CN110129406A - 一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法，涉及铜绿假单胞菌检测技术领域，本发明所述的铜绿假单胞菌显色培养基包括基础培养基、显色底物、抑菌剂，显色底物包括2,3,5‑苯基氯化四氮唑、4‑甲基伞形酮‑D‑葡萄糖醛酸苷，抑菌剂包括萘啶酮酸、环丝氨酸、牛胆盐，2,3,5‑苯基氯化四氮唑可以和铜绿假单胞菌代谢产物作用显红色，4‑甲基伞形酮‑D‑葡萄糖醛酸苷和铜绿假单胞菌作用在366nm紫外灯下显荧光；2,3,5‑苯基氯化四氮唑和抑菌剂共同配合能够抑制常见的干扰菌的生长，避免出现假阳性的情况，本发明所述铜绿假单胞菌快速检测的方法，仅需24h即可对铜绿假单胞菌检测计数，省时省力，稳定可靠，灵敏性更佳。
Description
技术领域
本发明涉及铜绿假单胞菌检测技术领域，更具体的说，它涉及一种铜绿假单胞菌显色培养基及利用其快速检测的方法。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属于假单胞菌属，普遍分布于自然界中，可以在水中生存时间很长，，被认为是一种水源性条件致病菌；铜绿假单胞菌可引起正常人腹泻等疾病，患代谢疾病、血液病和恶性肿瘤的病人，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌；本菌经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等，本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症，烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡，是危害人类健康的一大威胁。
世界卫生组织和我国将此菌都作为瓶装饮用水的污染危害指示菌，日本和加拿大等国家已经对水中的铜绿假单胞菌的存在做出了限量规定；国际食品法典委员会(CAC)和欧盟成员国都明确作出了相应的规定，并指出在水中不得检测出此菌。
根据我国GB8537-2018食品安全国家标准中，关于微生物限量标准一项，其中铜绿假单胞菌(单位：CFU/250mL)，标准值为n＝5c＝0m＝0，即5份样品中，各取250mL检测，5份样品中铜绿假单胞菌检测值必须全部为0CFU，意为5份水样检测中铜绿假单胞菌菌落数量均为0，允许出现特例的水样数量为0，才为合格。
GB8538-2016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法中给出一种铜绿假单胞菌的检测方法，需要先对水样进行过滤，然后将过滤后的滤膜平铺在已制备好的CN琼脂平板上，将平板倒置于36℃±1℃培养24h～48h，在培养20h～24h和40h～48h后观察滤膜上菌落的生长情况并计数，如果菌落全部呈现蓝绿色即判定为铜绿假单胞菌检测结果为阳性，但这种情况比较少出现；在实际操作过程中，如果出现产荧光(非蓝/绿色)菌落时，需要对这种菌落进行产氨试验，产氨试验检测结果为阳性即判定为检出铜绿假单胞菌；实际操作过程中，如果出现红褐色菌落时，需要对这种菌落进行产氨试验、氧化酶试验、荧光试验，当检测结果均呈阳性的时候即判定为检出铜绿假单胞菌。
水样中可能存在铜绿假单胞菌或其他干扰干扰菌，因此使用上述方法对水样进行过滤培养24h～48h后，通常会产生干扰菌落，即出现产荧光(非蓝/绿色)菌落或红褐色菌落，此时至少需要额外的1-5天做进一步的生化实验，以确定这些菌落是否为铜绿假单胞菌，综合的检测时间需要约5-7天，非常的耗时费力；并且在培养后铜绿假单胞菌和其他干扰干扰菌的菌落需要用专业的实验员肉眼对菌落的颜色和形态进行判断，菌落过分生长有可能出现菌落融合，非常考验实验员的工作经验是否丰富，而当铜绿假单胞菌发生变异时，菌落形态和颜色发生改变，难以从菌落颜色和形态上进行判断，容易造成漏判、误判。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铜绿假单胞菌显色培养基，其通过在铜绿假单胞菌培养基中加入铜绿假单胞菌特异性显色酶底物，由于食品、水源中是禁止检出铜绿假单胞菌的，水源中存假铜绿假单胞菌的情况下，能够在24小时内在显色培养基中显色呈阳性检出并计数。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种铜绿假单胞菌显色培养基，包括基础培养基、显色底物、抑菌剂，所述显色底物包括2,3,5-苯基氯化四氮唑；所述抑菌剂包括萘啶酮酸；所述基础培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、水。
通过采用上述技术方案，基础培养基给铜绿假单胞菌和其他干扰菌提供最基本的生长条件；如果待测样品中存在铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌产生脱氢酶与显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑发生脱氢酶作用，产生红色的脂溶性三苯基甲月替，不溶于水显红色；研究发现2,3,5-苯基氯化四氮唑也具有一定抑制干扰菌的作用；抑菌剂萘啶酮酸用于抑制其他干扰菌，避免干扰菌干扰显色计数。
