KR102166804B1 - 치수줄기세포 배양용기 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 치수줄기세포를 배양하기 위한 용기에 대한 것으로, 보다 상세하게는 치아로부터 치수줄기세포를 효율적으로 수득하기 위한 치수줄기세포 배양용기에 대한 것이다.
본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기는, 세포배양액이 담겨있는 용기본체(10)와, 상기 용기본체(10)와 결합하는 커버(20)와, 상기 커버(20)의 내부에 수용되는, 치아에서 치수줄기세포를 추출하기 위한 혼합효소(30)와, 상기 혼합효소(30)가 커버(20)에서 이탈되지 않도록 지지해주는 차단막(40)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

치수줄기세포 배양용기{CULTURE CONTAINER OF TOOTH STEM CELL}
본 개시내용은 치수줄기세포를 배양하기 위한 용기에 대한 것으로, 보다 상세하게는 치아로부터 치수줄기세포를 효율적으로 수득하기 위한 치수줄기세포 배양용기에 대한 것이다.
본 명세서에서 달리 표시되지 않는 한, 이 식별항목에 설명되는 내용들은 이 출원의 청구항들에 대한 종래 기술이 아니며, 이 식별항목에 기재된다고 하여 종래 기술이라고 인정되는 것은 아니다.
치수줄기세포란 치아 속에 위치하고 있는 줄기세포로서, 치아아 치수, 즉 신경 안에서 치수줄기세포를 추출하게 된다. 치수는 단단한 치아 속에서 보관되며, 다량의 중간엽 줄기세포를 함유하고 있다. 상기 치수줄기세포는 밀도가 매우 높고, 세포에 증식, 분화하는 능력에도 뛰어나며 치아의 주인인 당사자뿐만 아니라 그 부모나 조부모까지 재생의료에 사용될 수 있어 그 활용가치는 상당히 높다고 할 수 있다. 최근에는, 자연적으로 빠진 치아나 수술에 의해 제거된 치아에서도 쉽게 상기 치수줄기세포로부터 중간엽 세포를 얻을 수 있다는 장점 때문에 치아의 성체줄기세포 공급원으로서의 이용에 대한 관심도 높아지고 있다.
상기와 같은 치수줄기세포는 각종 질병치료를 위하여, 치아로부터 안전하게 추출하여 보관하는 것이 중요하다. 치수줄기세포를 치아에서 추출하기 위한 종래 방법으로는, 1) 우선 발치한 치아에서 충치나 염증과 같은 결손 부위를 제거하고 난 후 1% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 PBS로 세척을 하게 된다. 여기서 PBS란 Phosphate buffer saline(인산 완충 식염수)의 약자로, 세포는 원래 고유한 pH와 삼투농도를 가지고 있는데 그것과 매우 유사한 pH, 삼투 농도를 가지는 용액을 의미한다. 따라서 상기 PBS 용액으로 세척하게 되면 세포에 부담을 덜 주기 때문에 많은 실험에서 PBS를 세척용으로 사용하게 된다. 2) 다음으로, 치아에서 치수조직을 포셉으로 분리한 뒤 배양접시에 두고 가위로 잘게 자르고, 치수줄기세포 전용 배양액인 MEM ahpha 500㎕을 넣고 약 15분간 배양하게 된다. 여기서, 치수줄기세포 배양액이란, 인체에서 성장하는 줄기세포를 체외에서 성장, 분화시키기 위하여 인체와 가장 유사한 환경 속에서 세포를 활성화시켜주는 역할을 하는 용액을 의미한다. 3) 그 다음으로, 효소처리를 위하여 Collagenase type 1mg/mL를 500㎕ 처리한 후 15분간 배양하고, 70um strainer를 이용하여 큰 조직은 제거하고 상층액만 1500rpm, 3min으로 원심 분리하고 난 후 치수줄기세포의 숫자를 측정하는 일련의 과정을 거치게 된다(국내등록특허 10-1895648).
그러나 상기와 같은 종래 방법의 경우, 치아 한 개를 발치할 때마다 바로 치수줄기세포 배양액에 보관하고 난 후 치수줄기세포를 추출하는 것은 비효율적이므로, 최소 수 개에서 수십 개의 치아가 수거될 때까지 발치한 치아를 치수줄기세포 배양액에 수일간 4℃ 온도조건하에서 보관하게 되므로 시간이 많이 소요된다는 단점이 존재한다. 또한, 치아에서 포셉을 통해 치수조직을 추출하는 과정에서 많은 치수줄기세포가 손상되거나 이탈될 수 있어 추출되는 치수줄기세포의 개수가 감소된다는 단점이 있다.
