ES2295061T3 - Substrato enzimatico, procedimiento de sintesis y empleos. - Google Patents
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Abstract
Substrato enzimático de fórmula general (I): en la cual X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de carbono substituido con un grupo fenilo, estando dicho grupo fenilo eventualmente substituido en posición meta o para, Y y Z representan un átomo de hidrógeno cuando X representa un átomo de carbono ó Y y Z representan conjuntamente un enlace éter, tioéter o amina eventualmente substituida con un grupo alquilo o arilo, R1 y R2 representan cada uno, independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser idénticos o diferentes, ó R1 y R2 representan juntos un núcleo bencénico fusionado substituido o no, R3 y R4 representan cada uno, independientemente uno de otro H, Cl, F, I, Br y pueden ser idénticos o diferentes, R representa un grupo tal, que el enlace O-R es hidrolizable por una enzima.
Description
Substrato enzimático, procedimiento de síntesis
y empleos.
La presente invención se refiere a una nueva
familia de substratos enzimáticos y a sus aplicaciones,
especialmente para la detección de microorganismos.
La detección e identificación de bacterias es
muy importante en medicina o en la industria alimentaria dado que
estos microorganismos pueden no solamente manifestarse como agentes
patógenos sino también poner en evidencia ciertos tipos de
contaminaciones.
Los métodos recientes desarrollados con esta
finalidad se refieren a la utilización de compuestos coloreados o
fluorescentes, y las aplicaciones de estos compuestos han sido
descritas por ejemplo en las revisiones de Manafi M et
al., Microbiological Reviews ("Revista microbiológica"),
55(3), p 335-348, 1991 ó más recientemente
Manafi M., De Ware(n) Chemicus ("Substancias químicas"),
28, p 12-17, 1998.
De manera general, pueden distinguirse cuatro
grupos de compuestos:
- los marcadores fluorescentes como el naranja
de acridina, que producen un aumento de la fluorescencia cuando el
marcador es adsorbido por los ácidos nucleicos o por las proteínas
de las células de los microorganismos;
- los indicadores dependientes del pH, como la
acridina o la 7-hidroxicumarina, los cuales varían
en intensidad o en espectro de color o fluorescencia en función del
pH y por lo tanto, de la actividad bioquímica de los
microorganismos;
- los compuestos sensibles a la naturaleza
oxi-reductora del medio como el azul de metileno y
que producen un color por efecto de un medio reductor;
- los substratos de enzimas coloreados o
fluorescentes, los cuales producen respectivamente un color o
fluorescencia por efecto de una hidrólisis en presencia de una
enzima especificada de un microorganismo o de un grupo de
microorganismos.
- Entre esta última categoría, se han descrito
un cierto número de substratos, los cuales permiten especialmente
la detección de la
\beta-D-glucosidasa ó
\beta-D-galactosidasa, las cuales
son marcadores taxonómicos importantes para los microorganismos y
en particular los Enterobacteriaceae. Entre estos substratos,
se pueden citar los derivados del orto-nitrofenilo,
los cuales producen el o-nitrofenol de color
amarillo después de la hidrólisis, o substratos
fluorescentes como los derivados de la fluoresceína o de la
4-metilumbeliferona que producen un marcador
fluorescente. Una limitación importante de estos substratos es el
fenómeno de difusión en el medio de cultivo lo cual hace más
difícil la distinción entre la colonia y el ruido de fondo.
Para resolver este problema, se han empleado
otros substratos, los cuales dan un producto insoluble después de
la hidrólisis. Estos substratos quedan localizados alrededor de la
colonia bacteriana sin difundir sobre el soporte de cultivo lo cual
facilita la interpretación del ensayo.
Entre estos substratos, han sido desarrollados
los derivados del indoxilo (ver por ejemplo Kodaka et al.,
J. Clin Microbiol., 33, p 199-201, 1995 ó las
patentes US 5 358 854 y US 5 364 767) ó la esculetina (ver por
ejemplo WO 97/41138). Para los primeros la dificultad de síntesis
hace que el coste sea muy elevado limitando el desarrollo de
aplicaciones industriales a gran escala, y además, estos substratos
son sensibles a las condiciones de incubación del medio. Para los
segundos, la obligación de añadir al medio un agente formador de
complejos a base de hierro para tener una reacción coloreada,
constituye un problema para ciertos micro-organismos
puesto que el mismo puede interferir con su metabolismo y
especialmente el estudiado.
La presente invención describe una nueva familia
de substratos enzimáticos que no presentan los inconvenientes
citados puesto que la síntesis de estos compuestos es fácil de
realizar, los substratos son insolubles después de la hidrólisis,
no se difunden en el medio y no necesitan la adición de un agente
formador de complejos como el hierro o de condiciones de
oxi-reducción particulares.
\newpage
Un objeto de la presente invención es el
describir una familia de compuestos de fórmula general (I):
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual
X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de
carbono substituido con un grupo fenilo, estando dicho grupo fenilo
eventualmente substituido en posición meta o para,
Y y Z representan un átomo de hidrógeno cuando X
representa un átomo de carbono ó Y y Z representan conjuntamente un
enlace éter, tioéter o amina eventualmente substituida por un grupo
alquilo o arilo,
R_{1} y R_{2} representan cada uno
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes, o R_{1} y R_{2} representan juntos un
núcleo bencénico fusionado substituido o no,
R_{3} y R_{4} representan cada uno
independientemente uno de otro H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima.
