IT201600116012A1 - Vettori coniugativi selezionabili da fruttoligosaccaridi. - Google Patents
Vettori coniugativi selezionabili da fruttoligosaccaridi.Info
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Description
Vettori coniugativi selezionabili da fruttoligosaccaridi.
La presente invenzione si riferisce a vettori coniugativi selezionabili da fruttoligosaccaridi. In particolare, la presente invenzione si riferisce a nuovo DNA. La presente invenzione si riferisce a nuovi vettori plasmidici di DNA capaci di auto-coniugazione. Questo vettore non contiene antibiotico-resistenza come marcatori di selezione, ma batteri che ospitano questo vettore possono essere selezionati attraverso la loro capacità di crescere su una fonte di carbonio speciale.
Fondamento dell’invenzione
I vettori plasmidici sono molecole circolari di DNA che possono replicarsi in modo autonomo in cellule batteriche. Essi sono ampiamente usati per ingegneria genetica, ad esempio per clonare ed esprimere proteine di interesse, ad esempio antigeni di vaccino. La tecnologia di ingegneria genetica attuale si basa su plasmidi di piccole dimensioni (circa 3-5 kb) che contengono un’origine di replicazione e un marcatore di resistenza e possono essere introdotti nel ceppo batterico ricevente mediante trasformazione. I batteri trasformati recanti il plasmide ricombinante possono propagare ed esprimere i geni clonati nel vettore, ma non sono in grado di trasferire il vettore plasmidico ad altri batteri se il vettore plasmidico non è mobilizzato da un plasmide helper co-residente nella cellula batterica donatrice. Il marcatore più comunemente usato per la selezione dei batteri che hanno acquisito il vettore plasmidico mediante trasformazione è un gene che conferisce la resistenza a un farmaco antibatterico. Pertanto, i batteri che contengono il vettore possono essere selezionati in ragione della capacità di crescere su piastre di agar contenenti il farmaco antibatterico specifico. Tuttavia, per alcune applicazioni di ricerca e biotecnologiche, sono necessari vettori senza resistenza antibatterica. Ciò si applica allo studio di meccanismi di resistenza antibatterica o all’uso in vivo di vettori per distribuire proteine di interesse quali antigeni di vaccino al microbiota.
Descrizione dell’invenzione
Secondo l’invenzione, è fornito un vettore plasmidico. Ciò comprende un insieme di geni attivabile all’interno di un primo batterio che consente un trasferimento di detto vettore plasmidico da detto primo batterio a un secondo batterio mediante coniugazione quando detto insieme di geni è presente e funzionale in detto primo batterio. Il vettore plasmidico comprende inoltre un marcatore di selezione azionabile in detto primo batterio, in cui detto marcatore di selezione consente l’uso di una prima fonte di carbonio come l’unica fonte di carbonio in detto primo batterio quando i geni che costituiscono detto marcatore di selezione vengono trascritti in detto primo batterio.
Nel contesto della presente descrizione, il termine “coniugazione” è definito come un meccanismo di trasferimento di gene orizzontale tra cellule batteriche che comporta un contatto cellula-cellula.
Durante la coniugazione, la cellula donatrice trasferisce un elemento genetico, il più delle volte un plasmide, alla cellula ricevente.
Nel contesto della presente descrizione, il termine “auto-coniugativo(a)/i(e)” o semplicemente “coniugativo(i)/a(e)” è definito come la capacità di un vettore plasmidico di favorire il trasferimento di una copia di se stesso da un batterio donatore a un batterio ricevente mediante coniugazione.
In determinate forme di realizzazione, il primo e il secondo batterio sono selezionati tra i Gram-negativi del genere delle Enterobacteriaceae. Il vettore plasmidico consente una coniugazione tra specie diverse di batteri, specificamente tra i Gram-negativi dei generi Enterobacteriaceae e Pseudomonas.
In determinate forme di realizzazione, i geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione consentono detto trasferimento a temperature rilevanti per applicazioni di laboratorio e in vivo, specificamente 30 - 37 °C. Quest’intervallo di temperatura garantisce che una coniugazione possa verificarsi tra batteri residenti nel corpo umano, ad esempio nell’intestino, se questi batteri ospitano detto vettore plasmidico.
