WO2017185738A1 - 基因工程生物指示剂 - Google Patents

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    • C12R2001/145—Clostridium

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  • the selectable marker gene is located downstream of the constitutive promoter and is not regulated by the inducer.
  • the genetic engineering indicator microorganism comprises: 1*10 6 cfu to 5*10 6 cfu of Bacillus subtilis var. sp., and the foreign gene is transfected into the B. subtilis var. spore by the PIH41 plasmid.
  • the exogenous gene includes a neomycin resistance gene located downstream of the replication initiation site; a PBAD inducible promoter, and a yellow fluorescent protein YFP reporter gene downstream of the inducible promoter.
  • the transgenic Bacillus subtilis var. sp. spores were screened by adding neomycin to the culture medium after transfection of B. subtilis var.

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Abstract

提供了一种基因工程生物指示剂，其通过基因工程技术将外源基因导入指示微生物中，所述外源基因包括启动子、报告基因和选择性标记基因。本发明的生物指示剂可自发荧光，易于检测。

Description

基因工程生物指示剂 技术领域
本发明涉及属于消毒灭菌生物指示剂领域，尤其涉及用于一种或多种灭菌效力且用于生物监测的一种基因工程生物指示剂。
背景技术
在医疗保健行业，卫生检疫行业，制药企业等多种涉及无菌技术的行业，常常有必要对各种无菌生产工艺、无菌产品、无菌包装材料等灭菌效果进行评估验证，检测设备的灭菌效力。世界各地每年都会有因灭菌不彻底导致感染事件发生的报道。生物检测即是通过标准化的菌株，其合乎要求的抗力来考核灭菌负荷是否达到无菌保障水平的要求。
目前国内外广泛使用的生物指示剂为通用型生物指示剂和快速型生物指示剂。通用型生物指示剂是依据芽胞恢复生长时，新陈代谢产生酸性代谢产物引起培养基pH变化，通过添加pH指示剂如溴甲酚紫，根据其颜色变化来判读结果。微生物培养时间为24h～48h。通用型生物指示剂结果可靠，但耗时较久，无法达到快速判读的标准，在临床应用中有极大的限制。快速型生物指示剂，主要依据芽胞恢复生长时产生的a_葡萄糖苷酶，水解底物产生荧光物质，通过检测荧光强度的变化判读灭菌结果。a-葡萄糖苷酶是芽胞恢复生长所必须的水解酶，存在于芽胞外壁中，营养细胞中也有该酶存在。通过对酶水 解底物产生的荧光物质进行检测，可达到在lh～3h内读取结果，进而缩短读取到灭菌失败的结果的时间。但是由于通过间接检测酶的性质，来判读结果，而研宄发现该酶的耐热性比芽胞更强。因此导致芽胞已灭活而酶依旧存在并保持其活力的情况发生。
基因工程生物指示剂通过直接检测基因水平的表达，来确定灭菌结果。该方法直接检测芽胞的生命状态，可有效解决酶与芽胞活力状态不一致的问题。US8372624B2专利公开了一种基因工程生物指不剂，该生物指不剂携带有阻遏基因和报告基因。当微生物暴露于诱导剂中时，报告基因表达，转录翻译出指示酶。指示酶与特异性酶底物作用，产生荧光物质进行检测。传统的报告基因如CAT氯霉素乙酰转移酶，beta-Gal，beta-半乳糖苷酶等，由于其本身不能发光，需添加特异性酶底物，才可检测到报告基因的表达。应用此类报告基因同时也存在酶底物透膜速率慢，荧光强度与酶活力关系密切等缺点。而荧光蛋白家族在熟蛋白质形成后，可自发荧光，无需同特异性酶底物作用，即可进行荧光光强检测，来判断灭菌结果。US8372624B2专利也公开了以GFP绿色荧光蛋白作为报告基因的基因工程生物指示剂。野生型绿色荧光蛋白GFP，缺乏酶促放大作用，荧光信号相对较弱，灵敏度较低。
