ES2276514T3 - Derivados de indolamina para detectar peptidasas en microorganismos. - Google Patents

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Abstract

Utilización de por lo menos un compuesto de fórmula (I): X-NH-R (I) en la que X representa un grupo indol-3-ilo opcionalmente sustituido, y R representa el resto acilo de un aminoácido o de un péptido, estando el grupo o grupos amina presentes en R opcionalmente en forma protegida, como un agente revelador, siendo dicho agente añadido a un medio de cultivo y haciendo posible dar a conocer, mediante formación de una coloración o una fluorescencia en dicho medio, una actividad de peptidasa en medio de cultivo de microorganismos, o la presencia de un microorganismo o de un grupo de microorganismos que expresa tal actividad en dicho medio, con la excepción de la utilización de un compuesto de fórmula (I) para la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa un resto de leucilo o alanilo.

Description

Derivados de indolamina para detectar peptidasas en microorganismos.
La presente invención se refiere a la utilización de por lo menos un compuesto a base de un derivado de indolamina para dar a conocer una actividad de aminopeptidasa o de peptidasa en un cultivo de microorganismos, así como a un procedimiento y a un medio de cultivo para detectar tal actividad enzimática o para identificar microorganismos que expresan o no expresan esta actividad.
"Aminopeptidasa" es el término proporcionado generalmente a una enzima que es capaz de romper, mediante hidrólisis, el grupo amida formado entre un acilo de aminoácido y una amina primaria, y "peptidasa" es el término dado a una enzima que es capaz de escindir, mediante hidrólisis, el grupo amida formado entre el resto de acilo de un péptido y una amina primaria. En la presente Solicitud, el término "peptidasa" se puede referir, dependiendo de los casos, tanto a peptidasa como se define anteriormente, como a aminopeptidasa.
La detección e identificación de microorganismos son muy importantes en particular en medicina, en la industria agroalimentaria, o para monitorizar el medioambiente (por ejemplo, para controlar el agua). Los microorganismos se pueden buscar por su patogenicidad, como indicadores de contaminación, o para monitorizar procedimientos de fabricación.
Las técnicas para detectar e identificar microorganismos se basan actualmente en la búsqueda de secuencias nucleotídicas características, en la búsqueda de antígenos o anticuerpos, en el cultivo en medio selectivo o no selectivo, o en la búsqueda de actividades metabólicas y en particular enzimáticas (por ejemplo, actividades de osidasa, esterasa, peptidasa, oxidasa, etc.).
Habitualmente, los procedimientos para detectar e identificar microorganismos combinan varias de estas técnicas. De este modo, el cultivo se usa para multiplicar y seleccionar los microorganismos deseados. A fin de simplificar su detección, se ha propuesto dar a conocer las actividades bioquímicas introduciendo, directamente en el medio de cultivo, moléculas que producen una coloración o una fluorescencia. Dichos medios se denominan medios de detección. Las actividades bioquímicas buscadas se pueden dar a conocer mediante diversos procedimientos, tales como:
-
modificando fisicoquímicamente el medio: por ejemplo, cambiando el pH, dado a conocer con la ayuda de un indicador coloreado o fluorescente (metil-umbeliferona),
-
cambiando el potencial redox, dado a conocer con la ayuda de un indicador coloreado (sal de tetrazolio) o fluorescente,
-
haciendo reaccionar una molécula producida por los microorganismos con un compuesto presente en el medio, lo que conduce a una coloración,
-
o también hidrolizando moléculas que liberan un compuesto coloreado o fluorescente (naftol, cumarina).
Las hidrólisis detectadas son generalmente el resultado de la reacción de una enzima producida por el microorganismo con un sustrato enzimático natural o sintético. Estas actividades enzimáticas son, por ejemplo, aquellas de las siguientes enzimas: esterasas (por ejemplo, lipasas, fosfatasas), osidasas (\beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, N-acetilhexosaminidasa), peptidasas (alanina aminopeptidasa, tripsinasa, gelatinasa), ADNasas, descarboxilasas, desaminasas, ureasas, triptofanasas, oxidasas, catalasas, etc.
Además, se sabe que los medios gelificados son particularmente muy adecuados para cultivar y aislar microorganismos a partir de una muestra, así como también para detectar microorganismos "diana" en una mezcla de microorganismos. En estos medios, los microorganismos forman colonias que se pueden detectar a simple vista, y es muy deseable que los productos de las actividades bioquímicas buscadas permanezcan localizados en su sitio de producción. De hecho, esto hace posible distinguir una colonia de sus vecinas si no expresan las mismas actividades. De este modo, se pueden usar diversos procedimientos que detectan, por ejemplo, cambios en el pH (documento FR-A-2.671.100), actividades de esterasa (documento FR-2.457.323), actividades de osidasa (documento FR-A-2.684.110), etc. Por supuesto, es posible usar varios de estos procedimientos juntos, a fin de detectar varias especies o cepas, y/o a fin de incrementar la sensibilidad y/o especificidad de la detección.