In determinate forme di realizzazione, l’insieme di geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione comprende un gene selezionato tra excA (codificante proteina di esclusione ExcA del tipo IncM), traY (codificante proteina di secrezione TraY di tipoIV del tipo IncM), traX (codificante relaxasi TraX), traW, traU, traR, traQ, traP, traO, traN, traM, traL, traK, traJ (codificante ATPasi di trasferimento plasmidico TraJ), traI, traH, pri (codificante DNA primasi Pri), mobA (codificante relaxasi/DNasi di mobilizzazione MobA), mobB, tir (codificante proteina di inibizione di trasferimento Tir), trbA, trbB e trbC. Nel contesto della presente descrizione, excA è definito come un gene codificante ExcA di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traY è definito come un gene codificante TraY di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traX è definito come un gene codificante TraX di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traW è definito come un gene codificante TraW di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traU è definito come un gene codificante TraU di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traR è definito come un gene codificante TraR di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traQ è definito come un gene codificante TraQ di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traP è definito come un gene codificante TraP di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traO è definito come un gene codificante TraQ di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traN è definito come un gene codificante TraN di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traM è definito come un gene codificante TraM di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traL è definito come un gene codificante TraL di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traK è definito come un gene codificante TraK di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traJ è definito come un gene codificante TraJ di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traI è definito come un gene codificante TraI di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, traH è definito come un gene codificante TraH di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, pri è definito come un gene codificante Pri di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, mobA è definito come un gene codificante MobA di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, mobB è definito come un gene codificante MobB di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, tir è definito come un gene codificante Tir di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, trbA è definito come un gene codificante TrbA di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, trbB è definito come un gene codificante TrbB di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, trbC è definito come un gene codificante TrbC di plasmide R69 (Salmonella enterica sottosp. enterica serovar Paratyphi B ceppo R69, GenBank KM406488) od omologhi relativi.
I geni traX, traY ed excA sono parte del sistema di esclusione in ingresso di plasmidi coniugativi, il che garantisce che una cellula batterica non ospiti due plasmidi coniugativi strettamente correlati.
I geni traW, traU, traR, traQ, traP, traO, traN, traM, traL, primasi, traK, traJ, traI e traH del locus di trasferimento tra e i geni trbA, trbB e trbC del locus di trasferimento trb codificano le proteine di trasferimento coniugative.
In determinate forme di realizzazione, l’insieme di geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione comprende geni dei loci di trasferimento tra e trb.
In determinate forme di realizzazione, l’insieme di geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione comprende tutti i geni excA, traY, traX, traW, traU, traR, traQ, traP, traO, traN, traM, traL, traK, traJ, traI, traH, pri, mobA, mobB, tir, trbA, trbB e trbC.
In determinate forme di realizzazione, i geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione sono codificati da paia di basi 12894– 35539 e 59785-65769 di plasmide R69 (ID GenBank: KM406488). Queste paia di basi comprendono i geni excA, traY, traX, traW, traU, traR, traQ, traP, traO, traN, traM, traL, traK, traJ, traI, traH, pri, mobA, mobB, tir, trbA, trbB e trbC.
R69 è un plasmide auto-coniugativo appartenente alla famiglia IncM.
Nel contesto della presente descrizione, il termine “operone fos” è definito come un cluster di sette geni coinvolti nella via di utilizzo di scFOS: fosK, fosY, fosGH2, fosX, fosGH1, fosT e fosR. FosR codifica il repressore di fos, un regolatore trascrizionale specifico della famiglia LacI, che reprime l'espressione degli altri geni dell’operone.
Nel contesto della presente descrizione, fosK è definito come un gene codificante FosK di plasmide pEQ1 (Escherichia coli ceppo T23, Seq Rif NCBI NC_023289.2) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, fosY è definito come un gene codificante FosY di plasmide pEQ1 (Escherichia coli ceppo T23, Seq Rif NCBI NC_023289.2) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, fosGH2 è definito come un gene codificante FosGH2 di plasmide pEQ1 (Escherichia coli ceppo T23, Seq Rif NCBI NC_023289.2) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, fosX è definito come un gene codificante FosX di plasmide pEQ1 (Escherichia coli ceppo T23, Seq Rif NCBI NC_023289.2) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, fosGH1 è definito come un gene codificante FosGH1 di plasmide pEQ1 (Escherichia coli ceppo T23, Seq Rif NCBI NC_023289.2) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, fosT è definito come un gene codificante FosT di plasmide pEQ1 (Escherichia coli ceppo T23, Seq Rif NCBI NC_023289.2) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, fosR è definito come un gene codificante FosR di plasmide pEQ1 (Escherichia coli ceppo T23, Seq Rif NCBI NC_023289.2) od omologhi relativi.
