CN101535496A - 基因工程生物指示剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开的技术涉及一种基因工程生物指示剂，其包含：至少一种试验生物体和至少一种适于产生指示酶的报道基因，所述报道基因由所述试验生物体携带；以及至少一种阻抑基因，所述阻抑基因抑制所述报道基因的表达，直至所述报道基因暴露于至少一种诱导剂。本发明公开了一种使用所述生物指示剂的方法和装置。

Description

基因工程生物指示剂
技术领域
本发明公开的技术涉及基因工程生物指示剂。所述生物指示剂可用于检测一种或多种灭菌工艺的效力。
背景技术
主要在医疗保健业，还有许多其他商业和工业应用中，常常有必要监测用于对设备进行灭菌的工艺的效力，所述设备诸如医疗和非医疗装置、仪器以及其他物品和材料。在这些灭菌工艺中于批量待灭菌的物品中包括灭菌指示器通常是标准操作。这允许直接的方法用于分析灭菌工艺的致死率。
无菌保证的典型方法通常包括将包含一种或多种试验生物体(testorganisems)的灭菌指示器暴露于灭菌工艺，然后检测任何存活的试验生物体的生长。如果在暴露于灭菌工艺之后无试验生物体生长，则无菌得以保证。细菌芽孢(例如，嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)等)通常用作试验生物体。当灭菌工艺完成时，在促进任何存活的试验生物体细胞生长的条件下，将灭菌指示器暴露于液体生长支持培养基。生长支持培养基通常含有响应活跃生长(代谢)的细胞而改变颜色的化学染料。因为对于生长和代谢的需要，应用这些试验生物体的工艺在灭菌工艺的效力可被检测之前通常需要约24至72小时的培养。该工艺的问题涉及这样的事实：即，诸如医疗保健设施等的灭菌物品的许多使用者具有有限的资源，并且可能在24至72小时之内，有时立即再使用“灭菌的”物品。在这种情况下，用于无菌验证的24至72小时的持续时间可能不切实际、昂贵且效率低。
已经提出一种用于较快速读出某些121℃和132℃的重力和预真空蒸汽灭菌循环以及环氧乙烷灭菌循环试验结果的检测方法。据报道，观察存活的指示细胞的证据所需的时间少至1小时。据信，该工艺包括检测α葡萄糖苷酶的催化活性。这种酶可由微生物作为其代谢的正常组分而产生，并且可在灭菌前和灭菌过程中存在于所述微生物的芽孢外被中。这种酶的存在可通过读取由非荧光酶底物分解而产生的荧光而检测。这需要使用荧光自动读数仪。所述酶底物的分解可为一种早期检测，代替了等待指示灭菌工艺失败的可视的pH颜色变化。荧光信号既不需要生长也不需要代谢。这导致观察灭菌工艺失败所需的时间减少。然而，嗜热来源的α葡萄糖苷酶，比其所来源的微生物更抗热。这可导致让人讨厌的失败——即，其中试验微生物实际上已经被杀死，但指示酶指示试验微生物仍然存活的状况。另外，由于α葡萄糖苷酶可存在于试验微生物的芽孢外被中，并且其存在不需要代谢，这种酶的检测不直接指示生命。
存在着α葡萄糖苷酶的使用不能区分未成功灭菌的载荷的情形。成功的蒸汽灭菌取决于以最小的时间长度实现有效的温度和压力。由于细菌芽孢对于这种参数的组合具有高抵抗力，它们通常被选作该工艺的试验生物体。杀死细菌芽孢需要温度、压力和时间的特别致死的组合。尽管靶/报告分子(α葡萄糖苷酶)是一种源自嗜热生物体的催化酶，并由此对热具有一些抵抗力，但是最终破坏该酶功能的是工艺中的热。也就是说，压力和时间在α葡萄糖苷酶的变性中所起的作用减小。因此，在亚致死的压力或时间条件下，即使细菌芽孢不被破坏，指示酶也可被破坏。这可导致不能检测到未灭菌的载荷。
现有技术不能考虑到与细胞死亡相关的所有参数，这意味着可能需要“生长(grow out)”来提供最终的确定性结果。然而，需要传统上称为“生长”的工艺的主要缺点涉及获得灭菌检测结果的时间延迟。需要生长的灭菌指示器通常使用细菌芽孢，芽孢必须被培养至少约24至72小时，以确保的充分检测任何存活芽孢。在此期间，经历灭菌工艺且被评价的物品应直至芽孢存活率检测已经得以测定之后才可使用。然而，如上所述，这对于需要灭菌的物品的许多使用者来说是不切实际的。
因此，现有技术存在的问题是提供一种在较短的时间之内准确和直接检测灭菌工艺的效力的生物指示剂。本发明公开的技术提供了该问题的解决方案。
发明内容
本发明公开的技术涉及一种基因工程生物指示剂，其包含：至少一种试验生物体和至少一种适于产生指示酶的报道基因，所述报道基因由所述试验生物体携带；以及至少一种阻抑基因，所述阻抑基因抑制所述报道基因的表达，直至所述报道基因暴露于至少一种诱导剂。
本发明公开的技术涉及一种灭菌工艺，其包括：将待灭菌的物品和上述生物指示剂暴露于灭菌介质。
本发明公开的技术涉及一种用于检测灭菌工艺的效力的方法，其包括：将至少一种待灭菌的物品和包含上述生物指示剂的灭菌指示器暴露于灭菌介质；以及使所述灭菌指示器与至少一种诱导剂和至少一种酶底物接触以检测灭菌是否有效。
本发明公开的技术涉及一种灭菌指示器，其包括：载体，所述载体具有第一表面和第二表面；支持物，所述支持物具有第一部分和第二部分，所述载体覆盖在所述支持物的第一部分的上面，所述载体的第二表面附着于所述支持物的第一部分；以及上述基因工程生物指示剂，其由所述载体支持，所述支持物的第二部分具有足够的维度，以允许在不接触所述生物指示剂的情况下操作所述灭菌指示器。
本发明公开的技术涉及一种灭菌指示器，其包括：第一隔腔，所述第一隔腔包含上述基因工程生物指示剂，在灭菌过程中，所述第一隔腔适于允许使所述生物指示剂与灭菌介质接触；和第二隔腔，所述第二隔腔包含至少一种诱导剂和至少一种酶底物，所述第二隔腔适于在灭菌过程中，使所述诱导剂和所述酶底物与所述生物指示剂保持分离，且所述第二隔腔适于在所述生物指示剂暴露于所述灭菌介质之后，允许所述诱导剂和所述酶底物与所述生物指示剂接触。
附图简述
在附图中，相同的部件和特征具有相同的附图标记。
图1-图3是可用于形成本发明所公开的基因工程生物指示剂的质粒构建体的图解。
图4是实施例1中所使用的质粒构建体的图解。
图5是可用于支持本发明所公开的生物指示剂的灭菌指示器的平面示意图。
图6是图5描述的灭菌指示器的侧视示意图。
图7是用检测灭菌效力的灭菌指示器的分解示意图，所述灭菌指示器包含两个隔腔，前述生物指示剂位于其中一个隔腔中，并且至少一种诱导剂和至少一种酶底物位于另一个隔腔中。
具体实施方式
术语“灭菌”是指使得一种物质不能繁殖、代谢和/或生长。尽管此术语常用于指总体无活生物体，该术语在本发明中可用于指游离于活生物体的物质达到先前认为可接受的程度。除非特别指明，术语灭菌在本发明中还可指比灭菌较不严格的方法和过程，例如，消毒、清洁等。本发明所述的基因工程生物指示剂及其工艺和装置可用于医疗保健领域、科学领域等。这些可用于其中需要灭菌、消毒、卫生处理、排除污染、清洁等的商业和工业应用。所述商业和工业应用可包括诸如食品加工、巴氏消毒、土壤修复、水修复等。
本发明所公开的灭菌指示器所用于的灭菌工艺可包括任何灭菌工艺。所述灭菌工艺可包括下述灭菌工艺：其中灭菌介质或灭菌剂包括蒸汽、干热、辐射、等离子体以及一种或多种气体灭菌剂、一种或多种液体灭菌剂等的灭菌工艺。辐射可包括电子束或任何电磁波谱，包括电离辐射、脉冲白光或紫外光、微波等。辐射可包括γ或β辐射。气体灭菌剂可包括环氧乙烷、气体过氧化氢等。液体灭菌剂可包括福尔马林(溶解于水的甲醛气体，且任选含有抑制毒性物质生成的甲醇)、戊二醛、过氧乙酸、液体过氧化氢等。
所述基因工程生物指示剂可用于检测灭菌剂针对对于灭菌工艺具有比与所述基因工程生物指示剂提供的试验生物体具有较低抵抗力的任何生物体的致死性。这些微生物可包括细菌，诸如大肠杆菌(Escherichiacoli)、军团杆菌(Legionella sp.)、弯曲杆菌(Campylobacter sp.)和其他肠细菌，以及葡萄球菌(Staphylococcus)和链球菌(Streptococcus)，以及其他人类致病微生物，诸如隐孢子虫(Cryptosporidium)。
生物体的生长可包括多个细胞过程的组合结果。在典型的灭菌指示器应用中，这可以以几种方式观察到。随着细胞生长和分裂，它们的个体数量增加至一个点，在该点细胞的支持培养基可从澄清变为不透明(混浊)。为了促进这种对于生长的观察，可以使用pH指示染料。生长需要能量。该能量可由细胞代谢包含在支持培养基中的营养素的能力来提供。该过程的分解产物可导致支持培养基变成酸性。这种酸性可诱导pH指示染料(例如酚红)变成红色。因此，生长可被观察为支持培养基从澄清的红色转变成黄色，例如转变成混浊的黄色状态。尽管这些过程缓慢，但它们是代表生命的强有力证据，且通常被接受为各无菌保证管理机构的基准。通过将活力作为靶/报告酶(例如α葡萄糖苷酶)的活性的函数来间接测量，缩短得到无菌指示所需要的时间是可能的。然而，如上所述，该工艺可仍旧需要生长来作为最终的证实。因为生长和代谢废物产物的积累是生命过程的最终结果，它们需要大量的时间(24至72小时)来变得显而易见。
对于本发明来说，适于产生指示酶(例如，β-半乳糖苷酶)的报道基因(例如lacZ)可使用合适的载体(例如，质粒或病毒)由试验生物体(例如细菌微生物)携带。报道基因的表达可以被阻抑基因(例如xylR)活跃阻断。报道基因的表达可保持阻断状态，直至阻抑基因被暴露于一种可存在于恢复培养基中的诱导剂(例如，木糖)。由于直至灭菌工艺完成之后试验生物体才暴露于诱导剂，在灭菌之前或在灭菌过程中，指示酶可不存在。这意味着在试验生物体和指示酶对于灭菌工艺的易感性之间不需要相关性。可能暴露于灭菌工艺的是试验生物体存活和生长，同时还用于产生指示酶的不同关键机制。这些机制可包括用于细胞生长(和质粒复制)的DNA聚合酶、用于试验生物体(和质粒或病毒来源的报道基因，例如lacZ)代谢需要的转录的RNA聚合酶以及细胞蛋白翻译(以及指示酶表达)所需的核糖体的多核糖体。因为指示酶可快速用作信号产生机制，任何仍具有活力的生物体的存在可早于它们受限于试验生物体的关键生长机制的积累的最终结果的情况而变得明显。
试验生物体可包括对于预期的灭菌工艺的抵抗力超过待由所述灭菌工艺破坏的其他生物体的抵抗力的任何生物体。试验生物体的类型可取决于多种因素，例如但不限于所使用的灭菌工艺的类型。试验生物体可为微生物。可使用的菌株可为对用于灭菌的工艺具有最高抵抗力的那些。试验生物体可包括一种或多种细菌、病原体、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、营养型生物体、病毒、非自主复制因子、细胞的亚细胞组分或产物和/或朊病毒。细菌微生物可为形成内生孢子即细菌芽孢的那些。试验生物体可包括杆菌、地芽孢杆菌(Geobacillus)或梭状芽胞杆菌属。这些可包括嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、萎缩杆菌(Bacillus atrophaeus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、球形杆菌(Bacillussphaericus)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coαgulans)、产芽孢梭状芽孢杆菌(Clostridium sporogenes)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、枯草芽孢杆菌球形变异体(Bacillus subtilis globigii)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、大肠杆菌(Escherichia coli)等。所述细菌可包括真菌、分枝杆菌、原生动物、营养型细菌(vegetative bacteria)等。