CN105143452A - 包括简化的基因工程生物指示剂的灭菌指示器 - Google Patents

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特里西娅·A·克雷格
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Abstract

一种灭菌指示器，包括含有基因工程生物指示剂的第一隔室和含有酶底物的第二隔室，第二隔室被调整适于在灭菌期间保持酶底物与生物指示剂分开，并在生物指示剂已经暴露于灭菌介质后，允许酶底物接触生物指示剂；其中基因工程生物指示剂包含适合产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一种报告基因，所述报告基因被测试生物体摄取；并且测试生物体不含任何活性或可激活的阻遏基因，所述阻遏基因如果存在于测试生物体或灭菌指示器中将抑制报告基因的表达，并且选择指示酶和酶底物以使指示酶对酶底物的酶促作用产生可检测的信号。

Description

包括简化的基因工程生物指示剂的灭菌指示器
背景技术
本申请发明人以前公开一种基因工程生物指示剂，所述基因工程生物指示剂包含用于产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一种报告基因，所述报告基因被测试生物体摄取(takenup)，所述测试生物体包含细菌芽孢；至少一种阻遏基因，其抑制报告基因的表达，直至报告基因暴露于至少一种诱导物；其中基因工程生物指示剂是自含式生物指示器的一个组分，所述自含式生物指示器例如两隔室系统如瓶(vial)和封盖的组合，该两隔室系统还包含基因工程生物指示剂的生长培养基。参见例如U.S.专利号8,372,624。
在US8372624公开的基因工程生物指示剂系统和方法中，阻遏基因抑制报告基因的表达，直至该系统暴露于诱导物。在应用这种系统和方法时，遇到了各种问题，包括指示剂的变色，这是由于诱导物和/或与如报告基因一样必须被测试生物体摄取的阻遏基因有关的组织的降解造成的。例如，当系统在灭菌处理期间或者在生产基因工程生物指示剂系统的加工过程中被加热时，已观测到变色反应。认为通过加热或其他灭菌处理(例如，通过氧化灭菌处理，如气态过氧化氢、环氧乙烷等)，使诱导物例如木糖降解并变成褐色或者其他变色。这种变褐或变色对检测与显示灭菌失败的结果相关的任何变化造成干扰。可以理解，这是不期望的，因为这导致试验灵敏度降低。以前需要诱导物来克服阻遏基因的影响。通过省略阻遏基因，就不再需要使用诱导物，并因此可以避免由诱导物引起的变褐或变色问题。另外，将认识到在用于诱导测试生物体摄取报告基因的载体中必须包括阻遏基因只会增加用于生产基因工程生物指示剂系统的总体过程的复杂性。这些问题仍需要解决。
发明概述
因此，在利用这种系统时出现了问题，本申请发明人通过开发本发明解决了这个问题。本申请发明人已经开发了一种新的基因工程生物指示剂，如同先前的系统，其包括：用于产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一种报告基因，报告基因被测试生物体摄取，测试生物体包含细菌芽孢；其中基因工程生物指示剂是自含式生物指示器的一个组分。然而，本发明不需要阻遏基因和诱导物，并且在事实上不包括阻遏基因和诱导物，而阻遏基因和诱导物是在US8372624中公开的基因工程生物指示剂系统和方法所需的。
因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种灭菌指示器，其包括：
第一隔室，其含有基因工程生物指示剂，该第一隔室被调整适于允许生物指示剂在灭菌过程中与灭菌介质接触；和
第二隔室，其含有至少一种酶底物，该第二隔室被调整适于使酶底物在灭菌过程中保持与生物指示剂分开，并且该第二隔室被调整适于在生物指示剂已暴露于灭菌介质后允许酶底物接触生物指示剂；
其中，基因工程生物指示剂包含适合产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一种报告基因，所述报告基因被测试生物体摄取；
其中，灭菌指示器中的测试生物体不含任何活性的或者可激活的阻遏基因，该阻遏基因如果存在于测试生物体或灭菌指示器中将抑制报告基因的表达，并且
其中，选择指示酶和酶底物以使指示酶对酶底物的酶促作用产生可检测的信号。
在一个实施方案中，使用至少一种质粒和/或至少一种病毒，使报告基因被测试生物体摄取。
在一个实施方案中，测试生物体包括嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)和/或萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)的芽孢。
在一个实施方案中，报告基因包括lacZ、bgaB、xylE、cat或者其中的两种或更多种的混合物。
在一个实施方案中，指示酶包括β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰转移酶、儿茶酚-2,3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其中的两种或更多种的混合物。
在一个实施方案中，报告基因包括lacZ或bgaB，且指示酶包括β-D-半乳糖苷酶。
在一个实施方案中，质粒包含报告基因且不含任何阻遏基因。
在一个实施方案中，病毒包含至少一种基因转运蛋白(transporter)，所述基因转运蛋白包含被壳体包围的核酸，基因转运蛋白包含报告基因且不含任何阻遏基因。在一个实施方案中，病毒包含至少一种噬菌体。在一个实施方案中，病毒包含λ或M13噬菌体。
根据本发明的另一个实施方案，提供一种灭菌指示器，其包括：
第一隔室，其含有基因工程生物指示剂，该第一隔室被调整适于允许生物指示剂在灭菌过程中与灭菌介质接触；和
第二隔室，其含有至少一种酶底物，该第二隔室被调整适于使酶底物在灭菌过程中与生物指示剂分开，并且该第二隔室被调整适于在生物指示剂已暴露于灭菌介质后允许酶底物接触生物指示剂；
其中，基因工程生物指示剂包含产生指示酶的嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢和选自lacZ、bgaB、xylE和cat基因的至少一种报告基因，所述报告基因被嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢摄取；
其中，灭菌指示器中的嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢不含任何活性的或可激活的阻遏基因，该阻遏基因如果存在于测试生物体或灭菌指示器中将会抑制报告基因的表达，并且
其中，选择指示酶和酶底物以使指示酶对酶底物的酶促作用产生可检测信号。
在一个实施方案中，指示酶包括β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰转移酶、儿茶酚-2,3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其中的两种或更多种的混合物。
根据本发明的另一个实施方案，提供一种灭菌方法，其包括：
使待要进行灭菌的物品和上述的灭菌指示器暴露于灭菌介质；
合并第一隔室和第二隔室的内容物；
孵育第一隔室和第二隔室的合并内容物；并且
通过在孵育后检测存在或不存在可检测的信号来确定灭菌处理的效力。
在一个实施方案中，在该灭菌方法中，灭菌介质包括蒸汽、干热、辐射、等离子体、一种或多种气体灭菌剂和/或一种或多种液体灭菌剂。
在一个实施方案中，在该灭菌方法中，灭菌介质包括电子束辐射、电磁辐射、γ辐射、β辐射、环氧乙烷、气体过氧化氢、液体过氧化氢、福尔马林、戊二醛和/或过乙酸。