Nel contesto della presente descrizione, il termine “scFOS” è definito come fruttoligosaccaridi a catena corta, un gruppo di oligomeri di fruttosio lineari (n=1-5) che sfuggono alla digestione nell’intestino tenue umano e raggiungono il colon. Esempi di specie di scFOS sono: 1-chestosi, nistosi, 1F-fruttofuranosil nistosi.
In determinate forme di realizzazione, il marcatore di selezione è l’operone fos codificante fruttochinasi FosK, FosY, glicoside idrolasi FosGH2, FosX, glicoside idrolasi FosGH1, trasportatore dello zucchero FosT e FosR della famiglia Lac-I repressore di operone FOS e detta prima fonte di carbonio è un fruttooligosaccaride a catena corta (short-chain fructooligosaccharide, scFOS).
In determinate forme di realizzazione, l’elemento repressore fosR è stato rimosso dall’operone fos. Una rimozione di fosR porta a un’espressione aumentata degli altri geni appartenenti all’operone fos e quindi a una capacità aumentata di una cellula comprendente l’operone fos di usare scFOS come fonte di carbonio. Questa modifica migliora l’idoneità dell’operone fos come marcatore di selezione.
In determinate forme di realizzazione, gli elementi genetici mobili (IS903) sono stati rimossi dall’operone fos. Gli elementi genetici mobili IS903 fiancheggianti l’operone fos sono stati descritti in (Dolejska et al., J Antimicrob Chemother 2014; 69: 2388-2393). Gli elementi genetici mobili possono integrarsi nel genoma batterico ospite, inducendo in tal modo la disseminazione incontrollata dell’operone fos nel genoma di batteri non correlati. Una rimozione degli elementi genetici mobili dall’operone fos è quindi importante per eliminare potenziali effetti dannosi del vettore plasmidico.
In determinate forme di realizzazione, il vettore plasmidico non comprende un gene che conferisce resistenza a un farmaco antibatterico. La presenza di un gene che conferisce resistenza a un farmaco antibatterico può essere utile a fini di selezione durante il processo di costruzione (clonaggio) di un vettore plasmidico. Tuttavia, per applicazioni in vivo di un vettore plasmidico in animali o esseri umani, la presenza di un gene che conferisce resistenza a un farmaco antibatterico è molto sfavorevole, poiché rappresenta la possibile minaccia dell’emergenza di batteri resistenti a detto farmaco antibatterico.
Il vettore plasmidico è un plasmide di grandi dimensioni (>64 kb). Il motivo di queste grandi dimensioni è che il vettore plasmidico comprende un vasto array di geni che sono necessari per promuovere la replicazione (replicone che codifica la proteina di avvio della replicazione RepA, proteina regolatrice della replicazione RepC), stabilizzazione nella cellula batterica (proteina legante il DNA a singolo filamento SsB, proteina di antirestrizione KlcA, proteina repressoria trascrizionale KorC, proteina di riparazione di DNA RadC, endonucleasi Nuc, proteina di partizione plasmidica ParB, proteina di segregazione plasmidica ParA, resolvasi ResD, endonucleasi di restrizione Mrr_cat, proteina contenente dominio antitossina RelB, MucB, MucA, proteina di ereditarietà stabile PemK (tossina), proteina di ereditarietà stabile PemI (antitossina)) e il trasferimento summenzionato da cellule batteriche donatrici a riceventi (coniugazione). Esempi specifici di vettori plasmidici secondo il primo aspetto dell’invenzione sono il vettore plasmidico pFOS1 e i suoi derivati che sono stati generati dagli inventori come descritto negli esempi. Una volta trasformati in un ceppo di E. coli, questi vettori plasmidici non necessitano di un’ulteriore trasformazione per essere trasferiti da un ceppo batterico a un altro. Ciò può essere effettuato mediante accoppiamento, vale a dire co-coltivando ceppi donatori e riceventi. Non vi è alcuna necessità di plasmidi helper, poiché i vettori plasmidici sono autoconiugativi. I vettori plasmidici possono essere usati in vivo per portare informazioni genetiche all’interno di una popolazione batterica complessa (vale a dire il microbiota intestinale). Essi sono adatti alla famiglia delle Enterobacteriaceae e possono cambiare la specie batterica ospite mediante coniugazione, ad esempio raggiungendo E. coli residente che colonizza l’intestino di esseri umani e animali. Questi vettori plasmidici possono spostarsi dai batteri che vengono somministrati (coltura batterica probiotica) in batteri che sono colonizzatori residenti dell’intestino.
