BRPI0407072B1 - Substratos enzimáticos, meios de cultura contendo os mesmos e aplicação dos mesmos de modo a detectar atividade de aminopeptidase e/ou diferenciar bactérias gram-positivas de bactérias gram-negativas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUBSTRA- TOS ENZIMÁTICOS, MEIOS DE CULTURA CONTENDO OS MESMOS E

APLICAÇÃO DOS MESMOS DE MODO A DETECTAR ATIVIDADE DE

AMINOPEPTIDASE E/OU DIFERENCIAR BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS DE BACTÉRIAS GRAM-NEGATIVAS". A presente invenção refere-se a substratos enzimáticos cromo- gênicos para detectar atividade de aminopeptidase. Os substratos podem ser usados em aplicações compreendendo uma etapa de hidrólise enzimáti- ca que produz um sinal psicoquímico, em particular em microbiologia, bio- química, imunologia, biologia molecular, histologia, e etc. A invenção tam- bém refere-se a meios de cultura contendo os substratos referidos, à aplica- ção dos substratos ou dos meios para detectar atividades de aminopeptida- se e/ou diferenciar bactérias Gram-positivas de bactérias Gram-negativas e a métodos de aplicação.

Comparados com os substratos existentes, a maioria dos quais são fluorogênicos, estes novos substratos podem ser usados em particular em meios gelificados para detectar microorganismos uma vez que produzem uma coloração que não se difunde no meio de reação e portanto é concen- trada nas colônias.

Substratos enzimáticos cromogênicos para detectar atividade de aminopeptidase que não se difundem são descritos e já são conhecidos no estado da técnica. Deste modo, os substratos referidos são cobertos pelos requerimentos de patentes mundiais WO-A-98/04735 e WO-A-99/38995 ar- quivados pela requerente. Não obstante, estes substratos têm várias des- vantagens: eles são difíceis de sintetizar, a pureza é baixa e os rendimentos são baixos. Além disso, para aplicação em meios de cultura, é necessário definir uma composição de meio muito precisa de modo a observar uma cor.

Nenhum dos outros substratos atualmente descritos pode ser usado em meios sólidos para detectar microorganismos em culturas mistas.

Além disso, são conhecidas moléculas à base de acridina. Elas são usadas para: • suas propriedades corantes, veja, por exemplo, S. Rapposch et al., J. Dairy Sei. 2000 Dec; 83 (12): 2753-2758, ou ainda, por exemplo, A.

Giorgio et al., Microbiologica 1989 Jan; 12 (1): 97-100, • suas propriedades quimioterápicas, por exemplo, N. Costes et al., J. Med. Chem. 2000 Jun 15; 43 (12): 2395-2402, ou • realizar intercalações no DNA, por exemplo, O. Okwumabua et al., Res. Microbiol. 1992 Feb; 143 (2): 183-189, ou ainda, por exemplo, T.

Schelhorn et al., Cell. Mol. Biol. 1992 Jul; 38 (4): 345-365. A Patente EP-B-0.270.946 propõe substratos enzimáticos cro- mogênicos à base de acridinona, a qual é um derivado de acridina. O radi- cal, o qual pode ser clivado por uma enzima, está presente na posição 7 do grupamento acridina. Sua estrutura torna possível visualizar somente as se- guintes atividades enzimáticas: esterases e glicosidases.

De acordo com a presente invenção, são propostos novos substratos enzimáticos cromogênicos para detectar atividade de amino- peptidase em microorganismos ou para determinar se no mínimo uma bac- téria pertence ao grupo Gram-positivo ou ao grupo Gram-negativo de acordo com a cor da mesma. A invenção também refere-se a meios de cultura contendo os substratos referidos, à aplicação dos substratos ou dos meios para detectar atividades de aminopeptidase e/ou diferenciar bactérias Gram- positivas em relação a bactérias Gram-negativas, e aos métodos de aplica- ção.

Para este efeito, a presente invenção refere-se a substratos en- zimáticos cromogênicos para detectar atividade de aminopeptidase em mi- croorganismos ou para determinar se no mínimo uma bactéria pertence ao grupo Gram-positivo ou ao grupo Gram-negativo de acordo com a cor da mesma. Eles têm a fórmula (I) abaixo: na qual: • R, é nada ou um grupo alquila, alila ou arila, • R2 consiste em no mínimo um aminoácido, preferencialmente alanina, • R3, R4, R5 e R6 consistem, de modo independente um do outro, em H- ou -O-aiquila, preferencialmente -0-CH3, • R7 consiste em H, 0-CH3, alquila ou halogênio, • Rs consiste em H ou Cl, e • n é um número inteiro correspondente a 0 ou 1.

De acordo com a invenção, o termo "arila" em particular preten- de indicar um anel aromático C6-C10, em particular fenila, benzila, 1-naftila ou 2-naftila. O termo "alquila" pretende indicar um CrC6 alquila, isto é, uma alquila reta ou ramificada tendo de 1 a 6 átomos de carbono. A título de exemplo, pode ser feita menção de metila, etila, propila, isopropila, butila, t- butila, pentila, isopentila e hexila. O termo "átomo de halogênio" pretende indicar cloro, bromo, iodo ou flúor.

Os aminoácidos usados na invenção são qualquer aminoácido conhecido por aqueles versados na técnica. A expressão "no mínimo um aminoácido" pretende indicar um ou mais aminoácidos.

De acordo com uma modalidade da invenção, R2 representa um aminoácido ou um peptídeo tendo no máximo 10 aminoácidos no qual os aminoácidos são idênticos ou diferentes. Preferencialmente, por razões de custo do substrato, A representa um aminoácido ou um peptídeo tendo no máximo 4 aminoácidos no qual os aminoácidos são idênticos ou diferentes, preferencialmente idênticos. O(s) aminoácido(s) R2 pode(m) ser ligado(s) a um agente de bloqueio, o qual constitui outra modalidade da invenção.

Estes agentes de bloqueio compreendem qualquer agente de bloqueio conhecido por aqueles versados na técnica que seja capaz de proteger aminas. A título de exemplo, pode ser feita menção de t- butoxicarbonila (N-tBOC), 9-fluorenilóxi-carbonila, um agente solubilizante tal como succinila, ou ainda um aminoácido não metabolizável, isto é, não natural, tal como ácido pipecólico.

De acordo com uma modalidade, o substrato tem a fórmula (Ia) abaixo: ou tem a fórmula (Ib) abaixo: De acordo com outra modalidade, o substrato corresponde à fórmula (I) acima na qual R, é um grupo metila ou alila.

