CN103436589A - 鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法。具体而言，本发明涉及利用革兰氏阴性菌特异性表达L-丙氨酸氨基肽酶的性质，采用L-Alanine-AMC-TFA作为该酶的底物，利用环糊精阻滞产生的4-甲基香豆素的扩散，通过在平板上菌落产生的较强荧光区分革兰氏阴性菌和阳性菌的培养基及其使用方法。本发明的培养基和方法在分离菌落的同时即获得传统革兰氏染色方法同样的结果，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合医学临床微生物检验、食品安全微生物检测、环境保护等领域，有广泛的应用前景。

Description

鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法

技术领域

本发明涉及鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法。具体而言，本发明涉及利用革兰氏阴性菌特异性表达氨基肽酶在平板上鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法。

背景技术

通过革兰氏染色法，将细菌分为两大类，即革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，是对细菌进行鉴别、分类和鉴定的基础，因此，如何准确、便捷区分对于细菌鉴定与分类具有重要意义。

目前对于细菌的革兰氏阴性和阳性区分以染色方法为主，先用龙胆紫（亦称结晶紫）将细菌染成紫色，再涂以革兰氏碘液加强染料与菌体的结合，然后用95％的酒精脱色20～30秒钟，有些细菌不被脱色，仍保留紫色，有些细菌被脱色变成无色，最后再用复红或沙黄复染1分钟，结果已被脱色的细菌被染成红色，未脱色的细菌仍然保持紫色，不再着色，结果凡被染成紫色的细菌称为革兰氏阳性菌(G^﹢菌)；染成红色的称为革兰氏阴性菌（G^ˉ菌），其原理为：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色，为了保证实验结果的准确性，还需要设置对照菌株，该方法自1884年由丹麦医师Gram创立以来一直沿用至今，成为经典方法，但是这样的常规方法使得操作过程繁琐，虽然近年来已基于上述方法开发出细菌革兰氏鉴定染色仪和基于流式细胞技术通过添加特制染料实现细菌革兰氏鉴别，但这些方法需要专用设备的投入和特制试剂，不能满足所有微生物实验室的需求，而且鉴定前需要先分离出纯菌落，并不能节省人力和时间。

1973年Teuber和Cerny(Arch.Mikrobiol.91,235-240,1973)首次描述了大肠埃希氏菌具有特异的氨基肽酶活性，认为可能所有革兰氏阴性菌都具有该种特异性酶，C.Lazdunski（1975,Eur.J.Biochem.65,517-520）用L-丙氨酸-4-硝基苯胺（L-alanine-4-nitroanilide）作为酶底物，利用酶反应方法测试了从大肠埃希氏菌分离出的氨基肽酶活性，Murgier等人(1976,Eur.J.Biochem.65,517-520)用同样方法测试了其他革兰氏阴性菌并证实了上述观点。1978年，G.Cerny用浸染了L-丙氨酸-4-硝基苯胺的滤纸铺设在菌落上面进行孵育（5min），革兰氏阴性菌具有的特异性氨基肽酶分解L-丙氨酸-4-硝基苯胺，释放出对硝基苯胺使菌落产生黄色从而得到识别，从而建立了通过氨基肽酶测试来区分革兰氏阴性、阳性细菌的方法(European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.5,113-122,1978)，但是，该方法所用酶底物由于分解后游离出的发色基团硝基苯胺具有极好的水溶性而迅速扩散，信号减弱，使得该方法不能将底物直接添加到培养基中应用，因此也就无法在菌落生长过程中直接用于革兰氏阴性和阳性细菌的区分，随后出现的同类酶底物L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐（L-Alanine-AMC-TFA），由于释放出的基团4-甲基香豆素为荧光基团，与4-硝基苯胺相比显著提高了检测灵敏度，替代L-丙氨酸-4-硝基苯胺用于人类医学临床样本中L-丙氨酸氨基肽酶的测定，但由于仍未解决扩散问题，未见用于直接添加至平板中用于区分革兰氏阴性和阳性菌。专利WO-A-98/04735和WO-A-99/38995描述了一种不会扩散的用于检测氨基肽酶活性的显色底物；中国专利200480003095.7描述了一种结构较为复杂的显色酶底物；专利EP-B-0.270.946提出了基于吖啶酮的显色底物，然而，这些底物一方面要么难于获得（很难合成，纯度和产量低，不能商品化），要么存在潜在的危害，另一方面，为了使菌落获得明显颜色变化需要精确调整培养基配方，使得目前市场上没有商品化的产品出现。