Las enzimas de interés en la presente invención
son las enzimas cuya presencia proporciona una información que
permite la detección y/o la identificación y/o la cuantificación de
uno o de varios microorganismos o de un analito como una proteína,
un péptido, un ácido nucleico. En particular, la enzima es de la
familia de las osidasas como la
\beta-glucuronidasa, la
\beta-galactosidasa, la
6-fosfogalactohidrolasa, la
\alpha-galactosidasa, la
\alpha-amilasa, la
\alpha-glucosidasa, la
\beta-glucosidasa, las hexosaminidasas como la
N-acetil-\beta-glucosaminidasa
o la
N-acetil-\beta-galactosaminidasa,
de la familia de las esterasas, de las lipasas, de las fosfatasas,
de las sulfatasas, de las DNasas, de las peptidasas y de las
proteasas. De preferencia, la enzima es de la familia de las
osidasas como la
\beta-D-glucosidasa,
\beta-glucuronidasa o la
\beta-D-galactosidasa, de la
familia de las sulfatasas, fosfatasas, esterasas.
El grupo R se escoge en función de la enzima a
detectar. R es por ejemplo, un residuo del tipo azúcar \alpha- ó
\beta- como los derivados de la xilosa, glucosa, galactosa, ácido
glucurónico, glucosamina o un fosfato, un sulfato, un carboxilato
(R_{6}COO-) en el cual R_{6} es un grupo alquilo que tiene de
uno a 16 átomos de carbono, un nucleótido, un péptido. De
preferencia, el grupo R es la
\beta-D-glucosa o la
\beta-D-galactosa,
\beta-D-glucuronato, un fosfato,
un sulfato, un acetato.
Cuando R_{1} y R_{2} representan
conjuntamente un núcleo bencénico fusionado, se entiende la
estructura (Ia) siguiente que indica la fórmula desarrollada para
R_{1} y R_{2}:
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\newpage
Cuando Y y Z representan conjuntamente un enlace
éter, se entiende un enlace como el representado en la fórmula
general (Ib):
Cuando Y y Z representan conjuntamente un enlace
tioéter, se entiende un enlace como el representado en la fórmula
general (Ic):
Cuando Y y Z representan juntamente un enlace
amina eventualmente substituido con un grupo arilo o alquilo, se
entiende un enlace como el representado en la fórmula general
(Id):
en la cual A representa un grupo
arilo o
alquilo.
Substratos particulares de fórmula general (I)
están dados en las fórmulas generales (II), (III), (IVa), (IVb) y
(IVc) a continuación:
fórmula general (II) en la
cual,
R_{1} y R_{2} representan cada uno
independientemente uno de otro H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes ó R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia, R_{1} y R_{2} conjuntamente, representan un núcleo
bencénico fusionado no substituido.
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia, R_{3} y R_{4}
representan H,
R_{5} representa H, NO_{2}, CF_{3}, CN,
OCH_{3}, F, I, Cl, Br, SO_{3}H, CO_{2}H en posición meta o
para. De preferencia, R_{5} representa H,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo del tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa y
la \beta-D-galactosa o un acetato
o un sulfato.
fórmula general (III) en la
cual
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br, y pueden ser
idénticos o diferentes, o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia, R_{1} y R_{2} conjuntamente representan un núcleo
bencénico fusionado no substituido.
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br, y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia, R_{3} y R_{4}
representan H.
R_{5} representa H, NO_{2}, CF_{3}, CN,
OCH_{3}, F, I, Cl, Br, CO_{2}H, SO_{3}H en posición meta o
para. De preferencia, R_{5} representa H,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo del tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa o
la \beta-D-galactosa.
fórmula general (IVa) en la
cual,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br, y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia, R_{1} representa H y R_{2} representa Cl.
R_{3} y R_{4} representan, cada uno
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br, y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia, R_{3} y R_{4}
representan H,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo del tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa o
la \beta-D-galactosa o un acetato
o un sulfato.
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fórmula general (IVb) en la
cual,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br, y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia, R_{1} representa H y R_{2} representa Cl.
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br, y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia, R_{3} y R_{4}
representan H,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo del tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa y
la \beta-D-galactosa o un acetato
o un sulfato.
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fórmula general (IVc) en la
cual,
A representa un grupo arilo o alquilo,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia R_{1} representa H y R_{2} representa Cl.
R_{3} y R_{4} representan cada uno
independientemente uno de otro H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia, R_{3} y R_{4}
representan H.
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo del tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa y
la \beta-D-galactosa o un acetato
o un sulfato.
La invención se refiere igualmente a un
procedimiento de síntesis del substrato enzimático de fórmula
general (I) en la cual se prepara un intermediario de fórmula
general (V)
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en la
cual
X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de
carbono substituido por un grupo fenilo, estando dicho grupo fenil
eventualmente substituido en posición meta o para,
Y y Z representan un átomo de hidrógeno cuando X
representa un átomo de carbono ó Y y Z representan conjuntamente un
enlace éter, tioéter o amina eventualmente substituido por un grupo
alquilo o arilo,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no.
R_{3} y R_{4} representan cada uno
independientemente uno de otro H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes,
y se injerta sobre el hidroxilo un
grupo R convenientemente
protegido.
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En particular, el injerto se efectúa mediante
una reacción de glicosilación, esterificación, fosforilación.
En el caso de la glicosilación, es necesario
proteger los grupos hidroxilo del azúcar como por ejemplo, con un
grupo acetilo. Los derivados tetraacetilados del
\beta-D-glucósido o de
\beta-D-glucósido se obtienen a
partir del derivado correspondiente
\alpha-acetobromohexosa.
La desprotección de los grupos hidroxilos del
azúcar se realiza después del injerto en presencia de un agente
alcalino como el metóxido de sodio en metanol para un derivado
acetilado. Las condiciones de glicosilación son escogidas por el
experto en la especialidad y en particular por acción del hidróxido
de potasio en acetona.