De acordo com ainda outra modalidade, o substrato correspon- de à fórmula (I) acima na qual Ré um grupo alquila, preferencialmente me- tila, ou um grupamento alila, R2 é no mínimo um aminoácido, opcionalmente bloqueado com um agente de bloqueio, preferencialmente no mínimo uma alanina, R3, R4, Rs, R6, R7 e Rs são H, e n é 0 ou 1.

De acordo com ainda outra modalidade, o substrato tem a fór- mula (Ic) abaixo: ou tem a fórmula (Id) abaixo: Os compostos da invenção podem ser preparados de acordo com o valor de n, como se segue: (1) Quando n = 0, apropriado cloridrato de acridina (R8 é H ou Cl) é reagido com anilina apropriada (R3, R4, R5 e R0 sendo conforme defini- do acima) e enxofre, de modo a obter a 9-(4-aminofenil)acridina apropriada. A última é em seguida reagida com no mínimo um aminoácido acoplado a um agente de bloqueio e o composto obtido é opcionalmente desprotegido de modo a separar o agente de bloqueio do composto da invenção. Quando se deseja obter um composto para o qual o nitrogênio na posição 10 e qua- ternizado, o composto obtido é reagido com um XR, no qual X é um haloge- nlo e ^ é conforme definido acima, e (2) Quando n = 1, 9-metilacridina, preparada de acordo com o método de Campbell et al. (1958, acima), ou 9-cloroacridina, preparada de acordo com o método de Lehmstedt e Schrader (Albert, 1966, acima), é re- agida com nitrobenzaldeído apropriado (R3, R4, R5 e Resendo conforme de- finido acima) e cloreto de zinco de modo a preparar 9-(4-mtroestiril)acridina apropriada. O grupo nitro é em seguida reduzido ou com cloreto de esta- nho(ll) em uma mistura de acetato de etila e etanol, ou com boroidrato de sódio e acetilacetonato de cobre, de modo a obter 9-(4-aminoestiril)acridina. A última é em seguida reagida com no mínimo um aminoácido acoplado a um agente de bloqueio e o composto obtido é opcionaimente desprotegido de modo a separar o agente de bloqueio do composto da invenção. Quando se deseja obter um composto para o qual o nitrogênio na posição 10 e qua- ternizado, o composto obtido é reagido com XR, no qual X é um halogênio e r, é conforme definido acima. A invenção também refere-se a um meio de cultura usando no mínimo um substrato enzimático cromogênico conforme definido acima, so- zinho ou em combinação com no mínimo um outro substrato enzimático es- pecífico para atividade de uma enzima que é diferente da atividade de uma enzima detectada pelo substrato de acordo com a invenção.

Em consequência, quando microorganismos expressando ativi- dade de peptidase são semeados em um meio de reação contendo os com- postos da invenção, ocorre uma coloração que não se difunde para o meio de reação, e é portanto concentrada nas colônias. A expressão "meio de reação de acordo com a invenção pre- tende significar um meio que permite o desenvolvimento de no mínimo a atividade de uma enzima de no mínimo um microorganismo.

Este meio de reação pode ou ser usado somente como um meio de visualização, ou como um meio de cultura e meio de visualização. No primeiro caso, a cultura dos microorganismos é realizada antes da semea- dura e, no segundo caso, o meio de reação também constitui o meio de cultura.

O meio de reação pode ser sóiido, semi-sólido ou líquido. O termo "meio sólido" pretende significar, por exemplo, um meio gelificado.

Preferencialmente, este meio consiste em um meio gelificado. Ágar é o agente de gelificação convencional em microbiologia para cultura de microorganismos, porém é possível usar gelatina ou agaro- se. Várias preparações certas estão disponíveis comercialmente, por exem- plo ágar Columbia, ágar de soja Trypcase, ágar MacConkey, ágar Sabou- raud ou, de modo mais geral, as descritas no Handbook of Microbiological Media (CRC Press). A quantidade de ágar no meio de reação é de 2 a 40 g/l, e prefe- rencialmente de 9 a 25 g/l.

Os substratos enzimáticos da invenção podem ser usados den- tro de uma ampla faixa de pH, em particular entre pH 5,5 e 10. A concentração de substrato enzimático da invenção no meio de reação é entre 0,025 e 1,0 g/l, e é vantajosamente de 0,3 g/l. Especifica- mente, nesta concentração de substrato, é obtido um melhor contraste de cor. O meio de reação pode compreender no mínimo um outro subs- trato específico para atividade de uma enzima diferente da detectada pelo substrato de acordo com a invenção. A hidrólise enzimática do(s) outro(s) substrato(s) produz um sinal detectável que é diferente do sinal detectado pelo substrato da invenção, por exemplo produtos fluorescentes ou de cor diferente, de modo a permitir a demonstração, tal como a detecção e/ou a identificação e/ou a quantificação, de um ou mais microorganismos.

Como outro substrato específico, aplicação pode ser feita de qualquer outro substrato usado convencionalmente na detecção de microor- ganismos. A concentração do outro substrato enzimático específico é ge- ralmente entre 0,01 e 2 g/l. os versados na técnica serão capazes de pron.- tamente determinar uma concentração semelhante de acordo com o subs- trato usado. O meio de reação também pode compreender um ou mais ele- mentos em combinação, tais como aminoácidos, peptonas, carboidratos, nucleotídeos, minerais, vitaminas, antibióticos, tensoativos, tampões, sais de fosfato, sais de amônio, sais de sódio ou sais de metais. Exemplos de meios são descritos nos pedidos de patente das requerentes Nos. EP 656 421 e WO 99/09207.

Os substratos enzimáticos e meios de reação da invenção são portanto úteis no diagnóstico de microorganismos com atividade de peptida- se.

Deste modo, a presente invenção também refere-se à aplicação dos substratos enzimáticos cromogênicos conforme definido acima, ou de um meio de cultura também descrito acima, para detectar no mínimo a ativi- dade de uma aminopeptidase em microorganismos.

Um objeto da presente invenção é ainda a aplicação dos subs- tratos enzimáticos cromogênicos conforme descrito acima, ou de um meio de cultura também descrito acima, para separar bactérias com coloração Gram-positiva de bactérias com coloração Gram-negativa.

Finalmente, a invenção refere-se a um método para detectar no mínimo a atividade de uma aminopeptidase em microorganismos, este mé- todo consistindo em: • proporcionar um meio de cultura conforme definido acima, • semear o meio com uma amostra biológica a ser testada, • deixar a mesma para incubar, e • visualizar a presença de no mínimo a atividade de uma amino- peptidase, sozinha ou em combinação com no mínimo a atividade de uma outra enzima diferente. A invenção também refere-se a outro método para diferenciar bactérias em termos de se elas pertencem a microorganismos do tipo Gram- positivo ou a microorganismos do tipo Gram-negativo, este método consis- tindo em: • proporcionar um meio de cultura conforme definido acima, • semear o meio com uma amostra biológica a ser testada, • deixar a mesma para incubar, e • visualizar a presença de no mínimo uma cor sinônima com a presença de um microorganismo ou microorganismos do tipo Gram- negativo.

