CN116024097B - 一株戴尔根霉菌sicau-z1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株戴尔根霉菌SICAU‑Z1及其应用，戴尔根霉菌是戴尔根霉菌(RhizopusdelemarZ‑1)SICAU‑Z1，其保藏编号为CCTCCNO：M2022700。该菌株菌落为白色绒毛状，菌落质地棉絮状。基部菌丝白色，后变为灰褐色，反面无色。生长迅速，菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成假根，假根生长处向上长出孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊。孢囊孢子球形。SICAU‑Z1分离自凉山州成熟期的烤烟，产IAA较强，并经过实验验证，该菌株不仅可以明显抑制植物病原细菌和真菌的生长，降解作物秸秆，还能促进植物生长，提高烟苗的叶片数、茎粗、株高、最大叶宽、最大叶长，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株戴尔根霉菌株，特别是一株分离自烤烟内的戴尔根霉菌SICAU-Z1及其应用。
背景技术
烤烟(Flue cured Tobacco)是茄科一年生草本植物，集中种植在S30°至N45°之间，种植范围较广。目前，在种植生产中，产量低、病害多，已经成为了制约农业发展的主要因素。传统的化肥及农药虽然能在短期内提高农作物产量，但长期使用会对生态环境造成一定的破坏。因此，开发高效环保的菌剂肥料，能在生态友好的基础上促进农业生产以及解决目前的农产品供需矛盾。
长期以来，防治植物病害以及促进植物生长的主要方式是农药和肥料，虽然这种方法在防治疾病和促进生长上的效果显著，但是与此同时也引起了植物病原抗药性、农药残留等问题，造成了一定的环境污染和生态破坏。因此，改进现有种植方式，加强农作物自身微生物资源挖掘与应用，对于提高农作物产量和品质、保护生态环境、增加凉山州人民经济收入，提高生活水平具有重要的意义。
植物内生菌是指存在于植物组织中的细菌、放线菌和真菌等，在与植物长期的共存过程中，构建了和谐共处生存关系，并进化出了多种人类可以利用的有益功能，包括促进植物生长、抵抗植物病虫害、提高植物适应环境的能力。使用植物内生菌制备的微生物制剂可以降低农药、化肥施用给人类健康和生态环境带来的隐患，保护植物根际微生态平衡。因此，植物内生真菌在当前的微生物学领域研究中有重要研究价值。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一株戴尔根霉菌株及其应用，戴尔根霉菌是戴尔根霉菌(Rhizopus delemar Z-1)SICAU-Z1,该菌株可促进植物生长，抑制植物病原细菌和真菌。
本发明以烤烟烟茎为分离材料，进行高效PGPR内生真菌的分离筛选和鉴定，相关高效菌株可以用于新型生物有机肥的研发，对于种植业化肥减施增效具有重要价值。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供的根霉菌，是从凉山州烤烟烟茎中分离得到一株戴尔根霉菌(Rhizopus delemar Z-1)SICAU-Z1，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；保藏日期：2022年05月23日；保藏编号为CCTCC NO:M2022700。所述的戴尔根霉菌SICAU-Z1的ITS序列如SEQ IDNO.1所示。以下简称戴尔根霉菌SICAU-Z1。
该菌株菌落为白色绒毛状，菌落质地棉絮状。基部菌丝白色，后变为灰褐色，反面无色。生长迅速，菌丝体上产生匍匐枝，匍匐枝的节间形成假根，假根生长处向上长出孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，孢囊孢子球形。
本发明提供的所述戴尔根霉菌SICAU-Z1在植物病害生物防治中的应用，所述的植物病害为番茄早疫病菌(Afternaria solani(Ell.etMart).Joneset Grout)、黄瓜晚疫病菌(Phytophthora infestans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)引起的植物病害，所述的植物为草本茄科植物。