可以使用的真菌的实例可包括黑曲霉(Aspergillus niger)、白色念珠菌(Candida albicans)、须毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、皮炎万吉拉菌(Wangiella dermatitis)等。可以使用的分枝杆菌的实例可包括龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、戈登氏分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmantis)、土分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等。可以使用的原生动物的实例可包括兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、小球隐孢子虫(Cryptosporidiumpαrvum)等。可以使用的营养型细菌的实例可包括嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、化脓性链球菌(Streptococcus pyrogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺性军团病杆菌(Legionellapneumophila)、甲基营养杆菌(Methylobacterium)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、耐辐射微球菌(Micrococcusradiodurans)、耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)等。诸如嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩杆菌、枯草杆菌、凝结芽孢杆菌、产芽孢梭状芽孢杆菌等生物体可用于检测湿热灭菌(高压灭菌)的效力，嗜热脂肪地芽孢杆菌尤其有用。
营养型生物体，诸如营养型细菌，营养型细胞和/或它们的组成部分可用作试验生物体。其实例可包括大肠菌和不形成内生孢子的细胞，例如，嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、(肺炎)克雷伯氏杆菌、嗜肺性军团病杆菌、甲基营养杆菌、绿脓假单胞菌、猪霍乱沙门氏菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌等。这些可联合一种或多种赋形剂使用。赋形剂可被定义为一大类可用于稳定不稳定实体的通常为惰性的化合物。可以使用的赋形剂亚类包括碳水化合物，例如低聚糖和多聚糖。这种化合物的实例可为是二糖的海藻糖。某些生物体的组织中的高浓度海藻糖可允许所述生物体在缺水的状态下存活。海藻糖可用于在脱水后恢复功能性细胞组分。海藻糖可提供对于在极端环境条件下(例如，冷冻干燥)细胞的活力必需的膜和其他大分子结构的稳定性。其他稳定赋形剂化合物可包括单糖(例如，蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等)和长链聚合物(例如，葡聚糖、淀粉、琼脂糖、纤维素等)。其他基于非碳水化合物的赋形剂可包括蛋白质、膦酸酯(或盐)、缓冲剂、蜡、脂质、油以及其他基于烃的材料。
试验指示剂可包含一种或多种非自复制因子和/或细胞的亚细胞组分或产物。由于它们的临床重要性或由于它们作为生物恐怖因子的用途，可被使用。这些指示剂材料可包含目前由于天然或人工改变而对通常的抗生素治疗或化学消毒具有抵抗力的细胞株。前一种类型的实例可包括VRE(抗万古霉素肠球菌)、MSRA(抗甲氧西林金黄色葡萄球菌)、龟分枝杆菌等。由于VRE和MRSA已经发展了对治疗的对抗措施的抗性(例如，抗生素抗性)，和龟分枝杆菌已经发展了对某些消毒方式的抗性(例如，戊二醛抗性)，它们可以被使用。
试验指示剂可包含一种或多种新出现的生物体。这些可表现为对于治疗过程或消毒的特别的危险或挑战。这些指示剂材料的实例可包括朊病毒。朊病毒本质上不是活的生物体，但它们作为致病因子的功能与它们的结构有关，且该结构/功能关系可用于检测它们的相对感染性。可以使用其他非自主因子(例如，病毒)以及亚细胞元件和蛋白质性朊病毒。
由试验生物体携带的报道基因被提供用于产生指示酶，其可包括lacZ、bgaB、xylE、cat、gfp或它们中的两种或更多种的混合物。术语“lacZ”是指β-半乳糖苷酶的编码基因。术语“bgaB”是指来自嗜热脂肪地芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶的编码基因。术语“xylE”是指来自恶臭假单胞菌(Pseudomouas putida)的儿茶酚-2，3-加双氧酶的编码基因。术语“cat”是指氯霉素乙酰转移酶的编码基因，例如来自pC194的。术语“pC194”是指特定的质粒构建体。术语“gfp”是指耐热绿色荧光蛋白变异体的编码基因。
阻抑基因可由试验生物体携带。阻抑基因可包含xylR、lacI、tetR或它们中的两种或更多种的混合物。术语“xylR”是指木糖操纵子的调节子。术语“lacI”是指lac操纵子的调节子。术语“tetR”是指tet操纵子的调节子。可以使用这些的耐热对应物。阻抑基因可用于活跃阻断报道基因的表达，直至报道基因暴露于可存在于恢复培养基中的诱导剂。阻抑基因可由带有与用于在试验生物体中插入报道基因的相同运载体的试验生物体携带。
用于在试验生物体中插入报道基因和阻抑基因的运载体可包括一种或多种质粒和/或一种或多种病毒。这些运载体可被称为载体。质粒可包含从染色体DNA分离的环形双链DNA。质粒可以为线性的。质粒的大小范围可为约2000至约20000碱基对(bp)，在一个实施方案中，范围为约5000至约10000bp。相同质粒的一个或多个拷贝(例如，1至约3000拷贝，在一个实施方案中1至约60拷贝，在一个实施方案中约20至约3000拷贝)可以由试验生物体的单个细胞携带。质粒可含有用作复制起点(ori)的一个或多个DNA序列。质粒可含有一种或多种基因标记。质粒可含有聚合接头或多克隆位点(MCS)，聚合接头或多克隆位点可为含有一个或多个允许插入DNA片段的限制性位点的较短的区域。质粒可含有提供用来诱导试验生物体保留质粒的选择性标记的一种或多种基因。选择性标记可包括抗生素抗性基因和/或具有营养能力的基因。质粒可包括可接合质粒，可接合质粒含有可实现接合过程(质粒性转移至另一细菌)的转基因。
质粒可包含至少一种复制起点，至少一种选择性标记，至少一种可诱导启动子，以及至少一种报道基因。其实例描述于图1和图2中。选择性标记可包括抗生素抗性基因和/或具有外源性营养能力的基因。这些可包括氯霉素、氨苄青霉素或壮观霉素抗生素基因，和/或木糖或乳糖营养基因。可诱导启动子可包括PxylA。术语“PxylA”是指需要木糖来保留活性的转录启动子。报道基因可包括lacZ、bgaB、xylE、cat、gfp等。质粒可包含两个复制起点。其中一种复制起点可包括革兰氏阴性复制起点，另一种复制起点可包括革兰氏阳性复制起点。革兰氏阴性复制起点可包括大肠杆菌位点。革兰氏阳性复制起点可包括枯草杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌或萎缩杆菌位点。图1和2中描述的质粒可含有约2000至约20000bp，在一个实施方案中约5000至约10000bp。，
质粒可具有图3中描述的结构。在图3中，使用了下列缩略语：
“cat”是指含有来自pC194的氯霉素乙酰基转移酶基因的DNA片段。
“rep”是指复制基因。
“mob”是指移动因子基因。
“xylR”是指木糖操纵子的调节子。
“bgaB”是指耐热的β-半乳糖苷酶基因。
“T1T2”是指终止子1和2。
术语“PciI”、“BssSI”、“BseYI”、“ApaLI”、“PstI”、“NruI”、“PacI”、“PvuII”、“XhoI”、“SfiI”、“SalI”、“SpeI”、“SacII”、“NotI”、“AatII”、“SnaBI”是指存在于图3描述的质粒的DNA序列内的限制性内切酶位点。这些位点表现为多种限制性内切酶的切割位点，并在图3中用作参照位点。这些位点可用于帮助鉴定质粒。它们可用于将质粒切割成其组成部分。图3中描述的质粒具有7967个碱基对。
天然存在的质粒在大范围的天然宿主生物体中存在。它们可包含基因、调控元件和/或DNA的结构片段。质粒通常对其宿主生物体提供一些益处(例如，抗生素抗性或使用某些能量的营养来源的能力)，并且可由其宿主生物体耐受，只要该益处关系存在。基因工程质粒可包含拼凑的感兴趣的基因、调控元件和/或结构片段。由于可获得这么多天然存在的(和先前设计的)质粒，所以具有广泛可选的基因来选择。就图1和2中描述的质粒而言，所应用的基因基于最终得到的构建体的所需特性而选择。这些特性可包括转化最大范围的有用的宿主生物体的能力，提供给宿主生物体一些选择性益处(例如，抗生素抗性)，产生需要的耐热和快速可检测的信号，以及提供“关闭”的信号，直至其需要“打开”。这可通过将来自多种来源的质粒的DNA片段形式中的所需属性拼凑在一起(连接)来实现。例如，片段可包含革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的复制起点、氯霉素抗性的cat基因、耐热β-半乳糖苷酶的bgaB基因，以及调节bgaB基因产物直至被需要的xylR调节子。
具体设计的质粒可通过装配所需的基因元件而构建。基因元件可通过从供体质粒或生物体限制性酶切消化所需的基因序列以产生随后可容易地与另一基因序列连接的DNA末端而装配。通常，5′或3′悬突可经被靶向用于连接的两条序列上的限制性酶切消化而产生。在消化之后，可纯化靶序列和然后使用酶(连接酶)连接在一起。图3描述的质粒可通过装配含有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的复制起点和氯霉素抗性的cat基因的基础质粒而构建。xylR调节子片段可通过限制性酶切消化基础质粒和连接xylR片段而连接至基础质粒。在确认xylR调节子片段与基础片段合适连接之后，对于bgaB基因片段和该基因的终止子T1和T2可以重复该过程。当基因元件完全装配和确认装配和方向合适之后，可将质粒插入可用作试验生物体的宿主生物体中。
可被称为病毒体的完整的病毒颗粒可为基因运载体，其包含由可被称为衣壳的保护性蛋白外壳包围的核酸。衣壳可包含由病毒基因组编码的蛋白，其形状可作为形态学差异的基础。可被称为启动子的病毒编码的蛋白单元可自装配形成衣壳，不需要来自病毒基因组的输入，然而，少数病毒可编码有助于构建其衣壳的蛋白。与核酸结合的蛋白可较技术地称为核蛋白，病毒衣壳蛋白与病毒核酸结合可称为核壳体。病毒可被认为不是活的生物体，在宿主细胞之外可缺少自复制途径。本发明中用于细菌的病毒可被称为噬菌体或嗜菌体。病毒的实例可包括λ或M13噬菌体。报道基因和阻抑基因可通过首先使用内切酶切割非重组噬菌体DNA和然后将DNA片段与两个新形成的末端连接而插入病毒。
运载体(即，质粒，病毒)可通过下述方式由试验生物体携带：转化或接合，例如使用质粒；或转导或转染，例如使用病毒。
可由报道基因产生的指示酶可包括：β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、肉豆蔻酸脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或它们中的两种或更多种的混合物。可以使用这些的耐热对应物。