Qualquer que seja o método usado, quando o nitrogênio na po- sição 10 do grupo acridina não é quaternizado, a presença de no mínimo a atividade de uma aminopeptidase é visualizada adicionando ácido, prefe- rencialmente ácido clorídrico, ácido acético ou ácido cítrico, à cultura. O ter- mo "quaternizado" deve ser entendido como significando que o nitrogênio na posição 10 do grupo acridina é tetravalente, isto é, é encadeado através de três ligações convencionais com o anel fenila e uma ligação suplementar com um radical, de tal modo que o átomo de nitrogênio referido carrega uma carga positiva e portanto é catiônico. Neste caso, a molécula está sob a forma de um sal, por exemplo um sal de cloreto, brometo ou trifluoroacetato.

Todas as reações, as quais serão descritas abaixo nos exem- plos, foram monitoradas por meio de cromatografia de camada fina (TLC) e as estruturas dos produtos foram confirmadas por espectrometria de massa (MS) e ressonância magnética nuclear (RMN).

Exemplo 1: Visualização da atividade de L-alanina-aminopeotidase de mi- croorganismos sobre meio qelificado usando substratos não quaternizados: 1,1: Moléculas usadas: Foi realizado um estudo comparativo de dois substratos à base de acridina, estes substratos sendo L-alanil-9-(4-aminoestiril)acridina, nas partes que se seguem referidos como L-Ala-4-ASA, e L-alanil- aminofenilacridina (substratos não quaternizados), nas partes que se se- guem referidos como L-Ala-APA, tendo as fórmulas respectivas: 1.2: Síntese de substratos: I. 2.1: Síntese de L-Ala-4-ASA: Esta síntese é realizada em várias etapas.

Preparação de 9-cloroacridina: A preparação é realizada usando o método de Lehmstedt e Schrader, o qual foi referido por Albert neste livro "The Acridines", Arnold, second edition, (1966), pg. 33.

Preparação de 9-metilacridina Foi usado o método de Campbell, Franklin, Morgan e Tivey (ref. J. Chem. Soc., 1958,1145). Os rendimentos atingiram 90%.

Preparação de 9-(4-nitroestiril)acridina por meio de fusão Uma mistura de 9-metilacridina (4,83 g, 25,0 mmoles), 4-nitro- benzaldeído (4,23 g, 31,25 mmoles) e cloreto de zinco (5,06 g, 31,25 mmo- les) é aquecida a 130°C durante 3 horas com um banho de óleo. O sólido recuperado é aquecido em uma solução de metabissulfito de sódio de modo a eliminar o excesso de aldeído e a mistura a quente é filtrada. Os precipita- dos obtidos são dissolvidos em uma quantidade mínima de tetraidrofurano e água é adicionada à solução de modo a obter o produto sob a forma de pre- cipitados. Estes precipitados são recuperados por meio de filtração e secos. O produto pode ser recristalizado a partir de etanoi. O rendimento é de 35%.

Preparação de 9-(4-aminoestiril)acridina O produto 9-(4-nitroestiril)acridina (2,86 g, 10,0 mmoles) é dis- solvido em acetato de etila (250 ml) e em seguida trazido até o refluxo. Uma solução de deidrato de cloreto de estanho(ll) (9,0 g, 40 mmoles) em etanol a quente (150 ml) é resfriado e adicionado à solução de 9-(4- nitroestiril)acridina. A mistura é reagida sobre refluxo e com agitação durante 5 horas. Depois de esfriar, a 9-(4-aminoestíril)acridina precipitada e é isolada por meio de filtração sob vácuo. O filtrado é seco por evaporação e absorvi- do em água (500 ml) com agitação. A solução é basificada (pH 13-14) com uma solução de hidróxido de sódio. A fração de 9-(4-aminoestiril)acridina previamente isolada, a qual contém uma elevada proporção de sal de esta- nho, também é basificada. A 9-(4-aminoestiril)acridina é separada por filtra- ção, lavada com água e seca. É suficientemente pura para a etapa seguinte.

Preparação de t-Boc-alanil-9-(4-aminoestiril)acridina O produto t-Boc-alanina (3,79 g, 20,0 mmoles) é dissolvido em uma quantidade mínima de tetraidrofurano anidro (THF) e a solução é resfri- ada até -15°C por meio de uma mistura de etileno glicol/gelo seco em um banho. N-metilmorfolina (NMM) (2,02 g, 20 mmoles) é adicionada gota a gota à mistura. Cloroformato de isobutila (IBCF) (2,53 g, 20,0 mmoles) é em seguida introduzida gota a gota na mistura da reação. A temperatura deve estar abaixo de -10°C. Depois de aproximadamente 3 minutos, a 9-(4- aminoestiril)acridina (5,4 g, 20 mmoles), a qual é dissolvida em uma mínima quantidade de tetraidrofurano anidro (THF) e resfriada até -15°C, é introdu- zida. A mistura da reação é agitada e deixada para voltar à temperatura am- biente. O sal de N-metila-morfolina é eliminado por filtração com um funil contendo uma placa de filtro. A mistura é evaporada até um quarto de seu volume original com um evaporador giratório. O filtrado é introduzido gota a gota em uma mistura de água/gelo em grande quantidade, com agitação.

Precipitados amarelos, os quais se formam, são recuperados por filtração, lavados com água e secos. O produto pode ser recristalizado a partir de metanol. O rendimento é de essencialmente 75%.

Outros análogos de aminoácidos t-Boc-protegidos também fo- ram usados para formar novos produtos. Os aminoácidos são: prolina, glici- na, serina e β-alanina. Os rendimentos para estes produtos estão na região de 60 a 80%, os melhores resultados sendo geralmente para os análogos de β-alanina e os piores resultados sendo geralmente para os análogos de serina. 1.2,2: Síntese de L-Ala-APA: A preparação de 9-(4-aminofeni!)acridina por meio de reação de enxofre fundido pode ser realizada por meio de dois métodos diferentes.