Las patentes US-B-5.210.022 y US-B-5.358.854 describen sustratos cromogénicos que son sensibles a la acción de \beta-galactosidasa. Estos sustratos derivados de 3-hidroxiindol son, por ejemplo, indolil-\beta-D-galactósidos, cuyo núcleo de indol puede tener sustituyentes halogenados en las posiciones 4, 5, 6 ó 7.
Del documento DE 41.19.956 se conoce la utilización de la L-prolin-4-nitroalinina como agente cromogénico revelador de la actividad de aminopeptidasa de baterias.
El documento EP-A-0.224.830 describe un procedimiento para detectar bacterias Gram-negativas en una muestra de orina, en la que se añade a la muestra un extracto natural originado a partir de una cierta especie de cangrejo, y después, tras la incubación, la muestra se pone en contacto con un soporte que contiene un sustrato peptídico que comprende un grupo saliente cromogénico. El extracto natural usado contiene una proenzima, y si la muestra contiene bacterias Gram-negativas en un número suficiente, las endotoxinas de estas bacterias activan la proenzima a una enzima que es capaz de escindir el sustrato peptídico con formación de un producto coloreado en el
soporte.
Actualmente no existe ningún medio disponible, que sea adecuado para medios gelificados, para detectar actividades de aminopeptidasa y de peptidasa de microorganismos. En efecto, los sustratos enzimáticos usados hasta ahora han tenido el inconveniente de liberar moléculas coloreadas o fluorescentes que se difunden en los medios gelificados, o que sólo son reveladas con radiación U.V. (en el caso de naftilamina o de aminocumarina), o que requieren la adición de reactivos (en el caso de naftilamina), o cuya coloración tiene un contraste relativamente malo en los medios de reacción usados en microbiología (en el caso de nitroanilina).
En la presente solicitud, un término tal como (aminoácido)-BIA o (péptido)-BIA se refiere a un compuesto tal como 3-acilamino-5-bromoindol, cuyo acilo es el de dicho aminoácido o de dicho péptido.
Se sabe que la L-leucin-aminopeptidasa ha demostrado, en secciones histológicas de mamíferos, por medio de un sustrato enzimático, 3-L-leucilamino-5-bromoindol, también denominado L-leucina-3-(5-bromo-indolamina), conocido como L-Leu-BIA de forma breve, que produce un compuesto coloreado tras la hidrólisis; véase Pearson et al., 1963, Lab. Invest., 12: 712. En 1967, YARBOROUGH et al., J. Reticuloendoth. Soc., 4: 390 repitió la técnica de Pearson et al. en aplicaciones similares (secciones histológicas). Estos autores especifican que la adición de una muestra de ferri- o ferrocianuro potásico o sulfato de cobre inhibe la reacción.
En 1975, LOJDA y HAVRANKOVA, Histochemistry, 43: 355, propusieron mejorar el procedimiento usando el sustrato L-Leu-BIA añadiendo una mezcla de sal de tetrazolio y metosulfato de fenacina, derivándose la reacción coloreada observada, en este caso, de la reducción de la sal de tetrazolio a formazano.
El documento WO 98/04735, que se publicó después de la fecha de prioridad de la que se beneficia la presente Solicitud, describe la utilización de un derivado de acilación de 5-bromoindolamina, seleccionándose el acilo a partir de restos de leucilo y alanilo, como agente revelador para demostrar, mediante formación de un producto coloreado, una actividad de peptidasa en un cultivo de microorganismos.
En el curso de los estudios que condujeron a la presente invención, se llevó a cabo una investigación para saber si era posible usar este sustrato enzimático para detectar microorganismos cultivados, en particular en medios gelificados. Durante los ensayos preliminares, se añadió L-Leu-BIA o L-Pro-BIA a un medio actualmente usado para la búsqueda de osidasas, que se describe en el Ejemplo 1 más abajo. No fue posible demostrar una actividad de leucina-aminopeptidasa o de prolina-aminopeptidasa, independientemente del microorganismo cultivado en este medio (en particular los géneros Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Pseudomonas, Enterococcus, Staphylococcus y Streptococcus). La adición de los reactivos propuestos por LOJDA y HAVRANKOVA se reflejó en una inhibición más o menos total del crecimiento de los microorganismos sin permitir la revelación de una actividad de peptidasa con L-Leu-BIA o L-Pro-BIA.
Por el contrario, si se añade 7-L-leucilamino-4-metilcumarina (L-Leu-AMC) o 7-L-prolilamino-4-metilcumarina (L-Pro-AMC) al mismo medio del Ejemplo 1, se detecta una fluorescencia (y de este modo una actividad de leucina-aminopeptidasa o de prolina-aminopeptidasa) con algunos de estos mismos microorganismos (véase el Ejemplo 1). De forma similar, en este medio, con sustratos de osidasa (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido y 6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónido), se pueden detectar las actividades de \beta-galactosidasa y \beta-glucuronidasa de los microorganis-
mos.
Tampoco fue posible demostrar una actividad de peptidasa con L-Leu-BIA o L-Pro-BIA con el medio usado en el Ejemplo 2 más abajo.
