CN111876363B - 一种坚强芽孢杆菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种坚强芽孢杆菌及其应用，坚强芽孢杆菌经一级种子培养、发酵，制得所述坚强芽孢杆菌液体菌剂，或者进一步浓缩喷干，制得坚强芽孢杆菌菌粉。本发明的坚强芽孢杆菌菌剂对引起向日葵菌核病菌的核盘菌拮抗效果明显，能防止或减轻向日葵菌核病的发生，促进向日葵稳产、增收，改善和提高向日葵的产量和品质。

Description

一种坚强芽孢杆菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物菌剂产品领域，具体涉及一种坚强芽孢杆菌及其制备方法和应用。

背景技术

向日葵为世界四大油料作物之一，中国向日葵主产区分布在东北、西北和华北地区，如内蒙古、吉林、辽宁、黑龙江、山西等省、自治区。主产区北纬35°至55°之间。向日葵菌核病是向日葵生产的主要病害之一，每年都有程度不同的发生，对向日葵的产量和品质的提升有很大影响。

向日葵菌核病在向日葵整个生育期间都能发生，病害症状常见的有以下三种类型:(1)立枯型。幼苗至开花期均可染病，其症状为植株茎基部腐烂，湿度大时病斑长出白色菌丝，干燥后茎基收缩干枯、全株死亡，病斑部位可见像老鼠粪样的黑色菌核。(2)茎腐型。向日葵生育中期，染病植株茎秆中部腐烂，病斑长出白色菌丝，茎软化中空，内有鼠粪状的黑色菌核，植株倒伏而死。(3)烂盘型。开花盛期染病，花盘背面出现水浸状病斑，在雨水多的情况下，迅速蔓延，全盘腐烂易脱落，病盘长出白色菌丝，干缩后种子内外形成蜂窝状黑色菌核。

向日葵菌核病属子囊菌亚门盘菌纲，柔膜菌目，核盘菌科，核盘菌属。菌核可萌发产生子囊盘，盘中生子囊及侧丝，子囊圆筒形，子囊孢子单胞，卵形，无色。主要由菌核萌发侵染引起。病菌以菌核状态在土壤、病残组织及种子中越冬，在土壤中一般可生活2-5年。其侵染方式有二种:一是菌核萌发后产生一种菌丝，当它与寄主相接触后即直接侵入，苗期和成株期发病就是这种侵染方式；二是菌核可产生子囊盘，子囊孢子经过风雨或昆虫传播到寄主内，向日葵烂盘就是子囊孢子侵染后引起的。一般当气温在20℃、相对湿度达80％时，最适于菌核的萌发，也是花盘发病最严重的时期。尤其是在多雨之年，在一些低洼排水不畅、通风透光不良和连年重茬地发病率高。7～8月份如果遇到低温多雨，发病率也高。

常规培育抗病品种的防治方法需要的周期长，轮作、调节播期等方法操作繁琐，化学农药的使用会造成农药残留等环境问题还会降低农产品的质量和品质，不符合绿色可持续性发展的道路和方向。

生防微生物能有效防治植物病害的发生，符合绿色防控的发展方向。经检索，目前未见有效的微生物制剂防治向日葵菌核病。

发明内容

本发明的目的是提供一种坚强芽孢杆菌及其制备方法和应用。本发明的坚强芽孢杆菌菌剂对引起向日葵菌核病菌的核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)拮抗效果明显，能防止或减轻向日葵菌核病的发生，促进向日葵稳产、增收，改善和提高向日葵的产量和品质。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种坚强芽孢杆菌，所述坚强芽孢杆菌为(Bacillus firmus)MES80101，保藏日期：2020年7月20日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号：20403。该新菌种目前已送保藏，但还未出保藏号，后续会根据保藏证明在文本中进行补充。

作为上述方案的进一步改进：

本发明还提供了一种坚强芽孢杆菌菌剂，所述坚强芽孢杆菌MES80101的发酵物。

本发明还提供了一种坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，所述强芽孢杆菌经一级种子培养、发酵，制得所述坚强芽孢杆菌液体菌剂，或者进一步浓缩喷干，制得所述坚强芽孢杆菌菌粉。

优选的，所述一级种子培养的条件为：将经试管斜面活化的菌株MES80101进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为固体营养琼脂培养基。

优选的，所述固体营养琼脂培养基配方为：蛋白胨8-13g，牛肉膏2-5克，氯化钠3-5克，琼脂19.5克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度25℃-30℃，培养24h。

优选的，在30m³发酵罐中装有20L液体坚强芽孢杆菌发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40min后冷却到35℃，刮取一级种子菌苔后用100mL室温无菌水中混匀，接种在坚强芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在35℃培养26h；至芽孢形成比例大于等于90％时，结束发酵，放罐；将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂；也可以进一步将液体发酵液在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，制得所述坚强芽孢杆菌菌粉。