综上所述，传统革兰氏染色方法操作繁琐，基于传统方法原理的仪器测定需要设备投入，专用耗材成本较高；通过测定氨基肽酶区分细菌革兰氏阴性/阳性菌的方法虽然特异性强，操作简便，但没有解决扩散问题，不能通过平板培养法进行区分革兰氏阴性/阳性菌，成为该项技术不能在本领域进入实质性应用的技术瓶颈。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于解决现有技术中利用测定氨基肽酶区分细菌革兰氏阴性/阳性菌的方法未解决扩散问题的问题，获得通过平板培养法区分革兰氏阴性/阳性菌的改进方法。

因此，本发明的第一方面涉及一种区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基，在终体积为1000ml时，其包含：胰蛋白胨8-16g，氯化钠4-7g，琼脂12-20g，L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.05-0.5g，环糊精10-20g，余量为水。

优选地，所述培养基还含有下述成分的一种或多种：植物蛋白胨3-7.0g，牛肉浸出粉1-5g，酵母粉2-10g和葡萄糖1-3g。

优选地，所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精的一种或多种。更优选地，所述环糊精为β-环糊精。

更优选地，所述胰蛋白胨为12g、植物蛋白胨为5g、L-Alanine-AMC-TFA为0.08g、β-环糊精为16g。

本发明的第二方面涉及一种试剂盒，其包括根据上述第一方面所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基。

优选地，所述试剂盒还包括下述平板之一：血平板、巧克力平板、低选择性平板、中等选择性平板或强选择性平板。

优选地，所述低选择性平板为伊红美蓝琼脂，所述中等选择性平板为麦康凯琼脂，所述强选择性平板为SS琼脂。

本发明的第三方面涉及一种根据上述第一方面所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基的使用方法，其包括：1）平板制备：将上述培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH至6.8±0.2，待冷却至45-55℃，加入L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐，混匀，倒平板，备用；2）样品处理：依据各领域规范规定的样品处理方法；3）接种培养：将样品或含样品的增菌液划线或涂布接种到制备好的平板上，35±1℃培养20-24h；4）结果分析：将平板放置在365nm紫外灯下照射，若菌落产生鲜明的荧光，则说明该菌落为革兰氏阴性菌；反之则为革兰氏阳性菌。

本发明的第四方面涉及一种根据上述第一方面所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基或根据上述第二方面所述的试剂盒在制备用于医学临床微生物检验、食品安全微生物检测、环境保护的制剂中的用途。

换言之，本发明的目的在于提供一种用于鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基及使用方法。

本发明的鉴别革兰氏阴性和阳性菌的培养基的组成为每1000mL培养基含有胰蛋白胨8-16g，氯化钠4-7g，琼脂12-20g，L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.05-0.5g（L-Alanine-AMC-TFA，CAS：77471-41-1），α-环糊精或β-环糊精或羟丙基-β-环糊精10-20g，余量为水。本发明的培养基还可以含有下述成分的一种或多种：植物蛋白胨3-7.0g，牛肉浸出粉1-5g，酵母粉2-10g，葡萄糖1-3g。

优选的，阻滞或减缓荧光物质扩散的化合物为β-环糊精。

优选的，琼脂为石花菜来源。

优选的，胰蛋白胨为12-14g，植物蛋白胨为4-6.0g，牛肉浸出粉为2-4g，酵母粉5-7g，葡萄糖1.5-2.5g，氯化钠5-6g，琼脂14-18g，L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.07-0.12g或环糊精为14-18g。

优选的，每1000mL培养基中包含胰蛋白胨12g、植物蛋白胨5g、酵母粉6.0g、氯化钠5.0g、琼脂13g、L-Alanine-AMC-TFA0.08g、β-环糊精16g，余量为水。

本发明在培养基中含有革兰氏阴性菌特异性荧光底物以及阻滞荧光物质扩散的化合物。胰蛋白胨、植物蛋白胨为细菌生长提供充足氮源，牛肉浸出粉补充蛋白胨的功效，酵母粉为细菌生长提供了促进生长和平衡代谢的微量元素，葡萄糖为细菌生长提供碳源，L-Alanine-AMC-TFA为革兰氏阴性菌产生L-丙氨酸氨基肽酶的酶底物。由于荧光基团为信号显示物质，灵敏度高于产生黄色的4-硝基苯胺，添加的环糊精，化学结构独特，其外缘亲水而内腔疏水，可依据范德华力、疏水相互作用力与无机分子形成稳定的水合物，当L-Alanine-AMC-TFA被氨基肽酶分解后，有效阻滞或减缓了4-甲基香豆素的扩散，通过组合使用及配方优化，常见细菌均能在本发明培养基上较好生长，使具有L-丙氨酸氨基肽酶阳性的革兰氏阴性菌菌落呈现较强荧光，从而与革兰氏阳性菌区分开。