Método A O cloridrato de acridina {9,7 g, 45,0 mmoles), a anilina (8,37 g, 90,0 mmoles) e 10,0 g de enxofre são bem-misturados e aquecidos a 130°C durante 4 horas sob uma coifa eficiente. O meio de reação no frasco de fun- do redondo é resfriado até a temperatura ambiente e dissolvido em metanol a quente de modo a proporcionar uma solução de cor vermelho sangue, A solução é resfriada e o enxofre é eliminado por meio de filtração. O filtrado é basificado usando uma solução de amônia aquosa concentrada. Precipita- dos amarelo-claros, que se formam, são filtrados e em seguida lavados com metanol a frio. O rendimento é de 65%, Método B A acridina (8,06 g, 45,0 mmoles), o cloridrato de anilina (11,61 g, 90 mmoles) e 10,0 g de enxofre são bem-misturados e aquecidos a 130°C

durante 4 horas. O meio de reação é em seguida tratado como no método A acima. Em seguida é realizada uma preparação com base em um e/ou no outro dos dois métodos acima.

Preparação de t-Boc-alanil-9-(4-aminofenil)acridina O produto t-Boc-alanina (3,79 g, 20,0 mmoles) é dissolvido em uma mínima quantidade de tetraidrofurano anidro (THF) e a solução é resfri- ada até -15°C por meio de uma mistura de etileno glicol/gelo seco em um banho. N-metilmorfolina (NMM) (2,02 g, 20 mmoles) é adicionada gota a gota à mistura. Cloroformato de isobutila (IBCF) (2,53 g, 20,0 mmoles) é em seguida introduzido gota a gota na mistura da reação. A temperatura deve estar abaixo de -10°C. Depois de aproximadamente 3 minutos, é introduzida a 9-(4-aminofenil)acridina (5,4 g, 20 mmoles), a qual é dissolvida em uma mínima quantidade de tetraidrofurano anidro (THF) e resfriada até -15°C. A mistura da reação é agitada e deixada para retomar à temperatura ambien- te. 0 sal de N-metila-morfolina é eliminado por meio de filtração com um fu- nil contendo uma placa de filtro. A mistura é evaporada até um quarto de seu volume original com um evaporador giratório. O filtrado é introduzido gota a gota em uma mistura de água/gelo em grande quantidade, com agi- tação. Precipitados amarelos, que se formam, são recuperados por meio de filtração, lavados com água e secos. O produto pode ser recristalizado a partir de metanol. O rendimento é de 75%.

Outros análogos de aminoácidos t-Boc-protegidos também fo- ram usados para formar novos produtos. Os aminoácidos são: prolina, glici- na, serina e β-alanina. Os rendimentos para estes produtos estão na região de 60 a 80%, os melhores resultados sendo geralmente para os análogos de β-alanina e os piores resultados sendo geralmente para os análogos de serina. 1.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo L-alanil-9-(4-amino-estiril)- acridina (nas partes que se seguem referido como L-Ala-4-ASA) ou L-alanil- aminofenilacridina (nas partes que se seguem referido como L-Ala-APA) é preparado como se segue: 46,37 g de ágar Columbia são adicionados a 1 litro de água destilada e em seguida autoclavado. Este meio de reação é separado em dois meios de volume equivalente. Cada um destes meios compreende, respectivamente: 0,3 g/l de L-Ala-4-ASA proporcionado por meio da solução de matéria-prima em DMSO, e 0,3 g/l de L-Ala-APA tam- bém proporcionado por meio de uma solução de matéria-prima em DMSO.

Microorganismos derivados da coleção da requerente foram semeados sobre cada um dos meios, por delimitação como três quadrantes, usando uma suspensão a 0,5 McFarland. As placas foram incubadas a 37°C durante 24 horas. As colônias formadas foram examinadas visualmente de- pois de incubação durante 24 horas. A cor destas colônias foi anotada antes e depois da adição de uma gota de ácido clorídrico. 1.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 1 abaixo. Na ausência de HCI, os dois substratos não dão coloração espontânea. Na presença de uma gota de HCI, as colônias que possuem a atividade de L-alanina- aminopeptidase são de cor cinza-malva a malva. As colônias que não pos- suem esta atividade permanecem incolores. Estes substratos são portanto sensíveis e específicos. Estes substratos podem, no caso de uma cultura mista Gram-positiva e Gram-negativa, tornar possível separar os dois tipos de microorganismos.

Tabela 1: Visualização da atividade de L-alanina-aminopeotidase de micro- organismos por meio de L-Ala-4-ASA ou L-Ala-APA sobre meio gelificado Exemplo 2: Visualização da atividade de L-aíanina-aminopeotidase de mi- croorganismos sobre meio qelificado usando um substrato quaternizado: 2.1: Molécula usada: A atividade de L-alanina-aminopeptidase de microorganismos sobre meio gelificado é determinada usando cloreto de L-alanil-9-(4- aminofenil)-10-alilacridínio (substrato quaternizado), nas partes que se se- guem denotado L-Ala-4-AP-10-AA, de fórmula: Cloreto de L-alanil-9-f4-aminofenin-10-alilacridín_jo 2.2: Síntese de L-Ala-4-AP-10-AA: O composto de partida é t-Boc-alanil-9-(4-amino-fenila)acridina, cuja síntese já foi descrita no parágrafo 1.2.2 (Síntese de L-Ala-APA). A t- Boc-alanil-9-(4-aminofenil)acridina (0,88 g, 2,0 mmoles) é adicionada a te- traidrofurano anidro (4,0 mi), em um frasco de 10 ml que pode ser fechado, e a mistura é aquecida até a ebulição de modo a ter uma solução parcial. A

solução/suspensão é resfriada e brometo de alila (2,0 ml) é adicionado. O frasco é em seguida submetido a refluxo durante 8 horas, e a reação é re- gularmente monitorada por cromatografia de camada fina (TLC). Depois de esfriar e eliminar o solvente, o sal quaternário é lavado com éter dietílico e seco. O produto é dissolvido em uma mínima quantidade de etanol e agitado com acetato de etila (10 ml) saturado com HCI. Precipitados, que se formam umas poucas horas depois, são recuperados por filtração sob pres- são reduzida. A introdução de éter etílico no filtrado torna possível recuperar o produto adicional. As frações combinadas do produto são lavadas com éter etílico e secas rapidamente de modo a evitar absorção de umidade. 2.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo L-Ala-4-AP-10-AA como substrato é preparado como se segue: 46,37 g de ágar Columbia são adici- onados a 1 litro de água destilada e em seguida autoclavados. O meio de reação é separado em três meios de volume equivalente. Cada um destes meios compreende, respectivamente, 0,1 g/l, 0,2 g/l, 0,4 g/l de L-Ala-4-AP- 10-AA proporcionados por meio de uma solução de matéria-prima em DMSO.

