CN115927083B - 葡萄牙链霉菌和含有其的菌剂及其在作物抗低温方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了微生物和菌剂及其制备方法和应用，所述微生物为葡萄牙链霉菌(Streptomyces lusitanus)，于2021年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23410。本发明的微生物有助于作物缓解冷害，提高作物对低温抗性及冷害后的恢复能力，提高作物产量，在农业生产中可以广泛应用。

Description

葡萄牙链霉菌和含有其的菌剂及其在作物抗低温方面的应用

技术领域

本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及葡萄牙链霉菌和含有其的菌剂及其在作物抗低温方面的应用。

背景技术

低温是限制作物生长发育的主要非生物逆境之一。在农业领域，低温胁迫会限制作物的生长发育，尤其是在苗期和果实成熟期，这个时期的作物通常对温度较敏感，不仅会导致作物产量的降低，严重时还会造成作物的死亡，比如西葫芦果实遇低温后造成表皮凹陷、番茄果实遇冷害后转色不均匀，陆地棉苗期遇冷害后叶面失绿萎蔫等，影响农业生产。此外，遭遇低温逆境后，作物体内活性氧迅速积累，消除活性氧相关酶的代谢发生变化，会导致作物组织中膜脂过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)大量积累，细胞质相对电导率上升，造成细胞膜系统的严重损伤。

微生物肥料又称生物肥料、接种剂或菌肥(bacterial manure)等，是指以微生物的生命活动为核心，使农作物获得特定的肥料效应的一类肥料制品，目前已被广泛应用于农作物培育中，在农业发展中起到了重要作用。

然而，目前有助于提高作物抗低温的微生物仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此本发明提供了一种微生物、微生物的发酵液、液体微生物菌剂及其制备方法、固体微生物菌剂及其制备方法、复合微生物菌剂、液体发酵培养基、固体发酵培养基、肥料及其在培育作物中的用途和方法，本发明的微生物为葡萄牙链霉菌，其有助于作物缓解冷害，提高作物对低温抗性及作物冷害后的恢复能力，在农业生产中可以广泛应用。

为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物为葡萄牙链霉菌(Streptomyces lusitanus)，于2021年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23410，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。

发明人为了获得适用于作物抗低温的微生物而进行了大量的理论分析和实验筛选，考虑到各个地方的土壤环境的不同，收集了不同地区的土壤，对其中的菌株进行分离纯化，初筛到一些生长较好的纯菌株。为了检验这些菌株的抗低温效果，发明人进一步对多种菌株进行作物抗低温试验，发现了一株葡萄牙链霉菌CGMCC No.23410，其可发酵产生丙氨酰色氨酸、胡椒醛、辣椒苷、谷氨酰络氨酸、琥珀酸单月桂酯，苏氨酸、天冬氨酸谷氨酸、吡咯烷羟基羧酸等代谢产物，这些代谢产物参与植物体内代谢循环，合成植物体内多种酶。该菌株能够降低作物冷害后叶片电导率、丙二醇含量，促进作物产生SOD酶和POD酶，能够及时消除作物在低温情况下产生的活性氧，显著提升作物细胞内活性氧代谢的平衡，提升作物抗低温能力，恢复常温后能够促进植物生长，降低冷害带来的不利影响，提高作物产量，在农业生产中可以广泛应用。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种前面所述微生物的发酵液。由此，根据本发明实施例的微生物的发酵液能够降低作物冷害后叶片电导率、丙二醇含量，恢复常温后能够促进作物生长，降低冷害带来的不利影响。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种液体微生物菌剂。根据本发明的实施例，所述液体微生物菌剂含有前面所述微生物的发酵液。由此，根据本发明实施例的液体微生物菌剂能够降低作物冷害后叶片电导率、丙二醇含量，恢复常温后能够促进作物生长，降低冷害带来的不利影响。

根据本发明的实施例，所述液体微生物菌剂中活菌数不小于2亿/克。由此，该液体微生物菌剂中活性菌较多，可在少量添加的情况下高效发挥作用，提高作物中酶活力，从而提高作物抗低温能力和产量。

