TW200831145A

TW200831145A - Genetically engineered biological indicator

Info

Publication number: TW200831145A
Application number: TW096135087A
Authority: TW
Inventors: Phillip F Franciskovich; William A Yirava; Tricia A Cregger
Original assignee: American Sterilizer Co
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2008-08-01
Also published as: EP2084293A2; US20100267044A1; AU2007338610B2; US8372624B2; AU2007338610A1; US8507248B2; CA2955990A1; WO2008079469A3; US20120214154A1; WO2008079469A2; US20080070231A1; EP2084293B1; CA2667698C; CN101535496B; US8895239B2; EP2084293A4; CA2667698A1; ES2501465T3; CA2955990C; CN101535496A

Description

200831145 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】所揭示之技術係關於遺傳設計之生物指示器。物指不益可適用於測定一或多種殺菌程序之有效性。【先前技術】主要在衛生保健工業中’但也在許多其他商業及工業應用中，通常需要監測用於將諸如醫用及非醫mu ^ 具及其他物件及材料之設備滅菌之程序的有效性。在此; 殺菌程序中在待殺菌之物件批次中包括_殺菌指示器往往係料實施。其允許以直接方法檢定殺菌程序之致死性。無菌保證之標準方法典型地涉及將含有一或多種測試生物體之殺«指示器暴露於殺菌程序且接著量測任何存活測》式生物體之長出。若在暴露於殺g程序後無測試生物體長出則可保證無菌。細菌孢子（例如嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Geobacillus stearothermophilus ) # g ( Bacillus wbtUis)、枯萆芽孢桿菌票色變楂⑴似如⑺沖以則）及其=似物）典型地用作測試生物體。完成殺菌程序後，即在會促進任何存活測試生物體細胞生長之條件下將殺菌 =器暴露於液體生長支持培養基。财長支持培養基通苇έ有回應活躍生長（代謝）細胞而變色之化學染料。由於生長及代谢之需求，使用此等測試生物體之程序在可測疋叙菌私序之有效性前典型地需要約24至72小時之培月。使用此程序之一問題係關於經殺菌之物件（諸如衛生 5 200831145 保健設施及其類似物件）之許多使用者具有有限資源且可月 b ^ 2 4 牵 7 〇 | 0士小寸内及有時立即再使用該等「經殺菌」之物件。在該等情況下，用於無菌性確認之24至72小時之暫停期可能不實際、成本高且無效。 #、已提出用於對某些121。〇及132。〇重力及預真空蒸汽殺囷週期及氧化乙烯殺菌週期更快速讀出測試結果之偵測方法士觀測存活指示細胞之跡象所需之時間經報導為短至1 ^咸L此方法涉及偵測酶α葡糖苷酶之催化活性。此酶:作為I生物代謝之正常組份由該微生物i ±且可能在 T园之刚及期間存在於微生物之芽孢外被中。此酶的存在 I藉由讀取由非螢光酶受質分解所產生之螢光來偵測。其而要使用一金光自動讀取器。酶受質的分解可為等待指示杈囷程序失敗之可見pH顏色改變之提早偵測替代方法。生長或代謝皆非螢光信號所需。其使得觀測殺菌程序失敗所需之時間減少。然而，本來就嗜熱之酶α «糖㈣比其所來源之微生物更耐熱。此可導致干擾性失敗（nuisan^ failure )，其為測試微生物實際上已被殺死，但指示酶指不測4微生物仍保持存活之情況。另外，由於酶以葡糖苷酶可存在於測試微生物之芽孢外被中且其存在並不需要代謝’因此债測此酶可能不為生命的直接指示。存在使用酶α葡糖苷酶可能無法區分未成功殺菌之負荷的h形。成功蒸汽殺菌依賴於在最短時間長度内達成有效/里度及壓力。細菌孢子典型地被選作用於此程序之測試生物體，此係由於其對此參數組合具有高度抗性。需要採 6 200831145 ’w 用溫度、屢力及時間之特殊致死組合以殺死細菌抱子。儘管輕/報導分子U葡糖㈣）為來源於料生物體之催化酶且由此稍耐熱，但該程序之熱最終破壞該酶之功能。亦即，屢力及時間在使α葡糖芽酶變性方面起減小之2用。因此，在不足致死塵力或時間條件下，即使細菌抱子可未遭破壞，但指示酶亦可遭破壞。其可導致摘測未經殺菌之負荷失敗。 +現有技術不能克服與細胞死亡相關之所有參數意謂可需要「長出」以提供最終確認性結果。然而，使用需要傳 =上被稱作長出之程序之一主要缺陷係關於在獲得殺菌測。果方面時間延遲。需要長出之殺菌指示器通常採用使用細菌孢子，該等細菌孢子須培養至少約24至72小時以Γ充分偵測任何存活抱子。在此期間，經歷殺菌程序 =於㈣下之物件不應使用直至孢子活力測試之結果已 :確义然而，如上文所指示，其對於需要殺菌之物件的許多使用者而言為不實際的。一因此，已由此項技術所呈現之一問題在於提供一在相哭才’月内準確及直接偵測殺菌程序之有效性的生物指示揭示之技術k供對此問題之解決方法。【發明内容】人所揭不之技術係關於_遺傳設計之生物指示器，其包至少-種測試生物體及至少一種適合於產生指示酶之口該報導基因係由該測試生物體吸收；及至少一 200831145 種在使報導基因暴露於至少一種誘導體之前抑制該報導基因表現之抑制基因。土所揭示之技術係關於一種殺菌程序，其包含：將一待殺菌之物件及上文所指示之生物指示器暴露於殺菌介質。所揭示之技術係關於一種用於測定殺菌程序之有效性之私序，其包含：將至少一個待殺菌之物件及—包含上文所指示之生物指示器的殺菌指示器暴露於殺菌介質；及使

該殺菌指示器與至少一種誘導體及至少一種酶受質接觸以判定殺菌是否有效。所揭示之技術係關於一殺菌指示器，其包含：一载體，該載體具有一第一表面及一第二表面；一支撐體，該支撐體：有—第一部分及一第二部分，該載體覆蓋於該支撐體之第°卩分上，該載體之第二表面係黏附於該支撐體之第一部分；&由該載體支撐之上文所指示之遺傳設計之生物 “器’該支撐體之第二部分具妓夠尺寸以允許在不接觸该生物指示器的情況下操縱該殺菌指示器。所揭示之技術係關於—殺菌指示器，其包含：一含有 =所指示之遺傳設計之生物指示器的第一隔室，該第— ^至適於殺菌期間允許生物指示器與殺g介質接觸；及— 3有至少一種誘導體及至少一種酶受質之第二隔室，該第適於在殺菌期間維持該誘導體及該酶受質與該生物饥—°刀離且°亥第-隔室適於在已將生物指示器暴露於权囷"質後允許誘導體及酶受質與生物指示器接觸。 8 200831145 v

【實施方式】術語「殺菌」係指致使物質不能再生、代謝及儘管其通常意謂完全不存在存活生物體，但該術 I可用。於指代物質不存在存活生物體達先前經承認為可接又之私度。除非另有指#，否則術語殺菌在本文於指代與殺菌相比不太嚴格之方法及程序，例如消毒生處理及其類似者。本文料之遺傳設計之生物指示哭: :序及裝置可在衛生保健領域、科學領域及其類似領：中 1用,1”生物指示器及程序及裝置可在可需要殺菌、消毋、喊生處理、消除資逃、主、切朴成除/可木、清潔及其類似者之商業及工應用中使用。商章及工豐1 m η茶及工業應用可包括諸如食品加工、殺菌、土壤修復、水修復及其類似者之程序。 w I使用所揭示之殺8指示器之殺菌程序可包含任何殺困程序。該殺菌程序可包括其中殺菌介質或殺菌劑可包含 W、乾熱、輻射、電漿以及一或多種氣體殺菌劑、一或多種液體殺菌劑及其類似物之殺菌程序。該輻射可包含包括電㈣射之電子束或任何電磁波譜、脈衝白光或紫外光、微波及類似輻射。护射可4人耵輻射可包含γ或β輻射。氣體殺菌 μ&含氧化w'氣體過氧化氫及其類似物。液體殺菌制可包含福馬林（formalin)(溶解於水中且視情況含有甲酵以抑制毒性物質形成之甲越）、戊二越、過氧乙酸、液體過氧化氫及其類似物。、、專又十之生物扣示益’可用於檢查對抗與連同遺傳設物私不為提供的測試生物體相比對殺菌程序之抗性 9 200831145 权低之任何微生物的殺菌劑之致死性。此等微生物可包括細菌，諸如大腸桿菌（心⑶"）、退伍軍人桿菌 Uw〇⑽//α印·）、曲桿菌（C⑽仰/〇6以加π )及其他腸道細菌，以及葡萄球菌（&ap/^ococew)及鏈球菌 (Arepioeoaz^)物種；及其他人類病原性微生物，諸如隱胞子 A ( Cryptosp〇ridiUm)。生物體的生長可肖A , J匕3 ♦夕細胞過程之組合結果。在业型殺菌指示器應用中，其可以若干方式來觀測。當細胞I 長及刀衣日寸，其個.體數目增至該等細胞之支持培養基可自澄清變成不透明（混濁）之點。為有利於此生長觀測，可 = :PH/指示劑染料。生長需要能量。此能量可軸使含於支持培養基中之營表 ^ v ^ S養素代谢之能力來提供。此過程之为解產物可使支持與養其轉

俏於-勹、九w , 口土艾成酉夂性。此酸性可誘導· pH 值才日不悧朱料（例如酚紅）澄清紅色轉變成黃色因此’當支持培養基自 m 'PI 5! /t ^ '，轉變成混濁黃色狀態）時，了嬈測到生長。儘管此等命跡象且一般被各個益菌伴!:Ϊ1"’但其代表強有力的生與靶/報導酶（例如a葡糖㈣彳轉“為基準。错由力，有可食之活性相關間接量測成活 :短獲传無菌指示所需之時間。然而所才日不，此過程可能仍需要作為最終確認長及代謝廢產物的積累為生命過程、、能需要_|六具# M / 壬之攻、、，;結果’因此J1可月匕而要車又長知間（24至72小時）日 1 以本發明，適合於產生指示文传明顯。之報導基因（例如！曰::：（例如β·半乳糖苷酶）〇由測試生物體（例如細菌微生 200831145 吏用σ適之媒介物（例如質體或病毒）吸因的#相-r h ^ ^ & 、、σ由抑制基因（例如xylR)主動阻斷。報導基因的表現在將抑制基因暴露於可存在於恢復培養基中之誘導體（例如木糖）之前可保持受阻斷。由於直至殺菌程序已凡成後未將測試生物體暴露於誘導體，因此指示酶在殺菌之則或期間可不存在。其意謂測試生物體之敏感性與殺菌 +序可而之私示酶之彼敏感性之間無相關性。可暴露於殺 _ ^私序者為測試生物體用以存活及生長且亦用於產生指示 :之各種及生命機制。其可包括用於細胞生長（及質體複衣）之DNA聚合酶、用於轉錄測試生物體之代謝需求（及為體或病毒所帶之報導基因，例如lacZ)的PNA聚合酶，及細胞蛋白質轉譯（以及指示酶表現）所需之多核糖體。由於扣不酶可快速充當信號產生機制，因此任何剩餘成活生物體的存在可在比當將其約束於測試生物體之生命生長機制之所積累之最終結果時較早的時間變得顯而易見。 • 測忒生物體可包含對所欲殺菌程序之抗性超過待由該殺菌程序破壞之其他生物體之彼抗性的任何生物體。所使用之測試生物體之類型可視多種因素而定，該等因素例如 (但不限於）所使用之殺菌程序之類型。測試生物體可為 U生物。可使用之菌株可為對用於殺菌之程序最具抗性之彼等菌株。測試生物體可包含一或多種細菌、病原體、革蘭氏陰性生物體、革蘭氏陽性生物體、營養性生物體 (vegetative organism )、病毒、非自我複製劑、亞細胞組份（sub-cellular C〇mP〇nent)或細胞產物，及/或朊病毒 11 200831145 (prion)。細菌微生物可為形成内生孢子（亦即細菌孢子）之彼等細菌微生物。測試生物體可包含桿菌（似）、穿抱杯囷（）或梭菌（c/wir Wa )屬之細菌。此等細菌可包括嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌黑色變種、枯草桿囷、球形芽孢桿菌（心以·"似似）、炭疽芽胞桿菌（心㈣如以以）、短小芽孢桿菌（以、凝結芽孢桿菌（万㈣$)、生抱梭菌（C/wW山·謂a〇r〇gae〇、難養芽胞梭菌（c/owr油·謂 difficile)、肉莓復窗 Q Clostridium botulinum)、球形變兴枯草桿囷（^以以/以g/oWgz.z·)、虫鼠狀芽抱桿菌 (BacUlus cereus)、環狀芽孢桿菌〔βααΐι^ circulans)、大腸桿菌及類似細菌。該等細菌可包含真菌、分枝桿菌、原蟲、營養性細菌（vegetable bacteria )及類似細菌。可使用之真囷之貫例可包括黑麯徽（dspag/Z/w wz.ger )、白色念珠菌 { Candida albicans )、髮瘡小芽胞癖菌 (Trichophyton mentagrophytes)、皮炎王氏黴（⑽gieZ/α ☆ rm如)及類似真菌。可使用之分枝桿菌之實例可包括龜分枝桿菌（cAe/cmw )、戈氏分枝桿菌 (Mycobacterium gordonae ) 、包皮垢分枝桿菌 (Mycobacterium smegamatis ) 、土地分枝桿菌 (Mycobacterium terrae)、牛分枝桿菌（办OVZ^)、結核分枝桿菌（从及類似分枝桿菌。可使用之原蟲之實例可包括梨形鞭毛蟲 (Giardia lamblia )、敬，i、隱抱子备（Cryptosporidium 12 200831145 parvwm )及類似原蟲。可使用之營養性細菌之實例可包括嗜水產氣單細胞菌（Jeromo麗s /zj；办〇ρ/π7α )、糞腸球菌 (Enterococcus faecalis )、糞鍵球菌(Streptococcus /aeca/b)、屎腸球菌、膿鏈球菌