En la actualidad se ha descubierto que la ausencia de resultados con los derivados de indolamina no fue debida a una incompatibilidad con los microorganismos, o a una inhibición de su multiplicación durante el cultivo, sino que fue debida esencialmente a las condiciones del medio. De hecho, se ha descubierto que es posible dar a conocer la actividad de peptidasa de microorganismos con derivados de indolamina usando otros medios de cultivo. Se desconocen las razones por las cuales se pueden usar ciertos medios y otros no. Sin embargo, es posible determinar y desarrollar mediante ensayos simples normales, similares a los descritos en la sección experimental más abajo, los medios y/o ingredientes que son adecuados o que son inadecuados. De este modo, la invención consiste en primer lugar, en particular, en investigar, y asegurar que era posible encontrar, medios de cultivo en los que se pueden usar los sustratos de peptidasas derivados de indolamina mencionados anteriormente para dar a conocer las actividades enzimáticas correspondientes en un cultivo de microorganismos.
De este modo, se descubrió en particular que un medio que se puede usar es el siguiente, que contiene:
- Extracto de levadura 0,5-25 g/l
- Peptona de gelatina 0,5-25 g/l
- NaCl 0-50 g/l
y, eventualmente:
- Agente regulador de pH, cantidad suficiente para pH = 3 a 9
y/o:
- Agente gelificante 5-35 g/l
El agente gelificante es un agente gelificante convencional, por ejemplo agar.
El pH seleccionado es un pH que es adecuado para el microorganismo estudiado. En el caso de un medio gelificado, el pH es preferiblemente de 5 a 9. El pH se puede ajustar, por ejemplo, con ácido clorhídrico o con carbonato de
sodio.
Por ejemplo, si se añade L-Pro-BIA a tal medio, y se lleva a cabo una inoculación con microorganismos, dependiendo de qué microorganismos expresen o no la actividad de L-prolina-aminopeptidasa, se obtienen colonias marrones o incoloras.
Se han obtenido resultados comparables con sustratos tales como 3-acilamino-indol, en los que el acilo es el resto acilo de un aminoácido o de un péptido.
De este modo, un objeto de la invención es la utilización de por lo menos un compuesto de fórmula (I):
(I)X-NH-R
en la que X representa un grupo indol-3-ilo opcionalmente sustituido, y R representa el resto acilo de un aminoácido o de un péptido, estando el grupo o grupos amina presentes en R opcionalmente en forma protegida, como un agente revelador, para añadir dicho agente a un medio de cultivo de microorganismos y haciendo posible dar a conocer, mediante formación de una coloración o una fluorescencia en dicho medio, una actividad de peptidasa en dicho medio de cultivo, o la presencia de un microorganismo o de un grupo de microorganismos que expresa tal actividad en dicho medio, con la excepción de la utilización de un compuesto de fórmula (I) para la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa un resto de leucilo o alanilo. Por supuesto, la utilización según la invención también permite, cuando sea apropiado, observar la ausencia de la actividad de peptidasa buscada, y/o la ausencia del o de los microorganismos buscados.
El aminoácido o el péptido en el que R representa el resto acilo responde la fórmula RCOOH.
En los compuestos de fórmula (I), el grupo o grupos amina presentes en R, y en particular el grupo amina N-terminal, puede estar, si se desea, en una forma que esté protegida, en particular con la ayuda de los grupos protectores de amina temporales usados convencionalmente en la química de péptidos. La presencia o ausencia de tales grupos protectores no tiene ninguna influencia sobre la formación de un producto coloreado o fluorescente cuando la actividad de peptidasa buscada está presente en el medio de cultivo estudiado.
El grupo indolilo representado por X en la fórmula (I) puede comprender uno o más sustituyentes en por lo menos una de las posiciones 1, 4, 5, 6 y 7. Dichos sustituyentes se pueden seleccionar, en particular, de sustituyentes halógeno, alquilo inferior, arilo, aralquilo, alcoxi inferior y aralcoxi. En la presente Solicitud, los sustituyentes de alquilo inferior y alcoxi inferior, al igual que los grupos alquilo de los sustituyentes aralquilo y aralcoxi, comprenden en particular de 1 a 4 átomos de carbono. Los sustituyentes halógeno pueden ser flúor, cloro, bromo y yodo, en particular cloro y/o bromo. Los sustituyentes arilo son, en particular, grupos fenilo opcionalmente sustituidos con, por ejemplo, grupos alquilo inferior, halógeno o alcoxi inferior. El sustituyente opcionalmente presente en la posición 1 es, en particular, un sustituyente alquilo inferior, por ejemplo metilo. Entre los grupos indol-3-ilo sustituidos, representados por X, se puede hacer mención en particular de los derivados de 4-cloro-, 6-cloro-, 5-bromo-, 1-metil-, 4-metil-, 5-metil-, 4,7-dimetil-, 4,6-dicloro-, 6,7-dicloro-, 4-cloro-5-bromo-, 4,5,7-tricloro-, 4,6,7-tricloro-, 4-cloro-5-bromo-7-metil-, 5-metoxi-, 5-bencil-, 5-benciloxi- y 5-fenilindol.