根据本发明的实施例，所述液体微生物菌剂进一步包括辅料，所述辅料选自下列的至少之一：褐藻寡糖、甘油、氨基酸和甜菜碱。由此，可以增加液体微生物菌剂的营养成分，提升植物抗逆性能。具体地，氨基酸可以是任意来源的复合氨基酸，包括但不限于常规复合氨基酸类型原料，如大豆、畜禽残体、味精下脚料等来源的复合氨基酸。

根据本发明的实施例，以辅料总重量计算，所述辅料包括：12～25重量份的褐藻寡糖；1～9重量份的甘油；35～80重量份的复合氨基酸；3～17重量份的甜菜碱。发明人经过大量实验得到上述较佳配比，由此，添加本发明所提供的辅料能够使作物在苗期时受到的冷害影响有所缓解，产量有所提升。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种固体微生物菌剂。根据本发明的实施例，所述固体微生物菌剂含有前面所述的微生物和/或所述微生物的孢子。其中，当以纯孢子制备微生物菌剂时，其保存期更长，在4℃时可保存3年。

根据本发明的实施例，所述固体微生物菌剂中活菌数不小于200亿/克。由此，该固体微生物菌剂中活性菌较多，可在少量添加的情况下高效发挥作用，提高作物中酶活力，从而提高作物抗低温能力和产量。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种复合微生物菌剂。根据本发明的实施例，所述复合微生物菌剂含有：前面所述的微生物、微生物的发酵液、液体微生物菌剂或固体微生物菌剂；以及下列至少之一的菌剂：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。

发明人发现，枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌可以与前述葡萄牙链霉菌发挥协同增效的作用，提高作物抗低温能力，减缓作物在苗期时受到的冷害影响，提高作物产量，在农业生产中可以广泛应用。

需要说明的是，复合微生物菌剂中可以根据实际情况选择添加或者不添加辅料，优选添加辅料。在一些实施例中，复合微生物菌剂辅料选自填充剂，包括但不限于膨润土、硅藻土、基质、有机质等。其中，填充剂可以根据产品要求调配到所需的有效活菌数。

根据本发明的实施例，所述复合微生物菌剂中活菌数不小于0.2亿/克。由此，该复合微生物菌剂中活菌数较多，从而高效发挥作用，提高作物抗低温能力和产量。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于培养前面所述微生物的液体发酵培养基。根据本发明的实施例，所述液体发酵培养基含有下列至少之一：可溶性淀粉、硝酸钾、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、氯化钠和水。由此，以便于培养葡萄牙链霉菌，使得发酵产物中活菌数高，从而高效发挥作用，提高作物抗低温能力和产量。

需要说明的是，本文中所述的“液体发酵培养基”为改良高氏一号液体培养基。

根据本发明的具体实施例，所述液体发酵培养基含有：10～30重量份的可溶性淀粉；0.5～3重量份的硝酸钾；0.2～3重量份的硫酸镁；0.2～3重量份的磷酸氢二钾；0.01～1.5重量份的硫酸亚铁；0.1～6重量份的氯化钠；900～1100重量份的水。发明人经过大量实验发现，采用上述液体发酵培养基组成有助于更好地培养葡萄牙链霉菌，使得发酵产物中活菌数高，从而高效发挥作用，提高作物抗低温能力和产量。在本发明的又一方面，本发明提出了一种用于培养前面所述微生物的固体发酵培养基。根据本发明的实施例，所述固体发酵培养基含有下列至少之一：玉米淀粉、蔗糖、酵母浸出粉、豆粕粉、麸皮、磷酸二氢钾、硫酸镁和水。由此，有助于对微生物的孢子进行发酵培养，使得发酵产物中活菌数高，从而高效发挥作用，提高作物抗低温能力和产量。

根据本发明的实施例，所述固体发酵培养基含有：5～25重量份玉米淀粉；3～20重量份蔗糖；5～20重量份酵母浸出粉；15～30重量份豆粕粉；10～40重量份麸皮；2～15重量份磷酸二氢钾；2～15重量份硫酸镁；15～35重量份的水。