、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌 {Klebsiella pneumoniae )、嗜肺性退伍軍人桿菌 Q Legionella pneumophila)、$ 基择嵐Q Methylobacterium)、綠膿桿菌（aerwghosa )、緒霍亂沙門氏菌、幽門螺旋桿菌（7fe/k〇hCier 户少/orz)、抗輻射微球菌（她’croc〇(：<：rWiy似）、抗幸昌射奇異球菌（Dekococcw s )、金黃色葡萄球菌（57印awrews )、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis )、嗜麥募養食單胞菌 (似m<2/iop/n’"a )及類似營養性細菌。可使用諸如嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌黑色變種、枯草才干囷、政結芽孢桿菌、生孢梭菌及類似生物體之生物體 /則疋濕熱殺菌（高壓簽殺菌）之功效，其中嗜熱脂肪芽孢桿菌尤其適用。諸如營養性細菌、營養性細胞（vegetable cell)及/或其組成部分之營養性生物體可用作測試生物體。實例可包括不形成内生孢子之大腸菌種及細胞，例如嗜水產氣單細月匕菌、糞腸球菌、糞鏈球菌、屎腸球菌、膿鏈球菌、大腸才干菌克雷伯氏桿菌（尤）（肺炎克雷伯氏桿菌）、嗜肺性退伍軍人桿菌、甲基桿菌、綠膿桿菌、豬霍亂沙門 13 200831145 氏囷、幽門螺旋桿诠來窠|人™队 ’、匍萄球菌、表皮葡萄球菌、曰麥暴養食早胞菌及類似細菌。囷一戋多種献D 1 Λ 寺大知囷種及細胞可與 Α夕種賦^組合使用定實體穩定之一卢、、乏錄畔夕s + 了疋義為可用於使不穩之廣泛種類之通常為惰性之化合物之一子類之賦形劑包括碳水化使用醣。兮彳卜人私一 D物，例如寡聚醣及聚合以化3物之一實例可A省贫疏、海’眾糖’其為雙醣。草〇tb峰你體之組織中海藻糖古：曲系二生物活^度可允許生物體在缺水狀態下存使功月“生細胞組份在脫水後再生。海、m 糖可提供在極端環境條件（例如A 海泳必需之膜及其他大分子6 士握μ 乾燦）下細胞成活所 ,^ 子'、、口構的穩定性。其他穩定化賦形劑化合物可包括簡單糖類（ — 庶搪、葡萄糖、麥芽糖及類似糖）及長鍵聚合物「也丨l μ π 如葡汆糖、澱粉、瓊脂糖、纖維素及類似長鏈聚合物）。並 J ，、他基於非碳水化合物之賦形劑可包括蛋白質、膦酸_、修綾衝Μ、％、脂質、油以及其他烴基物質。 /、他測试指不器可包含_武之絲Α 3 或夕種非自我複製劑及/或亞細胞組份或細胞產物。此等非自我複製劑及/或亞細胞組份或細胞產物因其臨床意義或因其作為生物性恐怖攻擊劑之用途而可加以使用。此等指示物質可包含目前可因天然或人為改質而對抗生素治療或化學消毒之正常方式具有抗性之細胞菌株。前者類型之實例可包括(抗萬古徽素腸球菌， vanc〇mycin Resistant e崎⑽似〇、msra (抗二甲氧苯月极素金育色葡萄球菌，Methicillin Resistant phylococcus aureus )、龜分枝桿菌（御 200831145 de/om·)及類似菌株。由於VRE及MRS A已對治療對策减現抗性（例如抗生素抗性）且龜分枝桿菌（从.) 已對一些消毒模式顯現抗性（例如戊二醛抗性），因此可使用此等菌株。

測試指示器可包含一或多種新興生物體。此等生物體可代表對作用或消毒之治療過程之特殊風險或挑戰。此等指示物質之實例可包括朊病毒。朊病毒本身並非活生物體，但其作為致病劑之功能可與其結構相關且此結構/功能關係可用於確定其相對感染性。可使用其他非自給劑（例如病毒）以及亞細胞元件及蛋白質性朊病毒。由測試生物體吸收之報導基因係為達成產生指示酶之目的而提供且可包含lacZ、bgaB、xylE、cat、gfp或其兩者或兩者以上之混合物。術語rlacZ」係指編碼卜半乳糖苷酶之基因。術語「bgaB」係指編碼來自嗜熱脂肪芽孢桿菌⑺⑽叩办"⑽）之耐熱β_半乳糖苷酶之基因。術語r xylE」係指編碼來自惡臭假單胞菌（⑽⑽似 π—"0之兒茶酚_2,3_雙加氧酶之基因。術語「cat」係指編碼（例如）來自pC194之氣黴素乙醯基轉移酶之基因。術語「PCm」“特定質體構築體。術語「诉」係指編碼耐熱綠色螢光蛋白質變異體之基因。

抑制基因可由测試生物體吸收。該抑制基因可包含 xylR lael、tetR或其兩者或兩者以上之混合物。術語「X 係指木糖操縱子之镧銘三 4 π Γ , 卞之調即子。術語「lacI」係指lae 調節子。術語「tetR 总此于欠卞之 etR」係指tet操縱子之調節子。可 15 200831145 等抑制基因之耐熱對應物。抑制基因可用於主動阻斷報導基因表現直至將該報導基因暴露^可存㈣恢復培養基中之誘導體為止。抑制基因可由測試生物體連同用於將報導基因插入該測試生物體中之同一媒介物一起吸收。用於將報導基因及抑制基因插入測試生物體中之媒介物可包含-或多種質體及/或一或多種病毒。此等媒介物可被稱作載體。質體可包含與染色體DNA分離之環形雙股 DNA。質體可為線性的。f體之大小可在@ 2〇〇〇個至約 20000個驗基對（bp)之範圍内，且在—具體實例中係在約5000個至約10000個bp之範圍内。測試生物體之單個細胞可吸收同一質體之一或多個複本（例如i個至約個複本，及在一具體實例中丨個至約6〇個複本，及在一具體實例中約20個至約3000個複本）。質體可含有一或多個充當複製起點（〇ri )之DNA序列。質體可含有一或多個遺傳標記。質體可含有多酶切點接頭或多選殖位點 (MCS )，其可為含有一或多個允許DNA片段插入之限制性位點的相對短的區域。質體可含有一或多個提供選擇性標記以誘導測試生物體保持質體之基因。該選擇性標記可包含抗生素抗性基因及/或具有營養能力（nutrhi〇nal capability)之基因。質體可包含含有可執行接合過程（質體有性轉移至另一細菌）之tra基因之接合質體。質體可包含至少一個複製起點、至少一個選擇性標記、至少一個誘導性啟動子及至少一個報導基因。實例說明於圖1及圖2中。選擇性標記可包含抗生素抗性基因及/或具 16 200831145 有外源性營養能六>Im , 主 > 土口。此等基因可包括氯黴素、胺苄月Μ素或硯黴素抗生音其 %、t u ” 土口，及/或木糖或乳糖營養基因。誘導性啟動子可包会Ρν、！ Λ广· # f % ^ 。衡語PXylA係指需要木糖以保扣活性之轉錄啟動子。 J 丁叛¥基因可包含lacZ、bgaB、、 Γ起二基因。質體可包含兩個複製起點。該等複點可勺人可包含革蘭氏陰性複製起點且另-複製起黑占j包含革闌氏陽性籍顧 _ _ Θ。t #曼1U。革闌氏陰性複製起點可包 t #干 $闌氏陽性複製起點可包含枯草桿菌、嗜埶脂肪芽孢桿菌或枯箪芽掬 f ® 曰…、祐早牙孢杯囷黑色變種。圖1及圖2中所說明之質體可含有約2〇〇〇 ^ _ 丨口王约20000個bp，且在一具脰貫例中含有約5〇〇〇個至約1〇⑽〇個4。質體可具有圖3中所說明之構造。在圖3中，使用以下縮寫：之氯黴素乙醯基轉移酶之

Cat」係指含有來自PC194 基因的DNA片段。

rep」係指用於複製之基因。 mob」係指遷移因子基因。 xy1R」係指木糖操縱子之調節子。 bgaB」係指耐熱β_半乳糖苷酶之基因 T iΤ2」係指終止子1及2。術語「灿」、「BssSIj、「BseYi」、「卸山」、 PSU J NrUl」、「PacI」、「PvuII」、「Xhol」、「「SfiI」、「SalI」、「sPeI」、「sacii」、「NotI」、「AatIIj、「SnaBI」係指在圖3中所描繪之質體之DNA序列中存在 17 200831145 之限制性核酸内切酶位點。此等位點表示各種限制性核酸内切酶之裂解點且在圖3中用作參考點。此等位點可用於幫助鑑別質體。其可用於將質體切割成其組成部分。圖3 中所說明之質體具有7967個鹼基對。天然產生之質體存在於自然界廣泛範圍之宿主生物體