细菌在本发明培养基中呈现的特征有：

1）革兰氏阴性菌在生长过程中，产生L-丙氨酸氨基肽酶，该酶分解L-Alanine-AMC-TFA，使4-甲基香豆素游离出来，在365nm波长照射下，菌落及周围区域产生强烈荧光；

2）革兰氏阳性菌在生长过程中，不产生L-丙氨酸氨基肽酶，也就不能分解L-Alanine-AMC-TFA，没有4-甲基香豆素游离出来，在365nm波长照射下，菌落及周围不发出荧光。

利用本发明培养基区分革兰氏阴性、阳性菌的方法包括如下步骤：

1）平板制备：将上述培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH至6.8±0.2，待冷却至45-55℃，加入L-Alanine-AMC-TFA，混匀，倒平板，备用：

2）样品处理：依据各领域规范规定的样品处理方法；

3）接种培养：将样品或含样品的增菌液划线或涂布接种到制备好的平板上，36±1℃培养20-24h；

4）结果分析：将平板放置在365nm紫外灯下照射，若菌落产生鲜明的荧光，则说明该菌落为革兰氏阴性菌；反之则为革兰氏阳性菌。

本发明的有益效果是：

本发明的培养基可用于区分革兰氏阴性和阳性菌，在分离的同时即获得传统革兰氏染色方法同样的结果，具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果判断简单等优点，适合医学临床微生物检验、食品安全微生物检测、环境保护等领域，有广泛的应用前景。

本发明培养基在医学临床微生物检验方面，可以配合营养因子全面的血平板、巧克力平板以及低选择性（如伊红美蓝琼脂）、中等选择性（如麦康凯琼脂）或强选择性（如SS琼脂）使用，通过观察是否产生荧光，即可判断菌株为革兰氏阴性或阳性，指导下一步鉴定，提高了工作效率。

本发明培养基在食品卫生检验中，对样品中细菌计数的同时，即可观察到革兰氏阳性和阴性细菌的分布情况；在食源性致病菌分离鉴别培养基中使用时，在不影响观察生理特征的情况下，通过观察是否产生荧光，即可判断菌株为革兰氏阴性或阳性，可减少后续鉴定工作不必要的操作流程，提高鉴定结果的准确性。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明，但并不局限如此。

实施例

实施例1本发明培养基的营养能力评价及效果观察

（1）培养基配制：按表1中的配方称取各组分，将上述培养基的各组分，加入到1000mL去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH至6.8±0.2，待冷却至45-55℃，加入L-Alanine-AMC-TFA，混匀，倒平板，备用。

（2）接种与结果观察：挑取试验菌株的平板新鲜纯培养物，于灭菌生理盐水中制备成0.5麦氏浊度，取0.3mL菌悬液涂布于上述平板，于36℃下培养18h，在365nm波长下观察菌落是否产生荧光，产生荧光的实验菌株为革兰氏阴性菌，不产生荧光的实验菌株为革兰氏阳性菌。

表1.培养基组分(g/L)

成分	材料来源	培养基1	培养基2	培养基3
					胰蛋白胨	北京奥博星	10.0	12.0	12
植物蛋白胨	北京奥博星	6.0	5.0	5
					酵母粉	北京奥博星	7.0	6.0	6
氯化钠	Sigma	5.0	5.0	5.0
					琼脂	山东胶州	15	13	14
L-Alanine-AMC，TFA）	Sigma	0.10	0.08	0.09
					β-环糊精	Sigma	14	16.0	-

表2.菌落生长状况及观察结果

实验结果显示，培养基2具有更好的支持细菌生长的能力，同时有效减缓了荧光基团的扩散。

实施例2本发明培养基划线接种法效果测试

每1000mL培养基含有胰蛋白胨10g、植物蛋白胨6g、酵母粉7g、氯化钠5g、琼脂16g、L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.1g（L-Alanine-AMC-TFA），β-环糊精14g，余量为水，pH6.8±0.2。用无菌环将试验菌的过夜肉汤培养物以划线方式四区划线转种于上述平板，于35±1℃下培养18h，在365nm波长下观察菌落是否产生荧光，产生荧光的实验菌株为革兰氏阴性菌，不产生荧光的实验菌株为革兰氏阳性菌。实验结果显示，划线方法区分革兰氏阴性和阳性菌同样适用于本发明培养基。