发明人经过大量实验得到上述固体发酵培养基组成，葡萄糖链霉菌经培养后所得孢子在该固体发酵培养基中生长良好，代谢活性高，有助于提高固体微生物菌剂中的活菌数，从而提高作物抗低温能力，恢复常温后能够促进植物生长，降低冷害带来的不利影响，提高作物产量。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种肥料。根据本发明的实施例，所述肥料包含前述的微生物、微生物的发酵液、液体微生物菌剂、固体微生物菌剂或复合微生物菌剂。发明人发现，本发明的微生物、微生物的发酵液、液体微生物菌剂、固体微生物菌剂或复合微生物菌剂不仅能够缓解作物冷害，提高作物的抗低温性和作物冷害后的恢复能力，进而提升作物产量，在农业生产中可以广泛应用。

本发明对于肥料的性状不作严格限定，可以为固态，也可以为液态，具体可以根据实际情况灵活选择。

根据本发明的实施例，所述肥料进一步含有下列至少之一：褐藻寡糖、氨基酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、分散剂、水、有机肥和无机肥。本发明的肥料能够增加植物的营养成分，提升植物抗逆性能。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述液体微生物菌剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述微生物利用前面所述液体发酵培养基进行发酵培养；以及任选的，将所述发酵培养所得发酵产物与辅料进行混合，以便得到所述液体微生物菌剂。由此，根据本发明实施例的方法获得的液体微生物菌剂中具有高活性的葡萄牙链霉菌，可以缓解作物冷害，提高作物的抗低温性，提升作物冷害后的恢复能力，进而增加作物产量，在农业生产中可以广泛应用。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述固体微生物菌剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述微生物利用前面所述液体微生物发酵培养基进行发酵培养，收集形成的孢子，制成孢子悬液；将所述孢子悬液利用前面所述固体发酵培养基进行发酵培养，以便得到所述固体微生物菌剂。由此，根据本发明实施例的方法获得的固体微生物菌剂中具有高活性的葡萄牙链霉菌，可以缓解作物冷害，提高作物的抗低温性，提升作物冷害后的恢复能力，进而增加作物产量，在农业生产中可以广泛应用。

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述微生物、微生物的发酵液、液体微生物菌剂、固体微生物菌剂、复合微生物菌剂、肥料在培育作物、提高作物的抗低温能力和/或提高产量中的用途。

根据本发明的实施例，所述作物选自矮生番茄、陆地棉、小白菜、黄瓜。

在本发明的又一方面，本发明提出了一种培育作物、提高作物的抗低温能力和/或提高产量的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：向作物施加前面所述微生物、微生物的发酵液、液体微生物菌剂、固体微生物菌剂、复合微生物菌剂、肥料并进行培养。

根据本发明的实施例，所述作物选自矮生番茄、陆地棉、小白菜、黄瓜。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的葡萄牙链霉菌在高式一号平板的菌落形态图；

图2显示了根据本发明一个实施例的不同菌株处理后的矮生番茄的相对电导率、丙二醛(MDA)、白化叶片数以及株高增长量图；

图3显示了根据本发明一个实施例的不同菌株处理后的陆地棉相对电导率、丙二醛(MDA)、地上部鲜重以及株高增长量图；

图4显示了根据本发明一个实施例的葡萄牙链霉菌的系统发育树示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的不同微生物菌剂对矮生番茄、陆地棉以及黄瓜产量的影响图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

本发明提出了一种葡萄牙链霉菌，并提出通过葡萄牙链霉菌制备的微生物发酵液、液体微生物菌剂、固体微生物菌剂、复合微生物菌剂，并且可将以上葡萄牙链霉菌、葡萄牙链霉菌发酵剂、液体微生物菌剂、固体微生物菌剂、复合微生物菌剂应用于肥料中形成微生物肥料，用于提高作物的抗低温能力和/或提高产量。

实施例1菌株的筛选

1、分离纯化与发酵液的制备

(1)菌株的分离：收集来自新疆、辽宁、河南的不同土壤，分别将土壤样品用无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释过程为，取1g土样加入10ml无菌生理盐水中，得到10^1梯度，从10^{^1}中取1ml加入到9ml无菌生理盐水中，得到10^{^2}梯度，从10^{^2}中取1ml加入到9ml无菌生理盐水中，得到10^{^3}梯度，从10^{^3}中取1ml加入到9ml无菌生理盐水中，得到10^{^4}梯度。稀释至10^{^4}梯度时，分别吸取100μL稀释液均匀涂布于改良高氏一号培养基平板中，培养4～7天后，分别挑出单菌落于改良高氏一号培养基上做进一步划线培养，得到25种具有生长优势的纯菌株，其中F19菌株(如图1所示)来源于中国新疆陆地棉种植区。