本发明可以提供优于US8372624系统的一些优点中的一个或多个。通过移除阻遏基因或者以其他方式敲除其活性，也就移除了对诱导物的需要。“敲除”基因的活性可以通过插入突变、缺失突变或通过用不含该基因的病毒或质粒再转化该野生型宿主生物体来完成。由于在一些情况中诱导物(例如木糖)可非故意干扰US8372624系统的正常功能，它的移除完全消除了这种可能性。通过移除阻遏基因，本发明还提供了如下益处：降低成本和降低生产包括基因工程生物指示剂的灭菌指示器的复杂性，因为阻遏物和诱导物都不是必需的组分。通过移除阻遏物，转染载体能在组成上表达其报告酶；意味着在不存在阻遏的情况下，报告基因的产物将会达到高得多的水平，因而增加指示剂的灵敏度。因此，消除了在生产这种灭菌指示器的过程中所涉及的步骤的数量和复杂性，以及对这些现在不必要的组分的成本和操作。最后，当灭菌指示器已通过灭菌处理、已经过孵育并测定结果时，不存在因降解的诱导物引起的吸光度进一步增加读数器的灵敏度和信号强度。
附图简述
本发明可与多种灭菌指示器设备一起使用。附图旨在提供对适合的灭菌装置的示例性的、非限制性的描述，目的在于更好地理解本发明，而不是意图以任何形式限制本发明。在附图中，类似的部件和特征具有类似的标号。
图1是适合供本发明的实施方案使用的灭菌指示器的第一实施方案在激活前配置下的示意性剖面图。
图2是图1的灭菌指示器在激活配置下的示意性剖面图。
图3是类似于图1的适合供本发明实施方案使用的灭菌指示器的第二实施方案在激活前配置下的示意性剖面图。
图4显示无、一个和两个高压灭菌循环对不含有木糖的恢复培养基的影响。
图5显示无、一个和两个高压灭菌循环对含有1％木糖的恢复培养基的影响。
应该理解，为了简单和清楚地说明，图中所示的元件不一定是按比例绘制的。例如，为了清楚，一些元件的尺寸相对于彼此可以被放大。而且，认为适当时，在各图之间可以重复参考数字以指示相应的元件。
此外，应该理解，以下描述的方法步骤和结构可以不形成完整的生产最终可用的灭菌指示器的工艺流程。本发明可结合本领域中目前使用的装置和处理技术一起实施，并且仅包括那些对于理解本发明是必要的常规实践的工艺步骤。
发明详述
术语“灭菌”是指使物质不能繁殖、代谢和/或生长。虽然该术语通常是指活生物体完全不存在，但该术语在本文中是指物质在以前同意为可接受的程度上不含活生物体。除非另有说明，术语灭菌在本文中还指不如灭菌严格的方法和程序，例如，消毒、卫生处理等。本文中描述的基因工程生物指示剂以及方法和装置可以用于卫生保健领域、科学领域等。这些可以用于需要灭菌、消毒、卫生处理、排污和清洁等的商业和工业应用中。所述商业和工业应用可以包括诸如食品加工、巴氏杀菌、土壤修复、水修复等处理。
可以使用所公开的灭菌指示器的灭菌处理可以包括任何灭菌处理。灭菌处理可以包括其中灭菌介质或灭菌剂可以包括蒸汽、干热、辐射、等离子体、以及一种或多种气体灭菌剂、一种或多种液体灭菌剂等的灭菌处理。辐射可以包括电子束或任何电磁谱，包括离子辐射，脉冲白光或紫外光，微波等。辐射可以包括γ或β辐射。气体灭菌剂可以包括环氧乙烷、气体过氧化氢等。液体灭菌剂可以包括福尔马林(溶解在水中并任选地含有甲醇以抑制有毒物质的形成的甲醛气体)、戊二醛、过乙酸、液体过氧化氢等。
基因工程生物指示剂可以用于检查灭菌剂对任何目标微生物的致死率，所述目标微生物相比于与基因工程生物指示剂一起提供的测试生物体对灭菌处理具有更小的抗性。这些目标微生物可以包括细菌，如大肠杆菌(Escherichiacoli)，军团菌属物种(Legionellasp.)，弯曲菌属物种(Campylobactersp.)和其他肠细菌，以及葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)物种，和其他人致病微生物如隐孢子虫属(Cryptosporidium)。
生物体的生长可以包括许多细胞进程的综合结果。在典型的灭菌指示器应用中，这可以通过多种方式观察到。当细胞生长和分裂时，它们的个体数量增加到一个点，在该点时细胞的支持培养基可以发生从澄清到不清澈再到不透明(浑浊)。为便于观察生长，可以使用pH指示剂染料。生长需要能量。这种能量可以由细胞代谢支持培养基中含有的营养物的活性来提供。这个过程的分解产物可以引起支持培养基变为酸性的。这种酸度可以诱导pH指示剂染料(例如，酚红)变色。结果是，随着支持培养基从澄清的红色转变为黄色，例如，到浑浊的黄色条件，可以观察到生长。虽然这些过程缓慢，但它们代表令人信服的生命证据，并被很多无菌保证监管机构普遍接受作为基准。通过间接测量作为目标酶/报告酶活性(例如α-葡糖苷酶)的函数的活力，缩短获得无菌指示所需的时间是可能的。然而，如上所述，这个过程可能仍需要生长出来(growout)作为最终确认。因为生长和代谢废物的积累是生命过程的最后结果，它们可能需要显著的时间(24小时到72小时)才会变得明显。
采用本发明，适合于产生指示酶(例如，β-半乳糖苷酶)的报告基因可以被测试生物体(例如细菌微生物)利用适合的媒介物(例如质粒或病毒)摄取。与现有技术对比，本发明中，在测试生物体中不包括阻遏基因，并且因为不使用阻遏基因，无需诱导物来克服报告基因的影响。因此，本发明避免了灭菌后可能的可检测生命信号的混淆，并且因为不需抑制报告基因的表达，可以在更早的时间点获得对灭菌有效力或者灭菌失败的证实。暴露于灭菌处理的是测试生物体用来生存和生长的各种重要机制，其也用于产生指示酶。这些可以包括用于细胞生长(和质粒复制)的DNA聚合酶、用于转录测试生物体(和带有报告基因(例如lacZ)的质粒或病毒)代谢需求的RNA聚合酶、以及翻译细胞蛋白(以及指示酶的表达)所需的核糖体多聚核糖体。因为指示酶可以作为信号形成机制快速起作用，任何剩余的活生物体的存在相比于如果它们束缚于测试生物体的重要生长机制累积的最终结果可以更早地变为明显的。
测试生物体可以包括任何生物体，它们对预期的灭菌处理的抗性超过其他将被灭菌处理破坏的生物体的抗性。所用的测试生物体的类型可以取决于各种因素，例如但不限于，所用的灭菌处理的类型。测试生物体可以是微生物。可以使用的菌株可以是对用于灭菌的方法最具抗性的那些菌株。测试生物体可以包括一种或多种细菌、病原体、革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、营养生物体(vegetativeorganisms)、病毒、非自主复制剂、细胞的亚细胞组分或产物、和/或朊病毒。细菌微生物可以是形成内生孢子(即细菌芽孢)的那些细菌微生物。测试生物体可以包括芽孢杆菌属(Bacillus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)或梭状芽孢杆菌属(Clostridia)的细菌。这些可以包括嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridiumsporogenes)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridiumdifficile)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)、枯草芽孢杆菌球形变种(Bacillussubtilisglobigii)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)、大肠杆菌等。最常用的两种测试生物体是嗜热脂肪地芽孢杆菌和萎缩芽孢杆菌，最常用的且优选的是以芽孢的形式。在现有技术中，嗜热脂肪地芽孢杆菌也可以被称为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。