内其可包㊁基因、調節元件及/或DNA結構片段。質體通常向其宿主生物體提供一些優勢（例如抗生素抗性或使用某些能量營養源之能力）且只要此有利關係可存在，則可由其宿主生物體耐受。遺傳設計之質體可包含所關注之基因拼湊體、調節元件及/或結構片段。由於如此多的天然產生（及先前經設計）之質體可利用，因此，自其存在廣泛基因選擇用於選擇。在圖！及圖2中所示之質體的狀況下，所使用之基因可基於所完成之構築體之所要特性來加以選擇”匕等特性可包括以下能力：使整個範圍之適用宿 :生物體轉型，向宿主生物體提供一些選擇性優勢（例如抗生素抗性），按需求產生耐熱及可快速㈣之信號，及使信號關閉直至需要將其打開為止。其可藉由以來自多種 =質體之DNA片段之形式將所需屬性拼湊於—起（連接）來二成。舉例而言’該等片段可包含革蘭氏陽性生物體與革蘭氏陰性生物體兩者共用之複製起點、氯徽素抗性之加基因、耐熱β_半乳糖芽酶之bgaB基因，及調節㈣基因產物直至需要為止之XylR調節子。〇該之所〜特定設計體可藉由裝配所要遺傳元件來建構等运傳元件可藉由限制性消化來自供體質體或生物體 18 200831145 ㈣傳序列以產生可隨後易於連接至另一遺傳序列之職末端來褒配。典型地，5’或3,突出可經由對兩個連接把向序^進行限制性消化來產生。消化後，可將乾序列純化且接著與酶（連接酶）連接於一起。圖3中所描繪之質體可藉由裝配含有革蘭氏陽性生物體與革蘭氏陰性生物體兩者共用之複製起點的基本質體以及氯黴素抗性之⑽基因來建構。xylR調節片段可藉由限制性消化基本質體且連接 _ xylR片&而與基本質體連接。確認xylR調節片段與基本片段正確連接後，對於bgaB基因片段與此基因之终止子η 及η可重複該過程。完成遺傳元件之裝配且確認正確裝配及定向後’可將質體插入可用作測試生物體之宿主生物體中。可稱作病毒體之完整病毒粒子可為基因轉運體（_ 咖_0 ’其可包含由可稱作衣殼之蛋白質保護勒環繞之核酸。衣殼可包含由病毒基因組編碼之蛋白質且其形 .A可充=於形態區分之基礎。可稱作啟動子之病毒編碼之蛋白質早位可自主裝配以形士十> 衣配乂形成衣威而無需自病毒基因组輸入；然而’少數病毒可編碼可幫助建構其衣殼之蛋白質。與核酸相關之蛋白質在技術上可更常被稱作核蛋白質，、且病毒衣殼蛋白質與病毒核酸之聯合體可被稱作核殼體。病毒可不被視為活生物體且可缺乏在宿主細胞外自i繁殖之構件。j文連同細菌所用之病毒可被稱作m嗤菌體。病毒之實例可包括人或M13嗟菌體。藉由首先以核酸内切酶裂解非重組嗟菌體DNA且接著將DNA片段連接至兩個 19 200831145 新形成之末端可將報導基因及抑制基因插入病毒中。媒介物（亦即質體、病毒）可由以下方式由測試生物體吸收··轉型或接合（例如以質體），或轉導或轉染（例如以病毒）。

可由報導基因產生之指示酶可包含P_D_半乳糖普酶、 β-D-葡糖苷酶、a_D-葡糖苷酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、十四烷酸脂肪酶、白胺酸胺基肽酶、纈胺酸胺基肽酶、胰凝乳蛋白酶、磷酸水解酶、 a-D-半乳糖苷酶、a_L_阿拉伯呋喃糖苷酶、N_乙醯基·β•胺基葡萄糖苷酶、β-D-纖維二糖苷酶（p_D-ceU〇bi〇sidase)、丙胺酸胺基肽酶、脯胺酸胺基肽酶、酪胺酸胺基肽酶、笨丙胺酸胺基肽酶、β-D-葡萄糖醛酸苦酶、脂肪酸_酶或其兩者或兩者以上之混合物。可使用此等指示酶之耐熱對應物0 ....... 试刊兮週之程序將遺傳設訐之生物指示器暴露於殺菌介質。其可包括使用由冑5_7所說明之彼等殺菌指示器所例示（但不限於其）之殺菌指示器。蒼看圖5及圖6,殺菌指示器1〇波雜μ ^ 可包含载體12,該载體12 具有一弟一表面14及一繁-主I ，弟一表面16 ;支撐體2〇，該支撐體20具有一第一部分22及一 _朴弟一部分24，載體12覆盍於支撐體20之第一部分2? μ ^ 弟邛刀22上，载體12之第二表面16係黏附於支撐體2 0之第一部分99· __ #刀22,及由載體支撐之遺傳汉计之生物指示器3 〇。生物指。 # .^ 14 , ^ . 扣不态3〇可由載體12之弟一表面14支撐或黏附於載體12 ^ 9Π 、乐一表面14。支樓體20 20 200831145 j第二部分24可具有足夠尺寸以允許在不接觸生物指示 vm 3 〇的丨月况下操縱殺菌指示器1 〇。亦即，第二部分2 4可 :有足夠尺寸以充當一把手，從而允許有利地無菌操縱殺菌指示器10。載體12可呈—相對平坦基板之形式，其在圖式中係描、·冒、圓形之形式。然而，應瞭解，載體12可具有任何 :之：：或形式’例如正方形、長方形、橢圓形及類似形 -12可具有稜柱形橫截面。載體12可具有相對小 Γο!二例如約請1至約3麵，且在-具體實例中為約以職，且在一具體實例中為約〇.〇5至約以随，體實例中為約°」至約1 _。對生物指示器3。兮面产·^载體12之弟—表面14之面積可相對小，例如，至約8°_2之範圍内，且在-具體實例至約70 mm2之範圍内，且在一至約6〇 W之範圍内，且在二;，例中在約3 -2之範圍内。，… 、體貝例中在約5至約50 寸可相對小，二一優勢在於生物指示器3〇之尺的量可相tM ^ ^生物指不11所需之恢復培養基的里：:目對小且對於培育之時間需求可相對短。載體12可包含多孔松固體載體。载體 ” _夕孔材料。該載體可包含化之任何材料。評：在殺菌或培育程序期間不溶解或劣塑谬、膜：二者:可包含紙張、金屬、玻璃、陶堯、狀4具兩者或兩者塑膠可包含聚埽烴、聚笨二5。金屬可包含銘或鋼。醋、聚丙烯酸胺、聚酿亞胺：碳酸醋、聚甲基丙浠酸亞私、承酯及類似塑膠。载體12 21 200831145 可包含薄膜。該載體可呈紡織或非 ^ 局織毛魏之形式。載體可包含壓縮纖維墊。載體可包含由镇莊 m ^ . 心、、”破掏、破璃纖維、陶&、合成聚合物或其兩者或兩者从報莽有M上之組合製成之多孔材枓。載體可包含濾紙或吸水紙。 ^ ^ ^戰體可包含纖維素襯墊。支撐體20可包含在殺菌或谇盲耘序期間不溶解或崩解二壬何材料。支據體可包含金屬、破璃、陶[塑膠或其 ::支按體可包含銘或不鏽鋼。支撐體可包含聚苯乙烯、

來：^經（例如聚丙烯、聚乙嬌）〇佈）及類似物。支撐體2Q可為可撓性的或剛性的。支撐體^ 又每體20可為可摺疊的。圖式中所描繪之支撐體20之形狀為長方 ~ κ乃形，然而，應瞭解，該支接體可具有任何所要之形狀或〜狀或形式，例如正方形、圓形、橢圓形及類似形狀。支撐體2() 牙篮2ϋ之長度可在約0.2至約12 cm 之範圍内，且在一具體實例中在約〇2至約“之範圍内’且在-具體實例中在約G 5至約7加之_内，且在一具體實例中在約1至約5 cm之銘R^ em之乾圍内，且在一具體實例中在約1·5至約3·5 em之範圍内。支撐體2()之寬度可在約0.2至約2 cm之範圍内，且在一具體實例中在約〇 2至約Ucm之範圍内，且在—具體實例中在約〇 25至約_ 之範圍内。支撐體20之厚度可在約0.02至約3 mm之範圍内，且在一具體實例中在約〇1至約2顏之範圍内。第二部分24之長度可在約〇 2至約12⑽之範圍内，且在一具體貝例中在約0.3至約i 1 em之範圍内，且在一具體 κ例中在、’勺0.5至約1 〇 cm之範圍内，且在一具體實例中在約1至約7 Cm之範圍β，且在一具體實例中在約1 ·5至 22 200831145 約4 ·5 cm之範圍内。支撐體20可呈長方形薄片或條帶之形之第，22包含支撐體20之長度之較二，八支撐體2〇 20之第二部分24包含支撐體20之長度之卞支撐體部分24之長度與第-部分22之長度的心可二分。第二約12:1之範圍内，且在一具體實例中在約* 、、勺2.】至範圍内，且在-具體實例中在約5 5:1至約65 、約之

一可使用超音波炼接、熱封、黏著劑或層壓使=附 ΓΛ支Λ體Γ載體12可在將生物指示器3°施加於載體 U之可或之後附著於支撐體2〇。可在將生物指示哭30施加於載體12之後使用超音波溶接或黏著劑使载體；2附著 :支：體20。超音波熔接可包括使支撐體與载體摩擦結 ^黏者劑可為與載體12及支撐體2Q相容且在殺菌或培月程序期間不溶解或劣化之任何黏著劑。黏著劑對所關注之生物體不應具有致死性或抑制性。黏著劑可為壓敏性黏著劑。用於支撐所揭示之生物指示器之殺菌指示器Μ可在任 2序中使用，其中在殺g程序期間將殺菌指示器暴露於囷”貝且接著暴露於誘導體及酶受質以判定該殺菌程序疋否有效。殺菌程序可使用氣體或液體殺菌劑、乾熱、輪射及類似者。在殺菌程序期間將殺菌指示器1〇連同待枚菌之物件一起暴露於殺菌介質。完成殺菌程序後，即可將木又菌指不裔10置放於一含有包含至少一種誘導體及至 V —種酶受質之恢復培養基之小瓶中。可接著將遺傳設計 23 200831145 .2生物指示器培育所要時期且檢查以判定殺菌程序是否有遺傳設計之生物指示器可在一包室之容器的自含式殺菌指示器中使用。：；有兩個獨立隔可含有該生物指示器。另一隔室二=隔室中之-者主j 3有包含至少一種讀墓體及至少一種酶受質的恢復 ° 浐捭 "在使用時’可將殺菌之物件暴露於殺菌介質。殺菌後，可使殺菌指示器活化以便使生物指示器鱼足交了使杈 •冑狀恢復料基接觸。此_ 'w程序是否指示器暴露於殺菌介質之任曰不器可用於可使生物菌劑之殺菌程序。之任何衩困程序，例如使用氣體殺自，式殺菌指示器可呈由圖”所描繪裔例不（但不限於其）之形式。參看圖7,殺菌指…〇可包含楔形官42、内部隔室44及封帽46。封帽46包括 =I環隙43在楔形管42之内表面與内部隔室44 • 表面之間形成，該環隙43形成另-内部隔室。載體5〇置於環隙43中。遺傳設計之生物指示器可由載體5〇載體可包含圖4及圖5中所說明之殺菌指示器ι〇。恢设培養基可含_部隔室44中。楔形管42及封帽4 由與殺菌程序中所使用之條件及化學品相容之任何材料製成\此等材料可包括聚碳酸酯、聚烯煙、聚醯胺、聚甲基丙稀I酉曰、水甲基戊婦、聚醋及其類似物。内部隔室44 可呈玻璃或易碎玻璃安瓶之形式。楔形管42、内部隔室料及封帽46之構造之進一步細節可見於美國專利4,304,869 24 200831145 令’該專利以弓I用的方式併入本〇孔材料或非多孔分^ 載體50可包含多丁寸飞非夕孔材料。载體期間不溶解或劣化之钮打了匕3在权囷或培育程序化之任何材料。載體5〇屬、玻璃、陶瓷、塑膠…氏張、金八释^ 膜或其兩者或兩者以上之組人。 :蜀可。含鋁或鋼。塑膠可包含聚烯烴1笨乙烯、二户 :酷、聚甲基丙歸酸醋、聚丙烯醯：