Microorganismos derivados da coleção da requerente foram semeados sobre cada um dos meios, por delimitação como três quadrantes usando uma suspensão a 0,5 McFarland. As placas foram incubadas a 37°C durante 48 horas. As colônias formadas foram examinadas visualmente de- pois de incubação durante 24 e 48 horas. Foram anotadas a cor destas co- lônias e também a intensidade desta cor. 2.4: Resultados: Os resultados são expressos como intensidade da cor, usando uma faixa de escala arbitrária de a partir de 0 até 4 como uma base. Estes resultados são dados na tabela 2 abaixo.

Este substrato torna possível visualizar a atividade de L-alanina- aminopeptidase em bactérias Gram-negativas através do aparecimento es- pontâneo (sem a adição de ácido) de uma cor concentrada nas colônias. As colônias que não possuem esta atividade permanecem incolores. Este substrato é portanto sensível e específico. Pode tornar possível, no caso de uma cultura mista Gram-positiva e Gram-negativa, separar os dois tipos de microorganismos. A "quaternização1' do nitrogênio na posição 10 do grupo acridina torna possível obter uma reação espontânea sem a adição de áci- do, comparada com a mesma molécula não quaternizada descrita no exem- plo 1.

Tabela 2: Influência da concentração de substrato na visualização da ativi- dade de L-alanina-aminopeptidase dos microorganismos por meio da referi- da como L-Ala-4-AP-10-AA

Exemplo 3: Visualização da atividade de L-alanina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio qelificado usando outro substrato quaternizado: 3.1: Molécula usada: A visualização da atividade de L-alanina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio geiificado é realizada usando um substrato de- nominado cloreto de L-alanil-9-(4-amino-fenila)-10-metilacridínio (substrato quaternizado), nas partes que se seguem denominado L-Ala-4-AP-10-MA, cuja fórmula é como abaixo: Cloreto de L-aianil-9-(4-aminofenil)-10-metilacridínio 3.2: Síntese de L-Ala-4-AP-10-MA: Esta síntese já foi realizada no parágrafo 2.2 acima, e na síntese referida, o alilbrometo foi substituído por iodeto de metila. Deve ser referên- cia portanto para a síntese de L-Ala-4-AP-10-MA. 3.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo 300 mg/l de L-Ala-4-AP-10~ MA é preparado como se segue: 46,37 g de ágar Columbia são adicionados a 1 litro de água destilada e em seguida autoclavados, e o substrato é em seguida introduzido por meio de uma solução de matéria-prima em DMSO.

Microorganismos derivados da coleção da requerente foram semeados so- bre o meio, por delimitação como três quadrantes, usando uma suspensão a 0,5 McFarland. As placas foram incubadas a 37°C durante 48 horas. As co- lônias formadas foram examinadas visualmente depois de incubação du- rante 24 e 48 horas. Foram anotadas a cor destas colônias e também a in- tensidade desta cor. 3.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 3 abaixo: Tabela 3: Visualização da atividade de L-alanina-aminopeptidase de micro; oroanismos por meio de L-Ala-4-AP-10-AA para a qual a concentração de substrato é otimizada Este substrato torna possível visualizar uma atividade de L- alanina-aminopeptidase em bactérias Gram-negativas por meio do apareci- mento espontâneo {sem a adição de ácido) de uma cor rosa alaranjada con- centrada nas colônias. As colônias que não têm esta atividade permanecem incolores. Este substrato é portanto sensível e específico. Este torna possí- vel, no caso de uma cultura mista Gram +/Gram separar os dois tipos de microorganismos. Comparado com o substrato descrito no exemplo 2, pare- ce tornar possível obter maiores intensidades de cor para as cepas positi- vas. A diferença entre estes dois substratos é o tipo de grupo na posição 10 no nitrogênio do anel de acridina.

Exemplo 4: Visualização da atividade de L-alanina-aminooeptidase de mi- croorganismos sobre meio qelificado usando outros substratos não quater- nizados: 4.1: Moléculas usadas: A visualização da atividade de L-alanina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio gelificado é realizada usando dois substratos de- nominados L-alanil-2-metóxi-aminofenilacridina, nas partes que se seguem denominado L-Ala-2-MeOAPA, e L-alanil-2,5-dimetoxiaminofenilacridina, nas partes que se seguem denominado L-Ala-2,5-diMeOAPA, cujas fórmulas são respectívamente como se segue: L-Alanil-2-metoxiamino-fenilacridina L-Alani 1 -2,5-dimetoxiamíno-fenilacridina 4.2: Síntese de substratos: 4.2.1: Síntese de L-Ala-2-MeOAPA: Com base no que é descrito no ponto 1.2.2 acima, outros análo- gos de anilina também são usados para formar novos produtos, inclusive anisidina (3-metoxianilina), a qual dá 9-(4-amino-2-metoxifenil)acridina. 4.2.2: Síntese de L-Ala-2,5-diMeOAPA: Com base no que é descrito no ponto 1.2.2 acima, outros análo- gos de anilina também são usados para formar novos produtos, inclusive 2.5- dimetoxianilina, a qual dá 9-(4-amino-2,5-dimetoxifenil)acridina. 4.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo L-Ala-2-MeOAPA ou L-Ala- 2.5- diMeOAPA é preparado como se segue: 46,37 g de ágar Columbia são adicionados a 1 litro de água destilada e em seguida autoclavados. Este meio de reação é separado em dois meios de volume equivalente. Cada um destes meios compreende, respectivamente: 0,3 g/l de L-Ala-2-MeOAPA, introduzido por meio de uma solução de matéria-prima em DMSO, e 0,3 g/l de L-Ala-2,5-diMeOAPA, também introduzido por meio de uma solução de matéria-prima em DMSO. Microorganismos derivados da coleção da reque- rente foram semeados sobre cada um dos meios, por delimitação como três quadrantes, usando uma suspensão a 0,5 McFarland. As placas foram incu- badas a 37°C durante 24 horas. A cor destas colônias e também a intensi- dade desta cor foram anotadas depois da adição de HCI. 4.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 4 abaixo: *crescimento muito pequeno Tabela 4: Visualização da atividade de L-alanina-aminopeptidase de micro- organismos por meio de L-Ala-2-MeOAPA e L-Ala-2.5-diMeOAPA

Estes dois substratos tornam possível, depois da adição de uma gota de HCI, visualizar uma atividade de L-alanina-aminopeptidase em bac- térias Gram-positivas. A adição de (metóxi-)substituintes ao grupo fenila tor- na possível, além disso, reduzir a toxicidade dos substratos, em particular com respeito a bactérias Gram-positivas. No entanto, este ganho em fertili- dade ocorre para o detrimento da especificidade; especificamente, Entero- coccus faecalis apresenta uma atividade com L-Ala-2,5-diMeOAPA depois de incubação durante 48 horas.