测试生物体还可以包括真菌、分枝杆菌、原生动物、营养细菌(vegetativebacteria)等。可以使用的真菌的实例可以包括黑曲霉菌(Aspergillusniger)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、须毛癣菌(Trichophytonmentagrophytes)、皮炎万氏(Wangielladermatitis)等。可以使用的分枝杆菌的实例可以包括龟亚科分枝杆菌(Mycobacteriumchelonae)、戈登分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmantis)、龟型分枝杆菌(Mycobacteriumterrae)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)等。可以使用的原生动物的实例可以包括兰伯贾第虫(Giardialamblia)、小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)等。可以使用的营养细菌的实例可以包括嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、热原链球菌(Streptococcuspyrogenes)、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、嗜肺军团病杆菌(Legionellapneumophila)、甲基杆菌(Methylobacterium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、耐辐射微球菌(Micrococcusradiodurans)、耐辐射球菌(Deinococcusradiodurans)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)等。生物体如嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽胞杆菌、产芽胞梭状芽胞杆菌等可用于确定湿热灭菌(高压灭菌)的效力，其中嗜热脂肪地芽孢杆菌是尤其有用的。
营养生物体如营养细菌、营养细胞和/或它们的组成部分可以用作测试生物体。实例可以包括不形成内生孢子的大肠菌类物种和细胞，例如嗜水气单胞菌、粪肠球菌、粪链球菌、屎肠球菌、热原链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌(肺炎)、嗜肺军团病杆菌、甲基杆菌、铜绿假单胞菌、猪霍乱沙门氏菌、幽门螺杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、嗜麦芽窄食单胞菌等。
这些测试生物体可以与一种或多种赋形剂组合应用。赋形剂可以被定义为一大类一般为惰性的化合物，其可以用于稳定不稳定实体。可以使用的赋形剂的子类包括碳水化合物，例如低聚和多聚糖类。这种化合物的实例可以是海藻糖，其是二糖。某些生物体组织中的高浓度海藻糖可以使生物体在缺水状态下生存。海藻糖可以用于在脱水后恢复功能性细胞组分。海藻糖可以在极端环境条件下(例如，冷冻干燥)为细胞的活力所必需的细胞膜和其他大分子结构提供稳定性。其他稳定赋形剂化合物可以包括简单糖(例如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等)和长链聚合物(例如右旋糖酐类、淀粉、琼脂糖、纤维素等)。其他基于非碳水化合物的赋形剂可以包括蛋白质、膦酸酯、缓冲剂、蜡类、脂类、油类以及其他基于烃的物质。
测试生物体可以包括一个或多个非自主复制剂和/或细胞的亚细胞组分或产物。可以使用这些是由于它们的临床意义或者由于它们作为生物恐怖剂的用途。这些指示剂物质可以包括因为天然修饰或人工修饰导致现在对正常的抗生素处理或化学消毒的手段具有抗性的细胞菌株。前一种类型的实例包括VREs(抗万古霉素肠球菌(VancomycinResistantenterococci))、MSRAs(抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MethicillinResistantStaphylococcusaureus))，龟分枝杆菌(Mycobacteriumcheloni)等。这些可以使用是因为VREs和MRSAs已经出现对治疗对策的抗性(例如抗生素抗性)，龟分枝杆菌已经出现对一些消毒方式的抗性(如戊二醛抗性)。
测试生物体可以包括一个或多个新出现的生物体。它们可以代表治疗过程或消毒所面临的特殊风险或挑战。这些指示剂物质的实例可以包括朊病毒。朊病毒本身不是活的生物体，但是它们作为致病剂的功能可能与它们的结构相关，这种结构/功能关系可以被用于确定它们的相对传染性。可以使用其他非自主剂(例如病毒)以及亚细胞组份和蛋白质朊病毒。
提供被测试生物体摄取的报告基因是用于产生指示酶的用途，所述报告基因可以包含lacZ、bgaB、xylE、cat，或者其中两种或更多种的混合物。术语“lacZ”是指编码β-半乳糖苷酶的基因。术语“bgaB”是指编码来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的热稳定β-半乳糖苷酶的基因。术语“xylE”是指编码来源于恶臭假单胞菌(Pseudomouasputida)的儿茶酚-2,3-二加氧酶的基因。术语“cat”是指编码例如来源于pC194的氯霉素乙酰基转移酶的基因。术语“pC194”是指一种特殊的质粒构造。前述的关于报告基因的讨论适用于其他生物体，包括一些特殊的萎缩芽孢杆菌。
用于将报告基因插入(或转染)到测试生物体中的媒介物可以包括一种或多种质粒和/或一种或多种病毒。这些媒介物被称作载体。质粒可以包含与染色体DNA分开的环状双链DNA。质粒可以为线性的。质粒的尺寸可以在约2000到约20000碱基对(bp)的范围内，在一个实施方案中在约5000到约12000bp的范围内。相同质粒的一个或多个拷贝(例如，1到约3000拷贝，在一个实施方案中为1到约60拷贝，以及在一个实施方案为约20到约3000拷贝)可以被测试生物体的单细胞摄取。质粒可以含有一个或多个用作复制起始点的DNA序列。质粒可以含有一个或多个基因标记。质粒可以含有多接头或多克隆位点(MCS)，其可以是相对短的区域，该区域含有一个或多个允许DNA片段插入的限制性位点。质粒可以含有一个或多个基因，所述基因提供选择性标记以诱导测试生物体保留质粒。选择性标记可以包含抗生素抗性基因和/或具有营养能力的基因。质粒可以包含接合质粒，其含有tra-基因(转移操纵子)，该tra-基因可以进行接合过程，质粒向另一细菌的非性转移。
质粒可以包含至少一个复制起始点、至少一个可选标记、至少一种诱导型启动子、以及至少一种报告基因。可选标记可以包含抗生素抗性基因和/或具有外源营养能力的基因。这些可以包括氯霉素(chloramphenicol)、氨苄西林(ampicillin)或大观霉素(spectinomycin)抗生素基因，和/或木糖或乳糖营养基因。诱导型启动子可以包含PxylA。术语PxylA是指在活性xylR调节器功能的存在下需要木糖来保持活性的转录启动子。报告基因可以包括lacZ、bgaB、xylE、cat等。质粒可以包括两个复制起始点。一个复制起始点可以包括革兰氏阴性复制起始点，另一个复制起始点可以包括革兰氏阳性复制起始点。革兰氏阴性复制起始点可以包括大肠杆菌。革兰氏阳性复制起始点可以包括枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌或萎缩芽孢杆菌。质粒可以含有约2000到约20000bp，在一个实施方案中含有约5000到约12000bp。
天然存在的质粒在自然界广泛的宿主生物体中存在。它们可以包含基因、调控元件和/或DNA的结构件。质粒通常为它们的宿主生物体提供一些优势(例如，抗生素抗性或利用能量的某些营养源的能力)，并且只要这种有利关系可以存在，质粒就可以一直被它们的宿主生物体耐受。基因工程质粒可以包含关注的基因、调控元件和/或结构件的拼凑物。由于有如此多的可用的天然存在的(和以前工程设计的)质粒，因此可以从广泛的基因选择中选择。例如，所用的基因可以基于已完成构造的期望性质进行选择。这些性质可以包括转化全部范围的可用宿主生物体、为宿主生物体提供一些选择性优势(例如，抗生素抗性)、产生需要的热稳定的和快速可检测的信号、以及提供信号处在关闭状态直到期望将其打开的能力。这可以通过将所需的属性以来自多种质粒源的DNA片段的形式拼凑(连接(ligation))在一起来完成。例如，片段可以包含革兰氏阳性生物体和革兰氏阴性生物体的复制起始点、赋予氯霉素抗性的cat基因、赋予热稳定β-半乳糖苷酶的bgaB基因、任选的用于在需要时调节bgaB基因产物的xylR调节器。