La formación de ésteres orgánicos como el
acetato se realiza haciendo reaccionar sobre el derivado de fórmula
general (V), el anhídrido acético en frío, en piridina. La formación
de éster del tipo CH_{3}(CH_{2})_{n}COOR se
efectúa haciendo reaccionar un derivado cloruro de ácido en una
mezcla del disolvente tipo piridina/dimetilformamida, eventualmente
en presencia de un catalizador como la
4-dimetilaminopiridina.
La formación del fosfato se efectúa tratando el
derivado de fórmula general (V) en presencia de POCl_{3} en
presencia de piridina.
La formación de sulfato se efectúa tratando el
derivado de fórmula general (V) por acción del ácido clorosulfónico
en frío, en piridina. Los substratos de la presente invención en el
caso de los fosfatos y sulfatos están bajo la forma de sal, como
una sal de potasio o de sodio.
Ventajosamente, se prepara un intermediario que
responde a una cualquiera de las fórmulas (Va), (Vb) y (Vc)
siguientes:
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La invención se refiere igualmente a una
composición para la detección y/o identificación y/o cuantificación
de por lo menos un microorganismo que contiene por lo menos un
substrato enzimático de fórmula general (I) y un medio reactivo de
dichos microorganismos o dichos microorganismos.
Por medio reactivo según la invención, se
entiende un medio que permite el desarrollo de por lo menos una
actividad enzimática de por lo menos un microorganismo, como por
ejemplo, un medio de cultivo.
El medio reactivo es sólido, semisólido o
líquido. Por medio sólido se entiende por ejemplo un medio
gelificado. El agar es el medio tradicional sólido en microbiología
para el cultivo de microorganismos, aunque es posible utilizar la
gelatina o la agarosa. Están disponibles un cierto número de
preparaciones como el agar Columbia, la gelosa
Trypcase-soja, la gelosa Mac Conkey, la gelosa
Sabouraud, las descritas en el "Livret technique MILIEUX DE
CULTURE" ("Manual técnico de medios de cultivo") de la
solicitante, o más generalmente, los descritos en el Handbook of
Micro-biological Media ("Manual de medios
microbiológicos") (CRC Press).
Ventajosamente, el medio reactivo es un medio
gelificado que contiene entre 2 y 40 g/litro, de preferencia, entre
9 y 25 g/litro de agar.
Los substratos de la presente invención pueden
emplearse en una amplia gama de pH, principalmente entre 5,5 y 10,0
y ventajosamente entre pH 6,0 y 8,5.
El medio reactivo puede también contener uno o
varios elementos en combinación como ácidos aminados, peptonas,
hidratos de carbono, nucleótidos, minerales, vitaminas,
antibióticos, tensioactivos, tampones, sales de fosfato, de amonio,
de sodio, de metales. Ejemplos de medios están descritos en las
siguientes patentes de la solicitante, EP 0656421 ó WO
99/09207.
En otro aspecto de la presente invención, el
medio reactivo contiene por lo menos dos substratos enzimáticos: un
primer substrato enzimático de la familia de la invención y por lo
menos otro substrato enzimático de la familia de la invención y/u
otro substrato enzimático de otra familia de substrato. La
hidrólisis enzimática del o de los otros substratos genera una
señal detectable, diferente de la señal generada por el primer
substrato, como por ejemplo, productos coloreados o fluorescentes
diferentes, para permitir la puesta en evidencia, como la detección
y/o la identificación y/o la cuantificación, de uno o de varios
microorganismos.
A título de ejemplo, se pueden considerar las
asociaciones siguiente:
- un substrato de
\beta-glucuronidasa según la invención y
X-\beta-D-glucósido
(X es el
5-bromo-4-cloro-3-indolil-)
para un medio para las primeras tomas de muestras de orina (tipo
CPS ID2, bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia);
- un substrato de
\beta-galactosidasa según la invención y
X-\beta-D-glucósido
para un medio para las tomas de muestras urinarias (tipo CHROMagar
Orientation (marca registrada) vendido por la sociedad CHROMagar,
París, Francia u Oxoid UTI vendido por la sociedad OXOID, Hampshire,
Inglaterra);
- un substrato de
\beta-glucuronidasa según la invención y
X-\beta-D-galactósido
para un medio para Escherichia coli y los coliformes (tipo
Coli ID, bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia).
\vskip1.000000\baselineskip
A título de ejemplo, se puede utilizar un
substrato de hexosaminidasa según la invención, para las levaduras
y la identificación de la Candida albicans.
Los substratos según la presente invención,
pueden ser principalmente introducidos en los medios CPS ID2, SM
ID, Albicans ID2, Coli ID, O157:H7 ID comercializados por bioMérieux
(Marcy l'Etoile, Francia) y contienen todo o parte de sus
substratos enzimáticos, así como los medios que contienen esculina
como por ejemplo la gelosa Bile Esculine con o sin agentes
selectivos.
La concentración del substrato enzimático en el
medio reactivo está comprendida entre 0,02 y 1 g/litro,
ventajosamente entre 0,03 y 0,30 g/litro y de preferencia, entre
0,04 y 0,10 g/litro.
La presente invención se extiende también a un
kit de diagnóstico que comprende una composición como la definida
precedentemente, y un recipiente para el medio reactivo. Por
recipiente, se entiende cualquier soporte sólido como un frasco, un
tubo, una caja, un placa de microtitración o un consumible para
aparato automático como las galerías API o las tarjetas VITEK
(marcas registradas, BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia).