Exemplo 5: Visualização da atividade de β-alanina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio aelificado: aplicacão de cloreto de 8-alanil-9-(4- aminofeniO-10-metilacridínío (substrato auaternizadot: 5.1: Molécula usada: A visualização da atividade de β-alanina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio gelificado é realizada usando um substrato de- nominado cloreto de p-alanil-9-(4-aminofenil)-10-metilacridínio (substrato quaternizado), nas partes que se seguem denominado p-Ala-4-AP-10-MA, cuja fórmula é como abaixo: Cloreto de p-alanil-9-(4-aminofenil)-10-metilacridínio 5.2: Síntese de B-Ala-4-AP-1Q-MA: O composto de partida é t-Boc-alanil-9-(4-amino-fenila)acridina, cuja síntese já foi descrita no parágrafo 1.2.2 (Síntese de L-Ala-APA). A t- Boc-alanil-9-(4-aminofenil)acridina (0,67 g, 1,5 mmol) é dissolvida em aceto- nitrila (volume mínimo) e submetida a refluxo com iodeto de metila (4,0 ml). O frasco é em seguida fechado e incubado a 40°C durante mais de 100 ho- ras. O reagente sólido é dissolvido à medida que a reação prossegue, for- mando uma solução laranja. Cristais pretos alaranjados aparecem nesta solução.

Ao final das 100 horas, a mistura da reação é transferida para acetato de etila (100 ml) com agitação. Depois de um período de tempo re- querido, o sal quaternário é filtrado e lavado com éter dietílico. O produto é dissolvido em uma quantidade mínima de etanol e agitado com acetato de etila (10 ml) saturado com HCI. Precipitados, que são formados umas poucas horas depois, são recuperados por meio de fil- tração sob pressão reduzida. A introdução de éter dietílico no filtrado torna possível recuperar produto adicional. As frações combinadas do produto são lavadas com éter dietílico e secas rapidamente de modo a evitar a absorção de umidade. A desproteção é a mesma que a descrita acima. 5.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo 300 mg/l de p-Ala-4-AP-10- MA é preparado como se segue: 46,37 g de ágar Columbia são adicionados a 1 litro de água destilada e em seguida autoclavados, e o substrato é em seguida introduzido por meio de uma solução de matéria-prima em DMSO.

Microorganismos derivados da coleção da requerente foram semeados so- bre o meio, por delimitação como três quadrantes, usando uma suspensão de 0,5 McFarland. As placas foram incubadas a 37°C durante 48 horas. As colônias formadas foram examinadas visualmente depois de incubação du- rante 24 e 48 horas. A cor destas colônias e também a intensidade desta cor foram anotadas. 5.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 5 abaixo.

Este substrato torna possível visualizar uma atividade de β- alanina-aminopeptidase em bactérias Gram-negativas por meio do apareci- mento espontâneo (sem a adição de ácido) de uma cor laranja concentrada nas colônias. As colônias que não têm esta atividade permanecem incolo- res. Este substrato é portanto sensível e específico. Torna possível identifi- car cepas de Pseudomonas aeruginosa e em particular diferenciar as mes- mas de outras bactérias.

Tabela 5: Visualização da atividade de β-alanina-aminopeptidase de micro- organismos por meio de 6-Ala-4-AP-10-MA

Exemplo 6: Visualização da atividade de L-orolina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio qelificado usando um substrato não guaternizado à base de orolina: 6.1: Molécula usada: A visualização da atividade de L-prolina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio gelificado é realizada usando um substrato de- nominado L-proIil-9-(4-amino-fenila)acridina (substrato não quaternizado), nas partes que se seguem denominado L-Pro-4-APA, cuja fórmula é como abaixo: L-Prolil-9-(4-aminofenil)acridina 6.2: Síntese de L-Pro-4-APA: Esta síntese já foi realizada no parágrafo 1.2 acima, de acordo com dois métodos A e B, e em cujos métodos o aminoácido alanina foi suibstituído com o aminoácido prolina. Deve ser feita referência portanto à síntese de L-Pro-4-APA. 6.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo L-prolil-9-(4-amino-fenila)- acridina (nas partes que se seguem referidos como L-Pro-4-APA) é prepa- rado como se segue: 45 g de ágar Sabouraud são adicionados a 1 litro de água destilada e em seguida autoclavados. Este meio de reação compreen- de 0,3 g/l de L-Pro-APA também introduzido por meio de uma solução de matéria-prima em DMSO.

Microorganismos derivados da coleção da requerente foram semeados sobre este meio, por delimitação como três quadrantes, usando uma suspensão de 0,5 McFarland. As placas foram incubadas a 37°C du- rante 24 horas. As colônias formadas foram examinadas visualmente depois de incubação durante 24 horas. A cor destas colônias foi anotada antes e depois da adição de uma gota de ácido acético, nas partes que se seguem referido como GAA (ácido acético glacial). 6.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 6 abaixo: Tabela 6: Visualização da atividade de L-prolina-aminopeptidase de micro- organismos por meio de L-Pro-4-APA para a qual é otimizada a concentra- ção de substrato Com determinadas cepas de levedura Candida, é demonstrada a natureza inibitória do substrato. No entanto, algumas leveduras produzem uma cor amarela, sem a adição de ácido. Esta cor é mais intensa para al- gumas cepas, em particular Candida albicans, e também é mais intensa do que na ausência de cultura. Isto claramente demonstra que o presente substrato, contendo prolina como aminoácido, torna possível visualizar a atividade de L-prolina-aminopeptidase em leveduras.

Exemplo 7: Visualização da atividade de L-serina-aminopeptidase de micro- organismos sobre meio qelificado usando um substrato não guaternizado à base de serina: 7.1: Molécula usada: A visualização da atividade de L-serina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio gelificado é realizada usando um substrato de- nominado L-seril-9-(4-amino-fenila)acridina (substrato não quaternizado), nas partes que se seguem denominado L-Ser-4-ΑΡΑ, cuja fórmula é como abaixo: L-Seril-9-(4-aminofenil)acridina 7.2: Síntese de L-Ser-4-ΑΡΑ: Como a que foi descrita para L-Pro-4-APA (parágrafo 6.2 aci- ma), esta síntese já foi realizada no parágrafo 1.2 acima, de acordo com dois métodos A e B, e em cujos métodos o aminoácido alanina foi substituí- do com o aminoácido serina. Deve ser feita referência portanto à síntese de L-Ser-4-ΑΡΑ. 7.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo L-seril-9-(4-amino-fenila)- acridina (nas partes que se seguem referido como L-Ser-4-ΑΡΑ) é prepara- do como se segue: 30 miligramas de L-Ser-4-ΑΡΑ são adicionados a 4 gra- mas de ágar Columbia, que são adicionados a 0,1 litro de água destilada e em seguida autoclavado. Este meio de reação é autoclavado a 116°C du- rante 20 minutos. A maior parte do substrato está em solução, sem colora- ção residual.