==體5〇可包含薄膜。載體”呈紡織= 人冑體50可包含壓縮纖維墊。載體5〇可包 S由燒結玻璃、玻墙總維现螭緘維、陶瓷、合成聚合物或其兩者或兩者以上之組合盤成+夕β U Μ 、成之夕孔材料。載體5〇可包含濾紙或吸水紙。載體5 〇可白冬總祕主 J I 3纖、准素襯墊。在殺菌期間，將殺菌指示器40冑同待殺菌之物件一起暴露於殺菌介質。告已完成殺菌時，將封帽46向下壓人楔形管42中。突出: 48對内部隔室44力口以擠壓且使其破裂。其使得恢復培養基接觸載體5G及可在經歷殺菌後仍存在之由載體5〇支撐之任-殺菌指示器。在預定時間後，可移除載冑5〇且藉由偵測生物指示器之變化來確定殺菌程度。載體12或載體50可具有在約1至約8〇咖2範圍内及在一具體貝例中在約5至約5 0 mm2範圍内之用於支撐遺傳設计之生物指示器的表面積。殺菌前，由載體12或載體50支撐之生物指示器之菌落形成單位（cfu)之數目可在約1 〇4至約1 〇7 Cfu/mm2之範圍内，且在一具體實例中在約105至約106cfu/mm2之範圍内。誘導體可包含木糖、異乳糖、異丙基硫代半乳糖苷、 25 200831145 金屬硫蛋白或其兩者或兩者以上之混合物中之一或多者。可將誘導體與酶受質組合於恢復培養基中。酶X貝可包含當由指示酶對其起作用後轉化成酶修飾之產物的物質或物質混合物。一般而言，酶修飾之產物可包含發光、螢光或有色材料。或者，酶受質可包含當由酶對其起作用後可得到與另一化合物或組合物反應產生發光、螢光或有色材料之產物的一或多種化合物。存在可用於偵測特定指示酶之酶受質的兩種基本類型。酶受質之第一種類型可為螢光或發色的，且可給出諸如之AB化學式。當由指示酶對其起作用後，AB可分解成 A+ B。舉例而言，B可為螢光或有色的。在一具體實例中，兩個B化合物可一起反應以產生螢光或有色信號。此類型之螢光受質之一特定實例可為磷酸4_甲基傘形酮酯。在指不酶磷酸酶存在下，可使受質分解成仁甲基傘形酮及磷酸酯。此類型之其他螢光受質可包括4_甲基傘形酮基 (methylumbelliferyl ) 、7_醯胺基甲基香豆素、吲哚酚及螢光素之衍生物。此類型之發色受質之一實例可為磷酸 5-溴-4-氯-3-吲哚酯。在磷酸酶存在下，可使該受質分解成靛藍及磷酸酯。此類型之其他發色受質可包括5_溴_4_氯_3· σ弓Iσ朵基、墙基酚及紛酞之衍生物。酶受質之第二種類型可由化學式CD給出，舉例而言，其可由特定酶轉化成C + D。然而，C或D皆可不為榮光或有色的’但D可能夠進一步與化合物z反應以得到榮光或有色化合物，因此指示酶活性。此類型之一特定螢光實 26 200831145 例可為胺基酸離胺酸。在酶離胺酸脫羧酶存在下，離胺酸可失去一分子c〇2。離胺酸之剩餘部分可接著被稱作屍胺，其具強鹼性。可併入諸如4_甲基傘形酮之鹼性指示劑且其可在強驗存在下發螢光。此類型之發色受質可為磷酸孓萘酯。指示酶磷酸酶可與該酶受質反應以得到β_萘酚。所釋放之β-萘酚可與含有重氮基_4_苯甲醯胺基_2,5_二乙氧基苯之發色試劑反應以產生紫色。 +酶受質可包含螢光化合物，該螢光化合物在本文中被疋義為能（例如）藉由水解經酶修飾以得到具有經明顯修飾或增加之螢光之衍生螢光體的化合物。螢光化合物本身可為非螢光的或螢光滯後的（亦即， (例如）在顏色或強度方面與相應酶修飾之產物相比，以截然不同方式發螢光）且可使用適當的激發及偵測波長以使由酶修飾所產生之螢光信號與可存在之任何其他螢光八離。 77 可使用多樣來源之指示酶之多種酶受質。此等酶受質可包括螢光‘甲基傘形酮基衍生物（可水解成4_甲基傘形酉同）；7-醯胺基_4_甲基-香豆素之衍生物；二乙醯基螢光素仿生物；及胺螢（flu〇rescamine)。可用作酶受質之4-甲基傘形酮基衍生物可包括：扣甲基傘形酮基-2-乙醯胺基-4,6_〇_亞节基去氧_p_D_葡萄吼喃糖苷；乙酸4-甲基傘形酮酯；扣甲基傘形酮基卞·乙醯基胺基半乳糖苷；4_曱基傘形酮基_N_乙醯基•胺基葡萄糖苷；4-曱基傘形酮基_N_乙醯基胺基葡萄糖苷； 27 200831145 2'-(4-甲基傘形酮基）-a_D_N_乙醯基神經胺糖酸；甲基傘形酮基-a-L-阿拉伯呋喃糖普；4_甲基傘形酮基_a_L_阿拉伯糖苷’·丁酸4-甲基傘形酮酯；4_甲基傘形酮基纖維二糖普U — side)，·甲基傘形酮基·β·β_Ν，Ν，_二乙醯基幾丁二糖芽Uhitobioside);反油酸4_甲基伞形则旨；4_ 甲基傘形喊糖# ; 4_甲基傘賴基_a心岩藻糖苷’ 4-甲基傘形酮基_p_L_岩藻糖苷；4_甲基傘形酮基_a_D_ 半乳糖普；4·甲基傘形酮基H半乳料；心三氟甲基伞形酮基_β-ϋ_半乳糖苷；6 8 - yl 土，，一氟-4-甲基傘形酮基半乳糖苦；4_甲基傘形酮基條葡萄糖苦；4_甲基傘形酮基_ 叫葡萄料；4·甲基傘_基1械基·2_乙醯胺基-2_ 去氧仙_葡萄料；4·甲基傘形喊仰_㈣㈣酸普； Μ-二氟-4-甲基傘形酮基葡萄糖路酸普；對脈基苯甲甲基傘形酮醋；庚酸4·甲基傘形酮醋；4_甲基傘咖土 -a-D-吡喃甘露糖苷；4_曱基傘形酮基n咣喃甘苦’油酸4-甲基傘形酉同醋；油酸心三氟曱基傘形剩醋；棕櫚酸4_甲基傘形酮酉旨；磷酸仁甲基傘形酮酿；丙酸* +形酮酉曰’硬脂酸4·曱基傘形酮酯;硫酸4_甲基傘形_酯；扣甲基傘形酮基-口①七^山”-三乙醯基幾丁三糖；… 傘形酮基2,3,5-三{苯甲酸基一拉伯咬喃糖普氣2 4-甲基傘形酮基-β_三甲基銨肉桂酸醋；4_胍基笨甲酸基傘形酮酯；及4-甲基傘形酮基_0_〇_木糖苷。可用作酶受質之7_醯胺基_4_甲基香豆素之衍生物可勺括W7·醯胺基-4_曱基香豆素^脯胺酸·7-2 28 200831145 基-4-曱基香豆素；L -酪胺酸-7-酸胺基-4-曱基香豆素；L-精胺酸-7-醯胺基-4-甲基香豆素；L-瓜胺酸-7-醯胺基-4-甲基香立素；L-白胺酸-7-醯胺基-4-甲基香豆素；L_甲硫胺酸 -7-醯胺基-4-甲基香豆素；L-焦麩胺酸7-醯胺基-4-曱基香豆素；L-天冬胺酸β-(7-醯胺基-4-甲基香豆素）；L-麩胺酸 1-(7-醯胺基-4-曱基香豆素）；L-苯丙胺酸-7-醯胺基-4-曱基香豆素；及7-戊二醯基-苯丙胺酸-7-醯胺基-4-曱基香豆素。

可用作酶受質之7-醯胺基-4-甲基香豆素之肽衍生物可包括：N-t_BOC-Ile-Glu-Gly_Arg 7-醯胺基-4-甲基香豆素； N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7-醯胺基-4-甲基香豆素；>^-CBZ-Phe· Arg 7 -酿胺基-4-甲基香豆素；N -號ί白酿基-Leu_ Tyr-7_驢胺基-4-曱基香豆素；Gly-Pro 7 -醯胺基-4 -甲基香豆素；Pro-Phe-Arg 7-醯胺基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-醯胺基-4-曱基香豆素；及N-戊二醯基-Gly-Arg 7- 酿胺基-4-甲基香豆素。可用作酶受質之二乙酿基螢光素之衍生物可包括二乙酸螢光素、二丁酸螢光素、二乙酸2，，'二氯螢光素、螢光素二（β-D-N-乙醯半乳胺糖）、螢光素二”①—半乳糖苷）、螢光素單（β-D-半乳糠普）及二月桂酸螢光素。當活性待❹j之指示酶$晴葡糖苦酶、月夷凝乳蛋白酶或脂肪酸醋酶時，可使用之榮光酶受質可分別為4_甲基傘形酮基+D·㈣糖m料苯丙錢_7__^ 甲基香豆素或庚酸4_甲基傘形_0旨。當活性待债測之^示酶為α-L-阿拉伯咬喃糖芽酶時，可使用之螢光酶受質 29 200831145 4-曱基傘形酮基-a-L_阿拉伯呋喃糖苷。當活性待偵測之指不酶為β-D-葡糖苷酶時，可使用之螢光酶受質可為仁甲基傘形酮基-β-D-葡萄糖苷。可使用之酶受質可為能經酶修飾以得到衍生發色團戋得到與另一化合物反應以得到*有不m強帛色之衍生考X色團之產物的發色化合物。發色化合物可不帶色或（例如）在顏色或強度方面與相應酶修飾之產物相比以截然不

同方式帶色。以比色儀器使用者所熟知之方式，可使用適當之激發及偵測波長使由酶修飾所產生之有色信號與可= 在之任何其他顏色分離。可用作酶受質之發色化合物可包括5冬4_氯_3_則基衍生物；硝基苯基衍生H丨㈣衍生物；㈣敗衍佳物0 可使用之5-漠-4-氯-3-叫卜朵基衍生物可包括乙酸5_漠 6-氯-3令朵西旨、乙酉复5·演冰氣_3_十朵醋、5_漠冰氯_3』可使用之確基苯基衍生物可包括對硝基紛及鄰确基紛衍生物。此等對德苯純生物可包括磷酸二乙基對石肖基 ^醋；填酸二-對項基苯醋；對硝基苯基1乙醯胺基_2_去氧-3-Ο-β-吡喃半乳糖基_β_葡萄吡喃糖苷乙酿胺…氧·β-葡萄，㈣；乙酸對上= ㈣喃半乳料、5_溴_4_氯_3_㈣基·^•二乙酉酯、5-漠_4-氯-3“弓卜朵基_卜〇_岩藻吡喃糖皆、％漠_4·氯< t朵基_p_dh㈣料、5_溴_4_氯_3_㈣基仙-葡^ 搭酸、磷酸5-漠-4-氯_3_顿旨及硫酸5_漠_4_氯_3化 30 200831145 硝基本基乙醯基U*·胺基葡萄糖苷；對硝基苯基-β-D-N’N 一乙^基幾丁二糖苷；對硝基苯基_心葡萄吼喃糖苷；對^基苯基^麥芽㈣；對石肖基苯基·β·麥芽糖f對石肖笨土 t南甘路糖苷；對硝基苯基〇比喃甘露糖苷；十四烷酸對硝基笨酯；棕櫚酸對硝基苯酯；磷酸對硝基苯酉曰，雙（對硝基苯基）磷酸酯；參（對硝基苯基）磷酸酯；對硝，本土 β葡甸比喃糖苷；對硝’基苯基葡萄糖酸酸；以_對硝基苯基甘油，對硝基苯基_心°比喃鼠李糖苷；硬脂酸對硝基笨酯；硫酸對硝基苯酯；對硝基苯基_2,3,4,6-四-〇-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷；對硝基苯基胸苷單磷酸酯；對硝基苯基-2,3,4-三乙醯基_卜葡糖醛酸甲酯；及戊酸對硝基苯酯。適用之鄰硝基酚可包括乙酸鄰硝基苯酯、鄰硝基苯基_ β-葡萄糖苷及鄰硝基苯基-β-D—葡萄吼喃糖苷。其他適用之硝基苯基衍生物可包括硝基苯基_β_岩藻π比喃糖苷；硝基苯基-α-吨喃半乳糖苷；硝基苯基_β_吼喃半乳糖苷；丁酸硝基苯酯；癸酸硝基苯酯；己酸硝基苯酯；辛酸梢基苯醋；月桂酸硝基苯酯；及丙酸硝基苯酯。可使用之吲哚酚衍生物可包括吲哚酚-乙酸酯；σ引噪紛 β-D-糖苷；3-吲蜂紛硫酸酯；及3_σ引蜂紛磷酸酯。可使用之酴酜衍生物可包括：酴酞二丁酸g旨；紛酜二磷酸酯；酚酞二硫酸酯；酚酞葡糖醛酸；酚酞單_β_葡糖苷酸（glucosiduronic aicd);盼酜單-β-葡糖駿酸；及齡酞單 ί粦酸g旨。 31 200831145 上述發色酶受質可與適當指示酶直接反應以產生發色團。若衍生酶修飾之產物進一步與諸如重氮化染料之發色試劑反應以產生發色團，則可使用含有1-萘基、2-萘基及祭基-AS-ΒΙ衍生物之其他酶受質，該等重氮化染料例如·· 重虱基笨甲醯胺基_2,5-二乙氧基苯、1-重氮基-4-苯甲醯胺基_2,5-二乙氧基苯、對重氮基-2,5-二乙氧基-N-苯甲 &基丙胺酸、氯化4_氯_2-甲基苯重氮鹽及鄰胺基偶氮甲苯重氮鹽。可使用之萘基衍生物可包括1-萘基-N-乙醯基-β-D- 胺基葡萄糖苷。

