CN111088318A - 利用ttc还原反应检测细菌药物敏感性的方法 - Google Patents

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Abstract

利用TTC还原反应检测细菌药物敏感性的方法，是通过抗生素溶液配制；制备抗生素浓度呈梯度变化的96孔板；菌悬液制备；恒温培养；结果判读，培养基发生呈色反应后为红色，表示供试菌可耐受该浓度水平的抗生素，继而灵敏、准确的判断药敏性检测结果，得到最小抑菌浓度值，避免操作人员视觉判断的错误，以及仪器读取板孔中培养物的光密度值时培养基本身浊度而产生的误差。继而结合CLSI的鉴定标准，判读供试菌对各抗生素的敏感性结果，为选择合理的抗生素治疗提供指导依据，为新药的抗菌谱和抗菌活性提供准确的评价结果，更好的监测细菌耐药性，掌握耐药菌的流行趋势，保障食品与公共卫生安全。

Description

利用TTC还原反应检测细菌药物敏感性的方法
技术领域
本发明涉及一种细菌药物敏感性的检测方法，具体是一种利用TTC还原反应检测细菌药物敏感性的方法，属于微生物领域。
背景技术
抗生素在畜牧业、兽医和临床治疗领域的广泛使用导致大量耐药菌出现，耐药菌已成为全球性食品安全和公共卫生安全的主要威胁之一。对耐药菌的检测和判定主要通过药物敏感性检测试验来实现，试验结果也是临床治疗细菌感染性疾病时合理选用抗生素、提高疗效及避免滥用抗菌药物的重要参考，亦是开展耐药机制研究的依据。
目前细菌药物敏感性检测的常用方法主要包括琼脂稀释法、纸片扩散法和微量肉汤稀释法等，这些方法在药物敏感性检测过程中均存在一定的缺陷。琼脂稀释法：能同时检测大量菌株的药敏性，重复性好，但工作量较大，抗生素和培养基使用量大，对少量菌株的药物敏感性检测耗时耗力；纸片扩散法：操作简单，使用广泛，但检测结果会受到药敏纸片质量和培养基类型等较多因素的影响，不能检测出抗生素对供试菌的最小抑菌浓度，药敏纸片也不能自行制备；微量肉汤稀释法：较节省试剂和材料，但其最大的局限性在于难以用肉眼准确判读板孔内的细菌是否生长和抗生素最小抑菌浓度的结果，且药敏性检测结果可能会因试验人员的视觉误差而产生人为的判断错误，如用酶标仪或分光光度计等仪器读取板孔中培养物的光密度值，由于培养基本身浊度的影响导致较大误差。由此可见，目前常用的检测细菌药物敏感性的几种方法均存在一定的局限。
发明内容
本发明为克服现有细菌药物敏感性检测中存在的问题，而公开一种利用TTC还原反应检测细菌药物敏感性的方法。
本发明的技术方案如下：
a.抗生素溶液配制：用无菌缓冲液或无菌水配制2Nμg/mL浓度的抗生素溶液备用，0＜N＜2560；
b.制备抗生素浓度呈梯度变化的96孔板：在96孔板的每个板孔内加入100μL无菌肉汤，向第一列板孔中加入抗生素溶液100μL，混匀，吸取第一列板孔中的混合溶液100μL，每行原位加入第二列的板孔中，混匀，同法依次进行倍比稀释，最终每行板孔中肉汤培养基中抗生素的浓度分别为N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32、N/64……μg/mL，用不含抗生素的肉汤培养基作为空白对照；
c.菌悬液制备：将供试菌提前在培养基上培养18-20h，用无菌棉签从培养基上擦拭适量菌体，将其充分分散至装有3-5mL NaCl浓度为0.9％的无菌生理盐水中，配制成麦氏浊度在0.48-0.52之间的菌悬液，该菌悬液的细胞浓度为1-9×108CFU/mL；
d.菌悬液接种：在15min时间内，将制备好的菌悬液进行20倍稀释后，向每个板孔中加入10μL菌悬液，混匀，接种后每板孔内供试菌的最终浓度为5×105-4.5×106CFU/mL；