本发明的所述戴尔根霉菌SICAU-Z1防治植物病害的方法，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷雾为戴尔根霉菌SICAU-Z1的菌悬液或发酵液或代谢产物制备的农药制剂。
本发明还提供所述的戴尔根霉菌SICAU-Z1在制作生物菌肥中的应用，其可以通过常规的液体或固体培养，制作成生物菌剂，堆肥陈化处理7天后，向牛粪基堆肥中添加适当比例的化肥复合肥、粗氨基酸和功能微生物菌剂，制备生物有机肥。
本发明还提供了所述的戴尔根霉菌SICAU-Z1在促进植物生长方面的应用，同时戴尔根霉菌SICAU-Z1在作为制备植物生长调节剂的应用。
本发明还提供了所述的戴尔根霉菌SICAU-Z1在降解纤维素和无机磷中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的戴尔根霉菌SICAU-Z1，可以促进植物的生长，其IAA产量为113±2.15mg/L，同时对番茄早疫病菌(Afternaria solani(Ell.etMart).Joneset Grout)、黄瓜晚疫病菌(Phytophthora infestans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusRosenbach)和大肠杆菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)有拮抗效果。该菌株作为草本茄科植物的生物制剂材料，无论开发新的生物防治菌剂还是生长调节剂，都具有很好的市场前景。
附图说明
图1(a)、图1(b)为本发明菌株SICAU-Z1在盆栽试验中对烤烟苗期素质的影响；
其中CK为不接种本菌株的烟苗，SICAU-Z1为接种本菌株的烟苗；
图2为GC/MS离子碎片峰；
图3为丙三醇的化学结构式。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1戴尔霉菌(Rhizopus delemarZ-1)SICAU-Z1的分离与鉴定
1.1菌株来源
本实施例样品取于凉山州彝族自治区会理市的烤烟烟茎。随机采集烟茎，装入灭菌密封塑料袋，贴上标签，带回实验室保存。
1.2内生真菌的分离
以烤烟烟茎为材料，通过马丁氏培养基进行烤烟内生真菌的选择性培养和纯培养。将烤烟茎除去泥土，用75％乙醇浸泡1分钟，用5％NaClO溶液表面消毒后无菌水冲洗三遍，把消毒液接触的切面切去，切取外植体10mm茎段部分，用研钵碾压压碎，镊子取植物组织块涂抹在马丁氏培养基表面，于28℃培养箱中培养，待长出明显真菌菌落后，根据菌落大小、形态和色泽等表观特征挑取菌丝并进行纯化。
1.3戴尔根霉菌SICAU-Z1的鉴定
用真菌基因组提取试剂盒进行DNA提取，稀释10倍作为PCR反应的模板进行真菌ITS扩增，扩增引物为ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACC-TGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，然后将扩增产物回收并进行测序，测得的序列为SEQ ID.1。扩增引物ITS基因的NCBI基因登录号为ON584326。
基于以上特征，将菌株SICAU-Z1鉴定为戴尔根霉菌(Rhizopus delemarZ-1)。该菌株已于2022年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏号为CCTCC NO:M2022700。
实施例2产吲哚乙酸(IAA)测定
将实施例1分离得到120株菌株接种到金氏培养基中培养到对数期，28℃180r/min振荡培养3天，取50μl于洗净的白瓷板中，加50μL显色剂，37℃下避光30min，如果出现粉红色，表明产生IAA，以没有接菌的金氏培养基为对照。
将金氏培养基中培养的菌株，8000r/min离心5min，取上清液5ml加入5mlsalkowski显色剂，28℃下避光30min后，530nm下测定吸光度值。以空白培养基作对照，并以IAA的标准样品对应的光密度做标准曲线，计算IAA的产量(mg/L)，不同菌株的IAA产生量见表1。
表1 烤烟烟茎内生真菌产IAA能力
共从分离材料中获得分离得到65株表型和菌落大小各不相同的霉菌菌株。并对其进行产IAA测定(表1)，烤烟烟茎中部分真菌具有IAA产生能力，其中IAA产量高于50mg·L-1的菌株有23株，占分离总菌株数的35.4％，IAA产量高于80mg·L-1的菌株有4株，占6.15％。IAA产量高于80mg·L-1的菌株有4株，占6.15％。IAA产量最高的菌株是SICAU-Z1，产量为113mg·L-1。