可使用之2-萘基衍生物可包括2-萘基-磷酸酯；2-萘基 2不基_辛酸醋；2_萘基-十四烧酸g旨；L_白胺醯奈基醯胺；L-纈胺醯基-2-萘基醯胺；L-胱胺醯基-2_ 不基H N-笨甲醯基-DL-精胺酸，2·萘基醯胺；N-戊二醯基苯丙胺酸2-萘基_胺；2_萘基_磷酸酯；6_Br_2_萘基-a-D_ —南半礼糖苷，萘基-β-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-2-D-葡气匕南糖苷，6-溴-2-萘酚-β-D-葡萄吡喃糖苷；6-溴_2_萘土 ^比南甘路糖苷；及2-萘基-a-L-岩藻吡喃糠苷。 ^可使用之奈基-AS-ΒΙ衍生物可包括萘基-AS-BI•磷酸 -曰，及奈基葡萄糖醛苷酸。、田/舌f*生待偵測之指示酶& 葡糖苷酶時，酶受質可二1肖基苯基_a_葡萄t喃糖皆。當活性待彳貞測之指示酶為 a心阿拉m糖㈣時，可使用之酶受質可為對確基苯 32 200831145 基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷。當活性待 w 田/石I王付1貝娜之指示酶為卜半乳糖苷酶時，酶受質可& $4Q π π又貝J為5·/昊-4_虱-3-吲哚基_3-]〇_吡喃半乳糖苷或4-甲基傘形酮喃半乳糖苷。了使用之酶受貝可視活性處於研究中之指示酶之特性而定。以下為多種酶受質及可與該酶受質反應以產生具有經明顯修飾或增加之螢光或顏色之產物的相應指示酶之列表。

_指示酶_ 醋酶醋酶脂肪酶 β-Ι>半乳糖苷酶 a-D-半乳糖皆酶 (x-D-勤糖苦酶 β-D-葡糖苷酶酯酶脂肪酶酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶酯酶 β-D-半乳糖芽酶 β-D·葡糖苦酶 a-D-葡糖苷酶 a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶白胺酸胺基狀酶 __酶受質___ 乙酸4-曱基傘形酮酯丁酸4-甲基傘形酮酯反油酸4-甲基傘形酮酯 4-甲基傘形酮基-β—D-n比喃半乳糖普 4-甲基傘形酮基-a-D-11比喃半乳糖普 4-甲基傘形酮基-a_D-葡萄吼喃糖香 4-曱基牟形酮基-β-D-葡萄π比喃糖苦庚酸4-甲基傘形酮酯油酸4-曱基傘形酮酯碟酸4-甲基傘形酮酯丙酸4-曱基傘形酮酯 4-甲基傘形酮基_β-0-半乳糖芽 4-甲基傘形酮基_β_ι>葡萄糖苷 4-甲基傘形酮基-a_D_葡萄糖芽 4-曱基傘形酮基-a-L-阿拉伯呋喃糖苷 L-白胺酸-7-醯胺基-4-甲基香豆素 33 200831145 7-戊二醯基-苯丙胺酸-7-醯胺基-4-甲基香豆素胰凝乳蛋白酶 D-蜜二糖 α-D-半乳糖苷酶磷酸對硝基苯酯鹼性磷酸酶或酸性磷酸酶乙酸對硝基苯酯脂肪酶鄰石肖基苯基-β-D-°比喃半乳糖普 β-D-半乳糖苷酶對硝基笨基-CC-D- ^比喃半乳糖普 a-D-半乳糖苷酶鄰硝基苯基-β-D-葡萄吼喃糖苷 β-D-葡糖苷酶對石肖基笨基-ct-D-葡萄σ比喃糖誓 a-D-葡糖苦酶對石肖基苯基- β-D-匍甸糖藤酸 β-D-葡萄糖醛酸苷酶對石肖基苯基阿拉伯咬喃糖苦 a-L-阿拉伯咬喃糖苦酶月桂酸對硝基苯酯酯酶十四烧酸對石肖基苯酉旨酯酶棕櫚酸對硝基苯酯酯酶磷酸對硝基苯酯二鈉鹽驗性填酸酶酚酞二丁酸酯酯酶酚酞二磷酸酯酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶酚酞二磷酸酯五鈉鹽酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶酚酞-β-D-葡萄糖醛酸鈉鹽 β-D-葡萄糖醛酸苷酶酚酞-β-D-葡萄糖醛酸 β-D-葡萄糖醛酸苷酶 L-苯丙胺酸乙酯鹽酸鹽胰凝乳蛋白酶苯基喃半乳糖苷 β-D-半乳糖苷酶苯基-β-〇_葡萄糖醛酸 β-D·葡萄糖醛酸苷酶苯基-β-D-葡萄吼喃糖苷 β-D-葡糖苷酶苯基-β-D-葡萄糖醛酸 β-D-葡萄糖醛酸苷酶 34 200831145 α-D-葡糖苷酶酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶酸性磷酸酶或鹼性磷酸酶酯酶脂肪酶 β-D-葡糖苷酶白胺酸纈胺酸胰凝乳蛋白酶磷酸水解酶脂肪酶脂肪酶脂肪酶脂肪酶酸性填酸酶或驗性磷酸酶 β-D-葡糖苷酶脂肪酶鹼性磷酸酶或酸性磷酸酶 β-D-葡萄糖醛酸苷酶脂肪酶/酯酶苯基-cc-D-葡词糖普 β-甘油磷酸鈉 1- 萘基磷酸鈉 2- 萘基磷酸鈉 2- 萘基-丁酸酯乙酸β-萘酯 6-Br-2-奈基-β-D-葡萄糖普 L-白胺酿基-2-奈基酿胺胺基狀酶 L -異纈胺醯基-2 -萘基醯胺胺基肽酶 Ν-戍二S&基-苯丙胺酸-2-奈胺萘基-AS-ΒΙ-磷酸酯吲哚酚乙酸酯 Ν-曱基吲哚酚乙酸酯 Ν-甲基吲哚酚十四烷酸酯 5-溴吲哚酚乙酸酯 3- 吲哚酚磷酸酯吲哚酚-β-D-葡萄糖苷乙酸5-Br-4-Cl-3-吲哚酯磷酸5-Br-4-Cl-3-吲哚酯 5-Br-4-Cl-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸二乙醯基螢光素當指示酶為β_半乳糖苷酶時，酶受質可包含5-溴-4-氯 -3 -σ引朵基-β · D -吼喃半乳糖苦（X - g a 1 ) 、5 · >臭-6 ·氯-3 - 0引ϋ朵基-β -σ比喃半乳糖苦（M a g - g a 1 ) 、5 - >臭-3 -σ弓| 13朵基 β - D - °比喃 35 200831145 半乳糖* (B—)、6-演-2_萘w南 6-氯-3-吲哚基_p_D_吡喃半乳糖苷、 β如比喃半乳料（Y-gal)、3,㈣- ^ } 碘_3_吲哚酚喊主乳糖苷、N-甲基吲哚酚喃+乳糖苷、2-硝基芏其β D-吡喃半乳糖苷（〇NPg ) 、土卜替（PNPG) 1 ^ 基4基·β_Ι>，喃半乳糖甘IPNPG)、苯基_p_D_吡喃硝基苯基-β-D-乳糖苷、4曱美人 ga 、2-氯_4· 苦、4-ΛΛ 傘㈣基·β·β⑽半乳糖

皆4-二氣甲基傘形酮基·p_D“比喃半乳㈣、榮光素 D_°比喃半乳糖苷）（FDG)、螢弁杳w β八 ’、(β Μ# . /〇螢先素早-β-D-吡喃半乳糖苷、 a先素一（β_Ι>_乙醯半乳胺糖）、4_ 乳糖普（Uet〇Pyranc)side)、2 q 如比喃經基4 .β如比喃半乳㈣、試_ t ^。⑽η ) β如比礼糖普、3·羧基傘形綱基ID-吡喃半乳糖苦、4_氯甲土 -6’8·二氟傘形明基_β_〇_π比喃半乳糖普、◎-二氣冰甲其 ^形嗣基仙· °㈣半乳料、6ϋ .4_十U基傘形^ 基-β如比喃半乳糖普、5_(五氟苯甲醯胺基）_螢光素仰· "比喃半乳糖普、C2-螢光素仙十南半乳糖苦、&榮光素 β如比喃半乳㈣、Ci2_f光素仙“比喃半乳料、5_氣甲基螢光素_β·Ι^喃半乳糖普、^•試南靈仰“比喃半乳 :苷7尹工基领-(1，3-二氯-9,9-二甲基11丫11定_2__)(1：)1)八〇) 或其兩者或兩者以上之混合物。，在已完成殺菌程序後，可使其上具有可在經歷殺菌程序後仍存在之遺傳設計之生物指示器中之任一者的載體U 或载體50與含有營養生長培養基、誘導體及酶受質之恢 36 200831145 復培養基接觸或置放於該恢復培養基中。視需要，恢復培養基可包含供給生物體發育、代謝及隨後長出之水性培養基或X性/合液。水性培養基或水性溶液可經缓衝。誘導體 :使生物扎不态中之抑制基因與媒介#(亦即，質體、病毋）解離。其可允許轉錄增譯發生，由此產生指示酶。指示酶可接觸酶受皙#ρ 又貝使仔可具有可偵測之顏色或螢光的經酶修飾之產物形成。

匕水性溶液或水性培養基中之酶受質之濃度可視酶受質及扣不酶之特性、須產生以便可在視覺上或由儀器偵測之酶it飾產物㈣里及判定指示酶是否存在所需之時間量而疋可充足之酶受質之量可為與可在已完成殺菌後存在之任何指示酶反應以使得可在至多$ 4小時之時期内產生至 y ^ 1〇 Μ之莫耳濃度及在一具體實例中在至多約2小時之時期内產生至少約1〇·8 Μ之莫耳濃度的酶修飾之產物所需的量。水性溶液或水性培養基中誘導體之濃度可在約丨至約 20% w/v之範圍内，且在一具體實例中在約ι至約5% 之範圍内，且在一具體實例中為約2% w/v。含有營養生長培養基、誘導體及酶受質之水性溶液、水性培養基之pH值可在約5至約9·5之範圍内，且在—具體實例中為約7.5。在已使生物指示器經受殺菌週期後，可將恢復培養基中之誘導體及酶受質與該生物指示器一起培育。培育可持績足以釋放可偵測量之酶修飾產物之時期且處於足以釋放 37 200831145 :偵：量之酶修飾產物的條件下，假定任一生物指示器保持力月“生&而5 ’可偵測之酶修飾產物的量可低達約 I，·15莫耳濃度。培育條件可足以產生至少約…心耳濃度之酶修飾產物’且在—具體實财產生、約！ X 1〇·、6 至勺 1 〇莫耳痕度之酶修飾產物。產生可偵測量之酿