W02014149379A1专利在上述专利的基础上，减少阻遏基因，来降低基因工程生物指示剂的复杂性。若减少阻遏基因，则该基因在非诱导情况下也会表达，同样也会存在酶的耐热性与芽胞耐热性不一致的现象的发生。
发明内容
本发明目的在于针对上述存在的问题与不足，提供一种基因工程生物指示剂，以无害，高灵敏度的一种或多种突变体荧光蛋白作为报告基因，上游釆用高转录活性诱导型启动子，诱导型启动子上游添加选择性标记基因对菌株进行筛选。
本发明通过基因工程技术手段将上述外源基因导入指示微生物中，外源基因包括启动子，报告基因和选择性标记基因。选择性标记基因位于诱导型启动子上游，报告基因位于诱导型启动子下游。在无诱导物存在下，选择性标记基因表达，报告基因无表达，用于筛选转染成功的菌株。经过灭菌因子暴露后，指示微生物同诱导物相接触，报告基因表达。
本发明中基因工程生物指示剂在诱导物的存在下，从启动子处开始转录及翻译，表达出报告基因。此类报告基因具有独特的优异性，无需特异性酶底物，可自发荧光，同时也具有较高的性噪比，荧光信号强，易检测，灵敏度高等优点。诱导型启动子的存在，保证基因在非诱导情况下无表达，防止生物体在灭菌之前表达荧光蛋白，蛋白质与芽胞不同的抗热性能影响灭菌后结果的判读。
为达成上述发明目的，本发明的技术方案如下：一种基因工程生物指示剂，其包括：
菌片，其均匀分布有指示微生物；
内层包装，其确保菌片在保存时处于无菌环境，同时在灭菌过程中有效灭菌因子同菌片接触；
安瓿瓶，其内部密封有芽胞生长培养基和诱导物，其中芽胞生长培养基和诱导物在灭菌过程中与菌片分开，而在灭菌结束后允许同菌片接触。
在上述技术方案的基础上，进一步包括如下附属技术方案：
所述指示微生物包括嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，短小芽胞杆菌，生孢梭菌，枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞中的一种或多种。
所述指示微生物为细菌芽胞。
所述指示微生物为经过基因工程改造的指示微生物。
所述指示微生物导入的外源基因包括启动子、报告基因、和选择性标记基因。
所述启动子包括组成型启动子和至少一种诱导型启动子，其中所述启动子为LacUV5，Trp，Tac，pBAD，T7中的一种或几种，其中LacUV5的来源为乳糖操纵子，Trp的来源为色氨酸操纵子，Tac的来源为结合了色氨酸启动子的-35序列和乳糖启动子的-10序列的基因序列，PBAD的来源为阿拉伯操纵子，T7的来源为T7RNA聚合酶操纵子。
所述报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，突变体红色荧光蛋白RFP，黄色荧光蛋白YFP，蓝色荧光蛋白BFP，蓝绿荧光蛋白CFP中的一种或几种。
所述选择性标记基因位于诱导型启动子上游，且诱导型启动子不会抑制其表达，所述选择性标记基因包括氨苄青霉素抗性基因，新霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，LacZ蓝白斑筛选基因中的一种或几种。
所述选择性标记基因位于组成型启动子的下游，且不受诱导物调控。
所述启动子、报告基因、选择性标记基因均使用至少一种质粒和/或病毒被指示微生物摄取。
所述质粒包括环形双链质粒和线性质粒。
所述质粒包括一个或多个复制起始位点、一个或多个诱导型启动子、一个或多个报告基因、一个或多个选择性标记基因。
所述病毒包括一个或多个噬菌体。
所述安瓿瓶中包括一种或多种诱导物，所述诱导物为IPTG，吲哚丙烯酸，阿拉伯糖中的一种或多种。
其用于湿热灭菌、过氧化氢等离子体灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌中的一种或多种。
本发明的有益效果如下：
本发明使用基因工程技术手段，将外源报告基因融合于诱导型启动子的下游，将选择性标记基因融合于组成型启动子的下游。选择性标记基因不受启动子调节，为组成型表达；外源报告基因手诱导型启动子调控，在诱导物的存在下表达。外源基因被指示微生物摄取。通过选择性标记基因筛选出成功摄取外源基因的指示微生物，在筛选时无诱导物，选择性标记表达，报告基因不表达。诱导物位于基因工程生物指示剂的安瓿瓶中，在灭菌前及灭菌过程中，与菌片分离，不接触指示微生物。该基因工程生物指示剂经过湿热灭菌，过氧化氢等离子体灭菌，环氧乙烷灭菌，辐射灭菌等灭菌因子暴露后，芽胞生长培 养基及诱导物同菌片接触，若有未灭活芽胞，则报告基因表达产生报告蛋白，该报告蛋白，无需特异性酶底物，可自发荧光，同时也具有较高的性噪比，荧光信号强，易检测，灵敏度高，易于检测。且报告蛋白在灭菌结束前无表达，不会因其对热抗力同芽胞有差异导致灭菌结束后检测结果的差异性产生。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例一
