlorid,
    • • Hydrochlorid von L-Alanyl-9-(4-amino-2,5-dimethoxyphenyl)-10-methylacridiniumchlorid,
    • • Hydrochlorid von β-Alanyl-9-(4-aminophenyl)-10-methylacridiniumchlorid,
    • • β-Alanyl-9-(4-amino-2-methoxyaminophenyl)acridin,
    • • β-Alanyl-9-(4-amino-2,5-dimethoxyaminophenyl)acridin,
    • • Hydrochlorid von β-Alanyl-9-(4-amino-3-methoxyphenyl)-10-methylacridiniumchlorid,
    • • Hydrochlorid von β-Alanyl-9-(4-amino-2,5-dimethoxyphenyl)-10-methylacridiniumchlorid.
  • Außerdem wurden auch andere Spezies von Mikroorganismen, im Allgemeinen Bakterien, getestet, wie etwa die folgenden:
    • • Salmonella typhimurium
    • • Staphylococcus epidermidis
    • • Serratia marcescens.

Claims (12)

  1. Chromogene Enzymsubstrate zum Nachweis einer Aminopeptidaseaktivität bei Mikroorganismen und zum Definieren der Zugehörigkeit mindestens einer Bakterie zur Gruppe der Grampositiven oder der Gramnegativen entsprechend ihrer Färbung, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Formel (I) haben:
    Figure 00470001
    in der: – R1 nichts oder eine Alkyl-, Allyl-, Arylgruppe ist, – R2 aus mindestens einer Aminosäure, vorzugsweise Alanin, aufgebaut ist, – R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander aus H- oder -O-Alkyl, vorzugsweise -O-CH3, aufgebaut sind, – R7 aus H, O-CH3, Alkyl oder Halogen aufgebaut ist, – R8 aus H oder Cl aufgebaut ist, und n eine ganze Zahl ist, die 0 oder 1 entspricht.
  2. Substrate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Formel (Ia) haben:
    Figure 00470002
    oder daß sie die folgende Formel (Ib) haben:
    Figure 00480001
  3. Substrate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 eine Methyl- oder Allylgruppe ist.
  4. Substrate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende Formel (Ic) haben:
    Figure 00480002
    oder daß sie die folgende Formel (Id) haben:
    Figure 00480003
  5. Substrate nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß R2 oder das L-Alanin an einen Blocker gekuppelt ist.
  6. Kulturmedium, mit mindestens ein chromogenes Enzymsubstrat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, allein oder in Kombination mit mindestens einem weiteren Enzymsubstrat, das für eine Enzymaktivität spezifisch ist, die von jener, die durch das erfindungsgemäße Substrat nachgewiesen wird, verschieden ist.
  7. Medium nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem Gelmedium gebildet ist.
  8. Verwendung chromogener Enzymsubstrate wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert oder eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 6 oder 7 zum Nachweis mindestens einer Aminopeptidaseaktivität bei Mikroorganismen.
  9. Verwendung chromogener Enzymsubstrate wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert oder eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 6 oder 7, um die Bakterien mit positiver Gramfärbung von den Bakterien mit negativer Gramfärbung zu unterscheiden.
  10. Verfahren zum Nachweis mindestens einer Aminopeptidaseaktivität bei Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt: – Bereitstellen eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 6 oder 7, – Beimpfen des Mediums mit einer zu testenden biologischen Probe, – Inkubierenlassen, und – Sichtbarmachen des Vorhandenseins mindestens einer Aminopeptidaseaktivität, allein oder in Kombination mit mindestens einer weiteren Enzymaktivität, die von einer Aminopeptidaseaktivität verschieden ist.
  11. Verfahren zum Differenzieren von Bakterien nach ihrer Zugehörigkeit zu Keimen vom grampositiven Typ oder zu Keimen vom gramnegativen Typ, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt: – Bereitstellen eines Kulturmediums nach einem der Ansprüche 6 oder 7, – Beimpfen des Mediums mit einer zu testenden biologischen Probe, – Inkubierenlassen, und – Sichtbarmachen des Vorhandenseins mindestens einer Färbung, die gleichbedeutend mit dem Vorhandensein von einem Keim bzw. von Keimen vom gramnegativen Typ ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß dann, wenn der Stickstoff an der 10er-Position der Acridingruppe nicht quaternisiert ist, das Sichtbarmachen des Vorhandenseins mindestens einer Aminopeptidaseaktivität durch Zugabe von Säure, vorzugsweise Salzsäure, Essigsäure oder Citronensäure, zu der Kultur erreicht wird.
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