En la fórmula (I), cuando el grupo R representa el resto acilo de un aminoácido, es por ejemplo un resto alanilo, prolilo, leucilo, piroglutamilo o arginilo. Cuando el grupo R representa el resto acilo de un péptido, este péptido puede comprender hasta 10 restos de aminoácidos, en particular hasta 5 restos de aminoácidos, y en particular hasta 3 restos de aminoácidos. Entre los péptidos a partir de los cuales deriva el grupo R, se hará mención en particular de aquellos en los que el resto de aminoácido C-terminal se selecciona de restos de leucina, alanina, prolina y arginina. A título de ejemplo de un péptido, se puede hacer mención de alanil-fenilalanil-prolina, que da derivados de fórmula (I) para la cual R representa Ala-Phe-Pro-.
Los compuestos de fórmula (I) son solubles en medios acuosos. Se pueden preparar según los procedimientos habituales usados en síntesis de péptidos. Una indolamina de fórmula X-NH_{2}, siendo X como se define anteriormente, se puede hacer reaccionar en particular con un derivado de un aminoácido o de un péptido, satisfaciendo dicho aminoácido o dicho péptido la fórmula RH, siendo R como se define anteriormente. Dicho derivado de aminoácido o de péptido es un derivado con un grupo carboxilo activado y un grupo o grupos amina que se protegen con la ayuda de un grupo protector de función de amina primaria habitual. El grupo carboxilo activado es un derivado de grupo carboxílico que facilita la formación de una amida mediante reacción con aminas primarias, por ejemplo un grupo anhídrido mixto. Se sabe que un anhídrido mixto se puede obtener haciendo reaccionar, por ejemplo, un ácido con un cloroformiato de alquilo inferior.
Los grupos protectores y su utilización son bien conocidos: véase, por ejemplo, R. A. BOISSONAS, Adv. in Organic Chemistry, Methods and Results, Vol. 3, Interscience Publishers, 1963, p. 159 y las páginas subsiguientes. En el presente caso, se puede usar cualquier grupo protector de amina primaria usado en particular en química de péptidos, por ejemplo N-Cbz (N-benciloxicarbonilo) o N-Boc (N-butiloxicarbonilo), que se sabe que son grupos protectores de grupos amina temporales, siendo capaces de restaurar estos grupos, si se desea, mediante una simple hidrólisis ácida. Haciendo reaccionar la indolamina de fórmula X-NH_{2} con el derivado con un grupo carboxilo activado y un grupo amina protegido, y desprotegiendo después opcionalmente el grupo o grupos amina, se obtiene el compuesto de fórmula (I). La propia indolamina de fórmula X-NH_{2} se puede obtener, en particular, según un procedimiento que es similar al descrito por Madelung, Leibigs Annalen der Chemie, Vol. 405, p. 58-95
(1914).
La presente invención también se refiere a un procedimiento para dar a conocer una actividad de peptidasa en un cultivo de microorganismos en el que se añade, al medio de cultivo para dichos microorganismos, un agente revelador de fórmula (I) como se define anteriormente, y en el que se busca la posible formación, en el medio de cultivo, de un compuesto coloreado, entendiéndose que si se ha formado un compuesto coloreado, está presente la actividad de peptidasa buscada, y está ausente si no hay formación de un producto coloreado. En el procedimiento de la invención, por supuesto, se usa un medio de cultivo que se preselecciona por su capacidad para permitir la transformación de un sustrato de fórmula (I) en un producto coloreado cuando está presente una actividad de peptidasa correspondiente. En particular, se puede usar un medio tal como el descrito anteriormente.
En la presente solicitud, "producto coloreado" es la expresión dada a un producto que tiene un color intrínseco cuando se ilumina en luz blanca, por ejemplo, o un producto que emite una fluorescencia cuando se somete a irradiación con luz ultravioleta o visible, y la palabra "coloración" se refiere tanto a la presencia de un producto coloreado que tiene un color intrínseco cuando es iluminado con luz blanca, como a la presencia de un producto que emite una fluorescencia bajo la influencia de una radiación de longitud de onda apropiada.
La etapa en la que se busca la posible formación de un compuesto coloreado se implementa, por supuesto, cuando sea apropiado, después de un período de cultivo de forma que los microorganismos buscados se hayan multiplicado suficientemente para que sea detectable la actividad de peptidasa buscada si está presente.
Los compuestos de fórmula (I) se añaden al medio de cultivo en una concentración que es suficiente para detectar la actividad de peptidasa buscada. Para esta detección, se busca la aparición de una fluorescencia bajo irradiación con luz ultravioleta o visible, ya sea a simple vista o con la ayuda de un medio óptico adecuado. Esta concentración suficiente se puede predeterminar en cada caso mediante experimentos normales. El medio de cultivo puede contener, por ejemplo, desde 25 hasta 2000 mg/l del compuesto de fórmula (I).
Una de las ventajas de los compuestos de fórmula (I) es que los productos coloreados que forman en presencia de una actividad de peptidasa no se difunden en los medios de cultivo gelificados. De este modo, se pueden usar en medios gelificados. Por supuesto, también se pueden usar en medios líquidos.