基因工程生物指示剂，由以下部分构成：菌片，其均匀分布有基因工程指示微生物。
内层包装，其保证菌片在保存时处于无菌环境，同时在灭菌过程中有效灭菌因子可同菌片充分接触。
安瓿瓶，其内部密封有2ml大豆蛋白胨液体培养基和100mMIPTG诱导物，大豆蛋白胨液体培养基和IPTG诱导物在灭菌过程中与菌片分开，在灭菌结束后允许同菌片接触。
该基因工程指示微生物包含：l*106cfu～5*106cfu嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞，通过pUBl10质粒将外源基因转染入嗜热脂肪芽胞杆菌中。外源基因包括氨苄青霉素抗性基因，位于复制起始位点的下游；LacUV5诱导型启动子，诱导型启动子下游为增强型绿色荧光蛋白EGFP报告基因。嗜热脂肪芽胞杆菌转染后通过在培养基中添加氨苄青霉素对转染成功的嗜热脂肪芽胞杆菌进行筛选，制备基因工程生物指示剂。该基因工程生物指示剂在灭菌前和灭菌过程中，同安瓿瓶中 的培养基和IPTG诱导物相分离，EGFP无表达。经过预真空压力蒸汽灭菌132°，600s灭菌后，挤破安瓿瓶，培养基和IPTG同基因工程指示微生物接触。若指示微生物未完全杀灭，IPTG诱导LacUV5诱导型启动子活化，增强型绿色荧光蛋白EGFP表达，通过在484nm波长处激发，509nm处检测发射光，即可对其进行检测。
实施例二
基因工程生物指示剂，由以下部分构成：菌片，其均匀分布有基因工程指示微生物。
内层包装，其保证菌片在保存时处于无菌环境，同时在灭菌过程中有效灭菌因子可同菌片充分接触。
安瓿瓶，其内部密封有2ml营养肉汤培养基和100mM吲哚丙烯酸诱导物，营养肉汤培养基和吲哚丙烯酸诱导物在灭菌过程中与菌片分开，在灭菌结束后允许同菌片接触。
该基因工程指示微生物包含：l*106cfu～5*106cfu枯草芽胞杆菌芽胞，通过pSBPTQ质粒将外源基因转染入枯草芽胞杆菌中。外源基因包括LacZ蓝白斑筛选基因，位于复制起始位点的下游；Trp诱导型启动子，诱导型启动子下游为蓝色荧光蛋白BFP报告基因。枯草芽胞杆菌转染后通过蓝白斑筛选试验对转染成功的枯草芽胞杆菌进行筛选，制备基因工程生物指示剂。该基因工程生物指示剂在灭菌前和灭菌过程中，同安瓿瓶中的培养基和吲哚丙烯酸诱导物相分离，BFP无表达。经过干热180°，30min灭菌后，挤破安瓿瓶，培养基和吲哚丙烯酸同基因工程指示微生物接触。若指示微生物未完全杀灭，吲 哚丙烯酸诱导Trp诱导型启动子活化，蓝色荧光蛋白BFP表达，通过在383nm波长处激发，445nm处检测发射光，即可对其进行检测。
实施例三
基因工程生物指示剂，由以下部分构成:菌片，其均匀分布有基因工程指示微生物。
内层包装，其保证菌片在保存时处于无菌环境，同时在灭菌过程中有效灭菌因子可同菌片充分接触。
安瓿瓶，其内部密封有0.5％质量比葡萄糖肉汤培养基和阿拉伯糖诱导物，0.5％葡萄糖肉汤培养基和阿拉伯糖诱导物在灭菌过程中与菌片分开，在灭菌结束后允许同菌片接触。
该基因工程指示微生物包含：l*106cfu～5*106cfu枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞，通过PIH41质粒将外源基因转染入枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞中。外源基因包括新霉素抗性基因，位于复制起始位点的下游；PBAD诱导型启动子，诱导型启动子下游为黄色荧光蛋白YFP报告基因。枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞转染后通过在培养基中添加新霉素对转染成功的枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞进行筛选，制备基因工程生物指示剂。该基因工程生物指示剂在灭菌前和灭菌过程中，同安瓿瓶中的培养基和阿拉伯糖诱导物相分离，YFP无表达。经过环氧乙烷灭菌，环氧乙烷浓度1000mg/L，温度37°，相对湿度50％，作用120min后，挤破安瓿瓶，培养基和阿拉伯糖同基因工程指示微生物接触。若指示微生物未完全杀灭，阿拉伯糖诱导Trp诱导型启动子活化，黄色荧光蛋白YFP表达，通过在510nm波长处激发，530nm处检测发射光，即可对 其进行检测。
当然上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明主要技术方案的精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (15)