所述基因工程生物指示剂可在使用任何合适的操作程序的灭菌工艺过程中暴露于灭菌介质。这些可包括使用灭菌指示器，例如但不限于图5-图7种描述的那些。参照图5和图6，灭菌指示器10可包含：载体12，所述载体12具有第一表面14和第二表面16；支持物20，所述支持物20具有第一部分22和第二部分24，所述载体12覆盖在所述支持物20的第一部分22的上面，所述载体12的第二表面16附着于所述支持物20的第一部分22；以及基因工程生物指示剂30，其由所述载体12支持。所述生物指示剂30可由所述载体12的第一表面14支持或附着于所述载体12的第一表面14。所述支持物20的第二部分24可具有足够的维度，以允许在不接触所述生物指示剂30的情况下操作所述灭菌指示器10。也就是说，所述第二部分24可具有足够的维度以用作手柄(handle)，由此允许便利的无菌操作所述灭菌指示器10。
所述载体12可为较平的基片形式，在附图中被描述为圆形的形式。然而，应理解，所述载体12可具有任何需要的形状或形式，例如，方形、矩形、卵圆形等。所述载体12可具有菱形截面。所述载体12可具有较小的厚度，例如，约0.001至约3mm，在一个实施方案中约0.01至约2mm，在一个实施方案中约0.05至约1.5mm，以及在一个实施方案中约0.1至约1mm。为所述生物指示剂30提供支持的所述载体20的第一表面14的面积较小，例如，所述面积的范围可为约1至约80mm2，在一个实施方案中约2至约70mm2，在一个实施方案中，约3至约60mm2，以及在一个实施方案中，约5至约50mm2。这种小面积的优点是所述生物指示剂30的尺寸可较小，因此，培养所述生物指示剂所需要的恢复培养基的量较小，培养的时间需求较短。
所述载体12可包含多孔材料或非多孔材料。所述载体可包括固体载体。所述载体可包含在灭菌或培养过程中不溶解或不变质的任何材料。所述载体12可包括纸、金属、玻璃、陶瓷、塑料、膜，或它们中的两种或更多种的组合。所述金属可包括铝或钢。所述塑料可包括聚烯烃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚酯等。所述载体12可包括薄膜。所述载体可为纺毡或无纺毡的形式。所述载体可包括压缩纤维垫。所述载体可包括由烧结玻璃、玻璃纤维、陶瓷、合成聚合物或它们中的两种或更多种的组合制成的多孔材料。所述载体可包括滤纸或吸收性纸。所述载体可包括纤维素垫。
所述支持物20可包括在灭菌或培养过程中不溶解或不分解的任何材料。所述支持物可包括金属、玻璃、陶瓷、塑料或它们的组合。所述支持物可包括铝或不锈钢。所述支持物可包含聚苯乙烯、聚烯烃(例如，聚丙烯、聚乙烯)等。所述支持物20可为挠性的或刚性的。所述支持物20可为可折叠的。附图中描述的支持物20是矩形形状，然而，应理解所述支持物可为任何需要的形状或形式，例如，方形、圆形、卵圆形等。所述支持物20的长度范围可为约0.2至约12cm，在一个实施方案中约0.2至约10cm，在一个实施方案中约0.5至约7cm，在一个实施方案中约1至约5cm，在一个实施方案中约1.5至约3.5cm。所述支持物20的宽度范围可为约0.2至约2cm，在一个实施方案中约0.2至约1.5cm，以及在一个实施方案中约0.25至约1cm。所述支持物20的厚度范围可为约0.02至约3mm，以及在一个实施方案中约0.1至约2mm。所述第二部分24的长度范围可为约0.2至约12cm，在一个实施方案中约0.3至约11cm，在一个实施方案中约0.5至约10cm，在一个实施方案中约1至约7cm，以及在一个实施方案中约1.5至约4.5cm。
所述支持物20可为矩形片或条的形式，所述支持物20的第一部分22包含所述支持物20的长度的较小部分，所述支持物20的第二部分24包含所述支持物20的长度的较大部分。所述第二部分24的长度与所述第一部分22的长度的比例范围可为约2:1至约12:1，在一个实施方案中为约4:1至约8:1，以及在一个实施方案中约5.5:1至约6.5:1。
所述载体12可使用声波焊接、热封、粘合剂或层压(lamination)与所述支持物20连接。所述载体12可在将所述生物指示剂30应用于所述载体12之前或之后与所述支持物20连接。所述载体12可在将所述生物指示剂30应用于所述支持物20之后使用声波焊接或粘合剂与所述支持物20连接。声波焊接可包括所述支持物与所述载体的摩擦结合。所述粘合剂可为与所述载体12和所述支持物20相容的任何粘合剂，且在灭菌或培养过程中不溶解或不变质。所述粘合剂应对感兴趣的生物体具有致死性或抑制性。所述粘合剂可为压力敏感性粘合剂。
用于支持所公开的生物指示剂的灭菌指示器10可在下述的任何工艺中使用：在所述工艺中，所述灭菌指示器在灭菌工艺过程中暴露于灭菌介质，然后暴露于诱导剂和酶底物，以确定所述灭菌工艺是否有效。所述灭菌工艺可应用气体或液体灭菌剂、干热、辐射等。在所述灭菌工艺过程中，所述灭菌指示器10连同待灭菌的物品一起暴露于灭菌介质。当灭菌工艺完成时，可将所述灭菌指示器10置于含有包含至少一种诱导剂和至少一种酶底物的恢复培养基的小瓶中。然后，可将所述基因工程生物指示剂培养所需的时间段，并检测，以确定所述灭菌工艺是否有效。
所述基因工程生物指示剂可用于包含具有两个分开的隔腔的容器的自含式灭菌指示器中。所述隔腔之一可含有所述生物指示剂。另一个隔腔可含有包含至少一种诱导剂和至少一种酶底物的恢复培养基。在使用中，所述灭菌指示器和待灭菌的物品可暴露于灭菌介质。在灭菌之后，可激活灭菌指示器，使得所述生物指示剂与恢复培养基充分接触，以确定所述灭菌工艺是否有效。这些灭菌指示器可用于其中所述生物指示剂可暴露于灭菌介质的任何灭菌工艺中，例如，应用气体灭菌剂的灭菌工艺。
所述自含式灭菌指示器可为例如但不限于图7中描述的形式。参照图7，所述灭菌指示器40可包括锥形管42、内隔腔44以及闭合帽46。所述闭合帽46包括凸出部分48。在锥形管42的内表面和内隔腔44的外表面之间形成环形空间43，所述环形空间43形成另一个内隔腔。所述载体50位于所述环形空间43中。所述基因工程生物指示剂可由所述载体50支持。所述载体50可包括图4和5中描述的灭菌指示器10。所述恢复培养基可包含在内隔腔44中。所述锥形管42和闭合帽46可由与用于所述灭菌工艺的条件和化学物质相容的任何材料制成。这些材料可包括聚碳酸酯、聚烯烃、聚酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基戊烯、聚酯等。内隔腔44可为玻璃或脆性玻璃安瓿的形式。对于锥形管42、内隔腔44和闭合帽46构造的进一步的细节可见于美国专利第4,304,869号，其通过引用并入本申请。所述载体50可包含多孔材料或非多孔材料。所述载体50可包含所述载体可包含在灭菌或培养过程中不溶解或不变质的任何材料。所述载体50可包括纸、金属、玻璃、陶瓷、塑料、膜，或它们中的两种或更多种的组合。所述金属可包括铝或钢。所述塑料可包括聚烯烃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚酯等。所述载体50可包括薄膜。所述载体50可为纺毡或无纺毡的形式。所述载体50可包括压缩纤维垫。所述载体50可包括由烧结玻璃、玻璃纤维、陶瓷、合成聚合物或它们中的两种或更多种的组合制成的多孔材料。所述载体50可包括滤纸或吸收性纸。所述载体50可包括纤维素垫。在灭菌过程中，所述灭菌指示器40连同待灭菌的物品一起暴露于灭菌介质。当灭菌完成时，将所述闭合帽46向下压入所述锥形管42中。所述凸出部分48压在所述内隔腔44上，并引起其破裂。这使得恢复培养基与所述载体50和可在灭菌后存活的、由所述载体50支持的任何所述生物指示剂接触。在预定的时间之后，可去除所述载体50，灭菌的程度可通过检测所述生物指示剂的变化而测定。
所述载体12或所述载体50可具有用于支持所述基因工程生物指示剂的表面积，其范围为约1至约80mm2，在一个实施方案中其范围为约5至约50mm2。在灭菌之前，由所述载体12或所述载体50支持的所述生物指示剂的菌落形成单位(cfu)的数量范围为约104至约107cfu/mm2，在一个实施方案中，范围为约105至约106cfu/mm2。
所述诱导剂可包括木糖、异乳糖、异丙基硫代半乳糖苷、金属硫蛋白(metalothionine)中的一种或多种，或它们中的两种或更多种的混合物。在恢复培养基中，所述诱导剂可与酶底物组合。
所述酶底物可包括当被指示酶作用时被转化为酶修饰产物的一种物质或多种物质的混合物。通常，所述酶修饰产物可包括发光物质、荧光物质或有色物质。可选地，所述酶底物可包括当被酶作用时可产生与另外的化合物或组合物反应而形成发光物质、荧光物质或有色物质的一种或多种化合物。
有两种基本类型的可用于检测特异性指示酶的酶底物。第一种类型的酶底物可为生荧光的或生色的，可被给出诸如AB的化学式。当AB被指示酶作用时，可分解为A+B。B可为例如荧光的或有色的。在一个实施方案中，两种B化合物一起反应产生荧光信号或有色信号。这种类型的生荧光底物的具体实例可为4-甲基伞形酮酰磷酸酯。在指示酶磷酸酯酶的存在下，底物可分解为4-甲基伞形酮和磷酸。这种类型中的其他生荧光底物可包括4-甲基伞形酮酰，7-酰氨基-4-甲基香豆素、吲哚酚以及荧光素的衍生物。这种类型中的生色底物的实例可为5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯。在磷酸酯酶的存在下，底物可分解为靛蓝和磷酸。这种类型中的其他生色底物可包括5-溴-4-氯-3-吲哚基、硝基酚以及酚酞的衍生物。
第二种类型的酶底物可通过化学式CD给出，例如，CD可被特异性酶转化为C+D。然而，无论是C还是D都不是荧光的或有色的，但D能够进一步与化合物Z反应而产生荧光化合物或有色化合物，由此指示酶活性。这种类型中的特异性生荧光实例可为氨基酸中的赖氨酸。在酪氨酸脱羧酶的存在下，酪氨酸可失去CO2分子。酪氨酸的其余部分则可被称为尸胺，尸胺是强碱性的。碱性指示剂诸如4-甲基伞形酮可被掺入，并在强碱的存在下可发出荧光。这种类型中的生色底物可为2-萘基磷酸酯。指示酶磷酸酯酶可与酶底物反应产生β-萘酚。游离的β-萘酚可与含有1-重氮基-4-苯甲酰基氨基-2，5-二乙氧苯反应产生紫色。
所述酶底物可包括生荧光化合物，在本发明中定义为能够被酶修饰例如被水解的化合物，以产生具有可观地修饰的或增加的荧光的衍生荧光体。
所述生荧光化合物本身可为非荧光的或中等荧光的(即，以与相应酶修饰产物明显不同的方式的荧光，例如在颜色或强度上)，和具有合适的激发波长和检测波长，可用于区分酶修饰产生的荧光信号与可存在的任何其他荧光。
许多不同来源的指示酶的酶底物可使用。这些可包括生荧光的4-甲基伞形酮酰衍生物(可水解成4-甲基伞形酮)，7-酰氨基-4-甲基-香豆素的衍生物，二乙酰基荧光素衍生物，以及荧光胺。