Por otra parte, los sustratos de fórmula (I) no inhiben la multiplicación de los microorganismos en los medios de cultivo. De este modo, se pueden usar añadiéndolos al medio de cultivo en cualquier momento, incluyendo, si se desea, antes del comienzo del cultivo, en el comienzo del cultivo, o al final del cultivo. En el caso de un medio gelificado, por supuesto es preferible introducir el compuesto de fórmula (I) durante la preparación del medio de cultivo, antes de gelificar dicho medio.
La invención se refiere a un procedimiento para detectar un microorganismo o un grupo de microorganismos en una muestra que los contiene, o que es probable que los contenga. Este procedimiento comprende las etapas que consisten en añadir por lo menos un compuesto de fórmula (I) como se define anteriormente a un medio de cultivo que contiene la muestra, buscar la posible formación de un producto coloreado o fluorescente en dicho medio, y comparar, cuando sea apropiado, la coloración o fluorescencia obtenida con la obtenida con una muestra auténtica del microorganismo o del grupo de microorganismos buscado. En tal procedimiento, la detección se basa, por supuesto, en la expresión o ausencia de expresión, por el microorganismo o por el grupo de microorganismos buscado, de la actividad de peptidasa que el agente revelador de fórmula (I) usado permite dar a conocer.
Según un modo de realización particular del procedimiento para detectar microorganismos según la invención, también se puede añadir al cultivo por lo menos algún otro agente revelador para detectar, mediante formación de un producto coloreado o fluorescente, una actividad enzimática que puede ser la misma que aquella que se revela con la ayuda de los compuestos de fórmula (I) como se definen anteriormente, pero que generalmente es una actividad enzimática que es diferente de aquella revelada con la ayuda de los compuestos de fórmula (I). Por ejemplo, puede ser una actividad de esterasa, osidasa o peptidasa. De este modo, se puede obtener una información adicional, que está ligada con la ausencia de coloración (o de fluorescencia), o ligada con una coloración que está modificada con respecto a la coloración obtenida con un único sustrato enzimático. El otro agente revelador seleccionado tendrá propiedades que son diferentes de aquellas de los derivados de indolamina de fórmula (I): por ejemplo, se seleccionará otro agente revelador que es capaz de dar un producto de reacción que tenga un color que es diferente del color producido por la indolamina de fórmula (I). El otro agente revelador (o el segundo agente revelador) permitirá de este modo dar a conocer, debido a su color intrínseco o debido a su fluorescencia, la presencia de una actividad enzimática para la cual es específico. Si la actividad de peptidasa que se puede dar a conocer mediante los derivados de indolamina de fórmula (I) también está presente, se obtendrá una coloración modificada que es diferente de la coloración proporcionada por el compuesto de fórmula (I) cuando se usa solo, y también diferente de dicho color intrínseco proporcionado por el segundo agente revelador. Los ejemplos de utilización de varios sustratos, así como la información que se puede derivar de ellos, se dan más abajo en la sección experimental. Por supuesto, los resultados pueden variar con cada especie o cepa de microorganismo estudiada. De este modo, cada caso que tenga interés debe sufrir estudios previos según experimentos normales.
Los derivados que se usan para dar a conocer diferentes actividades enzimáticas, y que se pueden usar como otros agentes reveladores, son agentes reveladores conocidos o análogos de los mismos. En particular, son derivados de indoxilo, cumarina, resorufina, naftol, naftilamina, nitrofenol, nitroanilina, rodamina, hidroxiquinolina, fluoresceína, etc.
Entre estos otros agentes reveladores que se pueden usar en combinación con los derivados de indolamina, se puede hacer mención en particular de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-glucurónido, 6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido, L-alanina-7-amino-4-metilcumarina, 4-metilumbeliferil-N-acetil-\beta-D-galactosaminida, resorufin-\beta-D-galactósido, sulfato de \beta-naftilo, AS-BI \beta-D-galactósido naftol, L-alanina-\beta-naftil-amida, o-nitrofenol-\beta-D-galactósido, carboxibenzoil-L-arginina-p-nitroanilida, rodamina-110-bis(L-leucinaamida), hidroxiquinolin-\beta-D-glucósido y diacetato de
fluoresceína.
Las características y ventajas de la invención se ilustran con los siguientes ejemplos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1
\vskip1.000000\baselineskip
- Peptona de carne \code{1} 15 g/l
- Peptona de caseina \code{2} 3 g/l
- NaCl 5 g/l
- Tampón de Tris 0,5 g/l
- Na_{2}HPO_{4} 1 g/l
- Citrato de sodio 1 g/l
- Glucosa 1 g/l
- Piruvato de sodio 2 g/l
- Agar 13 g/l
\code{1} Comercializado por: D.I.F.C.O.
\code{2} Comercializado por: D.I.F.C.O. 
\vskip1.000000\baselineskip
Se añade L-Pro-BIA, o 7-L-prolilamino-4-metilcumarina (L-Pro-AMC), a este medio a una concentración de 200 mg/l. Los diversos medios obtenidos, que se distribuyen en cápsulas de Petri, se inoculan con microorganismos. Las cápsulas se incubaron a 37ºC durante 48 horas. Las colonias formadas se examinaron visualmente a la luz y bajo una lámpara de UV (longitud de onda = 365 nm) después de la incubación durante 24 y 48 horas. Se anotó el color o la presencia de fluorescencia. Los microorganismos estudiados fueron: Pseudomonas aeruginosa y Candida albicans.