발치한 치아를 치수줄기세포 배양액에 오랫동안 보관할 필요 없이, 빠르고 용이하게 치수줄기세포를 추출할 수 있는 치수줄기세포 배양용기를 제공함에 있다.
또한, 상술한 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 이하의 설명으로부터 또 다른 기술적 과제가 도출될 수도 있음은 자명하다.
본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기는, 세포배양액이 담겨있는 용기본체(10)와, 상기 용기본체(10)와 결합하는 커버(20)와, 상기 커버(20)의 내부에 수용되는, 치아에서 치수줄기세포를 추출하기 위한 혼합효소(30)와, 상기 혼합효소(30)가 커버(20)에서 이탈되지 않도록 지지해주는 차단막(40)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 커버(20)는, 상기 용기본체(10) 입구의 외측부와 결합되는 외측결합부(210)와, 상기 용기본체(10) 입구의 내측부와 결합되는 내측결합부(220)와, 하부가 개방되고, 상기 내측결합부(220)와 상호 지지되어 혼합효소(30)를 수용하는 수용부(230)를 더 포함하고, 상기 차단막(40)은 상기 내측결합부(220) 하단에 구성되어 수용부(230)에 수용되는 혼합효소(30)가 이탈되는 것을 방지하는 것을 특징으로 한다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 커버(20) 상부에 위치하며, 하부를 향해 가압하면 상기 차단막(40)이 찢어지면서 혼합효소(30)가 용기본체(10)로 전달되도록 하는 가압부(50)를 포함한다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 혼합효소(30)는 상기 혼합효소(30)는 collagenase type I, DNase I, papain, cysteine 및 dispase로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 용기본체(10)의 하부면은 원뿔(11) 형상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 개시내용의 실시예에 의하면, 단순하고 간단한 배양용기의 사용으로 인하여, 종래 여러 개의 치아를 보관하였다가 한꺼번에 치수줄기세포를 추출하는 방법과는 달리, 치아를 발치하고 바로 치수줄기세포를 추출할 수 있어 시간효율적이라는 장점이 있다.
또한, 치아에서 포셉을 이용하여 치수조직을 추출하지 않더라도, 배양용기로부터 바로 추출이 가능하므로 수득할 수 있는 치수줄기세포의 숫자가 증대된다는 장점이 있다.
본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 청구범위의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 종래 치아에서 치수조직을 분리하는 과정을 나타낸 사진.
도 2는 본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기의 사시도.
도 3은 본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기의 단면도.
도 4는 본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기의 사용상태도.
도 5는 본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기의 또 다른 실시예에 대한 상세도.
도 6은 본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기의 또 다른 실시예에 대한 상세도.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기의 구성, 동작 및 작용효과에 대하여 살펴본다. 참고로, 이하 도면에서, 각 구성요소는 편의 및 명확성을 위하여 생략되거나 개략적으로 도시되었으며, 각 구성요소의 크기는 실제 크기를 반영하는 것은 아니다. 또한, 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭하며 개별 도면에서 동일 구성에 대한 도면 부호는 생략하기로 한다.
도 1은 종래 치수줄기세포 배양방법에 따른 PBS에 치아를 세척하고 치아에서 치수를 분리하는 과정을 도식화한 사진을 나타낸다.
종래 치아로부터 치수줄기세포를 추출하는 방법의 일 실시예는 다음과 같다. 우선 환자가 치과에 방문하여 치아를 발치하거나 자연스럽게 치아가 잇몸으로부터 탈락되는 경우 보관튜브에 보관하여 치아보관은행으로 운송하게 된다. 여기서 보관튜브는 약 4℃ 정도로 냉장 보관되고, 상기 보관튜브 내에는 PBS(인산 완충 식염수)와 항생제가 들어있어 치아가 오염되는 것을 방지하게 된다. 다음으로, 치아에서 치수조직을 포셉으로 분리한 뒤 배양접시에 두고 가위로 잘게 자르고, 치수줄기세포 전용 배양액인 MEM ahpha 500㎕을 넣고 약 15분간 배양한다. 그 이후에는 치수줄기세포를 추출하기 위하여 필요한 효소 Collagenase type I 1mg/ml을 500㎕ 처리한 후 15분간 배양하게 된다. 그 이후에는, 70㎛ strainer를 이용하여 큰 조직은 제거하고 상층액만 1500rpm, 3min으로 원심 분리하고 난 후 치수줄기세포를 수득하게 된다. 그러나 전술한 종래의 치수줄기세포 추출방법은 치아에서 치수조직을 포셉 등을 이용하여 분리하는 과정에서 많은 세포가 손상되는 문제점이 발생하게 되고, 이를 치수줄기세포 배양액에 배양하여 이후 효소처리를 통해 치수줄기세포를 추출하여도 수득하는 치수줄기세포의 숫자는 상당히 줄어들 수밖에 없다는 문제점이 발생한다.