可用作酶底物的4-甲基伞形酮酰的衍生物可包括：4-甲基伞形酮酰-2-乙酰氨基-4，6-O-苯亚甲基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰乙酸酯；4-甲基伞形酮酰-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-N-乙酰基-α-D-氨基半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷；2′-(4-甲基伞形酮酰)-α-D-N-乙酰基神经氨酸；4-甲基伞形酮酰-α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮酰α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮酰丁酸酯；4-甲基伞形酮酰-β-D-纤维二糖糖苷；甲基伞形酮酰-β-D-N，N′-二乙酰壳二糖苷；4-甲基伞形酮酰反油酸酯；4-甲基伞形酮酰-β-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮酰-α-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮酰-α-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷；4-三氟甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷；6，8-二氟-4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰-7，6-硫代-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸；6，8-二氟-4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸；4-甲基伞形酮酰p-胍基苯甲酸酯；4-甲基伞形酮酰庚酸酯；4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基伞形酮酰油酸酯；4-三氟甲基伞形酮酰油酸酯；4-甲基伞形酮酰棕榈酸酯；4-甲基伞形酮酰磷酸酯；4-甲基伞形酮酰丙酸酯；4-甲基伞形酮酰硬脂酸酯；4-甲基伞形酮酰硫酸酯；4-甲基伞形酮酰-β-D-N，N′，N＂-三乙酰基壳三糖；4′-甲基伞形酮酰2，3，5-三-β-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-三甲基氯化铵肉桂酸酯(4-methylumbelliferyl-beta-trimethylammoniumcinnamate chloride)；4-甲基伞形酮酰4-胍基苯甲酸酯；以及4-甲基伞形酮酰-β-D-木糖苷。
可用作酶底物的7-氨基-4-甲基香豆素的衍生物可包括：L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-瓜氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-焦谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-天冬氨酸β-(7-氨基-4-甲基香豆素)；L-谷氨酸1-(7-氨基-4-甲基香豆素)；L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；以及7-戊二酰基-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素。
可用作酶底物的7-氨基-4-甲基香豆素的肽衍生物可包括：N-t-BOC-Ile-Glu-Gly-Arg 7-氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg7-氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ-Phe-Arg 7-氨基-4-甲基香豆素；N-琥珀酰基-Leu-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素；Gly-Pro 7-氨基-4-甲基香豆素；Pro-Phe-Arg 7-氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-氨基-4-甲基香豆素；以及N-戊二酰基-Gly-Arg 7-氨基-4-甲基香豆素。
可用作酶底物的二乙酰荧光素的衍生物可包括：荧光素二乙酸酯；荧光素二丁酸酯；2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯；荧光素二-(β-D-N-乙酰半乳糖胺)；荧光素二-(β-D-半乳糖苷)；荧光素单-(β-D-半乳糖苷)，以及荧光素二月桂酸酯。
在活性待检测的指示酶为α-D-葡萄糖苷酶、糜蛋白酶或脂肪酸酯酶的情况中，可使用的生荧光的酶底物可分别为4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷，7-戊二酰苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素，或4-甲基伞形酮酰庚酸酯。在活性待检测的指示酶为α-L-呋喃阿拉伯糖苷的情况中，可使用的生荧光酶底物可为4-甲基伞形酮酰-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。在活性待检测的指示酶为β-D-葡萄糖苷酶的情况中，可以使用的生荧光的酶底物可为4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷。
可使用的酶底物可为能够被酶修饰而产生衍生的生色团的生色化合物，或与其他化合物反应产生衍生的生色团的产物，所述生色团具有不同的或更强的颜色。生色化合物可以以与相应的酶修饰产物明显不同的方式，例如在颜色或强度上，为无色或有色的。对于颜色测量仪器使用者熟知的合适的激发波长和检测波长可用于区分酶修饰产生的有色信号和其他可存在的信号。
可用作酶底物的生色化合物可包括5-溴-4-氯-3-吲哚基衍生物、硝基苯基衍生物、吲哚酚衍生物，以及酚酞衍生物。
可使用的5-溴-4-氯-3-吲哚基的衍生物可包括5-溴-6-氯-3-吲哚乙酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-1，3-二乙酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃岩藻糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-fucopyranoside)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucopyranoside)；5-溴-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸；5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯；以及5-溴-4-氯-3-吲哚硫酸酯。
可使用的硝基苯基的衍生物可包括对硝基苯酚和邻硝基苯酚衍生物。这些包括二乙基对硝基苯基磷酸酯；二-对硝基苯基磷酸酯；对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-β-吡喃半乳糖基-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基乙酸酯；对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷；对硝基苯基-β-D-N，N′-二乙酰基壳二糖苷；对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-α-麦芽苷；对硝基苯基-β-麦芽苷；对硝基苯基-α-吡喃甘露糖苷；对硝基苯基-β-吡喃甘露糖苷；对硝基苯基肉豆蔻酸酯；对硝基苯基棕榈酸酯；对硝基苯基磷酸酯；双(对硝基苯基)磷酸酯；三(对硝基苯基)磷酸酯；对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-β-葡糖苷酸；α-对硝基苯基甘油；对硝基苯基-α-鼠李吡喃糖甙；对硝基苯基硬脂酸酯；对硝基苯基硫酸酯；对硝基苯基-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷；对硝基苯基胸腺嘧啶脱氧核苷单磷酸酯；对硝基苯基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-葡糖醛酸甲酯；以及对硝基苯基戊酸酯。
有用的邻硝基苯酚可包括邻硝基苯基乙酸酯、邻硝基苯基-β-葡萄糖苷以及邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。其他有用的硝基苯基衍生物可包括硝基苯基-β-吡喃岩藻糖苷；硝基苯基-α-吡喃半乳糖苷；硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷；硝基苯基丁酸酯；硝基苯基癸酸酯；硝基苯基己酸酯；硝基苯基辛酸酯；硝基苯基月桂酸酯；以及硝基苯基丙酸酯。
可以使用的吲哚酚衍生物可包括吲哚酚乙酸酯；吲哚酚β-D-葡萄糖苷；3-吲哚酚硫酸酯；以及3-吲哚酚磷酸酯。
可以使用的酚酞衍生物包括：酚酞二丁酸酯；酚酞二磷酸酯；酚酞二硫酸酯；酚酞葡糖醛酸；酚酞单-β-葡萄糖苷酸；酚酞单-β-葡萄糖醛酸；以及酚酞单磷酸酯。
上述的生色酶底物可直接与合适的指示酶反应产生生色团。
如果衍生酶修饰产物进一步与生色试剂反应产生生色团，可采用另外的包含1-萘基、2-萘基以及萘基-AS-BI衍生物的酶底物，所述生色试剂诸如，重氮化染料，例如1-重氮基-4-苯甲酰氨基-2，5-二乙氧基苯、1-重氮基-4-苯甲酰氨基-2，5-二乙氧基苯、对-重氮基-2，5-二乙氧基-N-苯甲酰丙氨酸、4-氯-2-氯化重氮甲苯，以及邻氨基偶氮甲苯重氮盐。
可以使用的1-萘基的衍生物可包括1-萘基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷。
可以使用的2-萘基的衍生物可包括2-萘基-磷酸酯；2-萘基-丁酸酯；2-萘基-辛酸酯；2-萘基-肉豆蔻酸酯；L-亮氨酰基-2-萘酰胺；L-缬氨酰基-2-萘酰胺；L-胱氨酰基-2-萘酰胺；N-苯甲酰基-DL-精氨酸-2-萘酰胺；N-戊二酰基-萘酰胺；2-萘胺；2-萘基-磷酸酯；6-溴-2-萘基-α-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-2-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘基-2-D-吡喃甘露糖苷；以及2-萘基-α-L-吡喃岩藻糖苷。
可以使用的萘基-AS-BI的衍生物可包括萘基-AS-B1-磷酸酯以及萘基-AS-BI-β-D-葡糖苷酸。
在活性待检测的指示酶为α-D-葡萄糖苷酶的情况中，酶底物可为对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷。在活性待检测的指示酶为α-L-呋喃阿拉伯糖酶的情况中，可使用的酶底物可为对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。在活性待检测的指示酶为β-半乳糖苷酶的情况中，酶底物可为5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷。
可使用的酶底物可取决于其活性在研究中的指示酶的身份。下文是一系列多种酶底物和与酶底物反应产生具有可观察到的修饰的或增加的荧光或颜色的相应的指示酶。
酶底物                          指示酶
4-甲基伞形酮酰乙酸酯             酯酶
4-甲基伞形酮酰丁酸酯             酯酶
4-甲基伞形酮酰反油酸酯脂         肪酶
4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷  β-D-半乳糖苷酶
4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃半乳糖苷  α-D-半乳糖苷酶
4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃葡萄糖苷  α-D-葡萄糖苷酶
4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃葡萄糖苷  β-D-葡萄糖苷酶
4-甲基伞形酮酰庚酸酯             酯酶
4-甲基伞形酮酰油酸酯             脂肪酶