Nuovi vettori plasmidici per uso biotecnologico sono forniti mediante DNA plasmidico purificato del pFOS-vettore e una sospensione batterica non patogena (Escherichia coli K12 ceppo DH5-alfa o Escherichia coli K12 JM83) recante il pFOS-vettore. Questa sospensione batterica può essere cresciuta in brodo Luria Bertani o piastre in condizioni standard di coltivazione batterica o su un terreno minimo M9 contenente scFOS come l’unica fonte di carbonio.
Il pFOS-vettore non contiene geni di resistenza e non necessita di un uso di farmaci antimicrobici per essere positivamente selezionato.
Il pFOS-vettore contiene un unico sito HindIII. Questo sito può essere usato come sito di clonaggio di restrizione per inserire qualsiasi tipo di determinanti genetici che necessitano di essere veicolati ed espressi attraverso il FOS-plasmide descritto in questa invenzione.
Il determinante genetico di interesse deve essere amplificato mediante PCR con primer recanti pinze HindIII da ligare nel plasmide HindIII-pFOS linearizzato. La miscela di ligazione può essere reintrodotta in qualsiasi tipo di cellula di Escherichia coli mediante elettrotrasformazione o in cellule chimicamente competenti. I trasformanti possono essere selezionati su terreno minimo M9 contenente scFOS come l’unica fonte di carbonio. I trasformanti positivi recanti il vettore di pFOS ingegnerizzato possono essere quindi usati per testare le proprietà dell’inserto clonato. L’uso più innovativo di questo vettore è la possibilità di testare le proprietà dell’inserto clonato direttamente in modelli animali in vivo. Una sospensione dei trasformanti recanti il plasmide ingegnerizzato di questa invenzione può essere somministrata a un modello animale che sostiene la colonizzazione nell’intestino somministrando zuccheri di scFOS nella dieta degli animali.
Secondo un secondo aspetto dell’invenzione, è fornita una cellula comprendente il vettore plasmidico secondo il primo aspetto dell’invenzione.
In determinate forme di realizzazione, la cellula è una cellula batterica.
In determinate forme di realizzazione, la cellula batterica può colonizzare l’intestino di animali o esseri umani.
La cellula batterica può essere selezionata mediante una dieta arricchita con scFOS.
I scFOS sono integratori alimentari consolidati commercializzati per il ripristino della flora intestinale in pazienti (includendo bambini) e animali e sono accettati come prebiotico dalla FDA negli Stati Uniti. La presenza di scFOS fornisce un vantaggio selettivo per cellule batteriche recanti il vettore plasmidico contenente l’operone fos, poiché questi batteri sono in grado di metabolizzare scFOS, mentre le altre Enterobacteriaceae del microbiota non possono. Pertanto si prevede che nell’ecosistema intestinale la proporzione enterobatterica cambierà e i batteri che esprimono l’operone fos prevarranno in modo transiente e colonizzeranno l’intestino ospite.
Per ragioni di sicurezza biologica ed ecologica, plasmidi di pFOS sono destinati a essere intrinsecamente instabili per essere rapidamente eliminati dai loro batteri ospiti e dall’ambiente quando la dieta di scFOS viene sospesa. Ci si attende che i vettori coniugativi di pFOS si trasferiscano orizzontalmente tra batteri intestinalmente cocolonizzanti mediante scambio coniugativo, raggiungendo i batteri endogeni.