本发明进一步设置为：所述显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑的用量为0.1-1.0g/L。
通过采用上述技术方案，显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑添加量在0.1-1.0g/L范围内时都足够使铜绿假单胞菌菌落达到预期显色效果。
本发明进一步设置为：显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑用量为0.5g/L。
通过采用上述技术方案，铜绿假单胞菌菌落生长状况良好，菌落形态佳，显色效果好，对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等干扰干扰菌具有更加良好的抑制效果，因此0.5g/L为显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑在铜绿假单胞菌显色培养基中的最佳添加量。
本发明进一步设置为：所述抑菌剂萘啶酮酸的用量为0.01-0.03g/L。
通过采用上述技术方案，抑菌剂萘啶酮酸添加量在0.01-0.03g/L范围内时，干扰干扰菌均能够受到抑制。
本发明进一步设置为：抑菌剂萘啶酮酸的用量为0.015g/L。
通过采用上述技术方案，铜绿假单胞菌菌落生长状况更加良好，菌落形态佳，显色效果好，铜绿假单胞菌菌落不会受到抑制，培养基上基本不生长干扰干扰菌。
本发明进一步设置为：所述显色底物还包括4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷。
通过采用上述技术方案，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷可以与铜绿假单胞菌作用，在366nm紫外灯下有荧光，个别可以显荧光的干扰菌受到抑菌剂和2,3,5-苯基氯化四氮唑的抑制无法在铜绿假单胞菌显色培养基上生长，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷和显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑配合，铜绿假单胞菌显色培养基上生长的铜绿假单胞菌的菌落显红色且在366nm紫外灯下有荧光，可以更加准确的判定检出铜绿假单胞菌，结果准确可靠，清楚明显。
本发明进一步设置为：所述4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的用量为0-0.1g/L。
通过采用上述技术方案，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷可以与铜绿假单胞菌发生作用，菌落在366nm紫外灯下有荧光。
本发明进一步设置为：显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的用量为0.01g/L。
通过采用上述技术方案，铜绿假单胞菌菌落显荧光效果好，铜绿假单胞菌菌落不会受到抑制，培养基上未检测出不生长干扰干扰菌。
本发明进一步设置为：所述碳源的用量为0-40g/L，所述碳源由葡萄糖提供；所述氮源的用量为5-25g/L，所述氮源由蛋白胨和/或酪蛋白提供；所述生长因子由酵母浸膏提供，所述酵母浸膏的用量为2-14g/L；所述无机盐包括硫酸钾、氯化镁，所述硫酸钾的用量为5- 20g/L，所述氯化镁的用量为1-3g/L；余量为蒸馏水。
通过采用上述技术方案，所述碳源由主要葡萄糖提供，葡萄糖为铜绿假单胞菌提供碳源，由于铜绿假单胞菌对营养要求不高，可以不添加葡萄糖；蛋白胨和/或酪蛋白为铜绿假单胞菌的生长提供氮源，维持培养液的电解质平衡；酵母浸膏为菌种提供营养、维生素、碱基、嘌呤、嘧啶等微生物生长所必须的生长因子，以促进铜绿假单胞菌的生长；在培养基中添加硫酸钾、氯化镁为铜绿假单胞菌生长提供微量元素，维持培养液中的渗透压；
本发明进一步设置为：所述蛋白胨的用量为15.0g/L；所述酵母浸膏的用量为8.0g/L；所述硫酸钾的用量为10.0g/L，所述氯化镁的用量为1.4g/L；所述琼脂的用量为15.0g/L；余量为蒸馏水。
通过采用上述技术方案，以此配方用量配制而成的基础培养基的性能更加适于铜绿假单胞菌生长。
本发明进一步设置为：所述抑菌剂还包括有环丝氨酸、牛胆盐中的一种或多种；所述牛胆盐的用量为0-1.0g/L；所述环丝氨酸的用量为0-1.0g/L。
通过采用上述技术方案，添加上述铜绿假单胞菌具有抗性的抗菌素环丝氨酸、牛胆盐中的一种或多种，进一步对铜绿假单胞菌显色培养基中除铜绿假单胞菌外的菌种起到抑制效果。