4-甲基伞形酮酰磷酸酯             酸性磷酸酯酶或碱性磷酸酯酶
4-甲基伞形酮酰丙酸酯                     酯酶
4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷              β-D-半乳糖苷酶
4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷              β-D-葡萄糖苷酶
4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷              α-D-葡萄糖苷酶
4-甲基伞形酮酰-α-L-呋喃阿拉伯糖苷        α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶
L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素             亮氨酸氨肽酶
7-戊二酰基-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素  糜蛋白酶
D-蜜二糖                                 α-D-半乳糖苷酶
对硝基苯基磷酸酯                         碱性磷酸酯酶或酸性磷酸酯酶
对硝基苯基乙酸酯                         脂肪酶
邻硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷              β-D-半乳糖苷酶
对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷              α-D-半乳糖苷酶
邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷              β-D-葡萄糖苷酶
对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷              α-D-葡萄糖苷酶
对硝基苯基-β-D-葡糖苷酸                  β-D-葡糖苷酸酶
对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷            α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶
对硝基苯基月桂酸酯                       酯酶
对硝基苯基肉豆蔻酸酯                     酯酶
对硝基苯基棕榈酸酯                       酯酶
对硝基苯基磷酸酯二钠盐                   碱性磷酸酯酶
酚酞二丁酸酯                             酯酶
酚酞二磷酸酯                             酸性磷酸酯酶或碱性磷酸酯酶
酚酞二磷酸酯五钠盐                       酸性磷酸酯酶或碱性磷酸酯酶
酚酞-β-D-葡糖苷酸钠盐                    β-D-葡糖苷酸酶
酚酞-β-D-葡糖苷酸                        β-D-葡糖苷酸酶
L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐                     糜蛋白酶
苯基-β-D-吡喃半乳糖苷                    β-D-半乳糖苷酶
苯基-β-D-葡糖苷酸                        β-D-葡糖苷酸酶
苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷                    β-D-葡萄糖苷酶
苯基-β-D-葡糖苷酸                  β-D-葡糖苷酸酶
苯基-α-D-葡萄糖苷                  α-D-葡萄糖苷酶
β-甘油磷酸酯钠                     酸性磷酸酯酶或碱性磷酸酯酶
1-萘基磷酸酯钠                     酸性磷酸酯酶或碱性磷酸酯酶
2-萘基磷酸酯钠                     酸性磷酸酯酶或碱性磷酸酯酶
2-萘基-丁酸酯                      酯酶
β-萘基乙酸酯                       脂肪酶
6-溴-2-萘基-β-D-葡萄糖苷           β-D-葡萄糖苷酶
L-亮氨酸-2-萘基酰胺氨基肽酶        亮氨酸
L-缬氨酰基-2-萘基酰胺氨基肽酶      缬氨酸
N-戊二酰基-苯基丙氨酸-2-萘胺       糜蛋白酶
萘基-AS-BI-磷酸酯                  磷酸水解酶
吲哚酚乙酸酯                       脂肪酶
N-甲基吲哚酚乙酸酯                 脂肪酶
N-甲基吲哚酚肉豆蔻酸酯             脂肪酶
5-溴吲哚酚乙酸酯                   脂肪酶
3-吲哚酚磷酸酯                     酸性磷酸酯酶或碱性磷酸酯酶
吲哚酚-β-D-葡萄糖苷                β-D-葡萄糖苷酶
5-溴-4-氯-3-吲哚酚乙酸酯           脂肪酶
5-溴-4-氯-3-吲哚酚磷酸酯           碱性磷酸酯酶或酸性磷酸酯酶
5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-葡萄糖醛酸  β-D-葡糖苷酸酶
二乙酰基荧光素                     脂肪酶/酯酶
在指示酶是β-半乳糖苷酶的情况中，酶底物可包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)，5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(Mag-gal)，5-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Bluo-gal)，6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷，6-氯-3-吲哚基-β-D-呋喃半乳糖苷(Rose-gal)，3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷(Y-gal)，5-碘-3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷，N-甲基吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷，2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)，苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(P-gal)，2-氯-4-硝基苯基-β-D-乳糖苷，4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，4-三氟甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)(FDG)，荧光素单-β-D-吡喃半乳糖苷，荧光素二(β-D-乙酰基半乳糖胺)，4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃乳糖苷，2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷，8-羟基喹啉-β-D-吡喃半乳糖苷，试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷(Resorufin β-D-galactopyranoside)，3-羧基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，4-氯甲基-6，8-二氟伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，6，8-二氟-4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，6，8-二氟-4-十七烷基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，5-(五氟苯甲酰基氨基)-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C2-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C8-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C12-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，5-氯甲基荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C12-试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷，7-羟基-9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)(DDAO)，或它们中的两种或更多种的混合物。
在灭菌工艺完成之后，可使得具有经历灭菌工艺而存活的任何基因工程生物指示剂的载体12或载体50与含有营养生长培养基、诱导剂以及酶底物的恢复培养基接触或放置于所述恢复培养基之中。恢复培养基可包含根据需要提供生物体的发生、代谢以及接下来的生长的水性介质或水溶液。水性介质或水溶液可被缓冲。诱导剂可导致生物指示剂中的阻抑基因从运载体(即质粒、病毒)离解。这使得允许发生转录/翻译，由此产生指示酶。指示酶可接触酶底物，导致可生成可具有可检测的颜色或荧光的酶修饰产物。
水溶液或水性介质中酶底物的浓度可取决于酶底物和指示酶的身份、必须被生成为视觉上或通过仪器可检测到的酶修饰产物的量，以及测定指示酶是否存在所需的时间量。足够的酶底物的量可为与任何指示酶反应所需要的量，所述指示酶可在灭菌完成之后存在，使得至少约10-15摩尔的摩尔浓度的酶修饰产物可以在最多约4小时的时间段内产生，在一个实施方案中，至少约10-8摩尔的摩尔浓度的酶修饰产物可以在最多约2小时的时间段内产生。
水溶液或水性介质中诱导剂的浓度范围可为约1至约20％w/v，在一个实施方案中，范围为约1至约5％ w/v，在一个实施方案中，约2％ w/v。
含有营养生长培养基、诱导剂以及酶底物的水溶液或水性介质的pH范围可为约5至约9.5，在一个实施方案中约7.5。
在生物指示剂经历灭菌循环之后，可将恢复培养基中的诱导剂和酶底物与生物指示剂一起培养。若假定任何生物指示剂仍具有功能，可在足以释放可检测量的酶修饰产物的条件下继续培养一段时间。通常，可检测到的酶修饰产物的量可低至约1×10-15摩尔。培养条件可足以产生至少约1×10-8摩尔的酶修饰产物，在一个实施方案中约1×10-6摩尔至约1×10-5摩尔的酶修饰产物。产生可检测量的酶修饰产物所需要的培养时间和温度可取决于指示酶和酶底物的身份，以及存在于恢复培养基中的各自的浓度。通常，培养温度的范围可为约20℃至约70℃。培养时间可在最多约4小时的范围内，在一个实施方案中范围为约0.01至约4小时，在一个实施方案中范围为约0.1至约3小时，在一个实施方案中范围为约0.1至约2小时，在一个实施方案中范围为约0.1至约1小时。