  1. 一种基因工程生物指示剂，其特征在于其包括：
    菌片，其均匀分布有指示微生物；
    内层包装，其确保菌片在保存时处于无菌环境，同时在灭菌过程中有效灭菌因子同菌片接触；
    安瓿瓶，其内部密封有芽胞生长培养基和诱导物，其中芽胞生长培养基和诱导物在灭菌过程中与菌片分开，而在灭菌结束后允许同菌片接触。
  2. 根据权利要求1所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述指示微生物包括嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，短小芽胞杆菌，生孢梭菌，枯草芽胞杆菌黑色变种芽胞中的一种或多种。
  3. 根据权利要求1所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述指示微生物为细菌芽胞。
  4. 根据权利要求2所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述指示微生物为经过基因工程改造的指示微生物。
  5. 根据权利要求4所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述指示微生物导入的外源基因包括启动子、报告基因、和选择性标记基因。
  6. 根据权利要求5所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述启动子包括组成型启动子和至少一种诱导型启动子，其中所述启动子为LacUV5，Trp，Tac，pBAD，T7中的一种或多种，其中LacUV5的来源为乳糖操纵子，Trp的来源为色氨酸操纵子，Tac的来源为结合了色 氨酸启动子的-35序列和乳糖启动子的-10序列的基因序列，pBAD的来源为阿拉伯操纵子，T7的来源为17RNA聚合酶操纵子。
  7. 根据权利要求5所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述报告基因为增强型绿色荧光蛋白EGFP，突变体红色荧光蛋白RFP，黄色荧光蛋白YFP，蓝色荧光蛋白BFP，蓝绿荧光蛋白CFP中的一种或多种。
  8. 根据权利要求6所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述选择性标记基因位于诱导型启动子上游，且诱导型启动子不会抑制其表达，所述选择性标记基因包括氨苄青霉素抗性基因，新霉素抗性基因，氯霉素抗性基因，四环素抗性基因，卡那霉素抗性基因，LacZ蓝白斑筛选基因中的一种或多种。
  9. 根据权利要求8所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述选择性标记基因位于组成型启动子的下游，且不受诱导物调控。
  10. 根据权利要求5所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述启动子、报告基因、选择性标记基因均使用至少一种质粒和/或病毒被指示微生物摄取。
  11. 根据权利要求10所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述质粒包括环形双链质粒和线性质粒。
  12. 根据权利要求10所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述质粒包括一个或多个复制起始位点、一个或多个诱导型启动子、一个或多个报告基因、一个或多个选择性标记基因。
  13. 根据权利要求10所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述 病毒包括一个或多个噬菌体。
  14. 根据权利要求1所述的基因工程生物指示剂，其特征在于:所述安瓿瓶中包括一种或多种诱导物，所述诱导物为IPTG，吲哚丙烯酸，阿拉伯糖中的一种或多种。
  15. 根据权利要求1所述的基因工程生物指示剂，其特征在于其用于湿热灭菌、过氧化氢等离子体灭菌、环氧乙烷灭菌、辐射灭菌中的一种或多种。
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