优选的，发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1％，玉米淀粉2％，酵母浸粉2.5％，氯化钙0.3％，pH值为7.0-7.5。

所述坚强芽孢杆菌菌粉中有效活菌数(CFU)≥1.0*10¹⁰个/g。

本发明还提供了一种坚强芽孢杆菌的应用，将所述贝莱斯芽孢杆菌菌液，喷洒至植株根部。

优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌菌粉的稀释后，喷洒至植株根部。

发明原理：

坚强芽孢杆菌为芽孢杆菌属，革兰氏阳性菌，菌体细胞杆状，两端盾圆，无荚膜，周生鞭毛，芽孢卵圆形，近中生，胞囊无明显膨大。在营养琼脂培养基上，菌落为微黄白色，圆形或近圆形，中间环状，不透明，表面褶皱，稍有光泽。好氧，接触酶阳性，氧化酶阳性，VP试验阳性，耐7％的氯化钠。

坚强芽孢杆菌通过菌体的生长及代谢活动产生一些次生代谢产物如抗菌肽、聚酮类化合物，能够对病原菌的生长和代谢产生抑制作用；同时菌株还能分泌一些特殊物质，如过氧化物酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶等，能诱导植物产生系统诱导抗性抑制或减轻病害的发生。此外，还能产生一些植物生长激素如生长素、细胞分裂素等，促进植物长得高大健壮，提高植物的抗病性，达到防病作用。

有益效果

本发明的菌剂为生物大分子活体制剂，菌体可自然分裂繁殖，持效期长，不产生抗性。无毒无残留，在作物的任何时期都可以安全使用。用在苗期盆栽防治向日葵菌核病，防治效果达80％以上。

采用微生物生产的生防菌剂属于绿色环保制剂、安全无残留、能大幅度降低农药使用量从而降低农业生产成本，其大面积推广使用的前景十分广阔。

附图说明

图1为坚强芽孢杆菌MES80101对向日葵菌核病的拮抗效果；其中A为坚强芽孢杆菌拮抗向日葵菌核病菌；B为仅接种向日葵菌核病菌对照

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

该株坚强芽孢杆菌MES80101是2019年3月我公司研发人员从土壤中分离获得。土壤经稀释、划线培养、在28℃培养24小时后，经5次纯化后制成斜面菌种，挑取2支斜面送农村农业部微生物质检机构鉴定，确定为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)，在4℃和-80℃冰箱保藏，具体可见提供的保藏证明。

实施例1

MES80101微生物菌剂的制备，按照以下步骤进行：

①一级种子培养：将经试管斜面活化的菌株MES80101进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为营养琼脂培养基。培养基配方为：蛋白胨8-13g，牛肉膏2-5克，氯化钠3-5克，琼脂19.5克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5。培养条件为：温度25℃-30℃，培养24h。

②发酵:在30m3发酵罐中装有20L液体坚强芽孢杆菌发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40min后冷却到35℃，刮取一级种子菌苔于100mL室温无菌水中，混匀后接种在坚强芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在35℃培养26h；发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1％，玉米淀粉2％，酵母浸粉2.5％，氯化钙0.3％，pH值为7.0-7.5。

③至芽孢形成比例大于等于90％时，结束发酵，放罐；

④将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂：

⑤将液体发酵液在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，装入包装袋内。

⑥检测计数，坚强芽孢杆菌产品有效活菌数(CFU)≥1.0*10¹⁰个/g。

实施例2

坚强芽孢杆菌MES80101对向日葵菌核病的抑菌试验：

(一)试验时间和地点：2019年11月在公司研发中心实验室内进行。

(二)试验方法：

(1)供试菌种来源

向日葵菌核病原菌来自内蒙古赤峰市向日葵农田，经公司研发人员培养、分离、纯化，经16S rDNA最终鉴定为向日葵菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)deBary，经致病力测定鉴定为强致病力。

坚强芽孢杆菌由实施例1所述菌种经过发酵培养、喷粉制备获得。

(2)平板拮抗实验

制备PDA固体平板，用无菌接种针挑取一颗向日葵菌核病菌核放在培养皿中间，烧红接种针，等接种针冷却后蘸取少量的坚强芽孢杆菌MES80101接种在距接种病原菌菌斑2.0厘米的四周，设置不接种坚强芽孢杆菌只接种向日葵菌核病菌的处理为空白对照，每个处理设置三次重复。28℃恒温培养，待空白对照菌丝长满整个培养皿时，测量仅接种向日葵菌核病病菌的对照菌落面积(菌落半径)和接种MES80101后病原菌的菌落面积(抑制菌落半径)，用拮抗效果表示(拮抗效果(％)＝(对照菌落面积-处理菌落面积)/对照菌落面积×100)。