도 2는 본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기의 사시도를, 도 3은 단면도, 도 4는 사용상태도를 나타낸다.
본 개시내용의 일 실시예에 따른 치수줄기세포 배양용기는, 세포배양액이 담겨있는 용기본체(10)와, 상기 용기본체(10)와 결합하는 커버(20)와, 상기 커버(20)의 내부에 수용되는, 치아에서 치수줄기세포를 추출하기 위한 혼합효소(30)와, 상기 혼합효소(30)가 커버(20)에서 이탈되지 않도록 지지해주는 차단막(40)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 커버(20) 상부에 위치하며, 하부를 향해 가압하면 상기 차단막(40)이 찢어지면서 혼합효소(30)가 용기본체(10)로 전달되도록 하는 가압부(50)를 포함한다.
본 개시내용에 따른 치수줄기세포 배양용기는 크게 용기본체(10)와, 상기 용기본체(10)의 상부를 차단하는 커버(20)로 구성된다. 여기서 상기 커버(20)는 용기를 외부 환경으로부터 차단하는 역할을 하는 뚜껑이라고 볼 수 있으며, 용기본체(10)는 세포배양액이 담겨있는 치아전용 보관용기에 해당한다. 상기 용기본체(10)의 형상은 내부에 공간이 형성되며 개방된 영역을 제외한 나머지 영역들이 전부 폐쇄된 일반적인 용기의 형상으로 구성될 수 있으며, 상기 커버(20)는 용기본체(10)의 개방영역을 폐쇄할 수 있는 구성으로 이루어질 수 있다.
상기 세포배양액은 치수줄기세포 전용배양액인 MEM alpha에 해당할 수 있고, 상기 MEM alpha는 인간 배아를 배반포로 성숙시키거나 미세 중력에서 기능성 장기 조직을 배양하거나, 일차 세포 및 세포주를 배양하는 등과 같이 다양한 응용분야에서 활용되고 있다. 다만 상기 세포배양액이 MEM alpha에 한정되는 것은 아니고, 치수줄기세포를 배양하기 위한 용도의 배양액인 경우 그 어떤 것도 가능하다. 상기 세포배양액이 포함된 용기본체(10)는 바람직하게는 본체 상부에서 커버(20)에 의하여 외부공기와 차단된다. 여기서 상기 커버(20)는 용기본체(10)와 끼움결합, 회전결합 등 다양한 결합방식을 통해 상호 결합될 수 있으며, 이와 같은 결합을 통해 용기본체(10) 내부에 수용되는 세포배양액과 치아가 외부로 이탈되지 않도록 방지하는 역할을 한다.
상기 커버(20)에는, 그 내부에 치아로부터 치수줄기세포를 추출하기 위한 혼합효소(30)가 수용된다. 상기 혼합효소(30)는 치아에서 치수줄기세포를 추출하기 위한 전용 효소에 해당하고, 바람직하게는 상기 혼합효소(30)는 collagenase type I, DNase I, papain, cysteine 및 dispase로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 상기와 같은 성분들이 혼합된 혼합효소(30)는 치아로부터 치수줄기세포를 추출하기 위하여 최적화된 성분들의 혼합액이라고 볼 수 있으며, 이를 10배 농축으로 제조하여 약 0.3ml정도의 혼합효소(30)가 상기 커버(20) 내부에 수용될 수 있다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 커버(20)는, 상기 용기본체(10) 입구의 외측부와 결합되는 외측결합부(210)와, 상기 용기본체(10) 입구의 내측부와 결합되는 내측결합부(220)와, 하부가 개방되고, 상기 내측결합부(220)와 상호 지지되어 혼합효소(30)를 수용하는 수용부(230)를 더 포함하고, 상기 차단막(40)은 상기 내측결합부(220) 하단에 구성되어 수용부(230)에 수용되는 혼합효소(30)가 이탈되는 것을 방지하는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는, 상기 커버(20)의 내측 영역은 용기본체(10)의 입구 영역(또는 개방영역) 외측부(110)와 결합하기 위한 외측결합부(210) 및 용기본체(10)의 입구영역 내측부(120)와 결합하기 위한 내측결합부(220)을 포함할 수 있다. 일 실시예로, 물병의 물뚜껑이 물병에 회전시켜 결합하는 경우에 나선형으로 이루어진 돌기부와 홈을 상호 결합하는 방식과 유사하게, 상기 외측결합부(210)는 용기본체(10)의 외측부(110)와 회전결합하여 상호 결합이 이루어진다. 또한, 상기 내측결합부(220)는 용기본체(10)의 내측부(120)와 회전결합 또는 끼움결합을 통해 상호 결합될 수 있다. 다음으로, 상기 커버(20)의 내측결합부(220)와 상호 지지되기 위하여 하부가 개방되는 수용부(230)를 더 포함한다. 상기 수용부(230)의 측면부는 상기 내측결합부(220)와 상호 지지되도록 끼움 결합될 수 있으며, 하부가 개방되도록 구성됨으로써 이후에 차단막(40)이 찢어지는 경우 내부에 수용된 혼합효소(30)가 하부로 배출되어 치수줄기세포 배양액과 섞일 수 있게 된다.