Secondo l’invenzione, è fornita una combinazione, comprendente
a. una sospensione non patogena recante la cellula contenente il vettore di pFOS; e
b. una formulazione farmaceutica o alimentare di scFOS. Ci si attende che i batteri recanti il vettore plasmidico colonizzino l’intestino di esseri umani e animali in vivo, approfittando in modo selettivo della dieta arricchita da scFOC. scFOS serviranno pertanto come un prebiotico. I scFOS di oligosaccaridi prebiotici possono aumentare la colonizzazione di specie intestinali benefiche che codificano l’operone fos.
Nell’ultimo stadio, il vettore di pFOS è trasferito da un ceppo donatore a un ceppo bersaglio mediante coniugazione e porta informazioni ai batteri di colonizzazione indigeni, senza disturbare la struttura del microbiota.
Vi sarà un vasto campo di applicazione per un tale vettore sicuro che può essere introdotto mediante coniugazione anche in batteri che recano resistenza a classi di antibiotici molteplici e che sono spesso inaccessibili a esperimenti di trasformazione o coniugazione a causa della mancanza di un marcatore di resistenza idoneo per la selezione. La selezione di scFOS è pertanto di per sé un fattore innovativo e promettente per l’ingegnerizzazione molecolare di batteri.
Il rilascio di antigeni di vaccino al microbiota può essere conseguito clonando il gene che codifica l’antigene all’interno del vettore. Ci si attende che gli antigeni siano espressi e rilasciati nel microbiota dal vettore coniugativo nella popolazione residente nella mucosa o nell’intestino. Il vettore che codifica l’antigene può colonizzare la mucosa o l’intestino, favorendo la risposta immunologica dell’ospite verso l’antigene clonato.
Descrizione di figure e tabelle
La figura 1 mostra l’operone fos da plasmide pEQ1, un cluster di geni coinvolti nella via di utilizzo di scFOS.
La figura 2 mostra la delezione del repressore fosR dall’operone fos mediante auto-ligazione sul sito SmaI, generando due derivati di PUC19 ricombinanti.
La figura 3 mostra una prova di crescita di trasformanti DH5 alfa di E. coli in terreno liquido minimo M9 contenente lo 0,2% di scFOS (FOS) o lo 0,2% di glucosio (GLU) come l’unica fonte di carbonio. pUC19 non contiene l’operone fos, A21 è un derivato di pUC19 che contiene l’operone fos originario (senza elementi mobili) e A21deltafosR contiene l’operone fos modificato (senza elementi mobili e il gene repressore fosR). Misurazione di densità ottica in unità McFarland raggiunta dalle colture dopo 24 h di crescita (ripetuta tre volte). La crescita viene misurata in uno strumento DensiCHEK plus Biomerieux in seguito a standardizzazione con riferimenti McFarland 0,0 e 2,0. La torbidità della sospensione batterica è considerata come un significato di crescita ottimale (>1,0 unità McFarland) e di crescita assente (<0,5 unità McFarland). R69 non contiene l’operone fos, pEQ1 contiene l’operone fos originario, pFOS1 contiene l’operone fos modificato e R69#3 contiene l’operone fos modificato e in aggiunta un gene di resistenza a kanamicina. Misurazione di densità ottica in unità McFarland raggiunta dalle colture dopo 24 h di crescita (ripetuta tre volte). La crescita viene misurata in uno strumento DensiCHEK plus Biomerieux in seguito a standardizzazione con riferimenti McFarland 0,0 e 2,0. La torbidità della sospensione batterica è considerata come un significato di crescita ottimale (>1,0 unità McFarland) e di crescita assente (<0,5 unità McFarland).
La figura 4 mostra il modo in cui il pFOS1 è stato costruito, contenendo l’operone fos modificato a partire dall’A21deltafosR clonato nell’impalcatura (scaffold) del plasmide R69 in seguito a eliminazione di geni di resistenza antimicrobica residenti.