本发明的另一目的在于提供一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，其通过铜绿假单胞菌显色培养基对水样过滤膜进行培养检验，在24小时内确定是否呈阳性检出并计算检出含量，迅速、准确、可靠，能够大量节约检测时间，特别适用于大量水样现场检验。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，包括如下步骤：
步骤A、配制权利要求书1-7中任意一种铜绿假单胞菌显色培养基；
步骤B、对待测水源混匀并取样250mL后得到待测样品，当水样污染较为严重的时候执行步骤C，否则省略步骤C直接执行步骤D；
步骤C、对待测样品进行梯度稀释后得到梯度稀释待测样品；
步骤D、用无菌镊子夹取灭菌过滤膜边缘部分,粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上,固定好过滤器，对步骤B中的待测样品或步骤C中的梯度稀释待测样品通过过滤膜进行过滤，所述过滤膜的规格为0.45μm；
步骤E、将步骤D中的过滤膜有菌一面向上，无菌贴合于步骤A中制备的铜绿假单胞菌显色培养基上进行接种，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留气泡；
步骤F、将接种完毕的铜绿假单胞菌显色培养基置于25-42℃的培养箱内24-48h；
步骤G、从培养箱中取出，选取每皿30-300CFU之间的平板计数并计算样品中铜绿假单胞菌的含量。
通过采用上述技术方案，先配制铜绿假单胞菌显色培养基，实验器材通过本领域技术人员公知的任意一种灭菌方法灭菌，排除环境因素的干扰；对待测样品取样250mL，当水样污染较为严重时制备梯度稀释待测样品；对样品进行过滤，使样品中所含的细菌都集中在规格为0.45μm的过滤膜上，过滤膜有菌一面向上，平铺于铜绿假单胞菌显色培养基上，避免滤膜和培养基之间夹留气泡，正向贴过滤膜，过滤膜有穿透性，营养物质和水可以渗透到过滤膜顶面，不影响微生物的培养，易于铜绿假单胞菌的培养，好计数，25-42℃为铜绿假单胞菌可以正常生长的温度，36℃为铜绿假单胞菌在铜绿假单胞菌显色培养基上生长的最适温度，优选的，将接种后的铜绿假单胞菌显色培养基置于36±1℃的培养箱内培养24-48h进行检测并计数，优选的，铜绿假单胞菌培养至24h即可显色并计数，判断是否检出铜绿假单胞菌以及计算样品中铜绿假单胞菌的数量。
菌落计数规则为：
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
本发明进一步设置为：所述步骤A具体包括；
步骤a.用电子天平称取蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、硫酸钾、氯化镁；
步骤b.直接加入蒸馏水，稍微加热使其完全溶解；
步骤c.再加入显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑、4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷；加入抗菌素萘啶酮酸，加入环丝氨酸、牛胆盐中的一种或多种；
步骤d.25℃下混匀后调节pH＝5-9；
步骤e.最后加入琼脂粉10-20g，煮沸使其完全溶解；
步骤f.冷却至50℃，在超净工作台上倒入无菌平板内，凝固后制成铜绿假单胞菌显色培养基；
步骤g.放置于2-8℃避光环境中保存。
通过采用上述技术方案，配制铜绿假单胞菌显色培养基，先配制基础培养基，稍微加热使各组分完全溶解，定容至1L，优选的，在25℃条件下调节pH＝7.2±0.2，在基础培养基中加入显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑、4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷和抗菌素萘啶酮酸、环丝氨酸、牛胆盐，铜绿假单胞菌显色培养基上生长的铜绿假单胞菌的菌落产生脱氢酶与显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑发生脱氢酶作用，产生红色的脂溶性三苯基甲月替，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷可以与铜绿假单胞菌作用，在366nm紫外灯下有荧光。
25℃下混匀后调节pH＝5-9均能够使铜绿假单胞菌发生上述显色反应，为了使铜绿假单胞菌在铜绿假单胞菌显色培养基上显色效果更佳，优选的，调节pH＝7.2±0.2，保证铜绿假单胞菌显色培养基的显色效果最好，加入琼脂粉便于制作固体培养基，便于观察铜绿假单胞菌在铜绿假单胞菌显色培养基上显色的菌落的数量；在2-8℃避光环境中保存铜绿假单胞菌显色培养基，铜绿假单胞菌在4℃左右不生长或生长极其缓慢。
本发明进一步设置为：所述步骤C具体包括；
步骤a1.将充分混匀的待测样品取27.5mL放入247.5mL灭菌生理盐水中稀释，充分混匀，制成1:10的梯度稀释待测样品；
步骤b1.用灭菌吸管吸取1:10的梯度稀释待测样品27.5mL，放入247.5mL灭菌生理盐水中稀释，充分混匀，制成1:100的梯度稀释待测样品；
步骤c1.另取1mL灭菌吸管，按步骤b1操作顺序，制作10倍递增稀释待测样品，每递增一次换用一支1mL灭菌吸管，制成若干倍数的均匀稀释液；