Microorganismos derivados da coleção da requerente foram semeados sobre este meio usando uma suspensão de 0,5 McFarland. As placas foram incubadas a 37°C durante 24 horas. Amostras de 10 μΙ de cada suspensão foram cultivadas de modo a produzir colônias. As colônias formadas foram examinadas visualmente depois de incubação durante 18 a 24 horas. A cor destas colônias foi anotada antes e depois da adição de uma gota de ácido acético, nas partes que se seguem referido como GAA (ácido acético glacial). 7.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 7 abaixo: Tabela 7: Visualização da atividade de L-serina-aminopeptidase de microor- ganismos por meio de L-Ser-4-ΑΡΑ para a qual a concentração do substrato é otimizada Mais uma vez, há uma inibição parcial de algumas cepas com o substrato à base de acridina. As três cepas Gram-negativas testadas produ- zem uma cor reacional particular depois da adição de ácido acético.

Exemplo 8: Visualização da atividade de L-alanina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio gelificado usando substratos quaternizados com base em uma, duas ou três L-alaninas: 8.1: Molécula usada: A visualização da atividade de L-a!anina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio gelificado é realizada usando três substratos, a saber L-A1a-4-AP-10-MA conforme descrito no exemplo 3, L-Ala-L-Ala-4-AP- 10-MA o qual corresponde a L-Ala-4-AP-10-MA compreendendo uma L- alanina adicional, uma L-Ala-L-Ala-L-Ala-4-AP-10-MA a qual tem outra L- alanina adicional. 8.2: Síntese destes substratos: Estes substratos foram preparados conforme descrito no ponto 3.2 acima, usando o composto de partida apropriado tendo uma, duas ou três L-alaninas. 8.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo estes três substratos é pre- parado como se segue: 30 mg de cada substrato são dissolvidos (aquecen- do) em 10 ml de água destilada esterilizada. Dez ml desta solução são em seguida adicionados a 90 mi de ágar Columbia mantido fundido a 50°C.

Várias cepas de microorganismos derivados da coleção NCTC (National Collection of Type Cultures, Colindale, Reino Unido) foram semea- das sobre os meios obtidos deste modo de acordo com inoculação multi- ponto: para cada cepa, uma gota de 10 μΙ de uma suspensão a 0,5 McFar- land é depositada sobre cada um dos meios de cultura.

As colônias formadas foram examinadas visualmente depois de incubação durante 24 h e 48 h. A cor e o crescimento destas colônias foram anotados. 8.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 8 abaixo: ++ significa bom crescimento, + significa crescimento moderado, +/- significa crescimento fraco e NG significa nenhum crescimento.

Sobre os três meios, as cepas de bactérias Gram-negativas formaram colônias de cor laranja, ao passo que as cepas de bactérias Gram-positivas formaram colônias incolores ou não se desenvolveram. Es- tes três meios portanto tornam possível diferenciar bactérias Gram- negativas de bactérias Gram-positivas, e, de acordo com os meios, o cres- cimento de todas ou algumas das cepas testadas.

Exemplo 9: Visualização da atividade de pirogiutamina-aminopeptidase de microorganismos sobre meio gelificado usando substratos quaternizados usando sal de cloridrato de piroglutamil-9-(4-aminofenil)-10-metilacridina: 9.1: Molécula usada: A visualização da atividade de pirogiutamina-aminopeptidase de microorganismos sobre meio gelificado é realizada usando piroglutamil-9-(4- aminofenil)-10-metila-acridina, nas partes que se seguem denominada PG- 4-AP-10-MA. 9.2: Síntese deste substrato: Este substrato foi preparado conforme descrito no ponto 3.2 acima, exceto que a L-alanina foi substituída com piroglutamina. 9.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo este substrato é preparado como se segue: 30 mg de cada substrato são dissolvidos (aquecendo) em 10 ml de água destilada esterilizada. Dez ml desta solução são em seguida adicionados a 90 ml de ágar Columbia mantido fundido a 50°C.

Várias cepas de microorganismos derivados da coleção NCTC (National Collection of Type Cultures, Colindale, Reino Unido) foram semea- das sobre os meios obtidos deste modo de acordo com a inoculação multi- ponto descrita no exemplo 8 acima.

As colônias formadas foram examinadas visualmente depois da incubação durante 24 h e 48 h. A cor e o crescimento destas colônias foram anotados. 9.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 9 abaixo: ++ significa bom crescimento, + significa crescimento moderado, +/- significa crescimento fraco e NG significa nenhum crescimento. O meio do exemplo torna possível diferenciar bactérias que ex- pressam atividade de piroglutamil-aminopeptidase das que não a expres- sam.

Exemplo 10: Visualização da atividade de qlicina-aminopeptidase de micro- organismos sobre meio qelificado usando um substrato quaternizado com base no sal de cloridrato de aliciÍ-9-(4-aminofenil)-10-metilacridina: 10.1: Molécula usada: A visualização da atividade de glicina-aminopeptidase de micro- organismos sobre meio gelificado é realizada usando glycyl-9-(4-aminofeniI)- 10-metilacridína, nas partes que se seguem denominadas G-4-AP-10-MA. 10.2: Síntese deste substrato: Este substrato foi preparado conforme descrito no ponto 3.2 acima, exceto que a L-alanina foi substituída com glicina. 10.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo este substrato é preparado como se segue: 30 mg do substrato são dissolvidos (aquecendo) em 10 ml de água destilada esterilizada. Dez ml desta solução são em seguida adici- onados a 90 ml de ágar Columbia, mantido fundido a 50°C.

Várias cepas de microorganismos derivadas da coleção NCTC (.National Collection of Type Cultures, Colindale, Reino Unido) foram semea- das sobre os meios obtidos deste modo de acordo com a inoculação multi- ponto descrita no exemplo 8 acima.

As colônias formadas foram examinadas visualmente depois de incubação durante 24 h e 48 h. A cor e o crescimento destas colônias foram anotados. 10.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 10 abaixo: ++ significa bom crescimento, + significa crescimento moderado, +/- significa crescimento fraco e NG significa nenhum crescimento. O meio do exemplo torna possível diferenciar as bactérias que expressam atividade de glicilamii-aminopeptidase das que não a expressam.