修飾產物所需之培育時間及溫度可視指示酶及酶受質之把性及存在於恢復培養基中之其每-者之濃度而定。-心言’培育溫度可在約⑽至約贼之範圍内。培育時^可在至多約4小時之範圍内，且在一具體實例中在約。可使用之用於偵測酶修飾產物之通常適用之方法可勹括光度測定、電位測定、重量測定、熱量測定、電導測^ 或電流測定技術。可使用螢光法或分光光度法。舉例而言疋酶受質可包含4-甲基傘形酮基衍生物，其與指示酶相互作用可產生可以螢光法監測之傘形酮；或該受質可包含硝基酚或類似類型之衍生物，其與指示酶相互作用時可產生可以比色法監測之酶修飾產物。約4小時之範圍内，且在一具體實例中在約至約時之範圍内，且在—具體實财在約Q1至約2小時之範圍内’且在一具體實例中在約〇.2至約1小時之範圍内。儘管生物指示器在本文中主要根據單一指示酶來描述，但該生物指示器可提供複數種指示酶。舉例而言，^ 生物指不器可提供三種類型之指示酶，一種酶具耐熱性^ 第二種對氣體殺菌介質具有抗性，且第三種對珥研、例如 γ或β輻射）具有抗性。 38 200831145 所揭示之技術可提供許多優於先前技術之優勢。此等優勢可包括僅以信號產生策略為基礎獲得酶（例如p半乳糖苷酶），對於酶選擇並不始終需要使用機電讀取器之酶文質（例如5-溴-4-氯_3-吲哚基吡喃半乳糖苷或 gal )，及將無菌保證（細胞死亡）與測試生物體之總體遣傳成活力相結合。藉由將指示酶之作用限於信號產生，可使指示酶之敏感性與測試生物體之彼敏感性匹配或使兩者 _ 相關聯之需要得以消除。使用所揭示之遺傳設計之生物指示器的優勢可包括在相對短時期内提供殺菌是否有效之結果，該相對短時期在至夕約4小時之範圍内，且在一具體實例中在約〇. 〇 1至約 4小時之範圍内，且在一具體實例中在約〇·丨至約3小時之範圍内，且在一具體實例中在約〇1至約2小時之範圍内’且在一具體實例中在約〇·2至約1小時之範圍内。藉助於使用所揭示之遺傳設計之生物指示器，可能直接量測 _ ’則忒生物體之成活力，而非藉由間接量測代用分子來量測測試生物體之成活力。所揭示之生物指示器的使用可不限於任何特定殺菌方法。亦即，所揭示之生物指示器可用於任何殺菌程序。殺菌程序之有效性可使用所揭示之遺傳設。十之生物指示器來測定，而無需長出以提供殺菌有效性的最終確涊。藉由使用所揭示之生物指示器，可無需使用電化予感測益以判定殺菌是否有效，儘管以感測器可能更快速地獲得結果。所揭示之生物指示器可加以改良以在即時 °貝取應用（諸如晶片或感測器應用）之情況下使用。所揭 39 200831145 示之遺傳設計之生物指示器可適用於”最具抗性生物體、具臨床意義生物體或生物戰用生物體之任何程序。用於傾菌程序有效性之所揭示之遺傳設計之生物指示器的使用可涉及使用基於遺傳理論模型（僅活細胞可表現基因）之量測。所揭示之遺傳設計之生物指示器可回應任何致死事件或致死事件之組合（轉錄、轉譯等）。所揭示之生物指示器可對任何殺生作用模式（蒸汽、過氧乙，、二化乙烯、液體甲醛、氣體甲醛、穩定化液體過氧化，、瘵氣過氧化氫、乾熱、臭氧、鄰苯二甲醛、戊二醛、氯胺、四級胺、紛系物、顿（iGdQpWe)、電離輕射、紫外輕射、脈衝白光、電漿、微波輻射等）提供快速作用回應。使用所揭示之^眚值讯< 吓殉不之退傳5又δ十之生物指示器可提供在評估中在殺菌程序之前或期間無指示酶或受體分子（例如乳糖苷酶）存在之優勢。貫施例1 圖4中所說明之質體係藉由限制性消化基本質體且將 xylR調節4段連接至該基本諸來建構。確認X池調節 =基本片段正確連接後，對於bgaB基因片段與此基因 ± 1及12重複該過程。$成遺傳元件裝配且確認裝配及定向後’將質體插入宿主生物體中。該質體可稱作1號質體。 1 施貝體可使用若干方法在宿主生物體内使用轉型技術而内化4等方法可包括原生質體化、電穿孔、衝擊法、反 200831145 應力誘導、轉導或化學（氯化鈣）方法。對於此實施例，經由化學轉型使感受態大腸桿菌（五e〇/z·)轉型。將缺乏任何限制性系統之大腸桿菌儲存於_7〇它下。將大腸桿菌於冰上解凍且混合。使大腸桿菌在冰上暴露於〗號質體歷時 30为鐘。使所得大腸桿菌/質體混合物在42它下熱休克％私且轉移至冰浴歷時兩分鐘。接著將經加溫之培養基添加至大腸桿菌/質體混合物中且在3rc下培育6〇分鐘。將樣 _ ^置放於含有抗生素及X-gal之瓊脂盤上。顯示藍色之菌落係經成功轉型。复I例3 使枯草桿菌在含有〇·5 M山梨糖醇之lb液體培養基中生長隔夜，在具有〇·5 Μ山梨糖醇及〇·5 M甘露糖醇之命办重里/〇甘油中洗滌三次，且在1號質體存在下使其經受电牙孔。電穿孔在一定範圍電壓（18〇〇_25〇〇 v)下進行。使所得生物體在培養基（具有0.5 M山梨糖醇及〇·5 “甘 • 露^醇之LB液體培養基）中恢復且使其纟37Χ下恢復三 ^恢復後，將生物體置放於含有抗生素之LB瓊脂盤乂便選擇經轉型之生物體且將其在37它下培育。將顯示迅長之菌落置放於含有誘導體（2重量％木糖）、選擇性 :口己（5 mg/mL 氯黴素）及 X-gal ( 80 mg/mL· )之 LB 瓊脂後上。在此等瓊脂盤上顯示藍色之菌落係經成功轉型。 ,使用以下方法使經轉型之枯草桿菌形成孢子。使營養超栝草杯菌（5· 之等分試樣散布於整個瓊脂培養邊中。將璦脂盤在饥下培育五天。培育後，將生物體自 200831145 瓊脂表面無菌回收且使用相差顯微鏡評估孢子形成。使用前將内生孢子洗滌數次。實施例4 將經轉型之枯草桿菌孢子直接接種至由不同物質 (Lexan、Huntsman P4G4Z-011、Huntsman P4C6Z-D59 及 Exxon PD9465E1，及200 微胞）製造之數個SCBI小瓶底部上且經空氣乾燥隔夜。使用經轉型之枯草桿菌之1 〇1 2 3 4 cfu/mL孢子懸浮液之1 0 pL等分試樣用於接種。緊接在乾燥經接種之孢子懸浮液後且在培育前，將1 mL具有2%木糖之LB液體培養基添加至Lexan、Huntsman及Exxon物質中。將100 pL具有2重量％木糖之LB液體培養基添加至微胞中。 LB液體培養基具有以下配方：去離子水 800 mL NaCl 10 g/1 胰化蛋白脒 10 g/1 酵母提取物 5 g/1 木糖 20 g/1 去離子水提供 1公升之最終體積 42 1 N NaOH用於將pH值調整至7.0 2 緊接在添加生長培養基後，將100 pL於N，N-二曱基 3 甲醯胺（DMF )中之200 pg/mL 4 -甲基傘形酮基- β-D-半乳 4 糖苷（MUG)添加至樣本（對於微胞而言10 pL )中。將每一樣本置放於在371恒溫箱中預加熱之Turner Modulus 200831145 中。以UV螢光模式操作Turner Modulus。每分鐘評估由自生長生物體產生之β-半乳糖苷酶所引起之受質經酶轉化而產生之螢光，歷時3小時。螢光增加指示β-半乳糖苷酶產生。結果如下：培育時間（min) 樣本 60 min 90 min 120 min 180 Lexan 0.8716 0.8679 0.8677 0.8680 Huntsman P4G4Z-011 0.8399 0.8386 0.8386 0.8384 Huntsman P4C6Z-D59 0.8497 0.8448 0.8423 0.8428 Exxon 0.8470 0.8437 0.8425 0.84431 微胞 0.8696 0.8697 0.8735 — 螢光數據係經正規化。實施例5 使用紫外可見分光光度計評估自於具有各種濃度木糖之LB生長培養基中生長之經轉型枯草桿菌產生之β-半乳糖普酶的量。評估以下組合：僅LB液體培養基含有1重量％木糖之LB液體培養基含有2重量％木糖之LB液體培養基含有3重量％木糖之LB液體培養基使用以下程序。將9 mL之每一培養基-木糖組合轉移至無菌燒杯中。將1〇8 cfu/mL經轉型枯草桿菌孢子之1 mL 等分試樣轉移至每一燒杯中以得到1 〇7 cfu/mL枯草桿菌孢子之初始起始濃度。將每一樣本在37°C下培育6.5小時以使得充足β-半乳糖苷酶產生得以發生。培育後，將每一樣 43 200831145 ’ 本經由0.45 μιη HV Durapore過濾器過濾。在室溫下在紫外-可見透光管中使每一樣本之1 mL等分試樣與1.0 mg/mL 0NPG (於磷酸鹽缓衝液中）溶液之11111^等分試樣反應30 分鐘。在420 nm下進行每一樣本之吸光度量測。吸光度結果如下：培養基 420 nm下之吸光度僅LB液體培養基 0.002 具有1重量％木糖之LB液體培養基 0.075 • 具有2重量％木糖之LB液體培養基 0.113 具有2重量％木糖之LB液體培養基 0.067 較高吸光度值與較高β-半乳糖苷酶產生具有相關性。實施例6 將經轉型之枯尊桿菌孢子懸浮液之樣本接種至200 pL 微胞中以得到以下孢子群體：1〇6、1〇4、1〇2、10G cfu/微胞。將100 pL具有2重量％木糖之LB液體培養基及10 μί於 DMF中之100 μg/mL MUG添加至每一經接種之微胞中。 φ 將每一樣本置放於37T：下之Turner Modulus中且每分鐘進行螢光量測歷時2小時。螢光增加指示β-半乳糖苷酶產生。結果如下：培育時間（min) 群體 15 30 45 60 90 120 106 cfu 0.8566 0.8465 0.8530 0.8549 0.8636 0.8708 104 cfti 0.8797 0.8705 0.8770 0.8751 0.8790 0.8841 102 cfli 0.8617 0.8516 0.8515 0.8588 0.8648 0.8699 10° cfu 0.9167 0.9019 0.9009 0.8977 0.8984 0.9016 螢光數據係經正規化。 44 200831145 ' 實施例7 將1 08 cfu/mL經轉型之枯草桿菌孢子之10 pL等分試樣轉移至四個200 μΐ微胞中之每一者中。將所得經接種之微胞經空氣乾燥。將100 pL具有2重量％木糖之LB液體培養基添加至每一樣本中。接著添加1 〇 pL之適當濃度 MUG。評估以下MUG濃度：，