可使用的通常适用的用于检测酶修饰产物的方法可包括光度测定、电势测定、比重测定、测热、电导测定或电流测定技术。可使用荧光测定或分光光度测定法。例如，酶底物可包括当与指示酶相互作用时可产生可通过荧光测定法检测的伞形酮的4-甲基伞形酮酰衍生物，或所述底物可包含硝基苯酚，或当与指示酶相互作用时可产生可通过色度测定法检测的酶修饰产物的相似类型的衍生物。
尽管生物指示剂在本发明中基本以单指示酶的方式描述，但可提供许多种指示酶。例如，生物指示剂可提供三种类型的指示酶，一种酶对热有抵抗力，第二种对气体灭菌介质具有抵抗力，第三种对辐射，例如γ或β辐射具有抵抗力。
本发明公开的技术可提供优于现有技术的许多优点。这些优点可包括仅基于信号产生策略提供酶(例如，β半乳糖苷酶)来源、选择不总是需要使用电机读数仪的酶的酶底物(例如，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D吡喃半乳糖苷或X-gal)，以及将无菌保证(细胞死亡)与试验生物体的总体遗传活力结合。通过将指示酶的作用限制于信号产生，消除了将指示酶的敏感性与试验生物体的敏感性匹配或关联起来的需要。
使用本发明公开的基因工程生物指示剂的优点可包括提供在以下范围的较短时间段内灭菌是否有效的结果：最多约4小时，在一个实施方案中为约0.01至约4小时，在一个实施方案中为约0.1至约3小时，在一个实施方案中为约0.1至约2小时，以及在一个实施方案中为约0.2至约1小时。由于使用本发明公开的基因工程生物指示剂，直接检测试验生物体的活力是可能的，而非通过间接测量代用分子。本发明公开的生物指示剂的用途不限于任何特定的灭菌方法。也就是说，本发明公开的生物指示剂可用于任何灭菌工艺。灭菌工艺的效力可使用本发明公开的基因工程生物指示剂测定，而不需要生长来提供对灭菌效力的最终确认。通过使用本发明公开的生物指示剂，不需要应用电化学传感器来测定灭菌是否有效，尽管使用传感器可能具有更快速的结果。本发明公开的生物指示剂可被修改为使用瞬间阅读应用软件例如芯片或传感器应用软件来使用。本发明公开的基因工程生物指示剂可适用于应用具有最大抵抗力的生物体、临床上重要的生物体或生物武器生物体的任何工艺。
本发明公开的基因工程生物指示剂用于检测灭菌工艺的效力的用途可包括使用基于遗传理论模型(仅活细胞可表达基因)的测量方法。本发明公开的基因工程生物指示剂可对任何致死事件或致死事件的组合(转录、翻译等)作出响应。本发明公开的生物指示剂可提供对于任何杀生物的作用模式(蒸汽、过氧乙酸、环氧乙烷、甲醛溶液、甲醛气体、稳定了的液体过氧化氢、过氧化氢气体、干热、臭氧、邻苯二甲醛、戊二醛、氯胺、季胺、酚类化合物、碘载体、电离辐射、紫外辐射、脉冲白光、等离子体、微波辐射等)的快速反应。本发明公开的基因工程生物指示剂的使用可提供在所评价的灭菌工艺之前或过程中无指示酶或报告分子(例如，β-半乳糖苷酶)的优点。
实施例1
图4中描述的质粒通过限制性酶切消化基础质粒和将xylR调节子片段与基础质粒连接而构建。在确认将xylR调节子与基础片段正确连接之后，对于该基因的bgaB基因片段和终止子T1和T2重复该过程。当基因元件装配完全且确认装配和方向合适之后，将质粒插入宿主生物体中，所述质粒可被称作1号质粒。
实施例2
可使用几种方法运用在宿主生物体内的转化技术将质粒进行内化。这些方法可包括原生质体、电穿孔、弹道方法、感受态诱导、转导或化学方法(氯化钙)。对于该实施例，经化学转化方法转化感受态大肠杆菌。将缺乏任何限制系统的大肠杆菌储存于-70℃。于冰上融化大肠杆菌并进行混合。于冰上将大肠杆菌暴露于1号质粒30分钟。将所产生的大肠杆菌/质粒混合物于42℃下热休克30秒，并转移至冰浴2分钟。然后将温热的培养基添加至大肠杆菌/质粒混合物中，并于37℃下培养60分钟。将样品置于含有抗生素和X-gal的琼脂培养板上。表现为蓝色的克隆被成功转化。
实施例3
在含有0.5M山梨糖醇的LB肉汤培养基中过夜培养枯草杆菌，在具有0.5M山梨糖醇和0.5M甘露醇的10重量％的甘油中洗涤三次，并使之在1号质粒的存在下经受电穿孔。经一定范围的电压(1800-2500V)实施电穿孔。在培养基(具有0.5M山梨糖醇和0.5M甘露醇的LB肉汤培养基)中恢复产生的生物体，并在37℃恢复三小时。在恢复之后，将生物体置于含有用于选择转化的生物体的抗生素的LB琼脂培养板上，并在37℃培养。将表现生长的克隆置于含有诱导剂(2重量％木糖)、选择性标记(5mg/mL的氯霉素)以及X-gal(80mg/mL)的LB琼脂培养板上。这些琼脂培养板上表现为蓝色的克隆被成功转化。
使用下述方法使转化的枯草杆菌形成芽孢。将一等份的营养型枯草杆菌铺于琼脂培养板。将琼脂培养板在37℃培养5天。在培养之后，从琼脂表面无菌地恢复生物体，并使用相差显微镜检查评价芽孢形成。在使用前洗涤内生孢子几次。
实施例4
将转化的枯草杆菌直接接种到由不同材料制造的几种SCBI小瓶(Lexan，Huntsman P4G4Z-011，Huntsman P4C6Z-D59，Exxon PD9465E1以及200μL微孔(Microcell))的底部，并空气干燥过夜。将一10μL等份的108cfu/mL的转化枯草杆菌的芽孢悬浮液用于接种。在接种的芽孢悬浮液干燥之后，且恰好接种之前，将1mL含有2％木糖的LB肉汤培养基添加至Lexan、Huntsman以及Exxon材料。向微孔中添加100μL含有2重量％木糖的LB肉汤培养基。
LB肉汤培养基具有下列配方：
去离子水         800mL
NaCl             10g/l
胰蛋白胨         10g/l
酵母提取物       5g/l
木糖             20g/l
提供最终体积为1L的去离子水
5N NaOH调整pH至7.0
在添加生长培养基之后，立即将100μL于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中的200μg/mL的4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷(MUG)添加至样品(10μL用于添加微孔)。将各样品置于在37℃培养箱中预热好的TurnerModulus中。在UV荧光模式下操作Turner Modulus。每分钟评价由来自生长生物体产生的β-半乳糖苷酶对底物的酶转化而产生的荧光一次，持续3小时。荧光增加表明产生β-半乳糖苷酶。结果如下：
Figure A200780042764D00371
Figure A200780042764D00381
对荧光数据进行标准化。
实施例5
使用UV-vis分光光度计评价在具有不同浓度木糖的LB生长培养基中生长的转化的枯草杆菌所产生的β-半乳糖苷酶的量。评价下列组合：
·仅LB肉汤培养基
·含有1重量％木糖的LB肉汤培养基
·含有2重量％木糖的LB肉汤培养基
·含有3重量％木糖的LB肉汤培养基
使用下列操作方法。将9mL各培养基-木糖组合转移至无菌烧杯中。将1mL等份的108cfu/mL转化的枯草杆菌芽孢转移至各烧杯中，得到最初的107cfu/mL起始浓度的枯草杆菌芽孢。在37℃培养各样品6.5小时以使得产生足够的β-半乳糖苷酶。在培养之后，通过0.45μm HV Durapore过滤器过滤各样品。使1mL等份的各样品与1mL等份的1.0mg/mLONPG(于磷酸盐缓冲液中)溶液在室温下于UV-vis杯中反应30分钟。测量各样品在420nm的吸光度值。吸光度结果如下：
培养基                      在420nm的吸光度值
仅LB肉汤培养基               0.002
含有1重量％木糖的LB培养基    0.075
含有2重量％木糖的LB培养基    0.113
含有3重量％木糖的LB培养基    0.067
较高的吸光度值与较高的β-半乳糖苷酶产量相关。
实施例6
将转化的枯草杆菌芽孢悬浮液样品接种至200μL微孔中，得到下列芽孢种群：106cfu/微孔、104cfu/微孔、102cfu/微孔、100cfu/微孔。向各接种的微孔中，添加100μL含有2重量％木糖的LB肉汤培养基和10μL于DMF中的100μg/mL MUG。在37℃将各样品置于Turner Modulus中，每分钟测量一次荧光值，持续2小时。荧光的增加表明产生β-半乳糖苷酶。结果如下：
对荧光数据进行标准化。
实施例7
将一10μL等份的108cfu/mL转化的枯草杆菌芽孢转移至四个200μL的微孔的每一个中。将所产生的接种的微孔进行空气干燥。向各样品中添加100μL含有2重量％木糖的LB肉汤培养基。然后，添加10μL合适浓度的MUG。评价下列MUG浓度：
1.0mg/mL
500μg/mL
200μg/mL
100μg/mL。
所有MUG溶液含有溶于DMF中的MUG。在将MUG溶液添加至微孔中之后，将微孔置于Turner Modulus中，并在培养箱中预热至37℃。每分钟测量一次荧光，持续120分钟。荧光增加表明产生β-半乳糖苷酶。结果如下：培养时间(分钟)
对荧光数据进行标准化。
尽管已结合具体实施方案解释了本发明公开的技术，但应理解，当阅读说明书时，其不同修改方式对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，应理解本文公开的发明意欲覆盖落在所附权利要求范围之内的此类修改方式。

Claims (59)

1.一种基因工程生物指示剂，其包含：
至少一种试验生物体和至少一种适于产生指示酶的报道基因，所述报道基因由所述试验生物体携带；以及
至少一种阻抑基因，所述阻抑基因抑制所述报道基因的表达，直至所述报道基因暴露于至少一种诱导剂。
2.根据权利要求1所述的生物指示剂，其中，所述报道基因和所述阻抑基因通过使用至少一种质粒和/或至少一种病毒由所述试验生物体携带。
3.根据权利要求1或2所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括一种或多种细菌、病原体、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、营养型生物体、病毒、非自主复制因子、细胞的亚细胞组分或产物，和/或朊病毒。
4.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括细菌芽孢。
5.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括杆菌、地芽孢杆菌或梭状芽胞杆菌属。
6.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩杆菌、枯草杆菌、球形杆菌、炭疽杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、产芽孢梭状芽孢杆菌、艰难梭状芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌球形变异体、蜡样芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、大肠杆菌，或它们中的两种或更多种的混合物。
7.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括真菌、分枝杆菌、原生动物、营养型细菌，或它们中的两种或更多种的混合物。