将得到的纯菌株编号为F01-F25，分别接种至改良高氏一号液体培养基中，进行摇瓶发酵，培养温度为30℃，转速180rpm，周期120h。培养结束后收集编号为F01-F25的发酵液备用。

其中改良高氏一号液体培养基配方为：硝酸钾1.0g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20g/L，琼脂粉15～20g/L，水1000mL，pH值7.0～7.5。

2、利用矮生番茄进行抗低温功能菌株的筛选

以矮生番茄作为供试作物，采用盆栽试验对实施例1中得到的多种菌株(编号F01-F25)进行抗低温盆栽试验，筛选出具有最优抗低温效果的菌株。

挑选均匀一致的矮生番茄种子用5％的次氯酸钠浸泡30秒、用75％酒精浸泡30秒，随后用无菌水反复冲洗干净。将冲洗干净的矮生番茄种子播种在小花盆中，培养基质为营养土：蛭石＝4：1，待长至四叶一心时，挑选生长一致的矮生番茄苗进行低温处理，温度设定6℃恒温，光照时间12h/d，冷处理前喷施发酵液(200倍稀释)，冷处理3天后，矮生番茄叶片出现卷曲，每个处理取6株样本检测电导率、丙二醛，剩余未取样植株再次喷施发酵液(200倍稀释)，每株等量喷施1mL。然后恢复常温(24℃/12℃，光照12h)，14天后采集株高增长量、白化叶片数。

结果如表1及图2中可以看出，在矮生番茄组中，与对照(未叶喷菌液)相比，F19编号的菌株处理后的矮生番茄叶片相对电导率降低41％，丙二醛(MDA)含量降低31.4％，白化叶片数降低50％，株高增长量升高25％。与对照F01-F18、F20-F25相比,F19编号的菌株处理后的矮生番茄叶片相对电导率降低11％～50％，丙二醛(MDA)含量降低4％～41％，白化叶片数量降低25％～63％，株高增长量升高5％～47％。结果显示F19菌株处理能够降低矮生番茄受到冷害后叶片电导率、丙二醛含量，恢复常温后能够促进植株生长，降低冷害带来的不利影响。

表1不同菌株对矮生番茄各个参数的影响

	相对电导率	MDA(umol/g)	白化叶片数(片)	株高增长量(㎝)
					ck	27.0％	0.032	6	0.68
F01	21.0％	0.025	8	0.69
					F02	20.0％	0.032	4	0.72
F03	22.0％	0.031	6	0.78
					F04	19.0％	0.029	4	0.74
F05	25.0％	0.033	5	0.73
					F06	27.0％	0.027	4	0.70
F07	32.0％	0.028	4	0.62
					F08	21.0％	0.025	8	0.72
F09	28.0％	0.032	8	0.73
					F10	23.0％	0.028	6	0.81
F11	21.0％	0.027	5	0.58
					F12	23.0％	0.027	4	0.81
F13	22.0％	0.023	4	0.60
					F14	21.0％	0.036	5	0.74
F15	23.0％	0.031	4	0.78
					F16	24.0％	0.037	7	0.63
F17	28.0％	0.028	6	0.59
					F18	24.0％	0.025	8	0.60
F19	16.0％	0.022	3	0.85
					F20	24.0％	0.028	4	0.72
F21	19.0％	0.027	5	0.74
					F22	26.0％	0.023	6	0.65
F23	27.0％	0.026	5	0.73
					F24	19.0％	0.025	5	0.73
F25	18.0％	0.031	7	0.78

注：ck为对照组。

3、利用陆地棉进行抗低温功能菌株的筛选

以陆地棉作为供试作物，采用盆栽试验对上述分离过程中得到的多种菌株(编号F01-F25)进行抗低温盆栽试验，筛选出具有最优抗低温效果的菌株。

挑选均匀一致的陆地棉种子用5％的次氯酸钠浸泡30秒、用75％酒精浸泡30秒，随后用无菌水反复冲洗干净。将冲洗干净的陆地棉种子播种在小花盆中，培养基质为营养土：蛭石＝4：1，待长至两叶一心时，挑选生长一致的陆地棉苗进行低温处理，温度设定6℃恒温，光照时间12h/d，冷处理前喷施发酵液(200倍稀释)，冷处理3天后，陆地棉叶片出现软化，每个处理取6株样本检测电导率、丙二醛，剩余未取样植株再次喷施发酵液(200倍稀释)，每株等量喷施1mL。然后恢复常温(24℃/12℃，光照12h)，7天后采集株高增长量、鲜重。