Otro aspecto de la presente invención se refiere
a un procedimiento para la detección y/o la identificación y/o la
cuantificación de por lo menos un microorganismo en una muestra
donde se pone en contacto el microorganismo procedente de la
muestra con un medio reactivo que contiene un substrato enzimático
de fórmula general (I) y se detecta el producto coloreado o
fluorescente formado por la hidrólisis de dicho substrato
enzimático.
Los substratos de fórmula general (I) presentan
la ventaja de que pueden utilizarse independientemente de las
condiciones de la atmósfera de incubación. La detección puede por lo
tanto efectuarse por incubación del medio reactivo que contiene el
substrato enzimático e inocularse, por lo menos para un
microorganismo, en una atmósfera controlada como en condiciones
aeróbicas, anaeróbicas, microaerofílicas o en atmósfera de CO_{2},
de preferencia, aeróbicas, microaerofílicas o en atmósfera de
CO_{2}.
La muestra a analizar es una muestra clínica
como una extracción de saliva, de sangre, de orina, de heces o
cualquier otra muestra en la que el análisis puede ayudar al clínico
a efectuar un diagnóstico. La muestra puede también ser una muestra
de un producto elaborado o de base de la industria alimenticia y/o
farmacéutica, en la cual hay que garantizar o bien la ausencia de
microorganismos patógenos o bien el contaje de una flora
contaminante, o detectar microorganismos específicos. La muestra
puede ponerse en cultivo bien sea directamente en un medio que
contiene un substrato de fórmula general (I), o bien sea después de
una etapa de precultivo por ejemplo, en el caso de una muestra
alimenticia.
El o los microorganismos identificables,
detectables o cuantificables de la presente invención son las
bacterias, levaduras, hongos, que pertenecen principalmente a los
grupos o taxas siguientes:
Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae,
Nesseriaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae, Campylobacter,
Micrococcaceae, Streptococcaceae, Bacillus, Lactobacillus,
Listeria, Coryne-bacterium, Gardnerella, Nocardia,
Candida, Cryptococcus, Aspergillus y más particularmente
Escherichia coli, E. coli O157:H7, Shigella, Salmonella,
Proteeae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis,
Enterococcus, Staphylo-coccus aureus, Bacillus
cereus, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus agalactiae, levaduras como Candida albicans,
Candida glabrata, Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans y
Aspergillus fumigatus. Estos microorganismos pueden ser
aerobios, aeroanaerobios, microaerófilos o anaerobios.
En otro aspecto de la presente invención, los
substratos enzimáticos se utilizan en las reacciones de detección
de un analito donde se pone en juego una actividad enzimática
(principalmente la fosfatasa alcalina o la
\beta-galactosidasa), como: las reacciones de
detección de anticuerpos o de antígeno, o de ácido nucleico, con un
formato tipo ELISA (ver por ejemplo "Las inmunodosificaciones de
la teoría a la práctica" coordinadas por Barbier Y., ediciones
de l'ACOMEN, Lion, p. 109-133, 1988); en técnicas de
biología molecular para la puesta en evidencia de un gen del tipo
\beta-galactosidasa (ver por ejemplo "Molecular
cloning a laboratory manual" ("Clonación molecular. Un manual
de laboratorio"), 2ª edición, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, sección 16.56 y sección 1.85,
1989); para la detección de ácidos nucleicos (ver por ejemplo "DNA
probes" ("Sondas de ADN") 2ª edición, Keller G.H., Manak,
M.M., Stockton press, sección 5 a 9, 1993) ó en las histoquímicas
técnicas, citoquímicas o de citometría de flujo.
Los ejemplos que siguen a continuación permiten
ilustrar algunas ventajas de la invención.
La p-naftolbenzeína se adquiere
en Acros Organics (Geel, Bélgica). Los otros reactivos se adquieren
en Sigma Aldrich Chimie (St Quentin Fallavier, Francia). Se
disuelve la p-naftolbenzeína (1,87 g, 5 mmoles) en
20 ml de acetona con una agitación vigorosa. Se añaden 5 ml de
hidróxido de potasio a una concentración de 1,4 moles/litro a esta
solución seguido de 10 ml de acetona. A continuación se añaden 5 ml
de agua gota a gota para generar una solución de color azul
intenso. Se añaden 10 mmoles de
\alpha-acetobromogalactosa (4,1 g) en 10 ml de
acetona, a la solución. Para mantener el pH a un valor superior,
11,2 ml, de una solución de hidróxido de potasio de 20 moles/litro,
se añaden una primera vez después de 30 minutos de agitación y una
segunda vez después de 90 minutos de agitación. Se efectúa una
tercera adición de solución alcalina después de 3,5 horas seguida
de una adición de 5 ml de
\alpha-acetobromogalactosa en acetona a la misma
concentración que anteriormente. Después de 4,5 horas, tiene lugar
una última adición de solución alcalina, y la solución se deja en
agitación durante la noche.
La acetona se elimina a presión reducida y la
solución residual se vierte en 300 ml de una solución de carbonato
de sodio de 0,06 moles/litro a una temperatura de 0ºC con agitación.
El precipitado de color pardo se filtra al vacío, se lava con agua
y se seca al aire. El sólido se disuelve en 100 ml de diclorometano
y se lava intensamente con una solución de hidróxido de potasio a
0ºC para eliminar la p-naftolbenzeína en exceso. La
p-naftolbenzeína residual se elimina por agitación
sobre una resina Dowex Maratón en 100 ml de agua a pH 11 durante 2 a
3 horas. Esta purificación es seguida de una cromatografía de capa
fina utilizando como disolvente acetato de etilo/tolueno (3:1) con
un revelado con amoniaco. La solución de color amarillo intenso se
seca durante la noche con sulfato de magnesio anhidro, se evapora a
presión reducida, se reconstituye con metanol y a continuación se
evapora de nuevo para obtener una espuma. Esta espuma se disuelve
en 50 ml de metanol y el producto se desprotege durante 5 horas
empleando 20 ml de metóxido de sodio en metanol a 0,4 moles/litro.