e.恒温培养：将已接种的96孔板密封后置于35±2℃恒温培养箱中培养16-20h后取出，向每个接种的板孔中加入5μL浓度为5g/L的TTC溶液， 35±2℃恒温培养30-60min；
f.结果判读：若添加有抗生素的培养基发生呈色反应变为红色，表示供试菌可耐受该浓度水平的抗生素；若培养基不发生呈色反应，表示供试菌对该浓度水平的抗生素敏感，能完全抑制供试菌生长的最低抗生素浓度值，即为该抗生素对供试菌的最小抑菌浓度值。
TTC(2，3，5-Triphenyte-trazoliumchloride)即2，3，5-三苯基氯化四氮唑，是生物学试验中常用的四唑盐，本身无色，可被细菌生长繁殖过程产生的琥珀酸脱氢酶还原成红色的三苯甲月替TTF(Triphenylformazan)。本方法在美国临床实验室标准协会CLSI(theClinical Laboratory Standard Institute)推荐的微量肉汤稀释法的基础上进行改进，当供试菌对某种抗生素不敏感时，即可在含有一定浓度抗生素的培养基中生长繁殖，产生的琥珀酸脱氢酶能够使培养基快速呈现红色；反之，当供试菌被抗生素抑制而不能生长、不产生琥珀酸脱氢酶时，培养基不发生呈色反应，通过对细菌培养过程培养基颜色变化的观察，可准确判断细菌可耐受的抗生素浓度，检测其药敏性，将细菌药敏检测试验与TTC可被琥珀酸脱氢酶还原为红色的TTF、出现呈色反应的原理进行有机结合，可得到灵敏度高、结果准确的抗生素最小抑菌浓度值。
本发明能耐受抗生素的供试菌在培养基中生长繁殖，产生的琥珀酸脱氢酶可将无色的TTC还原成红色的TTF，使培养基快速呈现红色变化，继而灵敏、准确的判断药敏性检测结果，得到最小抑菌浓度值，避免操作人员视觉判断的错误，以及仪器读取板孔中培养物的光密度值时培养基本身浊度而产生的误差。加入TTC溶液后，无需借助额外的仪器，呈色反应快速，反应灵敏度高，对技术设备要求均较低。抗生素和培养基使用量小，对少量菌株的药敏性检测试验也可轻松实现，向培养16-20h后的细菌培养物中加入TTC溶液，不影响板孔中预设抗生素的浓度，同时也避免了TTC 对板孔中的供试菌的生长繁殖产生影响，继而结合CLSI的鉴定标准，判读供试菌对各抗生素的敏感性结果，为选择合理的抗生素治疗提供指导依据，为新药的抗菌谱和抗菌活性提供准确的评价结果，更好的监测细菌耐药性，掌握耐药菌的流行趋势，保障食品与公共卫生安全。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细描述。
实施例一：
a.抗生素溶液配制：用无菌缓冲液配制2Nμg/mL浓度的抗生素溶液备用，0＜N＜2560；
b.制备抗生素浓度呈梯度变化的96孔板：在96孔板的每个板孔内加入100μL无菌肉汤，向第一列板孔中加入抗生素溶液100μL，混匀，吸取第一列板孔中的混合溶液100μL，每行原位加入第二列板孔中，混匀，同法依次进行倍比稀释，最终每行板孔中肉汤培养基中抗生素的浓度分别为N、 N/2、N/4、N/8、N/16、N/32、N/64……μg/mL，用不含抗生素的肉汤培养基作为空白对照；
c.菌悬液制备：将供试菌提前在培养基上培养18h，将适量菌体充分分散至装有3mL NaCl浓度为0.9％的无菌生理盐水中，配制成麦氏浊度在 0.48-0.52之间的菌悬液，该菌悬液的细胞浓度为1×108CFU/mL；
d.菌悬液接种：在15min时间内，将制备好的菌悬液进行20倍稀释后，向每个板孔中加入10μL菌悬液，混匀，接种后每板孔内供试菌的最终浓度为5×105CFU/mL；
e.恒温培养：将已接种的96孔板密封后置于37℃恒温培养箱中培养 16h后取出，向每个接种的板孔中加入5μL浓度为5g/L的TTC溶液，37℃恒温培养30min；