La figura 5 mostra i risultati di prove di crescita nel microbiota intestinale umano di E. coli recante vettore pR69#3 in un sistema di coltura a flusso continuo. Risultati di co-coltivazione di feci umane ed E. coli JM83 (mutante al lattosio) recanti il vettore R69#3, recante l’operone fos, in terreno BHI con o senza lo 0,2% di scFOS in un recipiente di fermentazione in vetro da 3 L, attivato sotto il controllo di un’unità BioFlo (New Brunswick Scientific, NJ, Stati Uniti). L’E. coli JM83-R69#3 è stato monitorato prendendo aliquote della coltura continua e piastrando una diluizione su Agar MacConkey con 30 mg/L di kanamicina. La resistenza a kanamicina in R69#3 è stata usata per semplificare l'analisi nel fermentatore ma è stata rimossa dal vettore di pFOS1 finale. Questi esperimenti sono stati ripetuti tre volte con o senza integratori di scFOS.
Esempi
L’invenzione è ulteriormente illustrata dagli esempi e dalle figure seguenti, dai quali possono essere tratti forme di realizzazione e vantaggi ulteriori. Questi esempi sono volti a illustrare l’invenzione ma non a limitarne l’ambito.
Per realizzare l’invenzione, i ricercatori hanno eseguito le fasi seguenti:
1- Trasferimento dell’operone fos conferente capacità di crescere su scFOS dal plasmide naturale pEQ1 (Dolejska et al., J Antimicrob Chemother 2014; 69: 2388–2393) a un vettore di clonaggio PUC19. In questo passaggio l’operone è stato amplificato mediante PCR senza gli elementi genetici mobili (elementi IS903) che costituiscono potenziali fattori di trasferibilità incontrollata dell’operone fos (figura 1).
2- Eliminazione molecolare del gene repressore fosR dall’operone fos, con conseguente espressione aumentata dei geni rimanenti dell’operone fos e capacità aumentata di batteri contenenti il vettore plasmidico di crescere su scFOS come l’unica fonte di atomi di carbonio. Testata inizialmente sui due plasmidi di PUC19 ricombinanti A21 e A21DeltafosR (figure 2, 3).
3- Eliminazione di geni di resistenza (conferendo resistenza ad ampicillina/tetraciclina) dal plasmide R69 auto-coniugativo, ottenendo il vettore intermedio di R69#1 (figura 4 schema del clonaggio).
4- Clonaggio dell’operone fos modificato nel vettore intermedio di plasmide R69#1 auto-coniugativo ottenendo il vettore R69#3 recante l’operone fos e la resistenza a kanamicina (figura 4).
5- Eliminazione di gene di resistenza a kanamicina dal vettore R69#3 recante l’operone fos. Ottenere il vettore finale di pFOS (figura 4).
6- Valutazione della capacità di tutti i costrutti contenenti l’operone fos (R69#3, pFOS, A21, A21deltafosR, il plasmide naturale pEQ1 originario) di crescere su terreno minimo contenente scFOS come l’unica fonte di atomi di carbonio, verificando che questa proprietà non sussista nella cellula batterica senza il vettore (DH5alfa), nei ricombinanti intermedi di pUC19, R69, R69#1 (figura 3).
7- Analisi di dinamica batterica cecale in presenza o assenza di scFOS (figura 5). 1 gr di feci fresche raggruppate provenienti da due volontari sani è stato inoculato in 1 L di terreno BHI con o senza lo 0,2% di scFOS in un recipiente di fermentazione in vetro da 3 L, attivato sotto il controllo di un’unità BioFlo (New Brunswick Scientific, NJ, Stati Uniti). In corrispondenza della sospensione fecale, 10<6>UFC di E. coli JM83 (mutante al lattosio) recante il vettore R69#3 comprendente l’operone fos e la resistenza alla kanamicina sono stati addizionati e la coltura è stata mantenuta per 96 h con agitazione moderata in condizioni microaerofiliche. Immediatamente dopo l’inoculazione dell’E. coli JM83, è stato prelevato un campione per calcolare il numero iniziale di ceppi donatori nel sistema di fermentazione. Il microbiota coltivabile è stato monitorato e contato prendendo aliquote della coltura continua e piastrando diluizioni su Agar MacConkey con e senza 30 mg/L di kanamicina. Sono state contate colonie resistenti a kanamicina negative al lattosio per misurare la capacità della coltura di E. coli JM83-R69#3 a essere mantenuta all’interno del microbiota coltivabile. Questi esperimenti sono stati ripetuti tre volte in presenza di BHI soltanto e tre volte in presenza di BHI più scFOS. Gli esperimenti hanno chiaramente dimostrato che l’E. coli JM83 è altamente stabile in coltivazione con BHI e scFOS, mentre era stato diluito e perso in 72 h senza la selezione positiva esercitata dagli scFOS. Gli scFOS possono essere utilizzati come fonte di carbonio dall’E. coli JM83 che reca il vettore R69#3 contenente l’operone fos e ciò può dare all’E.coli un vantaggio transitorio selettivo che consente la colonizzazione del microbiota coltivabile.