La solución se ajusta a continuación a pH 6,5 empleando una resina
IR120 (H^{+}), se separa por decantación y el disolvente se
elimina a presión reducida. El glicósido formado,
p-naftolbenzein-\beta-D-galactósido
(1,5 g) se presenta bajo la forma de un polvo de color amarillo
pardo.
La p-naftolbenzeína se disuelve
en piridina anhidra y a continuación se enfría a 0ºC y se añade a
esta solución anhídrido acético (exceso molar de 5 veces) disuelto
en piridina en frío. Después de 24 horas a temperatura ambiente, la
solución se trata con agua fría añadida gota a gota con agitación
para descomponer el exceso de agente acetilante. Se forma un
precipitado del éster el cual se elimina por filtración al vacío, se
lava con ácido acético y se recristaliza en caliente con ácido
acético.
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución fría de
p-naftolbenzeína en piridina anhidra se añade con
agitación, 1,2 exceso molar de ácido clorosulfónico a -15ºC.
Después de 1 hora a -15ºC y 30 minutos a temperatura ambiente, se
evapora el exceso de piridina a presión reducida y la sal de
piridinio se descompone por disolución en etanol y tratamiento con
una solución de hidróxido de potasio en etanol hasta pH 10. La sal
de potasio se filtra al vacío, se lava con etanol y a continuación
con éter dietílico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El
6-nitroso-4-clororesorcinol
(2,94 g, 20 mmoles) y el 1,3-dihidronaftaleno (3,20
g, 20 mmoles) se disuelven por separado en
butanol-1 (30 ml) y se mezclan. La mezcla reactiva
se calienta entre 50 y 60ºC mediante un baño maría y se añade ácido
sulfúrico (1,0 g) gota a gota con agitación, durante 30 segundos. La
solución se vuelve de color rojo oscuro y se forman cristales
rápidamente. Después de 15 minutos a 50ºC y 1 hora a temperatura
ambiente, se filtra el producto al vacío y se recristaliza a partir
de butanol-1 caliente para dar 2,8 g de cristales
de color rojo oscuro brillante de
8-cloro-1,2-benzoresorufina.
El derivado glucósido (2) se prepara mediante
una reacción Koenigs-Knorr como se ha descrito
anteriormente para el derivado p-naftolbenzeína. El
glucósido, bajo la forma protegida tetraacetilada, se aísla por
evaporación rotativa a partir de diclorometano y se desprotege
directamente utilizando una cantidad catalítica de metóxido de
sodio en metanol anhidro. El glicósido se presenta bajo la forma de
un polvo de color amarillo anaranjado.
\vskip1.000000\baselineskip
La forma de preparación del derivado
\beta-D-galactósido (3) es
idéntica a la descrita en el ejemplo 4 empleando el derivado
\beta-D-galactósido bajo la forma
protegida tetraacetilada en lugar del equivalente glucósido.
El
3-hidroxi-9-fenil-1,2:7,8-dibenzo-6-fluorona
se prepara a partir del 1,3-dihidroxinaftaleno
(Aldrich, 14529-7) por condensación en caliente con
el \alpha,\alpha,\alpha-trifluortolueno
(Aldrich, T6370-3) en presencia de un ácido Lewis
como el SnCl_{4} ó ZnCl_{2} en un disolvente de alto punto de
ebullición como el clorobenceno o el xileno. Después de la
hidrólisis del ácido Lewis, y purificación del compuesto intermedio,
se prepara el derivado galactósido (4) como se ha descrito en el
ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
bis
Una mezcla de 50 g de ácido sulfúrico y 130 ml
de agua, se añaden lentamente a una solución mantenida a 0ºC y bajo
agitación, de fenol (20 g), nitrito de sodio (18 g) e hidróxido de
sodio (9 g) en 500 ml de agua. Después de 2 horas de reacción, se
recoge el producto, se lava con agua helada. Después de la
recristalización en agua, se aísla el producto
p-nitrosofenol puro (13,4 g).
El p-nitrosofenol así preparado
(12,3 g, 0,1 moles) así como la
N-fenil-2-naftilamina
(14,5 g, 0,067 moles, Aldrich, 17,805-5) se
disuelven en etanol (400 mg) y la mezcla se enfría a 15ºC. A esta
solución se añade HCl concentrado (15 g). La temperatura aumenta
espontáneamente y el producto isorosindona (bajo la forma de sal
clorhidrato) se separa por filtración y se recristaliza en una
mezcla etanol-agua (50%-50%). El producto
recristalizado puede convertirse en su forma de base libre
disolviéndolo en primer lugar en etanol y a continuación añadiendo
hidróxido de amonio y finalmente añadiendo la solución en agua
caliente.
La base libre (isorosindona) precipita en forma
de cristales de color pardo oscuro, enfriando la solución. La
filtración al vacío conduce a 15 g de producto puro.
El producto diana (5) se obtiene calentando la
isorosindona a reflujo en una solución concentrada de KOH en
butanol-1. El producto se purifica por cromatografía
flash sobre sílice con acetato de etilo como diluyente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6
terc
El derivado galactósido del
nafto-safranol se prepara según el mismo protocolo
que se ha descrito para el
ejemplo 1.
ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepara un medio de agar sólido que contiene
PNB-gal, como sigue:
Se añaden 41 g de agar Columbia a 1 litro de
agua destilada con 100 mg de PNB-gal y 30 mg de IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactósido)
para facilitar la inducción de la actividad
\beta-galactosidasa. El agar se esteriliza
mediante autoclave a 116ºC durante 10 minutos. El medio se enfría
lentamente a 55ºC antes de repartirlo en cajas de 20 ml.
Se recogen 367 cepas diferentes incluyendo 303
Enterobacteriaceae a partir de muestras clínicas y medio
ambientales e identificadas por la colección API 20E (Bio Merieux,
Francia) como método de referencia. Las cepas se cultivan en un
medio de agar Columbia a 37ºC durante 24 horas, a continuación se
prepara un inóculo de aproximadamente 10^{8} organismos/ml
(equivalente a un estándar McFarland de 0,5) por cada cepa.
Utilizando un inoculador Denley, se inocula 1 microlitro de cada
suspensión en el medio PNB-gal preparado más arriba
a razón de 20 cepas por caja. Todas las cajas se incuban a 37ºC
durante 18 horas. Después de la incubación, se examinan las cajas
en función de la presencia de una colonia violeta en comparación con
el crecimiento sobre el medio de agar Columbia. Los resultados
están expuestos en la tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esta tabla muestra una buena eficacia del
substrato como indicador de la actividad
\beta-galactosidasa. No se detecta ninguna cepa
sin actividad \beta-galactosidasa lo cual
significa que no existen falsos positivos y la sensibilidad sobre
las cepas Enterobacteriaceae es del 95,1% respecto al método
de referencia API 20E.
El medio a continuación, base Columbia con una
concentración de 46,37 g/litro,
isopropil-tio-\beta-D-galactósido
(IPTG) con 0,03 g/litro,
p-naftolbenzeína-\beta-D-galactósido
con 0,1 g/litro, se ha ajustado a diferentes pH
(5,5-6,0-6,5-7,0-7,5-8,0-8,5)
a 24ºC después de tratar los medios en autoclave. Estos diferentes
medios repartidos en cajas de Petri han sido inoculados
aisladamente en tres cuadrantes a partir de la suspensión con 0,5
Mc Farland de microorganismos bien caracterizados procedentes de
colecciones tipo ATCC ó NCTC. Las cajas han sido incubadas a 37ºC
durante 48 horas. Las colonias formadas han sido examinadas
visualmente después de 24 y 48 horas de incubación, anotándose el
color. Los resul-tados se exponen en la tabla II que
sigue a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
"-" significa una ausencia de coloración,
TI representa el tiempo de incubación de las cajas.
Según las cepas y la duración de la incubación,
el color de las colonias varía en función del pH. En general, es
más de naranja a pardo a pH ácido y de verde a caqui a pH alcalino.
Esto permite diferenciar distintos grupos de microorganismos,
adaptar el color en función de las necesidades (asociación con otros
substratos enzimáticos, indicadores del pH), ó poner en evidencia
varios metabolismos (hidrólisis enzimática y variación del pH) lo
cual es una ventaja del substrato PNB-gal.
\vskip1.000000\baselineskip
En los medios Columbia, Trypcase Soja (GTS) y
MacConkey Sorbitol (SMAC), se ha añadido la mezcla siguiente:
Isopropil-tio-\beta-D-gaslactósido
\dotl0,03 g/litro
p-naftolbenzein-\beta-D-galactósido
\dotl0,1 g/litro
\vskip1.000000\baselineskip
Después del tratamiento en autoclave, el pH de
los medios fue a 23ºC: 7,1 - 7,1 y 7,2 en los medios SAMC, GTS y
Columbia respectivamente. Estos diferentes medios repartidos en
cajas de Petri han sido inoculados aislados en tres cuadrantes a
partir de la suspensión a 0,5 McFarland de microorganismos bien
caracterizados procedentes de la colección tipo ATCC ó NCTC. Las
cajas han sido incubadas a 37ºC durante 48 horas. Las colonias
formadas se han examinado visualmente después de 24 y 48 horas de
incubación, y se ha anotado el color. Los resultados están
mostrados en la tabla III a continuación:
"-" significa ausencia de coloración, TI
representa el tiempo de incubación de la caja.
Según las cepas y la duración de la incubación,
el color de las colonias varía en función del medio. En general, es
de color naranja sobre el medio SMAC y de color pardo sobre el medio
Columbia, sin que esta diferencia de color pueda ser atribuida al
pH del medio. Sobre el medio SMAC, es posible diferenciar la
Serratia marcescens de las otras bacterias, lo cual no
ocurre sobre los otros medios. Además, puede ser interesante poder
adaptar el color de las colonias obtenido con el
p-naftolbenzein-\beta-D-galactósido
en función de la utilización de otros substratos enzimáticos que
dan otros colores (por ejemplo, rosa o pardo).
\global\parskip0.880000\baselineskip
En el medio siguiente:
Extracto de levadura
\dotl6 g/litro
Peptona de gelatina
\dotl5 g/litro
NaCl
\dotl8 g/litro
Carbonato de Na
\dotl0,1 g/litro
Isopropil-tio-\beta-D-galactósido
\dotl0,03 g/litro
Agar
\dotl13 g/litro
se añade bien sea el
5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido
(X-gal), o bien sea el
p-naftolbenzein-\beta-D-galactósido
(PNB-Gal) a 0,1 g/litro. Hemos inoculado estos
diferentes medios repartidos en cajas de Petri con microorganismos
bien caracterizados procedentes de colección del tipo ATCC ó NCTC.
