CN110862932B - 一种促进植物生长的黑曲霉sicu-33及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进植物生长的黑曲霉SICU‑33及其应用，本发明公开的一株黑曲霉(Aspergillus niger)SICU‑33，其保藏编号为CCTCC NO：M2019778，其ITS序列为SEQ NO.1。该菌株不仅可以明显抑制植物病原真菌的生长，还能促进植物生长，提高玉米的叶片数、茎粗、最大叶宽、最大叶长、叶鲜重、根鲜重、根长和叶面积，具有很好的应用前景。

Description

一种促进植物生长的黑曲霉SICU-33及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种黑曲霉菌株，特别为一种促进植物生长的黑曲霉SICU-33及其应用。

背景技术

青稞是禾本科大麦属作物，裸大麦的一种，西藏是种植青稞的主要地区，西藏青稞种植土pH较高，大部分地区的土壤pH值在7.6-8.5之间，高于青稞最佳生长pH需要；另外，西藏地区日照时间长，水分蒸发快，土质和肥力也普遍较差，67.89％的农田土壤为沙壤土，土质松散，通气透水，宜于耕作，但保肥、保水力差。因此，培肥藏区青稞种植土的土壤地力，对于提高青稞产量和品质、满足藏区人民粮食需求，并为进一步提高藏区人民生活水平具有重要意义。

由于长期施用单一肥料或部分施用高氮复合肥，导致青稞种植土壤耕作层降低、土壤板结、贫瘠，耐极端天气能力急剧下降，土壤肥力持续下降、青稞产量和品质也不断降低。因此，改进现有施肥方式，增施有机质含量高的新型肥料、革新现有有机肥生产配方、挖掘抗性更强、促生能力更高的本土型PGPR高效菌株制作成高效微生物菌剂或研发新型生物有机肥产品对于培肥藏区青稞种植土壤、提高青稞产量和品质、增加藏区农牧民经济收入具有重要价值。

根际是植物生态系统和土壤生态系统交叉形成的特殊区域，植物根际土壤中含有大量的微生物，一类对植物生长有害，一类可以促进植物的生长。能促进植物的生长，防治病害，增加作物产量的微生物被称为植物根际促生菌(PGPR)。目前关于PGPR菌株的研究，人们主要是集中于研究PGPR细菌和放线菌，而关于具有PGPR功能的高效真菌菌株的分离鉴定和筛选尚不多见。因此以青稞根际土为分离材料，进行PGPR真菌的分离筛选和鉴定，研发新型PGPR复合菌剂并进一步开发具备田间应用价值的新型生物有机肥具有重要应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株促进植物生长的黑曲霉SICU-33，以及该菌株的用途，该菌株可以促进植物的生长，抑制植物病原真菌。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明从西藏青稞(藏青2000)根际土中分离得到一株黑曲霉(Aspergillusniger)SICU-33，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2019年10月8日；保藏编号为CCTCC NO：M2019778。

所述的黑曲霉SICU-33的ITS序列为SEQ NO.1。

本发明提供了所述的黑曲霉SICU-33在植物病害生物防治中的应用，所述的植物病害为小麦赤霉病菌、稻瘟病菌和西瓜枯萎病菌引起的植物病害，所述的植物为禾本科作物。

本发明还提供了所述的黑曲霉SICU-33在作为制备防治禾本科作物病害药物中的应用，其可以通过常规的液体或固体培养，获得包括真菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂；所述的禾本科作物为水稻、玉米、甘蔗、小麦、大麦或牧草。

本发明所述的黑曲霉SICU-33防治植物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为黑曲霉SICU-33的菌悬液或发酵液或代谢产物制备的农药制剂。