8- Identificazione di transconiuganti naturali presenti nel fermentatore, in ragione della coniugazione spontanea promossa da R69#3. R69#3 è stato identificato in E.coli lac-positivo di origine fecale dopo 48 h di incubazione nel fermentatore. Questa è l’attività di ingegnerizzazione di microbiota che questo tipo di vettori auto-coniugativi possono promuovere quando colonizzano una popolazione microbica complessa.
Conclusioni:
• Abbiamo costruito un vettore auto-coniugativo che non conferisce resistenza antimicrobica all’ospite batterico ma conferisce la capacità di utilizzare gli scFOS come fonte di carbonio.
• Abbiamo dimostrato in condizioni che simulano la colonizzazione di un microbiota cecale che batteri di E. coli non patogeni recanti i vettori di pFOS possono colonizzare con successo il microbiota intestinale quando il terreno viene integrato con scFOS.
Barzanò & Zanardo Roma S.p.A.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI 1. Vettore plasmidico comprendente a. un insieme di geni attivabile all’interno di un primo batterio, in cui detto insieme di geni consente un trasferimento di detto vettore plasmidico da detto primo batterio a un secondo batterio mediante coniugazione; e b. un marcatore di selezione attivabile in detto primo batterio, in cui detto marcatore di selezione consente l’uso di una prima fonte di carbonio in detto primo batterio.
- 2. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1, in cui detto primo e detto secondo batterio sono selezionati dai Gram-negativi della famiglia delle Enterobacteriaceae.
- 3. Vettore plasmidico secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto insieme di geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione comprende un gene selezionato tra excA (codificante proteina di esclusione del tipo IncM), traY (codificante proteina di secrezione di tipoIV del tipo IncM), traX (codificante relaxasi), traW, traU, traR, traQ, traP, traO, traN, traM, traL, traK, traJ (codificante ATPasi di trasferimento plasmidico), traI, traH, pri (codificante DNA primasi), mobA (codificante relaxasi/DNasi di mobilizzazione), mobB, tir (codificante proteina di inibizione di trasferimento), trbA, trbB e trbC.
- 4. Vettore plasmidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni di cui sopra, in cui detto insieme di geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione comprende i geni excA, traY, traX, traW, traU, traR, traQ, traP, traO, traN, traM, traL, traK, traJ, traI, traH, pri, mobA, mobB, tir, trbA, trbB e trbC.
- 5. Vettore plasmidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni di cui sopra, in cui detto insieme di geni che consentono un trasferimento plasmidico mediante coniugazione è codificato mediante paia di basi 12894-35539 e 59785-65769 di plasmide R69 (ID GenBank: KM406488).
- 6. Vettore plasmidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni di cui sopra, in cui detto marcatore di selezione è l’operone fos codificante fruttochinasi FosK, FosY, glicoside idrolasi FosGH2, FosX, glicoside idrolasi FosGH1, trasportatore dello zucchero FosT e FosR della famiglia Lac-I repressore di operone FOS e detta prima fonte di carbonio è un fruttooligosaccaride a catena corta (scFOS).
- 7. Vettore plasmidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni di cui sopra, in cui detto vettore plasmidico non comprende alcun gene conferente resistenza a un farmaco antibatterico.
- 8. Cellula comprendente il vettore plasmidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni di cui sopra.
- 9. Cellula secondo la rivendicazione 8, in cui detta cellula è una cellula batterica.
- 10. Processo per usare detto vettore plasmidico secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10 per il clonaggio e l’espressione di geni.
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