结果如表2及图3所示，可以看出，在陆地棉盆栽中，与对照(未叶喷菌液)相比，F19菌株处理后的苗期陆地棉相对电导率降低27.8％，丙二醛(MDA)含量降低31.4％，地上部鲜重升高27.4％，株高增长量升高49.5％。与对照F01-F18、F20-F25相比，F19菌株处理后的矮生番茄叶片相对电导率降低6％～45％，丙二醛(MDA)含量降低4％～31％，地上部鲜重升高2％～25％，株高增长量升高5％～49％。结果显示F19菌株处理能够降低棉花受到冷害后叶片电导率、丙二醛含量，恢复常温后能够促进植株生长，降低冷害带来的不利影响。

表2不同菌株对陆地棉各个参数的影响

综上所述，F19菌株整体的特性较佳，可以缓解作物冷害，提高作物的抗低温性和作物冷害后的恢复能力，进而提升作物产量，确定为最佳目标菌株。

4、F9菌株的16SrRNA鉴定

由分子生物学16SrRNA序列形成的菌株系统发育树显示，该菌株与链霉属同源性较高，与菌株Streptomyces lusitanus相似度最高，故经分子生物学鉴定分析，认定该菌株为葡萄牙链霉菌Streptomyces lusitanus。

该菌株16SrRNA序列如下，系统发育树参见图4。

TGGAGCTCTCCTTCGATACCTGCCCTGGAACGATGAACCGGCTTCGGCCGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATTACCTTGGGCATCCTTGGTGATCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACATCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAAGTGATTCATCATAAACCTC(SEQ ID NO：1)

实施例2葡萄牙链霉菌的发酵液及微生物菌剂的制备与施用效果

1、葡萄牙链霉菌微生物菌剂的制备

葡萄牙链霉菌的发酵培养基配方和培养条件参见表3，最终获得的微生物菌剂中有效活菌数≥2亿/g。

表3不同微生物菌剂的发酵及复配条件

2、含葡萄牙链霉菌发酵液的液体微生物菌剂在矮生番茄、陆地棉、黄瓜上的应用效果

将上述步骤制备的微生物菌剂1-微生物菌剂8，以及3种市售菌剂分别在矮生番茄苗期进行喷施，育苗及低温处理过程同实施例1，恢复常温后正常培育，收获期测产量。每个处理设置30盆重复，每一盆种1棵矮生番茄，即为一个重复。

将上述步骤制备的微生物菌剂1-微生物菌剂8，以及3种市售菌剂分别在陆地棉苗期进行喷施，育苗及低温处理过程同实施例1，待恢复常温后将苗移栽至试验田中，正常培育，收获期测产量。每个处理3个重复，每个重复之间设置50㎡。

将上述步骤制备的微生物菌剂1-微生物菌剂8，以及3种市售菌剂分别在黄瓜苗期进行喷施，育苗及低温处理过程同实施例1，待恢复常温后将苗移栽至试验田中，正常培育，收获期测产量，每个处理3个重复，每个重复之间设置10垄，垄宽40cm，长5米。

市售菌剂组成见表4：

表4不同市售菌剂的组成成分及活菌数

表5不同微生物菌剂对矮生番茄、陆地棉及黄瓜产量的影响

结果如表5及图5所示，可以看出，使用本发明所提供的含有葡萄牙链霉菌的微生物菌剂组中，矮生番茄、陆地棉、黄瓜在苗期时受到的冷害影响均有所缓解，产量均有所提升。在矮生番茄盆栽中，与对照(未叶喷微生物菌剂)相比，微生物菌剂处理后的矮生番茄产量增长14％～25％，而市售3种菌剂仅增长-8％～11％。在陆地棉田中，与对照(未叶喷微生物菌剂)相比，微生物菌剂处理后的陆地棉产量增长15％～31％，而市售3种菌剂仅增长4％～11％。在黄瓜中，与对照(未叶喷微生物菌剂)相比，微生物菌剂处理后的黄瓜产量增长15％～25％，而市售3种菌剂仅增长6％～9％。由此，表明本发明的微生物菌剂可以有效地提高作物产量。