质粒的特定设计可以通过装配所需的遗传成分来构建。遗传成分可以通过来自供体质粒或生物体的所需基因序列的限制酶切消化以产生DNA的末端进行装配，该DNA的末端然后可以容易地连接至另一基因序列。通常，5’或3’突出端可以经由对连接所靶向的这两个序列的限制酶切消化产生。消化之后，可以对靶序列进行纯化，然后用酶(连接酶)连接在一起。质粒可以通过装配含有革兰氏阳性生物体和革兰氏阴性生物体的复制起始点以及赋予氯霉素抗性的cat基因的基质粒来构建。证实了cat基因与基础片段的正确连接之后，对于bgaB基因片段和该基因的T1和T2终止子可以重复此过程。当遗传成分完全装配并确认正确的装配和取向后，可以将质粒插入到可以用作测试生物体的宿主生物体中。
完整的病毒颗粒(其可以被称为病毒体)可以为基因转运蛋白，其可以包含被蛋白质的保护外衣(其可以被称为壳体)包围的核酸。壳体可以包含被病毒基因组编码的蛋白质，并且它的形状可以用作形态学区分的基础。病毒编码的蛋白质单元(其可以被称为启动子)可以是可自装配的以形成壳体，不需要来自病毒基因组的输入；然而，一些病毒可以编码蛋白质，所述蛋白质可以协助它们的壳体的构建。与核酸相关的蛋白质在技术上更多地可以被称为核蛋白质，而与病毒核酸相关的病毒壳体蛋白质可以被称为核壳体。病毒可以不被认为是活生物体，并且可能不具备在宿主细胞外自主复制的方式。本文中与细菌一起使用的病毒可以被称为噬菌体。病毒的实例可以包括λ或M13噬菌体。报告基因可以通过首先用核酸内切酶裂解非重组噬菌体DNA，然后连接DNA的碎片与两个新形成的末端而插入到病毒中。
媒介物(即质粒、病毒)可以被测试生物体通过如下方式摄取：转化或接合，例如，利用质粒进行的，或者转导或转染，例如，利用病毒进行的。
可以由报告基因产生的指示酶可以包括β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其中两种或更多种的混合物。可以使用这些的热稳定或热不稳定的对应物，取决于对于所选的宿主生物体的优选孵育条件。
在灭菌处理期间，可以使用任何适当的程序使基因工程生物指示剂暴露于灭菌介质。
含有所公开的生物指示剂的灭菌指示器可以用于任何处理中，其中灭菌指示器在灭菌处理中暴露于灭菌介质，然后暴露于酶底物以确定灭菌处理是否有效。灭菌处理可以利用气体或液体灭菌剂、干热、辐射等。在灭菌处理过程中可以使灭菌指示器和待进行灭菌的物体一起暴露于灭菌介质。当灭菌处理完成后，基因工程生物指示剂与包含至少一种酶底物的恢复或孵育培养基合并。然后将基因工程生物指示剂与酶底物一起孵育所需的时间段，并对其进行检查以确定灭菌处理是否有效。
基因工程生物指示剂可以用于包括具有两个单独隔室的容器的自含式灭菌指示器中。一个隔室可以含有生物指示剂。另一个隔室可以含有包含至少一种酶底物的恢复培养基。在使用中，灭菌指示器和待进行灭菌的物品可以暴露于灭菌介质。灭菌后，灭菌指示器可以被激活，以使基因工程生物指示剂与恢复培养基充分接触，以确定灭菌处理是否有效。这些灭菌指示器可以用于其中生物指示剂可以暴露于灭菌介质的任何灭菌处理，例如使用气体灭菌剂的灭菌处理。
现在参考附图，图1和2显示根据本发明第一实施方案的灭菌指示器系统10。指示器系统10包含封盖20，其可安装在容器30上。容器30包括闭合的底端31和开放的上端，并限定了内部空间34。封盖20具有外壁22(开放的下端)和闭合的上端23。封盖还包括被设置在封盖外壁的内部的一个内壁(或多个内壁)24，形成一个单独的壁，并限定内腔室26。内腔室26包括邻近于壁24的底端的开口25。腔室26含有流体50，并且封盖20包括设置在内腔室26的开口25周围的可破裂阻挡层40，以将液体50封装在腔室26内。
在图1和图2中示出的实施方案中，指示器系统被配置成使封盖20以扣合关系安装到容器30。在其它实施方案(未显示)中，指示器系统可以被配置成使封盖以螺纹关系安装到容器上，其中封盖通过螺纹与容器啮合，并且通过相对于容器旋转封盖，即将封盖进一步螺丝接合到容器上，来激活所述系统。如图1和图2中所示，容器30包括环状突起物32，形成邻近或接近容器上端的凸起或边缘。封盖20包括环状突起物29，形成邻近封盖底部的凸起或边缘。可以通过使封盖的凸起29滑动到容器的凸起32上方将封盖20安装到容器30上。容器30的凸起32与封盖20上的凸起29啮合，以防止封盖20和容器30脱离。封盖20和容器30可以具有一定的尺寸，使得凸起32对封盖20施加足量的压力以防止封盖20在未向封盖20施加外部向下作用力时向下滑动。这样，可破裂阻挡层40可以与穿刺部件36的边缘38保持间隔开，因此，可破裂阻挡层40不接触穿刺部件和/或不被穿刺部件破坏，直到期望激活指示器时。
如图1和图2中所示，容器30被调整适于破坏可破裂阻挡层40。容器包括一个或多个具有边缘38的突起物36(其在本文中也可以被称为“穿刺部件”)，所述边缘38被调整适于当带有可破裂阻挡层40的封盖20向下移动且阻挡层40接触突起物36的边缘38时破坏或刺破可破裂阻挡层40。穿刺部件36被显示为与容器的内部底壁37成一体并且自容器的内部底壁37向上延伸。在另一实施方案(未显示)中，穿刺部件36可以自侧壁35和自内部底壁37延伸。
为评价灭菌处理，在容器30的内部34内设置校准浓度的微生物。所述微生物可以被直接设置在容器壁35上或者可以被提供在设置在容器30内的支持部件(例如，支持部件70)上。在另一实施方案中，微生物可以被直接设置于底壁37。然后，通过在容器30上安装填充有恢复培养基的封盖20，装配灭菌指示器。可以如上所述通过将封盖20扣合到容器30上，或者例如通过螺纹安装来安装封盖20。参照图1，在第一未激活(或开放)的位置将填充有恢复培养基的封盖20安装在容器30上，使得可破裂阻挡层40保持完整且未被穿刺部件36刺破。期望地，在第一未激活位置，可破裂阻挡层40被置于远离穿刺部件36的边缘38的位置并且不接触穿刺部件36的边缘38。
采用诸如图1所示的被装配的指示器10，然后可以对灭菌指示器进行灭菌处理。封盖20被显示为具有孔隙28，通过该孔隙28灭菌剂蒸汽可以进入并流动到指示器系统中。灭菌剂通过孔隙28进入封盖(进入到外壁22和内壁24之间的空间中)并且通过封盖20上的内壁24的外部空间和容器30上的壁35的内部空间之间界定的空间60流动到容器30中。灭菌剂蒸汽流动到容器30中并作用于基因工程生物指示剂的微生物。
灭菌处理完成后，可以通过将封盖20朝容器30向下移动到第二(或闭合或激活)位置来激活灭菌指示器，如图2所示。通过在封盖20上施加足够的向下作用力或压力使封盖20向下移动。随着封盖20向下移动，可破裂阻挡层40接触穿刺部件36的边缘38，并最终移动到使穿刺部件36的边缘38刺破或穿透可破裂阻挡层40的位置上。当可破裂阻挡层40被刺破时，露出腔室26的开口25，液体恢复培养基50流入到容器30的内部区域34中，并如图2中所示与微生物相接触。可以期望采用扭转动作向下移动封盖20以实现可破裂阻挡层40的更大的或最大的开口，以确保生长培养基完全流入到容器中。
如图1和图2中所示，在这一实施方案中，封盖20的内表面包括第二环状突起物27，而且封盖可以向下移动到某个位置，使得突起物27的上部与容器30上的凸起32的底部啮合，且封盖20保持在第二闭合/激活位置。第二闭合/激活位置可以用于使封盖20与容器30处于密封关系，这可以防止额外的微生物进入系统中。接着孵育灭菌指示器10持续足够的时间段，以允许测定微生物的活力。在孵育过程中，任何活的微生物将代谢和生长，而且这种代谢和生长将副产物释放到培养基中。可以根据任何选择的特征包括例如pH变化、颜色变化、不透明度、荧光等来检测所述副产物。
可以理解，在另一实施方案中，封盖20不包括将容器维持在密闭位置的第二突起物27。在一个替代的实施方案中，容器30可以包括在容器30的外部上且位于凸起32的下方的另一环状突起物或者一组止动装置(未显示)，该突起物或止动装置可被调整适于与封盖上的凸起29啮合，以保持容器30处于密闭位置。美国专利号5,770,393举例说明了这样的配置，并且该专利关于封盖和容器的配置的教导通过引用并入本文。在另一替代的实施方案中，封盖20的内表面与容器30的外表面可以通过螺纹方式连接，并且可以通过将封盖20螺丝接合到容器30上，使封盖20向闭合位置移动并保持在闭合位置上，其中封盖20可以如例如在美国专利号8,173,388B2中所示那样进行螺纹连接，关于瓶的这一实施方案的其它详情可以查阅上述美国专利，并且该专利关于这一实施方案以及前述实施方案的容器和封盖配置的教导通过引用并入本文。所有这些替代配置全部落入本发明的范围内。