8.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括龟分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、土分枝杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、兰伯贾第虫、小球隐孢子虫、嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏杆菌、嗜肺性军团病杆菌、甲基营养杆菌、绿脓假单胞菌、猪霍乱沙门氏菌、幽门螺旋杆菌、耐辐射微球菌、耐辐射奇球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌，或它们中的两种或更多种的混合物。
9.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括营养型细菌，营养型细胞和/或它们的组成部分。
10.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎肠球菌、化脓性链球菌、大肠杆菌、(肺炎)克雷伯氏杆菌、嗜肺性军团病杆菌、甲基营养杆菌、绿脓假单胞菌、猪霍乱沙门氏菌、幽门螺旋杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌，或它们中的两种或更多种的混合物。
11.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括抗万古霉素肠球菌、抗甲氧西林金黄色葡萄球菌、龟分枝杆菌，或它们中的两种或更多种的混合物。
12.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述试验生物体包括一种或多种朊病毒。
13.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述报道基因包括lacZ、bgaB、xylE、cat、gfp，它们中的两种或更多种的混合物。
14.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述指示酶由所述报道基因产生，所述指示酶包括β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、肉豆蔻酸脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或它们中的两种或更多种的混合物。
15.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述报道基因包括1acZ，所述指示酶包括β-D-半乳糖苷酶。
16.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述阻抑基因包括xylR、lacI、tetR或它们中的两种或更多种的混合物。
17.根据权利要求2-16任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含报道基因和阻抑基因。
18.根据权利要求2-17任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含lacZ基因和xylR基因。
19.根据权利要求2-18任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含环形双链DNA。
20.根据权利要求2-18任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒为线性的。
21.根据权利要求2-20任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒的大小范围为约2000至约20000碱基对。
22.根据权利要求2-21任一项所述的生物指示剂，其中，1至约3000拷贝的相同的所述质粒由所述试验生物体的一单个细胞携带。
23.根据权利要求2-22任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含用作复制起点的一个或多个DNA序列。
24.根据权利要求2-23任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含一种或多种基因标记。
25.根据权利要求2-24任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含一种或多种多克隆位点。
26.根据权利要求2-25任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含提供用来诱导试验生物体保留质粒的选择性标记的一种或多种基因。
27.根据权利要求2-26任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含至少一种复制起点、至少一种选择性标记基因、至少一种可诱导启动子，以及至少一种报道基因。
28.根据权利要求2-27任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含两种复制起点。
29.根据权利要求2-28任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含革兰氏阴性复制起点和革兰氏阳性复制起点。
30.根据权利要求29所述的生物指示剂，其中，所述革兰氏阴性复制起点包括大肠杆菌位点，所述革兰氏阳性复制起点包括枯草杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌或萎缩杆菌位点，或它们中的两种或更多种的混合物。
31.根据权利要求2-30任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含抗生素抗性基因和/或具有外源性营养能力的基因。
32.根据权利要求2-31任一项所述的生物指示剂，其中，所述质粒包含氯霉素、氨苄青霉素或壮观霉素抗生素基因，和/或木糖、乳糖或氨基酸营养基因。
33.根据权利要求2-32任一项所述的生物指示剂，其中，所述病毒包括至少一种包含由衣壳包围的核酸的基因运载体。
34.根据权利要求2-33任一项所述的生物指示剂，其中，所述病毒包括至少一种噬菌体。
35.根据权利要求2-34任一项所述的生物指示剂，其中，所述病毒包括λ或M13噬菌体。
36.根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂，其中，所述诱导剂包括木糖、异乳糖、异丙基硫代半乳糖苷、金属硫蛋白，或它们中的两种或更多种的混合物。
37.一种灭菌工艺，其包括：
将待灭菌的物品和根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂暴露于灭菌介质。
38.根据权利要求37所述的工艺，其中，所述灭菌介质包括蒸汽、干热、辐射、等离子体、一种或多种气体灭菌剂和/或一种或多种液体灭菌剂。
39.根据权利要求37或38所述的工艺，其中，所述灭菌介质包括电子束辐射、电磁辐射、γ辐射、β辐射、环氧乙烷、气体过氧化氢、液体过氧化氢、福尔马林、戊二醛和/或过氧乙酸。
40.一种用于检测灭菌效力的方法，其包括：
将至少一种待灭菌的物品和包含根据前述权利要求任一项所述的生物指示剂的灭菌指示器暴露于灭菌介质；以及
使所述灭菌指示器与至少一种诱导剂和至少一种酶底物接触以检测灭菌的效力。
41.根据权利要求40所述的工艺，其中所述诱导剂包括木糖、异乳糖、异丙基硫代半乳糖苷、金属硫蛋白，或它们中的两种或更多种的混合物。
42.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：一种或多种生荧光的4-甲基伞形酮酰衍生物；一种或多种7-酰氨基-4-甲基香豆素衍生物；一种或多种二乙酰基荧光素衍生物；荧光胺；或它们中的两种或更多种的混合物。
43.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：4-甲基伞形酮酰-2-乙酰氨基-4，6-O-苯亚甲基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰乙酸酯；4-甲基伞形酮酰-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-N-乙酰基-α-D-氨基半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷；2′-(4-甲基伞形酮酰)-α-D-N-乙酰基神经氨酸；4-甲基伞形酮酰-α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮酰α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮酰丁酸酯；4-甲基伞形酮酰-β-D-纤维二糖糖苷；甲基伞形酮酰-β-D-N；N′-二乙酰壳二糖苷；4-甲基伞形酮酰反油酸酯；4-甲基伞形酮酰-β-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮酰-α-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮酰-α-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷；4-三氟甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷；6，8-二氟-4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰-7，6-硫代-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸；6，8-二氟-4-甲基伞形酮酰-β-D-葡糖苷酸；4-甲基伞形酮酰p-胍基苯甲酸酯；4-甲基伞形酮酰庚酸酯；4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基伞形酮酰油酸酯；4-三氟甲基伞形酮酰油酸酯；4-甲基伞形酮酰棕榈酸酯；4-甲基伞形酮酰磷酸酯；4-甲基伞形酮酰丙酸酯；4-甲基伞形酮酰硬脂酸酯；4-甲基伞形酮酰硫酸酯；4-甲基伞形酮酰-β-D-N，N′，N＂-三乙酰基壳三糖；4′-甲基伞形酮酰2，3，5-三-β-苯甲酰基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮酰-β-三甲基氯化铵肉桂酸酯；4-甲基伞形酮酰4-胍基苯甲酸酯；以及4-甲基伞形酮酰-β-D-木糖苷；或它们中的两种或更多种的混合物。
44.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-酪氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；7-戊二酰基-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素；或它们中的两种或更多种的混合物。
45.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：N-t-BOC-Ile-Glu-Gly-Arg7-氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg7-氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ-Phe-Arg7-氨基-4-甲基香豆素；N-琥珀酰基-Leu-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素；Gly-Pro7-氨基-4-甲基香豆素；Pro-Phe-Arg7-氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Val-Pro-Arg7-氨基-4-甲基香豆素；N-戊二酰基-Gly-Arg7-氨基-4-甲基香豆素；或它们中的两种或更多种的混合物。