尤其是，在实施例微生物菌剂5～8中，使用本发明所提供的添加以上辅料的含有葡萄牙链霉菌的微生物菌剂组中，矮生番茄、陆地棉、黄瓜在苗期时受到的冷害影响均有所缓解，产量均有所提升。在矮生番茄盆栽中，与对照(未叶喷微生物菌剂)相比，微生物菌剂处理后的矮生番茄产量增长18％～25％。在陆地棉田中，与对照(未叶喷微生物菌剂)相比，微生物菌剂处理后的陆地棉产量增长19％～31％。在黄瓜中，与对照(未叶喷微生物菌剂)相比，微生物菌剂处理后的黄瓜产量增长19％～25％。

实施例3葡萄牙链霉菌的固体微生物菌剂的制备与施用效果

1、葡萄牙链霉菌固体微生物菌剂的制备

葡萄牙链霉菌的固体微生物菌剂制备方法如下：将葡萄牙链霉菌接种到改良高式一号液体培养基平板上，待孢子长满后，用无菌水洗下孢子，震荡并得到分散的孢子悬液。其次将孢子悬液接种到固态发酵培养基上，发酵温度28℃，周期8天，烘干粉碎后即得到固体微生物菌剂，有效活菌数大于等于200亿/g。其中，固态发酵培养基的配方参见表6。

表6不同微生物菌剂的发酵条件

2、含葡萄牙链霉菌的固体微生物菌剂在陆地棉上的应用效果

将上述含葡萄牙链霉菌微生物菌剂9～11，以及2种市售放线菌菌剂产品分别在新疆进行陆地棉田间试验。将本发明的微生物菌剂9～11、市售菌剂4～5分别随底肥施用，其中底肥为有机质含量40％，总养分20％的有机肥，田间管理相同。低温发生后2天测量SOD、POD酶活性、电导率、丙二醛含量，收获期测产量。每个处理3个重复，每个重复之间设置100㎡。

结果如表7所示，可以看出，在陆地棉田间，施用本发明的含葡萄牙链霉菌微生物菌剂后，与两种市售放线菌菌剂相比，苗期陆地棉相对电导率降低18～21％，丙二醛(MDA)含量降低22～39％，SOD酶活升高21％～62％，POD酶活升高22％～45％，收获期产量升高20～42％。由此，表明本发明的微生物菌剂可以提高作物的MDA、SOD酶活和POD酶活，从而提高作物抗低温能，提高作物产量。

表7不同菌剂对陆地棉各个参数的影响

实施例4葡萄牙链霉菌在复合微生物菌剂、生物肥料、水溶肥料方面的应用

1、葡萄牙链霉菌在复合菌剂中的应用

分别将5份实施例3中制备的复合菌剂9，与5份枯草芽孢杆菌菌粉、5份解淀粉芽孢杆菌菌粉、5份地衣芽孢杆菌菌粉、5份短小芽孢杆菌菌粉、75份填充剂进行掺混，得到复合菌剂，其中有效活菌数≥0.2亿/克。

2、葡萄牙链霉菌在生物肥料中的应用

分别将实施例3的固体微生物菌剂添加在不同的有机肥、复混肥等固体肥料表面，制备成生物肥料。具体地，其制备方法可以为：将实施例3的固体微生物菌剂9，添加到40-5有机肥表面，添加量0.5％，有效活菌数≥0.2亿/克。其制备方法也可以为：将实施例3的固体微生物菌剂9，添加到40-20有机无机复混肥的表面，添加量0.5％，有效活菌数≥0.2亿/克。其制备方法也可以为：将实施例3的固体微生物菌剂9，添加到15-15-15复混肥表面，添加量2％，有效活菌数≥0.2亿/克。

3、葡萄牙链霉菌在水溶肥料中的应用

将实施例2的微生物菌剂进一步制备为水溶肥料。具体地，其制备方法可以为：将30份实施例2中的微生物菌剂1，与15份褐藻寡糖、10份氨基酸、10份磷酸二氢钾、10份磷酸氢二钾、20份分散剂，添加10倍的水，制备成水溶肥，其中有效活菌数≥2亿/ml。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (16)