步骤d1.取每个倍数的均匀稀释液250mL进行下一步操作。
通过采用上述技术方案，便于将污染较为严重的的水样进行稀释，制作为10倍浓度递增的梯度稀释待测样品，避免水样污染较为严重，抑菌剂不足以完全抑制干扰菌或铜绿假单胞菌含量过高，菌落蔓延生长形成菌苔，成片显色，无法计数。
综上所述，本发明相比于现有技术具有以下有益效果：
1.在铜绿假单胞菌显色培养基的基础培养基中添加显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑和4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷，铜绿假单胞菌产生脱氢酶与显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑发生脱氢酶作用，产生红色的脂溶性三苯基甲月替，4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷可以与铜绿假单胞菌发生作用，菌落在366nm紫外灯下有荧光，铜绿假单胞菌与干扰菌区别效果更加明显，特异性显著，无需经验判断，减少实验员的偶然误差等优点；
2.优选的，在铜绿假单胞菌显色培养基中添加萘啶酮酸、环丝氨酸、牛胆盐用于抑制干扰菌；2,3,5-苯基氯化四氮唑也具有一定抑制干扰菌的作用，经试验验证，大部分干扰菌受到抑制，不会在铜绿假单胞菌显色培养基中生长，避免干扰菌的干扰；
3.一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，取250mL适宜稀释度的样品过滤，将过滤膜使用所述铜绿假单胞菌显色培养基，在36±1℃下培养24h即可得到显色结果，如果样品上存在红色菌落且在366nm紫外灯下有荧光，即可判断样品中存在铜绿假单胞菌，进而计数并计算样品中铜绿假单胞菌的含量，否则则不存在铜绿假单胞菌，传统方法通常需要5-7天才能判断是否存在铜绿假单胞菌，使用该方法大量节省了检测时间，并且检测结果稳定可靠，特别适用于大量水样现场检验。
附图说明
图1是国家标准GB8538-2016对于铜绿假单胞菌检测的流程图；
图2是一种铜绿假单胞菌快速检测的方法的流程图。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
一、材料
标准菌株：铜绿假单胞菌(ATCC 9027,ATCC 27853)，荧光假单胞菌(ATCC 13525),大肠埃希氏菌(ATCC 25922),粪链球菌(ATCC 29212)，金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)，沙门氏菌(ATCC 14028)均来源于美国菌种保藏中心。
仪器与试剂：密理博便携式过滤系统；密理博过滤膜0.45μm；海尔生物安全柜；三洋SANYO MLS-3050型高压灭菌锅；VDRTEX-5型旋涡混合仪；PL230型梅特勒电子天平；超净工作台。
实验基础条件：25-42℃条件下铜绿假单胞菌均可生长，考虑到铜绿假单胞菌的最适生长条件，优选的将筛选基础培养基的配方培养条件定为36±1℃，培养24h，本发明的所有操作均在超净台上进行无菌操作。
二、实施例1-46，对比例1-20
实施例1：一种铜绿假单胞菌显色培养基，其制备方法为：加入基础培养基配方，将蛋白胨 15.0g；酵母浸膏8.0g；硫酸钾10.0g，氯化镁1.4g，直接加入蒸馏水定容至1L，稍微加热使其完全溶解；再加入显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑0.5g，加入显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷0.01g，加入抑菌剂萘啶酮酸0.015g，混匀后25℃下调节pH＝7.2±0.2，最后加入琼脂15.0g，煮沸使其完全溶解，冷却至50℃左右倒平板，制得铜绿假单胞菌显色培养基，将铜绿假单胞菌(ATCC 9027)在营养肉汤中过夜复苏，配制105CFU菌悬液，转种于铜绿假单胞菌显色培养基上，在36±1℃的培养箱内培养24h，观察。
实施例2-7：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与实施例1的不同之处在于：在铜绿假单胞菌显色培养基上接种的菌种种类不同。具体参见表1所示，其中“+”表示添加，“-”表示未添加。
表1实施例2-7菌种特异性测试
实施例8：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与实施例1的不同之处在于：未加入显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷。
对比例1：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与实施例8的不同之处在于：未加入显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑和抑菌剂萘啶酮酸。