1.0 mg/mL 5 00 pg/mL • 200 pg/mL 100 μ§/Μ1 所有MUG溶液含有溶解於DMF中之MUG。將MUG 溶液添加至微胞中後，將微胞置放於Turner Modulus中且在恆溫箱中預加熱至37°C。每分鐘進行螢光量測歷時120 分鐘。螢光增加指示β-半乳糖苷酶產生。結果如下：培育時間（min) MUG濃度 15 30 45 60 90 120 1 mg/mL 0.9100 0.9003 0.8955 0.8926 0.8955 0.9003 500 pg/mL 0.8867 0.8852 0.8935 0.8959 0.9011 0.9094 200 pg/mL 0.8513 0.8562 0.8588 0.8602 0.8659 0.8726 100 pg/mL 0.8643 0.8694 0.8721 0.8754 0.8807 0.8870 螢光數據係經正規化。儘管所揭示之技術已關於特定具體實例加以說明，但應瞭解，其各種修改對熟習此項技術者在閱讀本說明書後將變得顯而易見。因此，應瞭解，本文中所揭示之本發明意欲涵蓋屬於隨附申請專利範圍之範疇内的該等修改。 45 200831145 IL圖式簡單說明】式中，類似部件及特徵具有類似參考符號。的質體構築體之圖。揭不之遺傳設計之生物指示器圖4為實施例！中所使用之質體構築體之圖。

。。圖5可用⑨支撐所揭#之生物指#器之殺菌指示裔之圖解說明的平面圖。圖6為圖5中所描繪之殺菌指示器之側面正視圖之知說明。 ° 圖7為一用於測定殺菌有效性之殺菌指示器之分解圖解說明，該殺菌指示器含有兩個隔室，前述生物指示器係置於一隔室中且至少一種誘導體及至少一種酶受質係置於另一隔室中。【主要元件符號說明】 10 : 殺菌指示器 12 ：載體 14 : 第一表面 16 : 第二表面 20 : 支撐體 22 : 第一部分 24 ：第二部分 30 : 遺傳設計之生物指示器 46 200831145 40 :殺菌指示器 42 :楔形管 43 :環隙 44 :内部隔室 46 :封帽 48 :突出物 50 :載體

47

Claims

200831145 十、申請專利範圍： 1. 一種遺傳設計之生物指示器，其包含：至少一種測試生物體及至少一種適合於產生指示酶之報導基因’該報導基因係由該測試生物體吸收；及至少一種在使該報導基因暴露於至少一種誘導體前抑制该報導基因表現之抑制基因。 2·如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中使用至少一種質體及/或至少一種病毒使該報導基因及該抑制基因由該測試生物體吸收。 3 ·如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含一或多種細菌、病原體、革蘭氏陰性生物體、革蘭氏1%性生物體、營養性生物體（vegetative organism )、病毋、非自我複製劑、亞細胞組份（sub_cellular c〇mp〇nent ) 或細胞產物，及/或朊病毒 (prion)。 4·如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含細菌孢子。 5·如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含桿菌（5acz7/w)、芽孢桿菌或梭菌（C/osirz·山·α)屬之細菌。 6·如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含嗜熱脂肪牙抱桿菌Q Geobacillus stearothermophilus )、枯草芽孢桿菌黑色變種（心以//似 atrophaeus )、枯草桿菌（)、球形芽孢桿囷{Bacillus sphaericus )、反痕芽胞桿菌 Q Bacmus 48 200831145 ⑽咖沉/5 )、短小芽孢桿菌（方心"似户謂"似）、凝結芽抱桿菌（5⑽//⑽〔⑽㈣編）、生孢梭菌（c/⑽介油·謂 sporogenes)、難養芽胞後菌（a〇stridium difficUe)、肉毋敎h i Clostridium botulinum、、球形變異枯草桿菌 (BaciHus subtilis gl〇bigii)、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cerew)、環狀芽孢桿菌（召以出似、大腸桿菌 α/ζ·)或其兩者或兩者以上之混合物。

7·如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含真菌、分枝桿菌、原蟲、營養性細菌（vegetabie bacteria)或其兩者或兩者以上之混合物。 8 _如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含黑麵徽（)、白色念珠菌 (Candida albicans )、髮瘡小芽胞癣菌{Trichophyton mentagrophytes)、良炎L 氏氬{Wangiella dermatitis)、龜分枝桿菌（Mj/cohcierz’wm e/ze/cmae )、戈氏分枝桿菌 (Mycobacterium gordonae ) 、包皮垢分枝桿菌 (Mycobacterium smegamatis ) 、土地分枝桿菌 (Mycobacterium terrae^)、牛分枝桿菌（ bovis )、結核分枝桿囷（)、梨形鞭毛蟲（)、微小隱孢子蟲 (Ο乂parvwm )、嗜水產氣單細胞菌（ hydrophila )、糞腸球菌（)、糞鏈球菌{ Streptococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium )、膿鍵球菌(Streptococcus pyrogenes )、大腸 49 200831145 桿菌、克雷伯氏桿菌（昃仏心)(肺炎克雷伯氏桿菌 (Klebsiella pneumoniae ))、嗜肺性退伍軍人桿菌 (Legionella pneumophila)、f 基桿溘（Methylobacterium)、綠膿桿菌i Pseudomonas aeruginosa)、豬霍亂> 沙門氏菌 (Salmonella choleraesuis )、幽門螺旋桿菌（

)、抗幸昌射微球菌（似）、抗輕射奇異球菌（⑽$ )、金黃色葡萄球& ( Staphylococcus aureus )、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis )、嗜麥寡養食單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)氙其兩者氙兩者以上之混合物。 9 ·如申明專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含營養性細菌、營養性細胞（vegetaMe ceu)及/ 或其組成部分。 10·如申請專利範圍f i項之生物指示器，其中該測試生物體包含嗜水產氣單細胞菌、糞腸球菌、糞鏈球菌、原 1囷、膿鏈球菌、大腸桿菌、1雷伯氏菌（肺炎克雷伯才干菌）曰肺性退伍軍人桿菌、甲基桿菌、綠腹桿菌、豬霍亂沙門氏菌、幽門蟫斿护片八廿么4 Μ # # η螺疑柃囷、金頁色葡萄球菌、表皮葡甸球囷、嗜麥寡養食單胞菌或其兩者或兩者以上之混合物。 π 口 11.如申請專利範圍第i項之生物指示器生物體包含抗萬古徽各β ，、肀》亥測美 # 4 、致素％球菌、抗二曱氧苯青黴素金音色 «3萄球菌、龜分枝桿菌 ' 仵囷（场;akci⑺·㈣e/zeZ〇"z·)或其雨 50 200831145 者或兩者以上之混合物。 12.如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該測試生物體包含一或多種朊病毒。 13 ·如申請專利範圍第i項之生物指示器，其中該報導基因包含lacZ、bgaB、xylE、cat、gfp或其兩者或兩者以上之混合物。 14·如申請專利範圍第i項之生物指示器，其中指示酶係由该報導基因產生，該指示酶包含卜;Q-半乳糖苦酶、β_ D-葡糖苷酶、a-D-葡糖苷酶、鹼性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯黴素乙醯基轉移酶、兒茶酴-2,3-雙加氧酶、十四烷酸脂肪酶、白胺酸胺基肽酶、類胺酸胺基肽酶、胰凝乳蛋白酶、磷酸水解酶、a-D_半乳糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N_乙醯基♦胺基葡萄糖苷 S#、β-D-纖維二糖普酶（β-D-cellobiosidase )、丙胺酸胺基狀酶、脯胺酸胺基肽酶、酪胺酸胺基肽酶、苯丙胺酸胺基肽酶、β-D-葡萄糖醛酸苷酶、脂肪酸酯酶或其兩者或兩者以上之混合物。 15.如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該報導基因包含lacZ且該指示酶包含β-D·半乳糖芽酶。 16·如申請專利範圍第丨項之生物指示器，其中該抑制基因包含xylR、lacI、tetR或其兩者或兩者以上之混合物。 17.如申s青專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含報導基因及抑制基因。如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體 51 200831145 包含lacZ基因及XyiR基因。 19,如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含環形雙股DN A。 20·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體為線性質體。 21.如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體之大小係在約2000個至約2〇〇〇〇個鹼基對之範圍内。 22·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該測試生物體之單一細胞吸收該同一質體之1個至約3〇〇〇個複 ° 23 ·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含一或多個充當複製起點之DNA序列。 24·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含一或多個遺傳標記。 25 ·如申请專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含一或多選殖位點。 26_如申請專利範圍帛2項之生物指示器，其中該質體包含-或多個提供選擇性標記以誘導㈣以生物體保持該質體之基因。 27. 如申响專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含至少-個複製起點、至少一個選擇性標記基因、至少一個誘導性啟動子及至少一個報導基因。 28. 如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含兩個複製起點。 52 200831145 29·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體包含革蘭氏陰性複製起點及革蘭氏陽性複製起點。 30’如申句專利範圍第2〇項之生物指示器，其中該革蘭氏陰性複製起點包含女g^ 大知杯囷，且该革闌氏陽性複製起點包含枯草桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌黑色變種或其兩者或兩者以上之混合物。 31·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體 • &含抗±素抗性基因及/或具有外源性營養能力（nutriti〇nai capability )之基因。 32.如申晴專利範圍第2項之生物指示器，其中該質體匕s氯彳放素、胺苄青黴素或觀黴素抗生素基因及/或木糖、乳糖或胺基酸營養基因。 33·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該病毒 "* ’ 種包$由衣设壤繞之核酸的基因轉運體（gene transporter) 〇 % 34·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該病毒包含至少一種噬菌體。 3 5 ·如申請專利範圍第2項之生物指示器，其中該病毒包含λ或M13嗟菌體。 36·如申請專利範圍第1項之生物指示器，其中該誘導體包含木糖、異乳糖、異丙基硫代半乳糖苷、金屬硫蛋白或其兩者或兩者以上之混合物。 3 7 · —種殺菌方法，其包含：將待殺菌之物件及如申請專利範圍第1項之生物指示 53 200831145 器暴露於殺菌介質。勺八p ㈣国弟37項之方法’其中該殺菌介質包含条八、乾熱、輻射、 .^ ^ ^ A 电水、一或多種氣體殺菌劑及/或一或多種液體殺菌劑。 39·如申請專利範圍第勹入帝n > 37項之方法，其中該殺菌介質匕έ包子束幸备射、電磁輻射 > _、a " 钿射、丫輻射、β輻射、氧化乙烯、虱體過氧化氫、液體過氧、5 匕氣、？田馬林（formalin )、戊