f.结果判读：若添加有抗生素的培养基发生呈色反应变为红色，表示供试菌可耐受该浓度水平的抗生素；若培养基不发生呈色反应，表示供试菌对该浓度水平的抗生素敏感，能完全抑制供试菌生长的最低抗生素浓度值，即为该抗生素对供试菌的最小抑菌浓度值。
实施例二：
a.抗生素溶液配制：用无菌水配制1024μg/mL浓度的四环素溶液备用；
b.制备抗生素浓度呈梯度变化的96孔板：在96孔板的每个板孔内加入100μL无菌MHB肉汤培养基，向第一列板孔中加入四环素溶液100μL，混匀，吸取第一列板孔中的混合溶液100μL，每行原位加入第二列的板孔中，混匀，同法依次进行倍比稀释，最终每行板孔中肉汤培养基中四环素的浓度分别为512、256、128、64、32、16和8μg/mL，用不含四环素的 MHB肉汤培养基作为空白对照；
c.菌悬液制备：将大肠杆菌提前在LB培养基上培养18h，用无菌棉签从LB培养基上擦拭适量菌体，将其充分分散至装有5mL NaCl浓度为0.9％的无菌生理盐水中，配制成麦氏浊度在0.48-0.52之间的菌悬液，该菌悬液的细胞浓度为1×108CFU/mL；
d.菌悬液接种：在15min时间内，将制备好的菌悬液进行20倍稀释后，向每个板孔中加入10μL菌悬液，混匀，接种后每板孔内供试菌的最终浓度为5×105CFU/mL；
e.恒温培养：将已接种的96孔板密封后置于37℃恒温培养箱中培养 16h后取出，向每个接种的板孔中加入5μL浓度为5g/L的TTC溶液，37℃恒温培养30min；
f.结果判读：若添加有四环素的培养基发生呈色反应变为红色，表示大肠杆菌可耐受该浓度水平的四环素；若培养基不发生呈色反应，表示大肠杆菌对该浓度水平的四环素敏感，能完全抑制大肠杆菌生长的最低四环素浓度值，即为四环素对该大肠杆菌的最小抑菌浓度值。
TTC溶液的配制：称取0.5g分析纯TTC粉末于无菌烧杯中，加入少量 pH为6-7的无菌磷酸盐缓冲液，搅拌，待TTC粉末完全溶解后转移至100mL 的无菌容量瓶中，用pH为6-7的无菌磷酸盐缓冲液洗涤无菌烧杯三次，洗涤液全部转入无菌容量瓶，定容即为TTC溶液，充分旋摇混匀后转移至棕色试剂瓶中冷藏备用，整个配制过程须在无菌、避光条件下进行。
采用本发明检测方法将编号为A-H的8株大肠杆菌接种至制备好的四环素浓度呈梯度变化的96孔板后，96孔板内菌株及抗生素分布见下表：
Figure BDA0002354673850000061
采用本发明检测方法进行四环素对大肠杆菌的药敏性检测，得到的药物敏感性结果及最小抑菌浓度值见下表：可见不同大肠杆菌同一批次检测结果不完全一样，最小抑菌浓度值越低说明大肠杆菌对四环素越敏感，可以用于指导大肠杆菌引起的疾病的治疗。
菌株编号 菌种 药物敏感性 最小抑菌浓度值(μg/mL)
A 大肠杆菌 耐药 128
B 大肠杆菌 耐药 128
C 大肠杆菌 耐药 256
D 大肠杆菌 耐药 128
E 大肠杆菌 耐药 128
F 大肠杆菌 耐药 128
G 大肠杆菌 耐药 256
H 大肠杆菌 耐药 128

Claims (3)

1.利用TTC还原反应检测细菌药物敏感性的方法，其特征在于：
a.抗生素溶液配制：用无菌缓冲液或无菌水配制2Nμg/mL浓度的抗生素溶液备用，0＜N＜2560；
b.制备抗生素浓度呈梯度变化的96孔板：在96孔板的每个板孔内加入100μL无菌肉汤，向第一列板孔中加入抗生素溶液100μL，混匀，吸取第一列板孔中的混合溶液100μL，每行原位加入第二列的板孔中，混匀，同法依次进行倍比稀释，最终每行板孔中肉汤培养基中抗生素的浓度分别为N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32、N/64……μg/mL，用不含抗生素的肉汤培养基作为空白对照；