对比例2-7：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与对比例1的不同之处在于：在铜绿假单胞菌显色培养基上接种的菌种种类不同。具体参见表2所示，其中“+”表示添加，“-”表示未添加。
表2对比例2-7菌种特异性测试
实施例9：一种铜绿假单胞菌显色培养基，其制备方法为：加入基础培养基配方，将蛋白胨15.0g；酵母浸膏8.0g；硫酸钾10.0g，氯化镁1.4g，直接加入蒸馏水定容至1L，稍微加热使其完全溶解；再加入显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑0.5g，加入显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷0.01g，加入抑菌剂萘啶酮酸0.015g，混匀后25℃下调节pH＝7.2±0.2，最后加入琼脂15.0g，煮沸使其完全溶解，冷却至50℃左右倒平板，制得铜绿假单胞菌显色培养基，将铜绿假单胞菌在营养肉汤中过夜复苏，配制10-5CFU菌悬液，用灭菌后的微量移液器移取100μL涂布于铜绿假单胞菌显色培养基上，在36±1℃的培养箱内培养24h 后对培养基上显红色的在366nm紫外灯下有荧光的铜绿假单胞菌的数量计数，菌落计数规则如下：
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个以上有效平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
实施例10：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与实施例9的不同之处在于：铜绿假单胞菌的菌悬液浓度为10-6CFU。
实施例11：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与实施例9的不同之处在于：铜绿假单胞菌的菌悬液浓度为10-7CFU。
对比例8：与实施例9的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1)57.4记载的方法对铜绿假单胞菌培养、计数。
对比例9：与对比例8的不同之处在于：铜绿假单胞菌的菌悬液浓度为10-6CFU。
对比例10：与对比例8的不同之处在于：铜绿假单胞菌的菌悬液浓度为10-7CFU。
对比例11：与实施例9的不同之处在于：使用营养琼脂培养10-5CFU的铜绿假单胞菌并进行计数。
对比例12：与对比例11的不同之处在于：铜绿假单胞菌的菌悬液浓度为10-6CFU。
对比例13：与对比例11的不同之处在于：铜绿假单胞菌的菌悬液浓度为10-6CFU。
实施例12：一种铜绿假单胞菌显色培养基，其制备方法为：加入基础培养基配方，将蛋白胨15.0g；酵母浸膏8.0g；硫酸钾10.0g，氯化镁1.4g，直接加入蒸馏水定容至1L，稍微加热使其完全溶解；再加入显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑0.5g，加入显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷0.01g，加入抑菌剂萘啶酮酸0.015g，混匀后25℃下调节pH＝7.2±0.2，最后加入琼脂15.0g，煮沸使其完全溶解，冷却至50℃左右倒平板，制得铜绿假单胞菌显色培养基。
将铜绿假单胞菌在营养肉汤中过夜复苏，将铜绿假单胞菌10-6的悬菌液、荧光假单胞菌10-6的悬菌液,大肠埃希氏菌10-6的悬菌液,粪链球菌10-6的悬菌液，金黄色葡萄球菌10-6的悬菌液，沙门氏菌10-6的悬菌液加到250mL的水样中，用无菌镊子夹取灭菌0.45μm过滤膜边缘部分,粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上,固定好过滤器，对加标水样进行过滤。
过滤膜有菌一面向上，无菌贴合于步骤A中制备的铜绿假单胞菌显色培养基上进行接种。在36±1℃的培养箱内培养24h后对培养基上铜绿假单胞菌的数量计数。
实施例13-22：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与实施例12的不同之处在于，显色底物、抑菌剂的配方及用量均不同。具体参见表3所示。
表3显色底物、抑菌剂配方及用量
实施例23-40：一种铜绿假单胞菌显色培养基，与实施例12的不同之处在于，基础培养基的配方及用量均不同。具体参见表4所示。
表4基础培养基各组分用量
实施例41：与实施例12的不同之处在于：将铜绿假单胞菌10-5、荧光假单胞菌10-5的悬菌液,大肠埃希氏菌10-5的悬菌液,粪链球菌10-5的悬菌液，金黄色葡萄球菌10-5的悬菌液，沙门氏菌10-5的悬菌液的悬菌液加到250mL的水样中制成加标水样，过滤后接种。
实施例42：与实施例12的不同之处在于：将铜绿假单胞菌10-7、荧光假单胞菌10-7的悬菌液,大肠埃希氏菌10-7的悬菌液,粪链球菌10-7的悬菌液，金黄色葡萄球菌10-7的悬菌液，沙门氏菌10-7的悬菌液的悬菌液加到250mL的水样中制成加标水样，过滤后接种。