Después de cultivar durante 24 ó 48 horas, no se observó coloración en los cultivos que contienen L-Pro-BIA, aunque estos cultivos contienen una actividad de L-Pro-peptidasa que se puede dar a conocer en los cultivos que contienen L-Pro-AMC: en este caso se observó la emisión de una fluorescencia bajo irradiación con UV.
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Cuando se añaden L-Ala-BIA, L-Leu-BIA, L-alanin-7-amino-4-metilcumarina (L-Ala-AMC) o L-leucin-7-amino-4-metilcumarina (L-Leu-AMC) al medio anterior, a concentraciones de 200 mg/l, no se observó coloración en el caso de los derivados de bromoindolamina (BIA) después de cultivar durante 24 ó 48 horas. Contrariamente, con los derivados de aminometilcumarina (AMC), se pudo dar a conocer la presencia de las actividades de L-alanin-aminopeptidasa y L-leucin-aminopeptidasa en el caso de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, P. aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium y Streptococcus pyogenes, y una ausencia de estas actividades con Staphylococcus epidermidis.
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Ejemplo 2
Se añadió L-Pro-BIA o L-Pro-AMC, a la concentración de 400 mg/l, a un tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,3, a 25ºC. El medio obtenido se distribuye en los pocillos de placas de microtitulación que se inoculan con suspensiones de P. aeruginosa o de C. albicans. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37ºC. Los pocillos se examinaron visualmente a la luz y bajo una lámpara de UV, tras la incubación durante 24 a 48 horas.
No se observó coloración con L-Pro-BIA, aunque es posible dar a conocer una actividad de L-Pro-aminopeptidasa en pocillos en los que L-Pro-BIA se ha sustituido por L-Pro-AMC.
De forma similar, la adición de L-Leu-BIA al tampón de fosfato mencionado anteriormente no permitió detectar una actividad de L-leucin-aminopeptidasa en los cultivos de E. coli, K. pneumoniae, C. freundii, P. aeruginosa, S. agalactiae, E. faecium y S. pyogenes, mientras que esta actividad se detecta, mediante emisión de fluorescencia después de 24 a 48 horas, para estas mismas bacterias, en el mismo tampón, con L-Leu-AMC.
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Ejemplo 3
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- Extracto de levadura \code{1} 6 g/l
- Peptona de gelatina \code{2} 5 g/l
- NaCl 8 g/l
- Na_{2}CO_{3} 0,1 g/l
- Agar 13 g/l
\code{1} Comercializado por BIOMERIEUX
\code{2} BIO-GELYTONE comercializado por BIOMERIEUX 
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Se añadió L-Pro-BIA, piroglutamil-BIA (Pyr-BIA) o Ala-Phe-Pro-BIA a este medio. Estos diversos medios, que se distribuyen en cápsulas de Petri, se inoculan con diversos microorganismos: E. coli, K. pneumoniae, C. freundii, P. aeruginosa, S. agalactiae, E. faecium, S. pyogenes, S. epidermidis, C. albicans y C. tropicalis. Las cápsulas se incuban a 37ºC durante 48 horas, y las colonias formadas se examinan visualmente después de la incubación durante 24 y 48 horas. Se anotó el color. Los resultados se presentan en la Tabla 1 más abajo:
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1
En el medio usado para este ejemplo, es posible así dar a conocer actividades de L-prolina-aminopeptidasa, piroglutamil-aminopeptidasa y alanina-fenilalanina-prolina-peptidasa con L-Pro-BIA, Pyr-BIA y Ala-Phe-Pro-BIA, respectivamente. En particular, las bacterias de la especie E. faecium (colonias incoloras con Ala-Phe-Pro-BIA) se pueden distinguir, de las bacterias del género Streptococcus estudiado (coloración marrón con Ala-Phe-Pro-BIA). La especie P. aeruginosa (colonias marrones con L-Pro-BIA) también se pueden distinguir de las otras bacterias Gram-negativas estudiadas. Las cepas de levadura de la especie C. albicans (colonias marrones con L-Pro-BIA) también se pueden distinguir de aquellas de la especie C. tropicalis.
Se obtuvieron resultados idénticos con un medio líquido similar, sin agar.