如上所述，图1和图2示出的实施方案中的封盖20被显示为具有孔隙28，以便允许蒸汽灭菌剂进入到指示器中。但是，可以理解，封盖不需要具有此类特征。考虑到与灭菌指示器一起使用的具体灭菌剂，可以按需选择孔隙的数量、尺寸、形状和/或位置。例如，可以选择封盖和/或容器中孔隙的位置、形状和尺寸，以便在微生物和周围环境之间提供灭菌蒸汽进入和排出的曲折路径。该曲折路径也可以用于抑制或防止外部物质的污染，并确保可获得足够量的灭菌剂。通过包括曲折路径，更可能使得整个载荷暴露于灭菌剂，从而在杀死灭菌指示器中的测试微生物之前杀死任何现存的微生物。
除了在封盖中提供孔隙之外或者作为在封盖中提供孔隙的替代方法，可以在容器中提供孔隙。此外，如果在容器中提供孔隙，应设定其位置，使得当指示器被激活以及阻挡层破裂时生长培养基不会经这些孔隙泄漏或溢出。
图3描述了除了封盖20中的孔隙28之外，还在容器30的侧壁35中在适当位置形成孔隙80的指示器10。图3中显示的孔隙是在容器30的侧壁35中接近容器30的顶部，在穿刺部件36的边缘38的附近，以避免激活后的泄漏或溢出。从图3中可以看出，激活后，位于这一位置的孔隙80将被处于激活位置的封盖20覆盖。注意到，图3中所示的指示器10包括封盖20中的孔隙28，但这不是必需的。在一个实施方案(未显示)中，容器30包括孔隙80并且与类似于封盖20的封盖一起使用，但该封盖不包括诸如孔隙28的孔隙。因此，可以在封盖中或者在容器中，或者在封盖和容器二者中都提供孔隙。
在已完成灭菌处理后，向下按压封盖20或者向下扭动封盖20，使得穿刺部件36的边缘38穿透并破坏可破裂阻挡层40，释放空间26中的生长培养基，以与灭菌处理后可能存活的任何基因工程生物指示剂微生物混合并一起孵育。恢复培养基50可以包含提供微生物的萌发、代谢和后续生长所需的含水培养基或含水溶液。该含水培养基或含水溶液可以是缓冲的。指示酶，如果是作为已由任何存活的基因工程生物指示剂微生物中的报告基因产生的结果而存在，接触酶底物，导致形成酶修饰产物，其具有可检测的颜色或荧光或其他特征，如pH变化。
酶底物可以包括一种物质或多种物质的混合物，其在被指示酶作用时转化成酶修饰产物。通常，酶修饰产物可以包括发光、荧光或有色物质。或者，酶底物可以包括一种或多种化合物，该化合物在被酶作用时，可以得到产物(例如，活性中间体或能够改变培养基的pH的物质)，该产物与另外的化合物或组成反应以生成发光、荧光或有色物质。
有两种基础类型的酶底物可以用于检测特异性指示酶。第一种类型的酶底物可以是荧光的或生色的，并且可以给予化学通式，如AB。当被指示酶作用时，AB可以分解为A+B。B例如可以是荧光的或有色的。在一个实施方案中，两个B化合物可以一起反应以生成荧光或有色信号。这种类型的荧光底物的具体实例可以是4-甲基伞形酮基磷酸酯(4-methylumbelliferylphosphate)。在指示酶磷酸酶的存在下，底物可以被分解为4-甲基伞形酮和磷酸酯。这种类型的其他荧光底物可以包括4-甲基伞形酮基、7-酰氨基-4-甲基香豆素、吲哚酚和荧光素的衍生物。这种类型的生色底物的实例可以是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯。在磷酸酶的存在下，底物可以分解成靛蓝和磷酸酯。这种类型的其他生色底物可以包括5-溴-4-氯-3-吲哚基、硝基酚和酚酞的衍生物。
第二种类型的酶底物可以给予化学通式CD，例如，其可以被特异酶转化为C+D。然而，C和D可以都不是荧光的或有色的，但是D可以能够与化合物Z进一步反应以生成荧光化合物或有色化合物，因此显示酶活性。这种类型的具体荧光实例可以为氨基酸赖氨酸。在酶赖氨酸脱羧酶的存在下，赖氨酸可以损失一分子的二氧化碳。赖氨酸的剩余部分则可以被称为尸胺，其是强碱性的。基础指示剂如4-甲基伞形酮可以被并入，并且在强碱的存在下可以发荧光。这种类型的生色底物可以是2-萘基磷酸酯。指示酶磷酸酶可以与酶底物反应生成β-萘酚。释出的β-萘酚可以与含有1-重氮基-4-苯甲酰基氨基-2,5-二乙氧基苯的生色试剂反应以产生紫色。
酶底物可以包括荧光化合物，在本文中定义为能够被酶修饰(例如通过水解)以提供明显改变的或增强的荧光的衍生荧光体的化合物。
荧光化合物本身可以是非荧光或变荧光(meta-fluorescent)(即，以与相应的酶修饰产物明显不同的方式发荧光，例如，通过颜色或者强度)，并且适当的激发波长和检测波长可以用于将通过酶修饰显示的荧光信号与可以存在的任何其他信号分开。
对于多种来源的指示酶可以使用许多酶底物。这些可以包括荧光4-甲基伞形酮基衍生物(可水解成4-甲基伞形酮)；7-氨基-4-甲基香豆素的衍生物；二乙酰基荧光素衍生物；和荧光胺。
可以用作酶底物的4-甲基伞形酮基衍生物可以包括：4-甲基伞形酮基-2-乙酰氨基-4,6-O-苯亚甲基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷；4-甲基伞形酮基乙酸酯；4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷；4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-α-D-氨基葡萄糖苷；4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷；2'-(4-甲基伞形酮基)-α-D-N-乙酰基神经氨酸；4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷；4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮基丁酸酯；4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖糖苷；甲基伞形酮基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖苷；4-甲基伞形酮基反油酸酯；4-甲基伞形酮基-β-D-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮基-α-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮基-β-L-岩藻糖苷；4-甲基伞形酮基-α-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷；4-三氟甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷；6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷；4-甲基伞形酮基-α-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮基-7,6-硫代-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸；6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸；4-甲基伞形酮基对胍基苯甲酸酯；4-甲基伞形酮基庚酸酯；4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃甘露糖苷；4-甲基伞形酮基油酸酯；4-三氟甲基伞形酮基油酸酯；4-甲基伞形酮基棕榈酸酯；4-甲基伞形酮基磷酸酯；4-甲基伞形酮基丙酸酯；4-甲基伞形酮基硬脂酸酯；4-甲基伞形酮基硫酸酯；4-甲基伞形酮基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖；4'-甲基伞形酮基-2,3,5-三-β-苯甲酰基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷；4-甲基伞形酮基-β-三甲基铵肉桂酸氯化物；4-甲基伞形酮基-4-胍基苯甲酸酯；和4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷。