1.一种微生物，其为葡萄牙链霉菌Streptomyces lusitanus，于2021年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23410。

2.一种权利要求1所述微生物的发酵液。

3.一种液体微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求2所述的微生物的发酵液。

4.根据权利要求3所述的液体微生物菌剂，其特征在于，所述液体微生物菌剂中活菌数不小于2亿/克。

5.根据权利要求3所述的液体微生物菌剂，其特征在于，所述液体微生物菌剂进一步包括辅料，所述辅料包括：褐藻寡糖、甘油、氨基酸和甜菜碱；

所述辅料包括：

15~25重量份的褐藻寡糖；

1~9重量份的甘油；

35~80重量份的复合氨基酸；

3~17重量份的甜菜碱。

6.一种固体微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的微生物和/或者所述微生物的孢子。

7.根据权利要求6所述的固体微生物菌剂，其特征在于，所述固体微生物菌剂中活菌数不小于200亿/克。

8.一种复合微生物菌剂，其特征在于，含有：

权利要求1所述微生物、权利要求2所述微生物的发酵液、权利要求3~5任一项所述液体微生物菌剂或权利要求6或7所述固体微生物菌剂；以及

下列至少之一的菌剂：枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌。

9.根据权利要求8所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中活菌数不小于0.2亿/克。

10.一种肥料，其特征在于，含有权利要求1所述微生物、权利要求2所述微生物的发酵液、权利要求3~5任一项所述液体微生物菌剂、权利要求6或7所述固体微生物菌剂或权利要求8或9所述复合微生物菌剂。

11.根据权利要求10所述的肥料，其特征在于，所述肥料进一步含有下列至少之一：褐藻寡糖、氨基酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、分散剂、水、有机肥和无机肥。

12.一种制备权利要求3~5任一项所述液体微生物菌剂的方法，其特征在于，包括：

将权利要求1所述微生物利用液体发酵培养基进行发酵培养；

所述液体发酵培养基含有：

10~30重量份的可溶性淀粉；

0.5~3重量份的硝酸钾；

0.2~3重量份的硫酸镁；

0.2~3重量份的磷酸氢二钾；

0.01~1.5重量份的硫酸亚铁；

0.1~6重量份的氯化钠；

900~1100重量份的水。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，将所述发酵培养所得发酵产物与辅料进行混合，以便得到所述液体微生物菌剂。

14.一种制备权利要求6或7所述固体微生物菌剂的方法，其特征在于，包括：

将权利要求1所述微生物接种到液体发酵培养基中进行发酵培养，收集形成的孢子，制成孢子悬液；

将所述孢子悬液利用固体发酵培养基进行发酵培养，以便得到所述固体微生物菌剂；

所述液体发酵培养基含有：

10~30重量份的可溶性淀粉；

0.5~3重量份的硝酸钾；

0.2~3重量份的硫酸镁；

0.2~3重量份的磷酸氢二钾；

0.01~1.5重量份的硫酸亚铁；

0.1~6重量份的氯化钠；

900~1100重量份的水；

所述固体发酵培养基含有：

5~25重量份的玉米淀粉；

3~20重量份的蔗糖；

5~20重量份的酵母浸出粉；

15~30重量份的豆粕粉；

10~40重量份的麸皮；

2~15重量份的磷酸二氢钾；

2~15重量份的硫酸镁；

15~35重量份的水。

15.权利要求1所述微生物、权利要求2所述微生物的发酵液、权利要求3~5任一项所述液体微生物菌剂、权利要求6或7所述固体微生物菌剂、权利要求8或9所述复合微生物菌剂、权利要求10或11所述肥料在培育作物、提高作物的抗低温能力和/或提高产量中的用途；

所述作物选自矮生番茄、陆地棉、小白菜、黄瓜。

16.一种培育作物、提高作物的抗低温能力和/或提高产量的方法，其特征在于，包括：

向作物施加权利要求1所述微生物、权利要求2所述微生物发酵液、权利要求3~5任一项所述液体微生物菌剂、权利要求6或7所述固体微生物菌剂、权利要求8或9所述复合微生物菌剂、权利要求10或11所述肥料；

所述作物选自矮生番茄、陆地棉、小白菜、黄瓜。

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