对比例14：与实施例12的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1)57.4记载的方法对铜绿假单胞菌培养、计数。
对比例15：与实施例41的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1)57.4记载的方法对铜绿假单胞菌培养、计数。
对比例16：与实施例42的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1)57.4记载的方法对铜绿假单胞菌培养、计数。
实施例43：一种铜绿假单胞菌快速检测的方法(如图2所示)，包括如下步骤：
步骤A、用电子天平称取蛋白胨15.0g、酵母浸膏8.0g、硫酸钾10.0g、氯化镁1.4g、琼脂15.0g；直接加入蒸馏水补足1L，稍微加热使其完全溶解，再加入2,3,5-苯基氯化四氮唑0.5g；4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷0.01g；萘啶酮酸0.015g、环丝氨酸0.5g，牛胆盐0.5g；25℃下混匀后调节pH＝7.2，煮沸使其完全溶解；冷却至50℃，在超净工作台上倒入无菌平板内，凝固制成铜绿假单胞菌显色培养基；
步骤B、将瓶/桶装水混匀并取样50份待测样品，每份待测样品250mL；
步骤C、省略；
步骤D、用无菌镊子夹取灭菌过滤膜边缘部分,粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上,固定好过滤器，对步骤B中的待测样品或步骤C中的梯度稀释待测样品通过过滤膜进行过滤，所述过滤膜的规格为0.45μm；
步骤E、将步骤D中的过滤膜有菌一面向上，无菌贴合于步骤A中制备的铜绿假单胞菌显色培养基上进行接种，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留气泡；
步骤F、将接种完毕的铜绿假单胞菌显色培养基置于36±1℃的培养箱内24h；
步骤G、从培养箱中取出，选取每皿30-300CFU之间的平板计数并计算样品中铜绿假单胞菌的含量。
实施例44：一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，与实施例43不同之处在于：步骤B中50份待测样品来自于水源水。
实施例45：一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，与实施例43不同之处在于：步骤B中50份待测样品来自于城市二次供水。
实施例46：一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，与实施例43不同之处在于：步骤B中从环境水中取25份待测样品，每一份待测样品取275.5mL，将每一份待侧样品取27.5mL放入247.5mL灭菌生理盐水中稀释，充分混匀，制成25份1:10的梯度稀释待测样品，共计 50份。
对比例17：与实施例43的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1所示)57.4记载的方法对50份取自于瓶/桶装水中的待测样品过滤、培养、计数。
对比例18：与实施例43的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1所示)57.4记载的方法对50份取自于水源水中的待测样品过滤、培养、计数。
对比例19：与实施例43的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1所示)57.4记载的方法对50份取自于城市二次供水中的待测样品过滤、培养、计数。
对比例20：与实施例43的不同之处在于：使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1所示)57.4记载的方法对25份取自于环境水中的待测样品，每一份待测样品取275.5mL，将每一份待侧样品取27.5mL放入247.5mL灭菌生理盐水中稀释，充分混匀，制成25份1:10的梯度稀释待测样品，共计50份进行过滤、培养、计数。
三、实验一：铜绿假单胞菌显色培养基的特异性测试
通过对实施例1-8和对比例1-7中每个实施例和对比例平行做5组实验，将实验结果均值示于表5。
表5实施例1-8和对比例1-7培养的显色结果