(3)拮抗效果

通过本实验发现坚强芽孢杆菌MES80101对向日葵菌核病的拮抗效果达82.56％；对照平均菌落半径为4.5cm，接种坚强芽孢杆菌的平均菌落半径为2.4cm(见图1)。说明坚强芽孢杆菌MES80101对向日葵菌核病具有明显的抑制作用，具有防治向日葵菌核病的生防潜力。

实施例3

坚强芽孢杆菌MES80101对向日葵菌核病的盆栽防治效果：

(一)试验药剂

(1)微生物菌剂

实施例1制备的MES80101固体制剂，分别用水稀释10倍、20倍、30倍、50倍；

(2)化学药剂

40％菌核净可湿性粉剂800-1200倍液(山东科大创业生物有限公司)。

(3)空白对照

设置清水处理为空白对照。

(二)试验时间和地点

试验于2019年11月在公司育苗室进行。

(三)试验方法

处理设置：向日葵品种为太阳斑，实验设置5个处理，分别为菌种比1:10、1:20、1:30、1:50和不加菌的对照处理。

实验方法：准确称取1g向日葵种子，放入培养皿里，加入10mL纯水浸没种子，在30℃培养箱里浸种4h后，按照预先设计好的菌种比例准确称取复合功能菌粉，小心均匀地撒在浸过种的种子上，混匀后在30℃培养箱里培养一天，待种子露白后种植在向日葵育苗基质中生长，观察变化。每隔3天浇40mL自来水或者40mL各浓度菌液，均匀浇在植株根部。30天后观察效果。

(四)结果

试验结果见表1，从结果可以看出，添加坚强芽孢杆菌MES80101菌粉的处理病情指数(8.25-8.40)显著低于空白对照处理后的病情指数(85.48)，而与化学药剂处理后的病情指数(7.59)差异不显著，MES80101对向日葵病的防治效果达83.85％-85.36％。说明坚强芽孢杆菌MES80101可作为防治向日葵菌核病的生防菌种，具有广阔的开发利用前景。

表1不同处理对向日葵菌核病的防治效果

处理	病情指数	防效(％)
			MES86101菌粉：种子比1：10	8.25bc	85.36
MES86101菌粉：种子比1：20	8.31bc	84.85
			MES86101菌粉：种子比1：30	8.35bc	84.43
MES86101菌粉：种子比1：50	8.40bc	83.85
			菌核净	7.59b	92.69
空白对照	85.48a	0.00

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的发明内容。

Claims (9)

1.一种坚强芽孢杆菌，其特征是：所述坚强芽孢杆菌为坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)MES80101，保藏日期：2020年7月20日，保藏单位名称及简称：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号：20403。

2.一种通过权利要求1所述的坚强芽孢杆菌制备的坚强芽孢杆菌菌剂，其特征是：所述坚强芽孢杆菌菌剂为坚强芽孢杆菌MES80101的发酵物。

3.根据权利要求2所述的一种坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征是：所述坚强芽孢杆菌经一级种子培养、发酵，制得所述坚强芽孢杆菌液体菌剂，或者进一步浓缩喷干，制得所述坚强芽孢杆菌菌粉。

4.根据权利要求3所述的一种坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征是：所述一级种子培养的条件为：将经试管斜面活化的菌株MES80101进行安碚瓶培养，安碚瓶培养基为固体营养琼脂培养基。

5.根据权利要求4所述的一种坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征是：所述固体营养琼脂培养基配方为：蛋白胨8-13g，牛肉膏2-5克，氯化钠3-5克，琼脂19.5克，超纯水1000毫升，pH值为7.0-7.5； 培养条件为：温度25℃-30℃，培养24h。

6.根据权利要求3所述的一种坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征是：所述发酵的条件为：在30m³发酵罐中装有20L液体坚强芽孢杆菌发酵培养基，115℃-122℃湿热灭菌35-40min后冷却到35℃，刮取一级种子菌苔后用100mL室温无菌水中混匀，接种在坚强芽孢杆菌液体发酵培养基中，控制罐压在0.02MPa-0.07MPa，在35℃培养26h；至芽孢形成比例大于等于90％时，结束发酵，放罐；将上述发酵液与稳定剂复合制成液体制剂；也可以进一步将液体发酵液在喷干塔内进行浓缩喷干成粉末状，制得所述坚强芽孢杆菌菌粉。

7.根据权利要求6所述的一种坚强芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征是：发酵所用培养基的原料及用量为:葡萄糖1％，玉米淀粉2％，酵母浸粉2.5％，氯化钙0.3％，pH值为7.0-7.5。

8.根据权利要求3-7任一所述的一种坚强芽孢杆菌的制备方法，其特征是：所述坚强芽孢杆菌菌粉中有效活菌数(CFU)≥1.0*10¹⁰个/g。

9.根据权利要求2所述的一种坚强芽孢杆菌菌剂在防治向日葵菌核病中的应用。

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