本发明还提供了所述的黑曲霉SICU-33在促进植物生长方面的应用，同时黑曲霉SICU-33在作为制备植物生长调节剂的应用也在本发明的保护范围内。

本发明的有益效果为：

本发明提供的黑曲霉SICU-33可以促进植物的生长，其IAA产量为52.13±0.46mg/L，同时对小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌和稻瘟病菌有拮抗效果。该菌株作为禾本科植物的生物制剂材料，无论开发新的生物防治菌剂还是生长调节剂，都具有很好的市场前景。

附图说明

图1本发明中不同PGPR菌株在盆栽试验中对玉米苗期素质的影响；其中，CK为无菌水；SICU-9和SICU-33接菌处理；

图2是本发明中不同PGPR菌株在盆栽试验中对玉米地上部分植株和地下部分根系的影响；其中，CK为无菌水；SICU-9和SICU-33接菌处理。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1黑曲霉SICU-33的分离与鉴定

1.1菌株来源

本实施例土壤取于西藏自治区隆子县隆子镇叶巴村。随机采集青稞根际土壤，装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，及时带回实验室，置于-20℃冰箱保存。

1.2土壤真菌的分离

将解冻后的土样进行10倍系列稀释后接种于马丁氏培养基平板中，在28℃倒置培养7d，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取单菌落并进行纯化，通过分离获得90株菌落形态各不相同的菌株。

1.3黑曲霉SICU-33的鉴定

用真菌基因组提取试剂盒进行真菌DNA提取，稀释50倍作为PCR反应的模板进行真菌ITS扩增，扩增引物为ITS1和ITS4，然后将扩增产物回收并进行测序，测得的序列为SEQNO.1，ITS基因的NCBI基因登录号为MN498286。

基于以上特征，将菌株SICU-33鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。该菌株已于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC NO：M2019778。

实施例2产吲哚乙酸(IAA)测定

将上述分离得到90株菌株接种到金氏培养基中培养到对数期，28℃140r/min振荡培养3天，取50μl于洗净的白瓷板中，加50μL显色剂，28℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生IAA，以没有接菌的金氏培养基为对照。

将金氏培养基中培养的菌株，8000r/min离心5min，取上清液5ml加入5mlSalkowski显色剂，28℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)，不同菌株的IAA产生量见表1。

表1青稞根际土可培养真菌产IAA能力

结果显示，90株菌中有87株菌能产IAA，IAA产量高于50mg/L的菌株有7株，占分离总菌株的7.78％。其中SICU-33菌株IAA产量为52.13±0.46mg/L。

实施例3抗菌活性测定

采用平板对峙法测定分离菌株对小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌和稻瘟病菌3种指示菌的抑菌作用。测定抑菌圈直径(HD)与菌落直径(CD)，通过计算HD/CD的比值来筛选出有抑菌效果的菌株，具体如表2。

表2青稞根际土可培养真菌产抑菌能力

其中，指示菌株：1：小麦赤霉病菌；2：西瓜枯萎病菌；3：稻瘟病菌.+++：HD/CD值介于3-4；++：HD/CD值介于2-3；+：HD/CD值介于1–2；-：HD/CD值小于1。

由表2可知，10株对小麦赤霉病菌有拮抗效果，24株对西瓜枯萎病菌有拮抗作用，27株对稻瘟病菌有拮抗效果，有四株菌能同时抑制上诉三种病原菌，其中SICU-33菌株能够同时抑制3种病原菌。

实施例4降解纤维素能力

将分离得到菌株接种到CMC培养基上，28℃培养3天，测定纤维素溶解圈的大小。不同菌株的溶解圈大小见表3。

表3青稞根际土可培养真菌纤维素酶活能力

由表3可知，90株菌中有34株具有降解纤维素的能力，纤维素降解圈大于2cm的菌株有20株，占分离总菌株的20.62％。其中菌株SICU-33溶解圈为2.4±0.16cm。