结论一：通过实施例1-7与对比例1-7对比发现，铜绿假单胞菌显色培养基的基础培养基中添加显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑、4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷，能够使铜绿假单胞菌显红色，366nm紫外灯下显荧光，2,3,5-苯基氯化四氮唑配合抑菌剂萘啶酮酸能够抑制105CFU的干扰菌荧光假单胞菌(ATCC 13525)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922),粪链球菌(ATCC 29212)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙门氏菌(ATCC 14028)的生长，荧光假单胞菌在不具有显色底物和抑菌剂的培养基，36℃条件下基本不生长，不过也有少部分可以生长良好，而在铜绿假单胞菌显色培养基上完全不生长，表明铜绿假单胞菌显色培养基具有很好的特异性。
结论二：通过实施例1和实施例8对比可以发现，显色底物4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷具有使铜绿假单胞菌在366nm紫外灯下显荧光的作用，显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑具有使铜绿假单胞菌显红色的作用，两种显色底物均添加可以使结果更加准确可靠，避免系统误差，减少偶然误差。
四、实验二：铜绿假单胞菌显色培养基的灵敏性测试
通过对实施例9-11和对比例8-13中每个实施例和对比例平行做5组实验，将实验结果均值示于表6。
表6实施例9-11和对比例8-10铜绿假单胞菌的计数结果
| 实验组别 | 计数结果 | 实验组别 | 计数结果 | 实验组别 | 计数结果 |
| 实施例9 | 220±10 | 对比例8 | 203±41 | 对比例11 | 195±45 |
| 实施例10 | 6±1 | 对比例9 | 5±2 | 对比例12 | 4±2 |
| 实施例11 | 0 | 对比例10 | 0 | 对比例13 | 0 |
结论三：通过实施例9-11、对比例8-10和对比例11-13经对比发现，铜绿假单胞菌在三种培养基上的生长数量无显著差异，铜绿假单胞菌显色培养基能够达到国标中使用的传统培养基(CN假单胞菌选择性培养基)相同的效果和灵敏度，铜绿假单胞菌显色培养基的效果和灵敏度优于营养琼脂，CN假单胞菌选择性培养基和营养琼脂的测试结果具有较大的波动，铜绿假单胞菌显色培养基检测的稳定性高于CN假单胞菌选择性培养基和营养琼脂，结果更加准确可靠。
五、实验三：铜绿假单胞菌显色培养基各组分最佳用量的确定
通过对实施例12-42和对比例14-16中每个实施例和对比例平行做5组实验，将实验结果均值示于表7。
表7实施例12-42和对比例14-16铜绿假单胞菌的计数结果
结论四：通过实施例12-22与对比例14对比、实施例41与对比例15对比、实施例 42与对比例16对比发现，2,3,5-苯基氯化四氮唑的最适用量为0.5g/L；4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的最适用量为0.01g/L；添加萘啶酮酸能够抑制干扰菌在铜绿假单胞菌显色培养基上生长，其最佳用量为0.015g/L；为了增加铜绿假单胞菌显色培养基更为广泛的抗菌性能，添加环丝氨酸、牛胆盐作为抑菌剂的补充，当环丝氨酸用量为环丝氨酸用量为0.5g/L，牛胆盐用量为0.5g/L时对铜绿假单胞菌的计数影响最小；综上，2,3,5-苯基氯化四氮唑的用量为0.5g/L、4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的用量为0.01g/L、萘啶酮酸用量为0.015g/L、环丝氨酸用量为0.5g/L、牛胆盐用量为0.5g/L时铜绿假单胞菌显色培养基上对铜绿假单胞菌的计数结果与国标方法GB8538-2016的计数结果无显著差异，铜绿假单胞菌显色培养基计数的稳定性更高，灵敏性更佳，结果更加准确可靠。
结论五：通过实施例23-40与实施例12对比发现，蛋白胨的用量为15.0g/L、酵母浸膏的用量为8.0g/L、硫酸钾的用量为10.0g/L、氯化镁的用量为1.4g/L、琼脂的用量为15.0g/L；余量为蒸馏水，添加15g琼脂粉时，以此配方用量配制而成的基础培养基的性能对于铜绿假单胞菌的生长是最佳的，是否添加葡萄糖对于通过铜绿假单胞菌显色培养基对铜绿假单胞菌的计数结果影响不大。
结论六：综合结论四与结论五，得到铜绿假单胞菌显色培养基的最终配方为：蛋白胨的用量为15.0g/L、酵母浸膏的用量为8.0g/L、硫酸钾的用量为10.0g/L、氯化镁的用量为1.4g/L、琼脂的用量为15.0g/L；2,3,5-苯基氯化四氮唑的最适用量为0.5g/L；4-甲基伞形酮- D-葡萄糖醛酸苷的最适用量为0.01g/L；萘啶酮酸用量为0.015g/L、环丝氨酸用量为0.5g/L，牛胆盐用量为0.5g/L，余量为蒸馏水。
六、实验四：铜绿假单胞菌显色培养基的确证性试验
通过对实施例43-46和对比例17-20中每个实施例和对比例平行做5组实验，将实验结果均值示于表8。
表8实施例43-46和对比例17-20铜绿假单胞菌的检测计数结果
| 实验组别 | 检测计数结果 | 实验组别 | 检测计数结果 |
| 实施例43 | 5 | 对比例17 | 6 |
| 实施例44 | 3 | 对比例18 | 3 |
| 实施例45 | 0 | 对比例19 | 0 |