实施例3抗菌活性测定
采用平板对峙法测定了分离菌株对番茄早疫病菌(Afternaria solani(Ell.etMart).Joneset Grout)、黄瓜晚疫病(Phytophthora infestans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)和大肠杆菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)等4种指示菌的拮抗效果。测定抑菌圈直径(HD)与菌落直径(CD)，通过计算HD/CD的比值来筛选出有抑菌效果的菌株，具体如表2。
表2 烤烟烟茎内生真菌抑菌能力
表2中，1.番茄早疫病菌(Afternaria solani(Ell.et Mart).Joneset Grout)，2.黄瓜晚疫病菌(Phytophthora infestans)，3.金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusRosenbach)，4.大肠杆菌(Staphylococcus aureus Rosenbach)。图中++：HD/CD值介于2-3；+：HD/CD值介于1-2；-：HD/CD值小于1。
由表2可知，9株对番茄早疫病菌有拮抗效果，8株对黄瓜晚疫病菌有拮抗作用，11株对金黄色葡萄球菌有拮抗效果，11株对大肠杆菌有拮抗效果。能同时抑制两种病原菌以上有的占分离总菌株数的4.62％，其中SICAU-Z1菌株能够同时抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌2种病原菌，且对番茄早疫病菌有较好的效果。
实施例4纤维素降解能力
将分离得到菌株接种到CMC培养基上，28℃培养3天，测定纤维素溶解圈的大小。不同菌株的溶解圈大小见表3。
表3 烤烟烟茎内生真菌纤维素酶活能力
注：nd：not detected，为该活性未检测到。
由表3可知，65株菌中有16株具有纤维素降解酶活，纤维素降解圈大于2cm的菌株有7株，占分离总菌株的10.8％。其中菌株SICAU-Z1溶解圈为2.60±0.86cm。
实施例5秸秆降解能力
基于实施例4中的结果，将具有纤维素降解酶活的菌株接种于装有15克水稻、玉米的250ml三角瓶中(内含150ml无机盐培养液)，28℃摇床培养3天(转速80r/min)，秸秆残渣于80℃烘干至恒重后称重，计算秸秆降解率，结果见表4。
表4 烤烟烟茎内生真菌秸秆降解率(％)
由表4可知，16株菌中有13株具有水稻秸秆降解能力，10株对玉米秸秆有降解能力。对2种秸秆均具有降解能力的菌株有8株。菌株SICAU-Z1对2种秸秆都表现出了降解效果。Nd：not detected，为该活性未检测到。
实施例6无机磷降解能力
将分离得到菌株接种到PVK液体培养基中，28℃培养3天，测定无机磷溶解圈的大小。不同菌株的溶解圈大小见表5。
表5 烤烟烟茎内生真菌无机磷降解能力
注：nd：not detected，为该活性未检测到。
由表5可知，65株菌中有30株具有降解无机磷的能力，占分离总菌株的46.2％。其中菌株SICAU-Z1溶解圈为1.60cm。
实施例7 SICAU-Z1的代谢产物研究
次生代谢物分离纯化：将分离得到菌株接种到PDB液体培养基中，28℃，180r/min的黑暗条件下恒温摇床中培养，培养72h后，纱布过滤菌丝，保留发酵液。将上述发酵液用等体积乙酸乙酯萃取3次，获得的有机相通过无水Na2SO4干燥除去水分，35℃减压旋转蒸发浓缩至浆状，用少量甲醇溶解。将发酵液粗提物甲醇和0.1％乙酸作流动相(60:40)过高效液相色谱柱(Agilent 1200 semi-preparative HPLC)，按峰收集物质。再把收集的物质加足量双蒸水于-80℃冷冻过夜，之后用真空冷冻干燥机除去溶剂，获得精提物质。
SICAU-Z1的促生物质筛选：取各物质用1mL甲醇溶解后再用双蒸水稀释，分别制成浓度为0.1mg/kg、1mg/kg，用于培养番茄苗。光照培养箱参数设置为温度24℃，相对湿度80％，光照：黑暗＝14h：10h，培养30天后分别检测其幼苗生长情况，以含同量甲醇的水溶液作对照(CK)。