Las cajas se han incubado a 37ºC durante 48 horas con diferentes
atmósferas: aerobiosa (AE), microaerofilia (MAP), anaerobiosa (ANA),
CO_{2}, por mediación del sistema GENbox (BioMérieux, Francia),
para el control de la atmósfera. Las colonias formadas han sido
examinadas visualmente después de 24 y 48 horas de incubación,
anotando la intensidad de coloración. Los resultados están
expuestos en la tabla IV a continuación:
^{*}: intensidad de coloración (escala
arbitraria a partir de una observación visual); "-" significa
una ausencia de coloración; TI significa tiempo de incubación.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Si el X-Gal permite detectar una
actividad sobre la cepa de E. faecium contrariamente al
PNB-Gal, para las cepas que hidrolizan fuertemente
el X-Gal en aerobiosis (E. coli, E. cloacae),
el PNB-Gal permite detectar esta actividad
\beta-D-galactosidasa
independientemente de la atmósfera y más intensamente. En efecto,
si las intensidades son débiles o mejor dicho, muy débiles, en las
condiciones del ensayo 3, entonces son fuertes en las condiciones
del ensayo 7.
El substrato CBR-gal se
incorpora en un agar Columbia a las concentraciones siguientes: 2,
6, 10 y 20 mg/100 ml y el medio así preparado se reparte en cajas.
Cada caja se inocula con los organismos siguientes: E. coli
(NCTC, 10418), K. pneumoniae (NCTC, 10896), P.
rettgeri (NCTC, 7475), E cloacae (NCTC, 11936), S.
marcescens (NCTC, 10211) y S. typhimurium (NCTC, 74). Se
incorpora IPTG en todos estos medios a una concentración de 3 mg
por 100 ml de agar Columbia. Todas las cajas se incuban a 37ºC
durante la noche.
Las cepas positivas para la actividad
\beta-galactosidasa (E.coli, K. pneumoniae, E.
cloacae y S.marcescens) hidrolizan rápidamente el
substrato después de una incubación de una noche dando una
coloración rosa que está limitada a la colonia bacteriana. Todas
las concentraciones ensayadas permiten diferenciar las especies,
pero la concentración óptima para obtener una coloración rosa
claramente visible sin ruido de fondo se sitúa hacia los 10 mg/100
ml. En todas las concentraciones ensayadas no se observa ninguna
inhibición del crecimiento.
El substrato CBR-gal se ensaya
en un medio líquido a diferentes concentraciones de 0,5 mg/ml a
0,0078 mg/ml. El medio de reacción líquido en el cual se incorpora
el substrato está compuesto de un tampón de fosfato de pH 7,4 que
contiene 0,5% de caldo nutritivo y 0,5% de NaCl. Se añaden 30
microlitros/ml de IPTG en el medio para todas las concentraciones
del substrato. Las cepas ensayadas son E. coli (NCTC, 10418),
K. pneumoniae (NCTC, 10896), P. rettgeri (NCTC,
7475), E. cloacae (NCTC, 11936), S. marcescens (NCTC,
10211) y S. typhimurium (NCTC, 74) con un inóculo de 0,5
McFarland.
Todas las cepas que poseen una actividad
\beta-galactosidasa generan una coloración rosa en
el curso del tiempo, como está resumido en la tabla V a
continuación.
Claims (25)
1. Substrato enzimático de fórmula general
(I):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual
X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de
carbono substituido con un grupo fenilo, estando dicho grupo fenilo
eventualmente substituido en posición meta o para,
Y y Z representan un átomo de hidrógeno cuando X
representa un átomo de carbono ó Y y Z representan conjuntamente un
enlace éter, tioéter o amina eventualmente substituida con un grupo
alquilo o arilo,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes, ó R_{1} y R_{2} representan juntos un
núcleo bencénico fusionado substituido o no,
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima.
2. Substrato enzimático según la reivindicación
1, caracterizado por el hecho de que la enzima es de la
familia de las osidasas como la
\beta-glucuronidasa, la
\beta-galactosidasa, la
\beta-glucosidasa, la
6-fosfogalactohidrolasa, la
\alpha-galactosidasa, la
\alpha-amilasa, la
\alpha-glucosidasa, las hexosaminidasas como la
N-acetil-\beta-glucosaminidasa
o la
N-acetil-\beta-galactosaminidasa,
de la familia de las esterasas, de las lipasas, de las fosfatasas,
de las sulfatasas, de las DNasas, de las peptidasas y de las
proteasas.
3. Substrato enzimático según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de
que R es un residuo del tipo azúcar \alpha- ó \beta- de
preferencia la \beta-D-glucosa o
la \beta-D-galactosa, o un
\beta-D-glucuronato, o un fosfato,
un sulfato, un acetato.
4. Substrato enzimático según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula general (II):
en la
cual,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no,
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes,
R_{5} representa H, NO_{2}, CF_{3}, CN,
OCH_{3}, F, I, Cl, Br, SO_{3}H, CO_{2}H en posición meta o
para,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Substrato enzimático según la reivindicación
4, caracterizado por el hecho de que
R_{1} y R_{2} representan conjuntamente un
núcleo bencénico fusionado,
R_{3} y R_{4} representan un átomo de
hidrógeno,
R_{5} representa un hidrógeno,
R representa un residuo del tipo azúcar
\alpha- ó \beta- de preferencia la
\beta-D-glucosa o la
\beta-D-galactosa, o un sulfato o
un acetato.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Substrato enzimático según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula general (III):
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no,
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes,
R_{5} representa H, NO_{2}, CF_{3}, CN,
OCH_{3}, F, I, Cl, Br, SO_{3}H, CO_{2}H en posición meta o
para,
R representa un grupo tal, que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Substrato enzimático según la reivindicación
6, caracterizado por el hecho de que
R_{1} y R_{2} representan conjuntamente un
núcleo bencénico fusionado,
R_{3} y R_{4} representan un átomo de
hidrógeno,
R_{5} representa H,
R representa un residuo del tipo azúcar
\alpha- ó \beta- de preferencia la
\beta-D-glucosa o la
\beta-D-galactosa.