| 实施例46 | 7 | 对比例20 | 9 |
其中本发明的一种铜绿假单胞菌快速检测的方法24h即可检验得出结果，经过API20NE鉴定试剂盒最终确认均为铜绿假单胞菌，未发现假阳性现象，而CN假单胞菌选择性培养基上出现5株假阳性菌株，经过鉴定均是荧光假单胞菌。
结论七：两种铜绿假单胞菌检测方法的结果基本相同，而使用CN假单胞菌选择性培养基，通过GB8538-2016(如图1所示)57.4记载的方法则至少需要48小时，如果再进行进行产氨试验、氧化酶试验、荧光试验则需要5-7天以上，本发明提出的一种铜绿假单胞菌快速检测的方法24h即可检验得出结果，较传统方法更加省时省力，可靠准确。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，包括基础培养基、显色底物、抑菌剂，所述显色底物包括2,3,5-苯基氯化四氮唑；所述抑菌剂包括萘啶酮酸；所述基础培养基包括碳源、氮源、无机盐、生长因子、水。
2.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑的用量为0.1-1.0g/L。
3.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述抑菌剂萘啶酮酸的用量为0.01-0.03g/L。
4.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述显色底物还包括4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷。
5.根据权利要求4所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷的用量为0-0.1g/L。
6.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述碳源的用量为0-40g/L，所述碳源由葡萄糖提供；所述氮源的用量为5-25g/L，所述氮源由蛋白胨和/或酪蛋白提供；所述生长因子由酵母浸膏提供，所述酵母浸膏的用量为2-14g/L；所述无机盐包括硫酸钾、氯化镁，所述硫酸钾的用量为5-20g/L，所述氯化镁的用量为1-3g/L；余量为蒸馏水。
7.根据权利要求1所述的一种铜绿假单胞菌显色培养基，其特征在于，所述抑菌剂还包括有环丝氨酸、牛胆盐中的一种或多种；所述牛胆盐的用量为0-1.0g/L；所述环丝氨酸的用量为0-1.0g/L。
8.一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A、配制权利要求书1-7中任意一种铜绿假单胞菌显色培养基；
步骤B、对待测水源混匀并取样250mL后得到待测样品；
步骤C、对待测样品进行梯度稀释后得到梯度稀释待测样品；
步骤D、用无菌镊子夹取灭菌过滤膜边缘部分,粗糙面向上贴放在已灭菌的滤床上,固定好过滤器，对步骤B中的待测样品或步骤C中的梯度稀释待测样品通过过滤膜进行过滤，所述过滤膜的规格为0.45μm；
步骤E、将步骤D中的过滤膜有菌一面向上，无菌贴合于步骤A中制备的铜绿假单胞菌显色培养基上进行接种，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留气泡；
步骤F、将接种完毕的铜绿假单胞菌显色培养基置于25-42℃的培养箱内24-48h；
步骤G、从培养箱中取出，选取每皿30-300CFU之间的平板计数并计算样品中铜绿假单胞菌的含量。
9.根据权利要求8所述的一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，其特征在于，所述步骤A具体包括：
步骤a.用电子天平称取蛋白胨、酵母浸膏、葡萄糖、硫酸钾、氯化镁；
步骤b.直接加入蒸馏水，稍微加热使其完全溶解；
步骤c.再加入显色底物2,3,5-苯基氯化四氮唑、4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷；加入抗菌素萘啶酮酸，加入环丝氨酸、牛胆盐中的一种或多种；
步骤d.25℃下混匀后调节pH=5-9；
步骤e.最后加入琼脂粉10-20g，煮沸使其完全溶解；
步骤f.冷却至50℃，在超净工作台上倒入无菌平板内，凝固后制成铜绿假单胞菌显色培养基；
步骤g.放置于2-8℃避光环境中保存。
10.根据权利要求8所述的一种铜绿假单胞菌快速检测的方法，其特征在于，所述步骤C具体包括：
步骤a1.将充分混匀的待测样品取27.5mL放入247.5mL灭菌生理盐水中稀释，充分混匀，制成1:10的梯度稀释待测样品；
步骤b1.用灭菌吸管吸取1:10的梯度稀释待测样品27.5mL，放入247.5mL灭菌生理盐水中稀释，充分混匀，制成1:100的梯度稀释待测样品；
步骤c1.另取1mL灭菌吸管，按步骤b1操作顺序，制作10倍递增稀释待测样品，每递增一次换用一支1mL灭菌吸管，制成若干倍数的均匀稀释液；
步骤d1.取每个倍数的均匀稀释液250mL进行下一步操作。
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