可以用作酶底物的7-酰氨基-4-甲基香豆素衍生物可以包括：L-丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-精氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-瓜氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-甲硫氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-焦谷氨酸7-酰氨基-4-甲基香豆素；L-天冬氨酸β-(7-酰氨基-4-甲基香豆素)；L-谷氨酸1-(7-酰氨基-4-甲基香豆素)；L-苯丙氨酸-7-酰氨基-甲基香豆素；和7-戊二酰基-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素。
可以用作酶底物的7-酰氨基-4-甲基香豆素的肽衍生物可以包括：N-t-BOC-IIe-Glu-Gly-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-CBZ-Phe-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-琥珀酰基-Leu-Tyr-7-酰氨基-4-甲基香豆素；Gly-Pro7-酰氨基-4-甲基香豆素；Pro-Phe-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；N-t-BOC-Val-Pro-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素；和N-戊二酰基-Gly-Arg7-酰氨基-4-甲基香豆素。
可以用作酶底物的二乙酰基荧光素衍生物可以包括荧光素二乙酸酯、荧光素二丁酸酯、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯、荧光素二-(β-D-N-乙酰基半乳糖胺)、荧光素二-(β-D-半乳糖苷)、荧光素单-(β-D-半乳糖苷)和荧光素二月桂酸酯。
当要检测其活性的指示酶是α-D-葡糖苷酶、糜蛋白酶或脂肪酸酯酶时，可以使用的荧光酶底物可以分别是4-甲基伞形酮基-α-D-葡萄糖苷、7-戊二酰基苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素，或4-甲基伞形酮基庚酸酯。当要检测其活性的指示酶是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶时，可以使用的荧光酶底物可以是4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷。当要检测其活性的指示酶是β-D-葡糖苷酶时，可以使用的荧光酶底物可以是4-甲基伞形酮基-β-D-葡萄糖苷。
可以使用的酶底物可以是能够被酶修饰以给出衍生生色团的生色化合物，或与另一化合物反应以给出衍生生色团的产物，该生色团具有不同或更强的颜色。生色化合物可以是无色的或以与对应的酶修饰产物明显不同的方式例如通过颜色或强度而有色的。可以以比色仪表使用者公知的方式使用适当的激发和检测波长将通过酶修饰出现的有色信号与可以存在的任何其他颜色分开。
可以用作酶底物的生色化合物可以包括5-溴-4-氯-3-吲哚基衍生物；硝基苯基衍生物；吲哚酚衍生物；以及酚酞衍生物。
可以使用的5-溴-4-氯-3-吲哚基衍生物可以包括5-溴-6-氯-3-吲哚基乙酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基乙酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-1,3-二乙酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃岩藻糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯以及5-溴-4-氯-3-吲哚基硫酸酯。
可以使用的硝基苯基衍生物可以包括对硝基苯酚和邻硝基苯酚衍生物。这些包括二乙基对硝基苯基磷酸酯；二对硝基苯基磷酸酯；对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-3-O-β-吡喃半乳糖基-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基乙酸酯；对硝基苯基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷；对硝基苯基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖苷；对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-α-麦芽糖苷；对硝基苯基-β-麦芽糖苷；对硝基苯基-α-吡喃甘露糖苷；对硝基苯基-β-吡喃甘露糖苷；对硝基苯基肉豆蔻酸酯；对硝基苯基棕榈酸酯；对硝基苯基磷酸酯；二(对硝基苯基)磷酸酯；三(对硝基苯基)磷酸酯；对硝基苯基-β-吡喃葡萄糖苷；对硝基苯基-β-葡糖苷酸；α-对硝基苯基丙三醇；对硝基苯基-α-吡喃鼠李糖苷；对硝基苯基硬脂酸酯；对硝基苯基硫酸酯；对硝基苯基-2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-氨基葡萄糖苷；对硝基苯基胸苷单磷酸酯；对硝基苯基-2,3,4-三-O-乙酰基-β-葡糖醛酸甲酯；以及对硝基苯基戊酸酯。
可用的邻硝基苯酚可以包括邻硝基苯基乙酸酯、邻硝基苯基-β-葡萄糖苷和邻硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。其他可用的硝基苯基衍生物可以包括硝基苯基-β-吡喃岩藻糖苷；硝基苯基-α-吡喃半乳糖苷；硝基苯基-β-吡喃半乳糖苷；硝基苯基丁酸酯；硝基苯基癸酸酯；硝基苯基己酸酯；硝基苯基辛酸酯；硝基苯基月桂酸酯；以及硝基苯基丙酸酯。
可以使用的吲哚酚衍生物可以包括吲哚酚乙酸酯；吲哚酚-β-D-葡萄糖苷；3-吲哚酚硫酸酯；和3-吲哚酚磷酸酯。
可以使用的酚酞衍生物可以包括：酚酞二丁酸酯；酚酞二磷酸酯；酚酞二硫酸酯；酚酞葡糖醛酸；酚酞单β-葡萄糖苷酸；酚酞单β-葡糖醛酸；和酚酞单磷酸酯。
以上所述的生色酶底物可以与适当的指示酶直接反应以产生生色团。
如果衍生的酶修饰产物进一步与生色试剂如重氮化染料，如1-重氮基-4-苯甲酰基氨基-2,5-二乙氧基苯、1-重氮基-4-苯甲酰基氨基-2,5-二乙氧基苯、对重氮基-2,5-二乙氧基-N-苯甲酰基丙氨酸、4-氯-2-甲基苯重氮氯化物和邻氨基偶氮甲苯重氮盐反应以产生生色团，可以应用其他含有1-萘基、2-萘基和萘基AS-BI衍生物的酶底物。
可以使用的1-萘基衍生物可以包括1-萘基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷。
可以使用的2-萘基衍生物可以包括2-萘基-磷酸酯；2-萘基-丁酸酯；2-萘基-辛酸酯；2-萘基-肉豆蔻酸酯；L-亮氨酰基-2-萘基酰胺；L-缬氨酰基-2-萘基酰胺；L-胱氨酰基-2-萘基酰胺；N-苯甲酰基-DL-精氨酸-2-萘基酰胺；N-戊二酰基-苯丙氨酸2-萘基-胺；2-萘基-磷酸酯；6-Br-2-萘基-α-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷；2-萘基-2-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；6-溴-2-萘基-2-D-吡喃甘露糖苷；和2-萘基-α-L-吡喃岩藻糖苷。