Ejemplo 4
Se incorporó en el medio del Ejemplo 3 L-Pro-BIA o Pyr-BIA, solo o en combinación con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-glucósido (X-Glu), 6-cloro-3-indolil-\beta-D-glucósido (Z-Glu) o 4-metil-umbeliferil-\beta-D-glucósido (MUGl). Estos diversos medios, que se distribuyen en cápsulas de Petri, se inoculan con microorganismos. Las cápsulas se incubaron a 37ºC durante 48 horas, y las colonias formadas se examinaron visualmente a la luz y bajo una lámpara de UV (longitud de onda = 365 nm). En la Tabla 2 se presentan los colores de las colonias obtenidas tras la incubación durante 24 y 48 horas:
TABLA 2
2
En los medios 2, 3 y 4, después de la incubación durante 24 horas, es posible distinguir E. coli (ausencia de coloración) y P. aeruginosa (coloración marrón) de las otras bacterias Gram-negativas. En estos medios, también es posible distinguir C. albicans de C. tropicalis, produciendo las dos especies colonias de colores diferentes. Los medios 6, 7 y 8 permiten la distinción entre S. agalactiae y la especie E. faecium y S. pyogenes, dando las cepas de S. agalactiae colonias incoloras, y dando aquellas de las otras dos especies colonias coloreadas. Después de la incubación durante 24 horas, también es posible distinguir las bacterias de E. faecium de las otras bacterias estudiadas debido a su color característico (variable dependiendo del medio).

Claims (17)

1. Utilización de por lo menos un compuesto de fórmula (I):
(I)X-NH-R
en la que X representa un grupo indol-3-ilo opcionalmente sustituido, y R representa el resto acilo de un aminoácido o de un péptido, estando el grupo o grupos amina presentes en R opcionalmente en forma protegida, como un agente revelador, siendo dicho agente añadido a un medio de cultivo y haciendo posible dar a conocer, mediante formación de una coloración o una fluorescencia en dicho medio, una actividad de peptidasa en medio de cultivo de microorganismos, o la presencia de un microorganismo o de un grupo de microorganismos que expresa tal actividad en dicho medio, con la excepción de la utilización de un compuesto de fórmula (I) para la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa un resto de leucilo o alanilo.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que R representa el resto acilo de un aminoácido, o el resto acilo de un péptido que comprende hasta 10 restos de aminoácidos.
3. Utilización según la reivindicación 2, en la que dicho péptido comprende hasta 5 restos de aminoácidos, y en particular hasta 3 restos de aminoácidos.
4. Utilización según la reivindicación 2 ó 3, en la que R representa el resto acilo del péptido Ala-Phe-Pro-.
5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en la que el resto de aminoácido C-terminal de dicho péptido es un resto de leucina, alanina, prolina o arginina.
6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en la que R representa un resto alanilo, prolilo, leucilo, piroglutamilo o arginilo.
7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que X representa un grupo indol-3-ilo sustituido en por lo menos una de las posiciones 1, 4, 5, 6 y 7, de dicho grupo indol.
8. Utilización según la reivindicación anterior, en la que X representa un grupo 5-bromo-indol-3-ilo.
9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho medio de cultivo es un medio gelificado.
10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho medio de cultivo es un medio líquido.
11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que se añade además al medio de cultivo por lo menos otro agente revelador que permite detectar, mediante la formación de un producto coloreado o fluorescente, una actividad enzimática.
12. Utilización según la reivindicación 11, en la que dicho otro agente revelador permite detectar una actividad enzimática diferente de la detectada con la ayuda del agente revelador de fórmula (I).
13. Procedimiento de detección de una actividad de peptidasa en un medio de cultivo de microorganismos, que comprende las etapas que consisten en añadir al medio de cultivo un compuesto de fórmula (I)
(I)X-NH-R
en la que X representa un grupo indol-3-ilo opcionalmente sustituido, y R representa el resto acilo de un aminoácido o de un péptido, estando el grupo o grupos amina presentes en R opcionalmente en forma protegida, con la excepción de un compuesto de fórmula (I) para la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa un resto de leucilo o alanilo,
y buscar la formación eventual de un producto coloreado o fluorescente en dicho medio, entendiéndose que la formación o la ausencia de formación de un producto coloreado o fluorescente permite concluir que existe o no, respectivamente, dicha actividad de peptidasa.
14. Procedimiento de detección de la presencia o ausencia de un microorganismo o de un grupo de microorganismos en una muestra que les contienen o que es susceptible de contenerlos, mediante detección de la expresión o de la ausencia de expresión por dicho microorganismo o grupo de microorganismos de una acividad de peptidasa, que comprende las etapas que consisten en añadir a un 
\hbox{medio de cultivo que contiene la muestra un compuesto  de
fórmula (I)}
(I)X-NH-R
en la que X representa un grupo indol-3-ilo opcionalmente sustituido, y R representa el resto acilo de un aminoácido o de un péptido, estando el grupo o grupos amina presentes en R opcionalmente en forma protegida, con la excepción de un compuesto de fórmula (I) para la cual X representa un grupo 5-bromoindol-3-ilo y R representa un resto de leucilo o alanilo,
buscar la formación eventual de un producto coloreado o fluorescente en dicho medio de cultivo,
y comparar, en caso necesario, la coloración o la fluorescencia obtenida con la obtenida con una muestra auténtica del microorganismo o del grupo de microorganismos buscado.