次生代谢物鉴定：将精提物质溶于甲醇，送检气相-质谱联用(Finnigan TraceDSQ GC/MS,Agilent 5977)获得一级和二级质谱图，确定该物质分子量和相关分子碎片，初步判断可能的物质结构。将相关活性物质通过硅胶板分离，用乙酸乙酯和石油醚洗脱，进一步纯化，并验纯。再用减压旋转蒸发浓缩去溶剂，加适量氯仿蒸干，重复3-5次，以彻底除去其他溶剂。送检核磁共振(Bruker,AVANCE III HD 400MHz)前，将物质用油泵抽提过夜，再用氘代氯仿溶解，检测获得1H谱和13C谱。
如图2所示，代谢产物结构鉴定：由GC/MS离子碎片峰可知，检测得到m/z 43.1和62.1两种，进一步通过核磁共振谱判定该物质为丙三醇(Glycerine)，其化学式如图3所示。
实施例8 PGPR性能的盆栽验证
基于上述实例测定结果，将具有抗病促生功能的真菌SICAU-Z1和活化后接种于PDB液体培养基中，28℃，180r/min的恒温摇床中培养，培养72h后，作为种子液以1:1比例接种PDB液体培养基，然后于28℃，180r/min的恒温摇床中震荡培养108h，使成为1×108cfu/mL的菌悬液，取出备用。
将长势一致的烟苗种植于花盆中，每个花盆中盛放采集自凉山州烟区的紫色土2.5kg。采用浇灌的方式将菌株SICAU-Z1菌剂接种于烟苗根部。每星期加一次孢子菌悬液(1×108cfu/mL)，每次40ml，总共浇灌2次，以无菌水作对照(CK)。
30d测定植株生长情况(如叶片数、茎粗、株高、最大叶宽、最大叶长)，结果见表6和附图1(a)、图1(b)。
表6 菌株SICAU-Z1对烟苗种子生长的影响
从表6和图1(a)、图1(b)，可以看出，根据IAA产量选择了SICAU-Z1做了盆栽实验(地点：四川农业大学教学农场)，用菌处理的植株较CK有明显效果，具体各方面数据见表6。施加SICAU-Z1菌株的烟苗植株的株高、茎直径、鲜重、干重均显著增加，增幅分别达到44.4％、34.6％、22.0％、40.7％。
综上所述，本发明综合评价烤烟烟茎内生真菌的产IAA能力，抗植物病原真菌特性、加速作物秸秆降解、促进植物生长和溶磷能力，选择出了菌株SICAU-Z1菌株可以促进植物的生长，抑制植物病原真菌，降解作物秸秆，提高烟苗的叶片数、茎粗、株高、最大叶宽和最大叶长，溶解土壤无机磷。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
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Claims (5)
1.戴尔根霉菌，其特征在于，所述戴尔根霉菌为戴尔根霉菌(Rhizopus delemar)Z-1，其菌株编号为SICAU-Z1，其在中国典型培养物保藏中心的登记入册编号是CCTCC NO:M2022700。
2.根据权利要求1所述的戴尔根霉菌的下述任意一种应用：
U1.戴尔根霉菌在植物病害生物防治中的应用或制备植物病害生物防治产品中的应用；
所述植物病害为番茄早疫病菌、黄瓜晚疫病菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）引起的植物病害；
所述植物为草本植物；
U2.戴尔根霉菌在制作生物菌肥中的应用或制备生物菌肥产品中的应用；
U3.戴尔根霉菌作为促进植物生长方面的应用或制备促进植物生长产品的应用；
具体是：制备植物生长调节剂的应用或制备植物生长调节剂产品的应用；
U4.戴尔根霉菌在降解纤维素或/和无机磷中的应用或制备降解纤维素或/和无机磷产品中的应用。
3.一种用于生物防治或植物生长调节的产品，其特征在于，含有权利要求1所述的戴尔根霉菌SICAU-Z1。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，为下述任意一种产品：
V1:生产防治番茄早疫病菌或黄瓜晚疫病菌或金黄色葡萄球菌引起的生物病害的产品，所述植物为草本植物；
V2：生产生物菌肥的产品；
V3：生产植物生长调节剂的产品；
V4：生产降解纤维素或/和无机磷的产品。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，V3的制备方法包括如下步骤：戴尔根霉菌SICAU-Z1通过常规的液体或固体培养，制作成功能微生物菌剂，堆肥陈化处理7天后，向牛粪基堆肥中添加适当比例的化肥复合肥、粗氨基酸和功能微生物菌剂，制备而成。
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