可以使用的萘基-AS-BI衍生物可以包括萘基-AS-BI-磷酸酯；和萘基AS-BI-β-D-葡糖苷酸。
当要检测其活性的指示酶是α-D-葡糖苷酶时，酶底物可以是对硝基苯基-α-吡喃葡萄糖苷。当要检测其活性的指示酶是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶时，可以使用的酶底物可以是对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷。当要检测其活性的指示酶是β-半乳糖苷酶时，酶底物可以是5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷或4-甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷。
可以使用的酶底物可以取决于其活性正在研究中的指示酶的身份。下面是一些酶底物和可以与该酶底物反应以产生具有明显改变的或增加的荧光或颜色的相应指示酶的列表。
当指示酶是β-半乳糖苷酶时，酶底物可以包括5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、5-溴-6-氯-3-吲哚基-β-吡喃半乳糖苷(Mag-gal)、5-溴-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Bluo-gal)、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷、6-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Rose-gal)、3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(Y-gal)、5-碘-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、N-甲基吲哚酚-β-D-吡喃半乳糖苷、2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(PNPG)、苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(P-gal)、2-氯-4-硝基苯基-β-D-乳糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、4-三氟甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)(FDG)、荧光素单-β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二-(β-D-乙酰基半乳糖胺)、4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃乳糖苷、2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷、8-羟基喹啉-β-D-吡喃半乳糖苷、试卤灵(Resorufin)β-D-吡喃半乳糖苷、3-羧基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、4-氯甲基-6,8-二氟伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、6,8-二氟-4-十七烷基伞形酮基-β-D-吡喃半乳糖苷、5-(五氟苯甲酰基氨基)-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷、C2-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷、C8-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷、C12-荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷、5-氯甲基荧光素-β-D-吡喃半乳糖苷、C12-试卤灵-β-D-吡喃半乳糖苷、7-羟基-9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)(DDAO)，或者其中两种或更多种的混合物。
含水溶液或含水培养基中酶底物的浓度可以取决于酶底物和指示酶的身份、为通过视觉或通过仪器可检测的所必须生成的酶修饰产物的量、以及确定指示酶是否存在的所需的时间量。可以为足够的酶底物量可以是与在灭菌完成后可以存在的任何指示酶反应从而使可以在最多为约4小时的周期内产生摩尔浓度为至少约10-15摩尔(在一个实施方案中在最多为约2小时的周期内产生摩尔浓度为至少约10-8摩尔)的酶修饰产物所需的量。
含有营养生长培养基和酶底物的含水溶液含水培养基的pH可以在约5至约9.5的范围中，在一个实施方案中为约7.5。
在此处以及本申请公开内容的其他地方，范围和比例限制的数值限值可以组合。因此，例如，在前文中，尽管没有具体列举，在约6到约9范围内的pH和在约7到约8范围内的pH被包括在具体公开的pH范围内。在本申请所述的所有范围内，介于中间的整体值或分数值被认为是被公开的。
在生物指示剂经历过灭菌循环后，恢复培养基中的酶底物可以与该生物指示剂一起孵育。孵育可以在一定条件下继续进行一段时间，所述条件足以释出可检测量的酶修饰产物，假定任何生物指示剂保持为功能性的。通常，可以是可检测的酶修饰产物的量可以低至约1x10-15摩尔。孵育条件可以足以产生至少约1x10-8摩尔的酶修饰产物，在一个实施方案中产生约1x10-6到约1x10-5摩尔的酶修饰产物。产生可检测量的酶修饰产物所需的孵育时间和温度可以取决于指示酶和酶底物的身份以及各自在恢复培养基中存在的浓度。通常，孵育温度可以在约20℃到约70℃的范围中。孵育时间可以在最多至约4小时的范围内，在一个实施方案中在约0.01到约4小时的范围内，在一个实施方案中在约0.1到约3小时的范围内，在一个实施方案中在约0.1到约2小时的范围内，在一个实施方案中在约0.2到约1小时的范围内，在一个实施方案中，在约1分钟到约30分钟的范围内。
可以使用的检测酶修饰产物的普遍适用方法可以包括光度测定、电势测定、重量分析、量热、测量导热率或测量电流技术。可以使用荧光测定法或分光光度法。例如，酶底物可以包含4-甲基伞形酮基衍生物，其与指示酶的相互作用可以生成可以用荧光测定法监测的伞形酮，或者底物可以包括硝基酚，或类似的衍生物类型，其与指示酶的相互作用可以生成可以用比色法监测的酶修饰产物。
生物指示剂，尽管此处主要是就单一指示酶进行描述的，可以提供多种指示酶。例如，生物指示剂可以提供三种类型的指示酶：一种酶对热有抗性的，第二种酶对气体灭菌介质具有抗性，第三种酶对辐射如γ或β辐射具有抗性。
使用所公开的基因工程生物指示剂的优点可以包括在如上对孵育周期所述的相对短的时间周期内提供灭菌是否有效的结果，因为就算需要时间，一般在孵育时间内所需结果就变得明显。通过使用所公开的基因工程生物指示剂，可以直接测量测试生物体的活力，而不用间接测定替代物分子。使用所公开的生物指示剂可以不限于任何特定的灭菌方法。也就是说，所公开的生物指示剂可以用于任何灭菌处理。灭菌处理的有效性可以使用所公开的基因工程生物指示剂来确定，而不需生长出来以提供灭菌有效性的最终证实。通过使用所公开的生物指示剂，可以不必使用电化学传感器来确定灭菌是否有效，尽管采用传感器可能更快速地得到结果。所公开的生物指示剂可以是可修改的，以用于即时读数应用如芯片或传感器应用。所公开的基因工程生物指示剂可适用于任何使用最具抗性的生物体、临床上重要的生物体或生物战生物体的处理。
使用所公开的基因工程生物指示剂检测灭菌处理的有效性可以涉及使用基于基因理论模型(只有活细胞可以表达基因)的测量方法。所公开的基因工程生物指示剂可以对任何致命事件或致命事件的组合做出反应。所公开的生物指示剂可以对任何杀生物作用方式(蒸汽、过乙酸、环氧乙烷、液体甲醛、气体甲醛、稳定的液体过氧化氢、汽化过氧化氢、干热、臭氧、邻苯二甲醛、戊二醛、氯胺、季胺、酚类物质、碘递体(iodophores)、电离辐射、紫外辐射、脉冲白光、等离子体、微波辐射等)提供快速作用反应。