46.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括荧光素二乙酸酯；荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)；荧光素二月桂酸酯；或它们中的两种或更多种的混合物。
47.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括α-D-葡萄糖苷酶、糜蛋白酶或脂肪酸酯酶；所述酶底物包括4-甲基伞形酮酰-α-D-葡萄糖苷，7-戊二酰苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素，或4-甲基伞形酮酰庚酸酯。
48.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶包括α-L-呋喃阿拉伯糖苷；所述酶底物包括4-甲基伞形酮酰-α-L-呋喃阿拉伯糖苷。
49.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶包括β-D-葡萄糖苷酶；所述酶底物包括4-甲基伞形酮酰-β-D-葡萄糖苷。
50.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括一种或多种5-溴-4-氯-3-吲哚基衍生物；一种或多种硝基苯基衍生物；一种或多种吲哚酚衍生物；一种或多种酚酞衍生物；或它们中的两种或更多种的混合物。
51.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：5-溴-6-氯-3-吲哚乙酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚乙酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-1，3-二乙酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃岩藻糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷；5-溴-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸；5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯；5-溴-4-氯-3-吲哚硫酸酯；或它们中的两种或更多种的混合物。
52.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：一种或多种对硝基苯酚衍生物；一种或多种邻硝基苯酚衍生物；或其两种或更多种的混合物。
53.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：二乙基对硝基苯基磷酸酯；二-对硝基苯基磷酸酯；对硝基苯基-乙酰氨基-脱氧-3-O-β-吡喃半乳糖基-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基乙酸酯；对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷；对硝基苯基-β-D-N，N′-二乙酰基壳二糖苷；对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-α-麦芽苷；对硝基苯基-β-麦芽苷；对硝基苯基-α-吡喃甘露糖苷；对硝基苯基-β-吡喃甘露糖苷；对硝基苯基肉豆蔻酸酯；对硝基苯基棕榈酸酯；对硝基苯基磷酸酯；双(对硝基苯基)磷酸酯；三(对硝基苯基)磷酸酯；对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-β-葡糖苷酸；α-对硝基苯基甘油；对硝基苯基-α-鼠李吡喃糖甙；对硝基苯基硬脂酸酯；对硝基苯基硫酸酯；对硝基苯基-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷；对硝基苯基胸腺嘧啶脱氧核苷单磷酸酯；对硝基苯基-2，3，4-三-O-乙酰基-β-葡糖醛酸甲酯；对硝基苯基戊酸酯；或它们中的两种或更多种的混合物。
54.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶底物包括：邻硝基苯基乙酸酯；邻硝基苯基-β-葡萄糖苷；邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷；硝基苯基-α-吡喃半乳糖苷；硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷；硝基苯基丁酸酯；硝基苯基癸酸酯；硝基苯基己酸酯；硝基苯基辛酸酯；硝基苯基月桂酸酯；硝基苯基丙酸酯；吲哚酚乙酸酯；吲哚酚β-D-葡萄糖苷；3-吲哚酚硫酸酯；3-吲哚酚磷酸酯；酚酞二丁酸酯；酚酞二磷酸酯；酚酞二硫酸酯；酚酞葡糖醛酸；酚酞单-β-葡萄糖苷酸；酚酞单-β-葡萄糖醛酸；酚酞单磷酸酯；1-重氮基-4-苯甲酰氨基-2，5-二乙氧基苯；1-重氮基-4-苯甲酰氨基-2，5-二乙氧基苯；对-重氮基-2，5-二乙氧基-N-苯甲酰丙氨酸；4-氯-2-氯化重氮甲苯；邻氨基偶氮甲苯重氮盐；1-萘基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷；2-萘基-磷酸酯；2-萘基-丁酸酯；2-萘基-辛酸酯；2-萘基-肉豆蔻酸酯；L-亮氨酰基-2-萘酰胺；L-缬氨酰基-2-萘酰胺；L-胱氨酰基-2-萘酰胺；N-苯甲酰基-DL-精氨酸-2-萘酰胺；N-戊二酰基-萘酰胺；2-萘胺；2-萘基-磷酸酯；6-溴-2-萘基-α-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-2-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘基-2-D-吡喃甘露糖苷；2-萘基-α-L-吡喃岩藻糖苷；萘基-AS-B1-磷酸酯；萘基-AS-BI-β-D-葡糖苷酸；或它们中的两种或更多种的混合物。
55.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶包括β-半乳糖苷酶，所述酶底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷。
56.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶包括β-半乳糖苷酶，所述酶底物包括4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷。
57.根据权利要求40或41所述的工艺，其中，所述酶包括β-半乳糖苷酶，所述酶底物包括：5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷，5-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷，6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷，6-氯-3-吲哚基-β-D-呋喃半乳糖苷，3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷，5-碘-3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷，N-甲基吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷，2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，2-氯-4-硝基苯基-β-D-乳糖苷，4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，4-三氟甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)，荧光素单-β-D-吡喃半乳糖苷，荧光素二(β-D-乙酰基半乳糖胺)，4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃乳糖苷，2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷，8-羟基喹啉-β-D-吡喃半乳糖苷，试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷，3-羧基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，4-氯甲基-6，8-二氟伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，6，8-二氟-4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，6，8-二氟-4-十七烷基伞形酮酰-β-D-吡喃半乳糖苷，5-(五氟苯甲酰基氨基)-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C2-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C8-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C12-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，5-氯甲基荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷，C12-试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷，和/或7-羟基-9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮)。
58.一种灭菌指示器，其包括：
载体，所述载体具有第一表面和第二表面；
支持物，所述支持物具有第一部分和第二部分，所述载体覆盖在所述支持物的第一部分的上面，所述载体的第二表面附着于所述支持物的第一部分；以及
根据权利要求1-36任一项所述的基因工程生物指示剂，其由所述载体支持，所述支持物的第二部分具有足够的维度，以允许在不接触所述生物指示剂的情况下操作所述灭菌指示器。
59.一种灭菌指示器，其包括：
第一隔腔，所述第一隔腔包含根据权利要求1-36任一项所述的基因工程生物指示剂，在灭菌过程中，所述第一隔腔适于允许使所述生物指示剂与灭菌介质接触；和
第二隔腔，所述第二隔腔包含至少一种诱导剂和至少一种酶底物，所述第二隔腔适于在灭菌过程中，使所述诱导剂和所述酶底物与所述生物指示剂保持分离，且所述第二隔腔适于在所述生物指示剂暴露于所述灭菌介质之后，允许所述诱导剂和所述酶底物与所述生物指示剂接触。
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