实施例5无机磷降解能力

将分离得到菌株接种到PVK培养基上，28℃培养3天，测定无机磷溶解圈的大小。不同菌株的溶解圈大小见表4。

表4青稞根际土可培养真菌无机磷降解能力

由表4可知，90株菌中有8株具有降解无机磷的能力，占分离总菌株的8.89％。其中菌株SICU-33溶解圈为2.5cm。

实施例6PGPR性能的盆栽验证

基于上述实例测定结果，将具有抗病促生功能的真菌SICU-33和SICU-9活化后接种于PDA液体培养基中，28℃，160r/min的恒温摇床中培养，培养72h后，作为种子液以1:1比例接种PDA液体培养基，然后于28℃，160r/min的恒温摇床中震荡培养108h，使活菌数达到10亿以上，取出备用。

将长势一致的玉米种植于花盆中，每个花盆中的土样为2.5kg。采用浇灌的方式将菌株SICU-33和SICU-9菌剂分别接种于玉米根部。每一个星期重复加一次菌悬液，每次40ml，总共浇灌2次，以无菌水作对照(CK)。测定植株生长情况(如叶片数、茎粗、最大叶宽、最大叶长、叶鲜重、根鲜重、根长和叶面积)，结果见表6及附图1和2。

表6菌株SICU-33对玉米种子生长的影响

从表6及附图1和2可以看出，SCIU-9、SCIU-33的叶片数与CK相比分别增加了5.274％、21.064％；SCIU-9、SCIU-33的茎粗与CK相比分别增加了6.486％、22.652％；SCIU-9、SCIU-33的最大叶长与CK相比分别增加了12.507％、21.924％；SCIU-9、SCIU-33的根长与CK相比分别增加了20.155％、58.730％；SCIU-9、SCIU-33的最大叶宽与CK相比分别增加了3.166％、7.890％；SCIU-9、SCIU-33的根鲜重与CK相比分别增加了2.331％、42.856％；SCIU-9、SCIU-33的叶鲜重与CK相比分别增加了19.956％、47.159％；SCIU-9、SCIU-33的叶面积与CK相比分别增加了7.899％、24.195％。

综上所述，本发明综合评价青稞根际土真菌的产IAA能力、抗植物病原真菌特性、植物促生特点，选择出了更加优异的菌株SICU-33来申请菌株专利。SICU-33菌株可以促进植物的生长，抑制植物病原真菌，提高玉米的叶片数、茎粗、最大叶宽、最大叶长、叶鲜重、根鲜重、根长和叶面积。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种促进植物生长的黑曲霉SICU-33及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 568

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillusniger)

<400> 1

cggaaggatc attaccgagt gcgggtcctt tgggcccaac ctcccatccg tgtctattgt 60

accctgttgc ttcggcgggc ccgccgcttg tcggccgccg ggggggcgcc tctgcccccc 120

gggcccgtgc ccgccggaga ccccaacacg aacactgtct gaaagcgtgc agtctgagtt 180

gattgaatgc aatcagttaa aactttcaac aatggatctc ttggttccgg catcgatgaa 240

gaacgcagcg aaatgcgata actaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgagtctt 300

tgaacgcaca ttgcgccccc tggtattccg gggggcatgc ctgtccgagc gtcattgctg 360

ccctcaagcc cggcttgtgt gttgggtcgc cgtccccctc tccgggggga cgggcccgaa 420

aggcagcggc ggcaccgcgt ccgatcctcg agcgtatggg gctttgtcac atgctctgta 480

ggattggccg gcgcctgccg acgttttcca accattcttt ccaggttgac ctcggatcag 540

gtagggatac ccgctgaact taagcata 568

Claims (6)

1.一种促进植物生长的黑曲霉(Aspergillus niger)SICU-33，其特征在于，该菌株已于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019778。

2.权利要求1所述的黑曲霉SICU-33在防治小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌或稻瘟病菌引起的植物病害中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物为禾本科作物。

4.权利要求1所述的黑曲霉SICU-33在制备防治小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌或稻瘟病菌引起的禾本科作物病害药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物制成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

6.权利要求1所述的黑曲霉SICU-33在制备植物生长调节剂中的应用。

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