二酸及/或過氧乙酸。 4〇.-種用於測定殺菌有效性之方法，其包含： V们待权菌之物件及包含如申請專利範圍第1 項之生物指示器的殺菌指示器暴露於殺菌介質；及使該殺菌指示器與至少—種誘導體及至少—種酶受質接觸以測定該殺菌之有效性。人41 _如申清專利範圍帛40項之方法，其中該誘導體包 3木糖K糖、I丙基硫代半乳糖苦、金屬硫蛋白或其兩者或兩者以上之混合物。八42·如申請專利範圍第40項之方法，其中該酶受質包 2 : 一或多種螢光4-甲基傘形酮基（methylumbeUiferyl) I生物；一或多種7_醯胺基_4_甲基_香豆素衍生物；一或乙酉血基舍光素竹生物，胺榮（fluorescamine );或其兩者或兩者以上之混合物。 43·如申請專利範圍第4〇項之方法，其中該酶受質包 ^ 曱基傘形酮基-2-乙醯胺基-4,6-〇-亞苄基_2_去氧-β-D-«萄吡喃糖苷；乙酸4_曱基傘形酮酯；4_甲基傘形酮基_N_ 54 200831145 η 乙醯基-β-D-胺基半乳糖苷；4-甲基傘形酮基-Ν-乙醯基-α_ D-胺基葡·萄糖苷；4-甲基傘形酮基乙醯基-β-D-胺基葡萄糖苷，2’-(4-甲基傘形酮基）_a_D-N-乙藤基神經胺糖酸； 4-甲基傘形酮基_a_L_阿拉伯呋喃糖苷；和甲基傘形酮基_a_ L-阿拉伯糖苷；丁酸4胃甲基傘形酮酯；4-甲基傘形酮基 D_纖維二糖苷（eellobioside ) •，甲基傘形酮基-β-ϋ-Ν，Ν^ 一乙酿基幾丁二糖苷（chit〇bi〇side);反油酸4-甲基傘形 • S同醋；4-曱基傘形酮基_β-Γ)_岩藻糖苷；‘曱基傘形酮基_a_ L-岩藻糖苷；4-曱基傘形酮基_p_L_岩藻糖苷；4_甲基傘形酮基-a-D-半乳糖苷；4_甲基傘形酮基半乳糖苷；4_甲基傘形酮基-a-D-葡萄糖苷；4-甲基傘形酮基-p_D_葡萄糖苦’ 4-甲基傘形酮基_p_D_葡萄糖酸酸苦；對胍基苯甲酸心甲基傘形酮酯；庚酸4_甲基傘形酮酯；4_曱基傘形酮基_以一 D-吡喃甘露糖苷；4_甲基傘形酮基吡喃甘露糖苷；油酸4-甲基傘形酮酯；棕櫚酸4_曱基傘形酮酯；磷酸甲基藝傘形酮酯；丙酸4_甲基傘形酮酯；硬脂酸4_曱基傘形酮酯；硫酸4-甲基傘形酮酯；4_甲基傘形酮基u_n，n，n"_三乙醯基幾丁三糖；4，-甲基傘形酮基-^^三-^苯甲醯基-以氺-阿拉伯呋喃糖苷；氯化4-甲基傘形酮基_β_三甲基銨肉桂酸酯；肛甲基傘形酮基木糖苷；或其兩者或兩者以上之混合物。 44.如申請專利範圍第4〇項之方法，其中該酶受質包含：L-丙胺酸_7_醯胺基_4_曱基香豆素；L_脯胺酸_7_醯胺基-4-甲基香豆素；L_酪胺酸_7_醯胺基_4_甲基香豆素.l_ 55 200831145 白胺酸-7-醯胺基_4_甲基香豆素；^苯丙胺酸_7_醯胺基曱基香豆素，7 -戊二醯基_苯丙胺酸-7-醯胺基-4-甲基香豆素’或其兩者或兩者以上之混合物。

45 ·如申請專利範圍第40項之方法，其中該酶受質包含：N-t-BOCMle-Glu-Gly-Arg 7-醯胺基-4_曱基香豆素；N_ t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg 7-醯胺基-4·甲基香豆素；n_CBz_ Phe-Arg 7-酸胺基_4_甲基香豆素；pro_phe-Arg 7-醯胺基曱基香豆素，N-t-BOC-Val-Pro-Arg 7-醯胺基甲基香豆素，N-戊二醮基_Giy-Arg 7_醯胺基_4_曱基香豆素；或其兩者或兩者以上之混合物。八46.如申請專利範圍第4〇項之方法，其中該酶受質包 ^ 乙酉欠金光素、螢光素二（β-D-σ比喃半乳糖普）、二月方土酸k光素或其兩者或兩者以上之混合物。 α 仏如甲請專利範圍帛40項之方法，其中：該酶包含 D-葡糖苷酶、胰凝乳蛋白酶或脂肪酸酯冑；且該酶受質包含衣4-甲基傘形酮基·α·!)_葡萄㈣、7•戊二醯基苯丙胺酸 •7-醯胺基_4_甲基香豆素或庚酸4_甲基傘形酮酯。如申請專利範圍第40項之方法，其中：該酶包含 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶；且該酶受質包含扣甲基傘形酮基· a-L_阿拉伯呋喃糖苷。土如申請專利範圍第40項之方法，其中：該酶包含 β-D-葡糖㈣；且該酶受質包含4•甲基傘形酮基仙-葡萄糖皆。該酶受質 50·如申請專利範圍第40項之方法，其中 56

200831145 包含-或多種5，_4·氯苯基衍生物；―或夕丨木基何生物；一或多種硝基物；或其兩者或兩者广木酚衍生物；-或多種酚酞衍生啤考从上之混合物。 .如申請專利範圍第4〇含乙酸5-“_氯_31#、員之方去，其中该酶受質包溴-4-氯-3令朵齡、"乙酸5_漠-4-氯-3-吲哚酯、5-1，3-二乙酸酿、5_淳…千孔糖* 5”臭-4-氯I吲哚基- 漠-4-氯I，基仙 Ρ Μ比南糖普、5- β-D·葡糖㈣、磷酸5_、享4 /料、5_溴_4·氯·3令朵基· 3侧或其兩者或兩者以上之混合物。、乳_ 人二·如中請專利範圍f 4()項之方法，其中該酶受質包或夕種對確基紛街生物；一或多種鄰确基齡衍生物；或其兩者或兩者以上之混合物。八M·如申凊專利範圍第40項之方法，其中該酶受質包 ^ ^ ^ 一乙基對硝基苯酯；磷酸二-對硝基苯酯；對硝基苯基-2-乙醯胺基_2_去氧-np-n比喃半乳糖基_β_葡萄响喃糖苷；對硝基笨基_2_乙醯胺基-2_去氧_β_葡萄吡喃糠苷；乙酸對硝基苯酯；對硝基苯基_Ν_乙醯基-p — D-胺基葡萄糖苦，對硝基苯基-p-D-N，N，-二乙醯基幾丁二糖苷；對硝基苯基-α-葡萄。比喃糖苷；對硝基笨基麥芽糠苷；對硝基笨基-β-麥芽糖苷；對硝基苯基-心吡喃甘露糠苷；對硝基苯基-β-咄喃甘露糖苷；十四烷酸對硝基苯酯；棕櫚酸對硝基苯酯；磷酸對硝基苯酯；雙（對硝基苯基）磷酸酯；參（對硝基笨基）磷酸酯；對硝基苯基-β-葡萄u比喃糖苷；對硝基 57 200831145 苯基-β-葡萄糖經酸；α_對硕基苯基甘油；對硝基苯基心比喃鼠李糖L硬脂酸對石肖基苯醋；硫酸對確基苯酉旨；對石肖基苯基-2,3,4,6-四乙醯基_β_胺基葡萄糖苷；對硝基苯基胸普單鱗酸酉旨，·對石肖基苯基_2,3,4-三·〇_乙酿基_卜葡糖路酸甲醋；戊酸對硝基苯酯；或其兩者或兩者以上之混合物。

.54•如申請專利範圍第4〇項之方法，其中該酶受質包 3 .乙酸鄰硝基苯酯；鄰硝基苯基葡萄糖苷；鄰硝基苯基比喃糖普；石肖基苯基·α_^半乳糖芽·確基苯基-β-吡喃半乳糖苷；丁酸硝基苯酯；癸酸硝基苯酯·己酸石肖基苯酯；辛酸石肖基苯醋；月桂酸石肖基苯醋；丙酸石肖基苯酯；吲哚酚·乙酸酯；吲哚酚_p_D_葡萄糖苷；％吲哚酚硫酸醋’· 3.f朵㈣酸自旨；盼酞二丁酸醋；盼酞二麟酸醋；酚酞二硫酸酯；酚酞葡糖醛酸；酚酞單_β_葡糖苷酸 (glUC〇Sidur〇nicaicd);酚酞單·卜葡糖醛酸；及酚酞單磷酸酯；1-重氮基-4-苯甲醯胺基_2,5_二乙氧基苯；卜重氮基_ 4_苯甲醯胺基-2,5-二乙氧基苯；對重氮基_2,5_二乙氧基_ν· 苯甲醯基丙胺酸；氯化4_氯_2.甲基苯重氮鹽；鄰胺基偶氮曱苯重氮鹽；1-萘基-Ν-乙醯基_p_D，基葡萄糖苦；2_萘基 -磷酸酷；2-萘基-丁酸醋；2_萘基_辛酸醋；2_萘基-十二二酸酯；L-白胺醯基-2-萘基醯胺；L_異缬胺醯基_2_萘基醯胺； L-胱胺醯基-2-萘基醯胺；料甲酿基视_精胺酸蔡基醯胺；N-戊二醯基-苯丙胺酸2_萘基_胺；2_萘基-碟酸酿； Br-2-萘基-a.D·吼喃半乳㈣；2_萘基·β_Μ喃半乳糖苦； 2-萘基-2-D-葡萄吼喃糖普；6备2_萘㈣_D_葡萄吼喝糖 58 200831145 苷；6-溴-2-萘基-2-D-吡喃甘露糖苷；2_萘基_a_L_岩藻吡喃糖苦；萘基-AS-Bl·碟酸醋；蔡基·AS_m_p_D_葡萄糖脊酸；或其兩者或兩者以上之混合物。 A如申請專利範圍帛4()項之方法，其中該酶包半乳糖㈣，且該_受f包含5务4务3令錄喃半乳糖苷。 b 其中該酶包含β_ _ 比喃半乳 56.如申請專利範圍第4〇項之方法，

半乳糖苷酶，且該酶受質包含‘曱基傘形糖苷。 3/.如甲睛專利範圍第人你 <日不句半乳糖苷酶，且該酶受質包含5_溴_4_氯 Γ::乳糖h 5·漠―引鄉^ 二“6基喃半乳糖苷、6_溴萘基仙，喃半令十朵基·叫°比喃半乳糖苦、3^㈣n η比料乳糖普、5冬3令朵朌仙“比喃半乳糖苦、㈣美 IL # ^^ ^ ^ 'p'D'otb ^ ^ ^为基本基仙-°比。南半乳糖芽、苯基-β如比畴半乳糖 :二氯Μ基苯基例糖芽、…伞心二乳μ、4·三氟甲基傘形酮基·β·κ料乳糖芽、二=-D:T乳㈣)、螢光素單―南半乳糖素一㈣_乙釀半乳胺糖）、心f基傘形· °比。南乳糖芽（lactopyranoside)、2_ 土仙- 苷、Si A d 不基-P'D “比喃半乳糖皆W基㈣仙吼喃半乳糖苦、試MAS⑽㈤比喃半讀_、3•羧基㈣縣仰，料乳糖普、 59 200831145 4-氯甲基㈣料仙十 4·甲基伞形叫—半乳㈣、心：二氣· 傘形酮基仙+南半乳糖七燒基 R η⑽士，（五亂本甲酸胺基:l·罄氺喜 -β如比喃半乳糖m光素仙_吨喃半）鸯先素光素-β-Dd比喃半乳糖苷、c ^ . ' C8-螢 5-氯甲美螢#去《 n 12蚤先素仙-°比喃半乳糖苷、、土蚤先素^_吡喃半乳糖苷、半乳糖# e / 4、 α 12 Α自莖·β-ι>_%喃牛礼搪*及/或7_經基卿，3

酮）。， Τ暴吖啶-2- 58. 一種殺菌指示器，其包含：載體，該载體具有一第一表面及一第面一支撐體，該支撐體具有―第—部分及—第—评分 :載體覆蓋於該支撐體之該第-部分上，該載體之該第表面係黏附於該支撐體之該第一部分；及由該载體支撐之如申請專利範圍第〗 ::擇體之該第二部分具有足夠尺寸以允許二 /物扎不态之情況下操縱該殺菌指示器。 59·一種殺菌指示器，其包含： —一含有如申言青專利範圍帛"員之生物指*器的第一隔室，該第一隔室適於在殺菌期間允許該生物指示器與殺介質接觸；及一含有至少一種誘導體及至少一種酶受質之第二隔室，該第二隔室適於在殺菌期間維持該誘導體及該酶受質舁4生物指示器分離，且該第二隔室適於在已將該生物指不為恭路於該殺菌介質後允許該誘導體及該酶受質與該生 200831145 物指示器接觸。十一、圓式：如次頁。

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