Exemplo 11: Visualização da atividade de t-BQC-L-alanil-L-alanil-L-alanil- peptidase de microorganismos sobre meio qelificado usando um substrato quaternizado para o qual o aminoácido é acoplado a um agente de bloqueio, um substrato com base no sal de cloridrato de t-BOC-L-alanil-L-alanil-L- aianil-9-(4-aminofenil)-10-metilacridina: 11.1: Molécula usada: A visualização da atividade de L-alanina-aminopeptidase de mi- croorganismos sobre meio gelificado é realizada usando t-BOC-L-alanil-L- alanil-L-alanil-9-(4-amino-fenila)-10-metilacridina, nas partes que se seguem denominadas t-BOC~L-Ala-4-AP-10-MA. 11.2: Síntese deste substrato: Este substrato foi preparado conforme descrito no ponto 3.2 acima, com a exceção de que não foi realizada a desproteção do composto amino. 11.3: Preparação do meio: Um meio gelificado compreendendo este substrato é preparado como se segue: 30 mg do substrato são dissolvidos (aquecendo) em 10 ml de água destilada esterilizada. Dez ml desta solução são em seguida adici- onados a 90 ml de ágar Columbia, mantido fundido a 50°C.

Várias cepas de microorganismos derivados da coleção NCTC (National Collection of Type Cultures, Colindale, Reino Unido) foram semea- das sobre os meios obtidos deste modo de acordo com a inoculação multi- ponto descrita no exemplo 8 acima.

As colônias formadas foram examinadas visualmente depois de incubação durante 24 h e 48 h. A cor e o crescimento destas colônias foram anotados. 11.4: Resultados: Os resultados são dados na tabela 11 abaixo: ++ significa bom crescimento, + significa crescimento moderado, +/- significa crescimento fraco e NG significa nenhum crescimento. O meio do exemplo toma possível obter quatro grupos de mi- croorganismos: • os que formam colônias de cor laranja verdadeira, • os que formam colônias de cor laranja clara, • os que formam colônias incolores, e • os que não formam colônias.

Entre as cepas testadas, as bactérias Gram-negativas perten- cem aos dois primeiros grupos, ao passo que as bactérias Gram-positivas pertencem aos dois últimos. A presença de um agente de bloqueio (t-Boc) torna possível modular a atividade comparada com os resultados obtidos com o substrato desprotegido (ver o exemplo 8 acima).

Foram realizados outros experimentos: Foram testados outros substratos, que tornam possível validar os resultados apresentados aqui; pode ser feita menção, por exemplo, de: • Cloreto de L-alanil-9-(4-amino-3-metoxifenil)-10-metila-acridí- nio, • Cloridrato de cioreto de L-alanil-9-(4-aminofenil)-10-metilacridí- nio, • Cloridrato de cloreto de L-alanil-9-(4-amino-2,5-dimetoxifenil)- 10-metila-acridínio, • Cloridrato de cloreto de p-alanil-9-(4-aminofenil)-10-metilacridí- nio, • p-alanil-9-(4-amino-2-metoxiaminofenil)acridina, • p-alanil-9-{4“amino-2,5-dimetoxiamino-fenila)acridina, • Cloridrato de cloreto de p-alanil-9~(4-amino-3-metoxifenil)-10- metila-acridínio, • Cloridrato de cloreto de p-alanil-9-(4-amino-2,5~dimetoxifenil)- 10-metila-acridínio.

Do mesmo modo, também foram testadas outras espécies de microorganismos, geralmente bactérias, tais como: • Salmonella typhimurium, • Staphylococcus epidermidis, • Serrada marcescens.

Claims (12)

1. Substrato enzimático cromogênico para detectar atividade de aminopeptidase em microorganismos ou para determinar se no mínimo uma bactéria pertence ao grupo Gram-positivo ou ao grupo Gram-negativo de acordo com a cor da mesma, caracterizado pelo fato de aue tem a fórmula (I) abaixo: na qual: • é nada ou um grupo alquila, alila ou arila, • R2 consiste em no mínimo um aminoácido, preferencialmente alanina, • R3. Rí» R5 e R6 consistem, de modo independente um do outro, em H- ou -O-alquila, preferencialmente -0-CH3, • R7 consiste em H, 0-CH3, alquila ou halogênio, • Re é consiste em H ou Cl, e • n é um inteiro correspondente a 0 ou 1.

2. Substrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula (Ia) abaixo: ou pelo fato de que tem a fórmula (Ib) abaixo:

3. Substrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um grupo metila ou alila.

4. Substrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem a fórmula (Ic) abaixo: ou pelo fato de que tem a fórmula (Id) abaixo:

5. Substrato de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que R2 ou a L-alanina é acoplada a um agen- te de bloqueio.

6. Meio de cultura usando no mínimo um substrato enzimático cromogênico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, so- zinho ou em combinação com no mínimo um outro substrato enzimático es- pecífico para atividade de uma enzima que é diferente da detectada pelo substrato de acordo com a invenção.

7. Meio de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que consiste em um meio gelificado.

8. Aplicação dos substratos enzimáticos cromogênicos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou de um meio de cul- tura como definido em qualquer uma das reivindicações 6 e 7, para detectar no mínimo a atividade de uma aminopeptidase em microorganismos.

9. Aplicação dos substratos enzimáticos cromogênicos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou de um meio de cul- tura como definido em qualquer uma das reivindicações 6 e 7, para separar bactérias com coloração Gram-positiva de bactérias com coloração Gram- negativa.

10. Método para detectar no mínimo a atividade de uma amino- peptidase em microorganismos, caracterizado pelo fato de que consiste em: • proporcionar um meio de cultura como definido em qualquer uma das reivindicações 6 e 7, • semear o meio com uma amostra biológica a ser testada, • deixar a mesma para incubar, e • visualizar a presença de no mínimo a atividade de uma amino- peptidase, sozinha ou em combinação com no mínimo a atividade de uma outra enzima diferente da atividade de uma aminopeptidase.

11. Método para diferenciar bactérias em termos de pertence- rem ou não a microorganismos do tipo Gram-positivo ou a microorganismos do tipo Gram-negativo, caracterizado pelo fato de aue consiste em: • proporcionar um meio de cultura como definido em qualquer uma das reivindicações 6 e 7, • semear o meio com uma amostra biológica a ser testada, • deixar a mesma para incubar, e • visualizar a presença de no mínimo uma cor sinônima com a presença de um microorganismo ou microorganismos do tipo Gram- negativo.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizado pelo fato de que, quando o nitrogênio na posição 10 do grupo acridina não é quaternizado, a presença de no mínimo uma atividade de aminopeptidase é visualizada adicionando ácido, preferencialmente ácidoclorídrico, ácido acético ou ácido cítrico, à cultura.