15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que dicho compuesto de fórmula (I) es tal como se define según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, 14 ó 15, en el que se añade dicho compuesto de fórmula (I) al medio de cultivo antes del inicio de una etapa de cultivo o al inicio de una etapa de cultivo de dicho microorganismo, o de dicho grupo de microorganismos susceptible de estar presente en dicha muestra.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicho medio de cultivo es un medio gelificado, y en el que se introduce el compuesto de fórmula (I) durante la preparación del medio de cultivo, antes de la gelificación de dicho medio.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030069187A1 (en) * 2001-10-05 2003-04-10 Rao Srinivasa K. Elastase inhibitors
FR2850378B1 (fr) * 2003-01-29 2005-03-04 Bio Merieux Substrats enzymatiques, milieux de culture les contenant, utilisation pour detecter une activite aminopeptidase et/ou differencier des bacteries a gram+ par rapport a des bacteries a gram-
AU2004260926B2 (en) * 2003-01-31 2007-08-16 Systagenix Wound Management Ip Co. B.V. Cationic anti-microbial peptides and methods of use thereof
FR2854893B1 (fr) 2003-05-13 2006-07-07 Biomerieux Sa Nouveaux substrats enzymatiques derives de phenoxazinone et leur utilisation comme revelateur dans la detection de microorganismes a activite peptidase
EP1692510B1 (en) * 2003-11-03 2008-01-02 Ethicon, Inc. Methods, peptides and biosensors useful for detecting a broad spectrum of bacteria
DE602004021281D1 (de) * 2003-11-03 2009-07-09 Ethicon Inc Kolorimetrische substrate, kolorimetrische sensoren und verwendungsverfahren
AU2011202861B2 (en) * 2003-11-03 2013-02-21 Systagenix Wound Management Ip Co. B.V. Colorimetric substrates, colorimetric sensors, and methods of use
FR2875242B1 (fr) 2004-09-10 2006-11-17 Biomerieux Sa Nouveaux substrats enzymatiques derives de phenoxazinone et leur utilisation comme revelateur dans la detection de microorganismes a activite peptidase
FR2875241B1 (fr) * 2004-09-16 2010-07-30 Biomerieux Sa Procede de detection de streptococcus agalactiae en utilisant l'activite esterase
FR2897874B1 (fr) * 2006-02-28 2013-11-15 Biomerieux Sa Procede pour l'identification d'au moins deux groupes de microorganismes
FR2916763B1 (fr) * 2007-05-31 2013-11-15 Biomerieux Sa Nouveaux substrats de peptidase
FR2948686B1 (fr) 2009-07-30 2011-08-19 Biomerieux Sa Nouveaux substrats de peptidase
FR2948684B1 (fr) 2009-07-30 2011-08-19 Biomerieux Sa Nouveaux substrats de peptidase
FR2948685A1 (fr) * 2009-07-30 2011-02-04 Biomerieux Sa Nouveaux substrats
CN103436589A (zh) * 2013-09-11 2013-12-11 中国检验检疫科学研究院 鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法
CN109136328B (zh) * 2018-08-22 2023-09-01 杭州俊丰生物工程有限公司 一种平板培养基酶活性测定方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2457323A1 (fr) 1979-05-25 1980-12-19 Api Labor Test permettant la mise en evidence des bacteries du genre salmonella et serratia et leur distinction des genres proteus et providencia
JPS5998698A (ja) * 1982-11-30 1984-06-07 Eiken Kagaku Kk グラム陽性菌と陰性菌の鑑別試薬
US4717658A (en) * 1985-12-03 1988-01-05 Miles Inc. Gram negative bacteria screening method with horseshoe crab amebocyte lysate (LAL)
US4925789A (en) * 1986-06-30 1990-05-15 Edberg Stephen C Method and medium for use in detecting target microbes in situ in a specimen sample of a possibly contaminated material
US5210022A (en) 1990-04-20 1993-05-11 Rcr Scientific, Inc. Method test media and chromogenic compounds for identifying and differentiating general coliforms and Escherichia coli bacteria
FR2671100B1 (fr) 1990-12-28 1993-03-05 Bio Merieux Procede d'analyse bacteriologique, et milieu de detection des bacteries genre salmonella.
DE4119956A1 (de) * 1991-06-18 1992-12-24 Fanghaenel Silvia Dipl Biochem Verfahren zur identifizierung und differenzierung gramnegativer bakterien mittels l-prolinaminopeptidase
FR2684110B1 (fr) 1991-11-25 1995-08-11 Bio Merieux Procede d'analyse microbiologique et milieu pour detecter des levures de l'espece candida albicans.
FR2708286B1 (fr) * 1993-07-28 1995-10-20 Rambach Alain Procédé d'identification de microorganismes avec au moins deux chromogènes.
FR2751663B1 (fr) * 1996-07-29 1998-10-02 Bio Merieux Procede de mise en evidence d'une activite enzymatique de microorganismes
AP9801302A0 (en) * 1997-07-23 2000-01-23 Pfizer Indole compounds as anti-inflammatory/analgesic agents..

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Publication number Publication date
WO1999038995A1 (fr) 1999-08-05
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CA2318461A1 (fr) 1999-08-05
AU2167999A (en) 1999-08-16
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DE69933855D1 (de) 2006-12-14
US6649365B1 (en) 2003-11-18
EP1051509A1 (fr) 2000-11-15
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FR2774097A1 (fr) 1999-07-30

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