c.菌悬液制备：将供试菌提前在培养基上培养18-20h，用无菌棉签从培养基上擦拭适量菌体，将其充分分散至装有3-5mL NaCl浓度为0.9％的无菌生理盐水中，配制成麦氏浊度在0.48-0.52之间的菌悬液，该菌悬液的细胞浓度为1-9×108CFU/mL；
d.菌悬液接种：在15min时间内，将制备好的菌悬液进行20倍稀释后，向每个板孔中加入10μL菌悬液，混匀，接种后每板孔内供试菌的最终浓度为5×105-4.5×106CFU/mL；
e.恒温培养：将已接种的96孔板密封后置于35±2℃恒温培养箱中培养16-20h后取出，向每个接种的板孔中加入5μL浓度为5g/L的TTC溶液，35±2℃恒温培养30-60min；
f.结果判读：若添加有抗生素的培养基发生呈色反应变为红色，表示供试菌可耐受该浓度水平的抗生素；若培养基不发生呈色反应，表示供试菌对该浓度水平的抗生素敏感，能完全抑制供试菌生长的最低抗生素浓度值，即为该抗生素对供试菌的最小抑菌浓度值。
2.根据权利要求1所述的利用TTC还原反应检测细菌药物敏感性的方法，其特征在于：
a.用无菌缓冲液配制2Nμg/mL浓度的抗生素溶液备用，0＜N＜2560；
b.在96孔板的每个板孔内加入100μL无菌肉汤，向第一列板孔中加入抗生素溶液100μL，混匀，吸取第一列板孔中的混合溶液100μL，每行原位加入第二列板孔中，混匀，同法依次进行倍比稀释，最终每行板孔中肉汤培养基中抗生素的浓度分别为N、N/2、N/4、N/8、N/16、N/32、N/64……μg/mL，用不含抗生素的肉汤培养基作为空白对照；
c.将供试菌提前在培养基上培养18h，将适量菌体充分分散至装有3mL NaCl浓度为0.9％的无菌生理盐水中，配制成麦氏浊度在0.48-0.52之间的菌悬液，该菌悬液的细胞浓度为1×108CFU/mL；
d.在15min时间内，将制备好的菌悬液进行20倍稀释后，向每个板孔中加入10μL菌悬液，混匀，接种后每板孔内供试菌的最终浓度为5×105CFU/mL；
e.将已接种的96孔板密封后置于37℃恒温培养箱中培养16h后取出，向每个接种的板孔中加入5μL浓度为5g/L的TTC溶液，37℃恒温培养30min。
3.根据权利要求1所述的利用TTC还原反应检测细菌药物敏感性的方法，其特征在于：
a.用无菌水配制1024μg/mL浓度的四环素溶液备用；
b.在96孔板的每个板孔内加入100μL无菌MHB肉汤培养基，向第一列板孔中加入四环素溶液100μL，混匀，吸取第一列板孔中的混合溶液100μL，每行原位加入第二列的板孔中，混匀，同法依次进行倍比稀释，最终每行板孔中肉汤培养基中四环素的浓度分别为512、256、128、64、32、16和8μg/mL，用不含四环素的MHB肉汤培养基作为空白对照；
c.将大肠杆菌提前在LB培养基上培养18h，用无菌棉签从LB培养基上擦拭适量菌体，将其充分分散至装有5mL NaCl浓度为0.9％的无菌生理盐水中，配制成麦氏浊度在0.48-0.52之间的菌悬液，该菌悬液的细胞浓度为1×108CFU/mL；
d.在15min时间内，将制备好的菌悬液进行20倍稀释后，向每个板孔中加入10μL菌悬液，混匀，接种后每板孔内供试菌的最终浓度为5×105CFU/mL；
e.将已接种的96孔板密封后置于37℃恒温培养箱中培养16h后取出，向每个接种的板孔中加入5μL浓度为5g/L的TTC溶液，37℃恒温培养30min；
f.若培养基不发生呈色反应，表示大肠杆菌对该浓度水平的四环素敏感，能完全抑制大肠杆菌生长的最低四环素浓度值，即为四环素对该大肠杆菌的最小抑菌浓度值。
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