表3.在培养基2上划线培养法效果测试

实施例3本发明培养基制成血平板后区分革兰氏阴性和阳性菌的效果

每1000mL培养基含有胰蛋白胨10g、牛肉粉5g、氯化钠5g、琼脂16g、L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.1g（L-Alanine-AMC，TFA），β-环糊精14g，余量为水，pH6.8±0.2，参考血平板制作方法，添加无菌脱纤维羊血60mL，制成血平板。医学实验样本按照全国临床检验操作规程或其他通用方法处理后，划线接种于该平板，于35±1℃下培养18h，在365nm波长下观察菌落是否产生荧光，产生荧光的实验菌株为革兰氏阴性菌，不产生荧光的实验菌株为革兰氏阳性菌。实验显示，本发明培养基可以制成血平板后用于革兰氏阴性和阳性菌的区分，结果见表4。

表4本发明培养基制成血平板后的实验效果观察

实施例4环境样品（空气）计数及革兰氏阴性阳性菌鉴别

每1000mL培养基含有胰蛋白胨15g、植物蛋白胨5g、氯化钠5g、琼脂15g、L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.1g（L-Alanine-AMC，TFA），β-环糊精14g，余量为水，pH7.3±0.2。对于洁净室或洁净区沉降菌的测试和环境验证按照《医药工业洁净区沉降菌的测试方法》（GB/T16294-2010）进行操作，于35±1℃下培养18h，如果有菌落生长，在365nm波长下观察菌落是否产生荧光，产生荧光的菌株为革兰氏阴性菌，不产生荧光的菌株为革兰氏阳性菌。将各菌落再用传统革兰氏染色法进行验证。结果见表5，说明本发明培养基与传统方法测定结果一致。

表5环境样品（空气）计数测定结果

实施例5食品中细菌总数测定及革兰氏阴性阳性菌鉴别

每1000mL培养基含有胰蛋白胨5g、酵母粉2.5g、葡萄糖1g、琼脂15g、L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.1g（L-Alanine-AMC，TFA），β-环糊精13g，余量为水，pH7.3±0.2。对于食品中细菌总数的测定按照食品安全国家标准《食品微生物学检验菌落总数测定》（GB/T4789.2-2010）进行操作，于35±1℃下培养18h，如果有菌落生长，在365nm波长下观察菌落是否产生荧光，产生荧光的菌株为革兰氏阴性菌，不产生荧光的菌株为革兰氏阳性菌。

表6本发明培养基与标准中规定培养基检测效果比较

实施例6本发明培养基的特异性实验及结果

菌株接种于TSB肉汤中35±1℃下培养18h，用接种环将培养物划线接种于本发明培养基2上，在35±1℃下培养18-20h，于365nm波长下观察菌落是否产生荧光，产生荧光的实验菌株为革兰氏阴性菌，不产生荧光的实验菌株为革兰氏阳性菌，记录观察结果，见表7。

表762株实验菌株、编号及特异性实验结果

Claims (10)

1.一种区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基，在终体积为1000ml时，其包含：胰蛋白胨8-16g，氯化钠4-7g，琼脂12-20g，L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐0.05-0.5g，环糊精10-20g，余量为水。

2.根据权利要求1所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基，其特征在于其含有下述成分的一种或多种：植物蛋白胨3-7g，牛肉浸出粉1-5g，酵母粉2-10g和葡萄糖1-3g。

3.根据权利要求1或2所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基，其特征在于所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基，其特征在于所述环糊精为β-环糊精。

5.根据权利要求2-4任一项所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基，其特征在于胰蛋白胨为12g、植物蛋白胨为5g、L-Alanine-AMC-TFA为0.08g、β-环糊精为16g。

6.一种试剂盒，其包括根据权利要求1-5任一项所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于其还包括下述平板之一：血平板、巧克力平板、低选择性平板、中等选择性平板或强选择性平板。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述低选择性平板为伊红美蓝琼脂，所述中等选择性平板为麦康凯琼脂，所述强选择性平板为SS琼脂。

9.一种根据权利要求1-5任一项所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基的使用方法，其包括：1）平板制备：将上述培养基的各组分，加入到去离子水中，搅拌，加热煮沸至完全溶解，调节pH至6.8±0.2，待冷却至45-55℃，加入L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐，混匀，倒平板，备用；2）样品处理：依据各领域规范规定的样品处理方法；3）接种培养：将样品或含样品的增菌液划线或涂布接种到制备好的平板上，35±1℃培养20-24h；4）结果分析：将平板放置在365nm紫外灯下照射，若菌落产生鲜明的荧光，则说明该菌落为革兰氏阴性菌；反之则为革兰氏阳性菌。

10.一种根据权利要求1-5任一项所述的区分革兰氏阴性和阳性菌的培养基或根据权利要求6-8任一项所述的试剂盒在制备用于医学临床微生物检验、食品安全微生物检测、环境保护的制剂中的用途。