8. Substrato enzimático según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula general (IVa):
en la
cual,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia, R_{1} representa H y R_{2} representa Cl.
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia R_{3} y R_{4}
representan H.
R representa un grupo tal que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo de tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa o
la \beta-D-galactosa.
9. Substrato enzimático según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula general (IVb):
en la
cual,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia, R_{1} representa H y R_{2} representa Cl.
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia R_{3} y R_{4}
representan H.
R representa un grupo tal que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo de tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa o
la \beta-D-galactosa.
10. Substrato enzimático según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, de fórmula general (IVc):
en la
cual,
A representa un grupo arilo o alquilo,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no. De
preferencia, R_{1} representa H y R_{2} representa Cl.
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes. De preferencia R_{3} y R_{4}
representan H.
R representa un grupo tal que el enlace
O-R es hidrolizable por una enzima. En particular, R
representa un residuo de tipo azúcar \alpha- ó \beta-, de
preferencia la \beta-D-glucosa o
la \beta-D-galactosa.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Substrato enzimático según la reivindicación
8, caracterizado por el hecho de que
R_{1} representa H y R_{2} representa
Cl,
R_{3} y R_{4} representan H,
R representa un residuo de tipo azúcar \alpha-
ó \beta-, de preferencia la
\beta-D-glucosa o la
\beta-D-galactosa.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Substrato enzimático según la reivindicación
10, caracterizado por el hecho de que
R_{1}, R_{2} y R_{3} representan H,
A representa un fenilo,
R representa un residuo de tipo azúcar \alpha-
ó \beta-, de preferencia la
\beta-D-glucosa o la
\beta-D-galactosa.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Procedimiento de síntesis de un substrato
enzimático según la reivindicación 1, caracterizado por el
hecho de que se prepara un compuesto intermedio de fórmula general
(V) y se injerta sobre el hidroxilo un grupo R convenientemente
protegido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la
cual
X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de
carbono substituido con un grupo fenilo, estando dicho grupo fenilo
eventualmente substituido en posición meta o para,
Y y Z representan un átomo de hidrógeno cuando X
representa un átomo de carbono ó Y y Z representan conjuntamente un
enlace éter, tioéter o amina substituida eventualmente con un grupo
alquilo o arilo,
R_{1} y R_{2} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes o R_{1} y R_{2} conjuntamente,
representan un núcleo bencénico fusionado substituido o no,
R_{3} y R_{4} representan cada uno,
independientemente uno de otro, H, Cl, F, I, Br y pueden ser
idénticos o diferentes.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado por el hecho de que el compuesto intermedio
corresponde a la fórmula (Va) siguiente:
15. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado por el hecho de que el compuesto intermedio
corresponde a la fórmula (Vb) siguiente:
16. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado por el hecho de que el compuesto intermedio
responde a la fórmula (Vc) siguiente:
17. Composición para la detección y/o la
identificación y/o la cuantificación de por lo menos un
microorganismo que comprende por lo menos un substrato enzimático
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un medio
reactivo apropiado a dicho microorganismo o a los dichos
microorganismos.
18. Composición según la reivindicación 17,
caracterizada por el hecho de que dicha composición contiene por lo
menos dos substratos según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 12, y cuya hidrólisis enzimática conduce a productos coloreados
y/o fluorescentes diferentes.
19. Composición según la reivindicación 17 ó
18, caracterizada por el hecho de que comprende además otro
substrato enzimático diferente de los substratos según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y cuya hidrólisis
enzimática conduce a un producto coloreado o fluorescente diferente
del liberado por la hidrólisis enzimática del substrato utilizado
según la reivindicación 17 ó de los liberados por la hidrólisis
enzimática de los substratos utilizados según la reivindicación
18.
20. Composición según la reivindicación 17, 18 ó
19, caracterizada por el hecho de que el medio reactivo es
sólido, semisólido o líquido.
21. Composición según una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 20, caracterizada por el hecho de que
la concentración del substrato enzimático en el medio reactivo está
comprendida entre 0,02 y 1 g/litro, de preferencia entre 0,03 y
0,30 g/litro y más preferentemente entre 0,04 y 0,10 g/litro.
22. Kit de diagnóstico que contiene una
composición según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, y
un recipiente para el medio reactivo.
23. Procedimiento para la detección y/o la
identificación y/o la cuantificación de por lo menos un
micro-organismo en una muestra,
caracterizado por el hecho de que:
se pone en contacto el microorganismo procedente
de la muestra con un medio reactivo que contiene un substrato
enzimático como se describe en las reivindicaciones 1 a 12, para
obtener un medio inoculado, y se detecta el producto coloreado o
fluorescente formado por la hidrólisis de dicho substrato
enzimático.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
caracterizado por el hecho de que se incuba el medio reactivo
inoculado en una atmósfera controlada como en condiciones aeróbicas,
anaeróbicas, microaerofílicas o en atmósfera de CO_{2}, de
preferencia en condiciones aeróbicas, microaerofílicas y
CO_{2}.
25. Utilización de un substrato enzimático según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para la detección de
un analito, utilizando técnicas que ponen en juego una actividad
enzimática tales como la técnica ELISA en donde el analito es un
anticuerpo o un antígeno o un ácido nucleico, o utilizando técnicas
de biología molecular en donde el analito es un gen del tipo
\beta-galactosidasa.
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