本发明的重要益处包括避免了对测定指示剂颜色变化、荧光等的干扰，由于在基因工程生物指示剂微生物中包括阻遏基因时所需的诱导物的分解，所述干扰已在常规系统中被观察到。通过在基因工程生物指示剂微生物中消除对阻遏基因的需要，也消除了对任何诱导物的需要，因此避免了例如由于木糖分解引起的变色问题以及可能由其他诱导物分解引起的问题。另外，通过省略对在用于转染指示剂微生物的载体中包括阻遏基因的需要，基因修饰得到了极大地简化。
实施例
图4和图5显示了存在木糖的影响、省略木糖的影响、以及因而带来的本发明的益处，图4和图5是在高压灭菌前、1个高压灭菌循环后以及两个高压灭菌循环后，在325nm到900nm波长下的吸光度。如可以理解的，常规上含有诱导物的至少第二隔室在测定灭菌效力的过程中在读取吸光度之前将经历两个高压灭菌循环。第一高压灭菌循环是在灭菌指示器被造好时发生，并且确保生长培养基和酶底物无菌是必要的；第二高压灭菌循环是在灭菌指示器经历灭菌处理时发生，在此过程中其是指示剂。
图4显示高压灭菌前、一个高压灭菌循环后和两个高压灭菌循环后，不含木糖(即，包含0％的木糖)的生长培养基的吸光度。在图4的实例中，关注的酶底物在360nm下吸收电磁辐射，并在420nm下发射荧光。从图4中可以看出，在420nm的附近，生长培养基的吸光度只有很小的差别。
图5显示高压灭菌前、一个高压灭菌循环后和两个高压灭菌循环后，含有1％木糖的生长培养基的吸光度。在图5的实例中，使用相同的关注的酶底物，其在360nm下吸收电磁辐射，并在420nm下发射荧光。从图5中可以看出，在420nm附近，最初生长培养基的吸光度极小，但是在420nm附近，在仅一个高压灭菌循环后生长培养基的吸光度急剧增加，并且在第二高压灭菌循环后生长培养基的吸光度进一步增加。在一个或两个高压灭菌循环后高压灭菌的生长培养基的吸光度如此大以至于将预料到至少部分地且可能完全地混淆因存活的基因工程生物指示剂微生物的生长引起的任何颜色变化或荧光，并因此干扰了对灭菌处理效力的测定。
本发明是为了避免通过图4和图5的比较而如此明显的问题而作出的。
虽然本发明的原理已根据某些特定的实施方案加以解释，但是提供这些实施方案仅是出于举例的目的。可以理解，对于本领域技术人员而言，在阅读本说明书后，实施方案的多种修改方案将变得显而易见。因此，可以理解，本文公开的发明旨在涵盖落入随附权利要求范围内的这些修改方案。本发明的范围仅受权利要求范围的限制。

Claims (15)

1.一种灭菌指示器，包括：
含有基因工程生物指示剂的第一隔室，所述第一隔室被调整适于允许所述生物指示剂在灭菌期间与灭菌介质接触；和
含有至少一种酶底物的第二隔室，所述第二隔室被调整适于使所述酶底物在灭菌期间保持与所述生物指示剂分开，并且所述第二隔室被调整适于在所述生物指示剂已经暴露于所述灭菌介质后，允许所述酶底物接触所述生物指示剂；
其中，所述基因工程生物指示剂包含适合产生指示酶的至少一种测试生物体和至少一种报告基因，所述报告基因被所述测试生物体摄取；
其中，所述灭菌指示器中的测试生物体不含任何活性或可激活的阻遏基因，所述阻遏基因如果存在于所述测试生物体或灭菌指示器中将抑制所述报告基因的表达，并且
其中，选择所述指示酶和所述酶底物以使所述指示酶对所述酶底物的酶促作用产生可检测的信号。
2.权利要求1所述的灭菌指示器，其中通过利用至少一种质粒和/或至少一种病毒，所述报告基因被所述测试生物体摄取。
3.权利要求1或2所述的灭菌指示器，其中所述测试生物体包括嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)和/或萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)的芽孢。
4.权利要求1-3中任一项所述的灭菌指示器，其中所述报告基因包括lacZ、bgaB、xylE、cat，或者其两种或更多种的混合物。
5.权利要求1-4中任一项所述的灭菌指示器，其中所述指示酶包括β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰转移酶、儿茶酚-2,3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其两种或更多种的混合物。
6.权利要求1-5中任一项所述的灭菌指示器，其中所述报告基因包括lacZ或bgaB，且所述指示酶包括β-D-半乳糖苷酶。
7.权利要求2所述的灭菌指示器，其中所述质粒包含报告基因并且不含任何阻遏基因。
8.权利要求2所述的灭菌指示器，其中所述病毒包含至少一种基因转运蛋白，所述基因转运蛋白包含被壳体包围的核酸，所述基因转运蛋白包含报告基因并且不含任何阻遏基因。
9.权利要求8所述的灭菌指示器，其中所述病毒包含至少一种噬菌体。
10.权利要求8所述的灭菌指示器，其中所述病毒包含λ或M13噬菌体。
11.一种灭菌方法，包括：
使待进行灭菌的物品和权利要求1-10中任一项所述的灭菌指示器暴露于灭菌介质中；
合并所述第一隔室和所述第二隔室的内容物；
孵育所述第一隔室和所述第二隔室的合并内容物；以及
通过在孵育后检测存在或不存在可检测的信号来确定所述灭菌方法的效力。
12.权利要求11所述的灭菌方法，其中所述灭菌介质包括蒸汽、干热、辐射、等离子体、一种或多种气体灭菌剂和/或一种或多种液体灭菌剂。
13.权利要求11所述的灭菌方法，其中所述灭菌介质包括电子束辐射、电磁辐射、γ辐射、β辐射、环氧乙烷、气体过氧化氢、液体过氧化氢、福尔马林、戊二醛和/或过乙酸。
14.一种灭菌指示器，包括：
含有基因工程生物指示剂的第一隔室，所述第一隔室被调整适于允许所述生物指示剂在灭菌期间与灭菌介质接触；和
含有至少一种酶底物的第二隔室，所述第二隔室被调整适于使所述酶底物在灭菌期间保持与所述生物指示剂分开，并且所述第二隔室被调整适于在所述生物指示剂已经暴露于所述灭菌介质后，允许所述酶底物接触所述生物指示剂；
其中，所述基因工程生物指示剂包括用于产生指示酶的嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢和选自lacZ、bgaB、xylE和cat的至少一种报告基因，所述报告基因被嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢摄取；
其中，所述灭菌指示器中的嗜热脂肪地芽孢杆菌和/或萎缩芽孢杆菌的芽孢不含任何活性或可激活的阻遏基因，所述阻遏基因如果存在于所述测试生物体或灭菌指示器中将抑制所述报告基因的表达，并且
其中，选择所述指示酶和所述酶底物以使所述指示酶对所述酶底物的酶促作用产生可检测的信号。
15.权利要求14所述的灭菌指示器，其中所述指示酶包括β-D-半乳糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、α-D-葡糖苷酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、丁酸酯酶、辛酸酯酶脂肪酶、氯霉素乙酰转移酶、儿茶酚-2,3-二加氧酶、肉豆蔻酸酯脂肪酶、亮氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、糜蛋白酶、磷酸水解酶、α-D-半乳糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、N-乙酰基-β-氨基葡糖苷酶、β-D-纤维二糖糖苷酶、丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶、酪氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、β-D-葡糖醛酸糖苷酶、脂肪酸酯酶，或者其两种或更多种的混合物。
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