상기 내측결합부(220) 하단에 구성되어 수용부(230)에 수용되는 혼합효소(30)가 이탈되는 것을 방지하기 위한 상기 차단막(40)이 추가로 구성된다. 여기서, 차단막(40)은 일정한 외력 이상을 가해주지 않는 이상 찢어지거나 파손되지 않는 얇은 두께의 막으로 구성될 수 있으며, 상기 수용부(230) 내부에 수용되는 혼합효소(30)는 수용부(230) 하부가 개방되어 쉽게 이탈될 수 있으나, 내측결합부(220) 하단에 구성되는 차단막(40)에 의하여 외부로 이탈되지 않게 되는 것이다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 커버(20) 상부에 위치하며, 하부를 향해 가압하면 상기 차단막(40)이 찢어지면서 혼합효소(30)가 용기본체(10)로 전달되도록 하는 가압부(50)를 포함한다.
여기서 가압부(50)는 상기 커버(20)의 상부에 위치하며, 더욱 바람직하게는 상기 수용부(230)의 상부영역을 구성할 수 있다. 따라서, 상기 수용부(230)의 상부영역을 손가락 등을 이용하여 가압하게 되면, 상기 수용부(230)가 내측결합부(220)를 따라 내려가면서 차단막(40)을 찢음으로써 혼합효소(30)가 용기본체(10)로 투입된다.
본 개시내용의 바람직한 특징에 따르면, 상기 용기본체(10)의 하부면은 원뿔(11) 형상으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
상기 용기본체(10)는 내부에 배양액과 치아가 수용되는데, 치아의 형상은 일반적으로 내부에 원뿔 형상의 홈이 형성되고, 치수줄기세포는 일반적으로 상기 홈 내부에 포함된다. 따라서, 일반적인 치아의 외형과 일치하도록 용기본체(10)의 하부면의 형상을 원뿔(11) 형상으로 변경함에 따라, 기존보다 적은 양의 혼합효소(30)가 세포배양액과 섞인다고 하더라도, 치아 내부의 원뿔 형상의 홈과 용기본체(10) 하부면이 쉽게 접하게 되므로 용이하게 치수줄기세포를 추출할 수 있게 되는 것이다. 결과적으로, 배양용기 하나당 필요로하는 혼합효소(30)의 양이 줄어들게 되므로 비용 절감의 효과가 인정된다.
이와 같이, 상기 치수줄기세포 배양용기를 사용하여, 용기본체(10)에 배양액과 함께 담겨있는 치아가 커버(20)에서 투입되는 혼합효소(30)와 섞이게 되고, 보다 잘 섞이게 하기 위하여 인위적 힘을 가할 수 있다. 다음으로, 상기 치아가 담긴 배양용기를 약 30분 가량 90%의 습도 및 37℃의 온도 조건하에서 5% CO2 배양기에서 배양시키게 되면 치아로부터 충분히 많은 치수줄기세포를 추출할 수 있게 된다.
아래 그림은, 종래 치아로부터 치수줄기세포를 추출하는 방법에 따라서 추출한 치수줄기세포의 세포수와 소요시간 및 본 개시내용에 따른 치수줄기세포 배양용기를 사용하여 수득한 치수줄기세포 세포수와 소요시간을 비교한 그래프이다.
Figure 112018122472001-pat00001
Figure 112018122472001-pat00002
보다 상세하게는, 기존 방법을 통해 치수줄기세포를 추출하게 되면 치아 3개에서 추출한 치수줄기세포의 평균 세포수는 실험결과 약 1.9 x 105±0.2로 나타났으며, 그 소요시간은 27±0.2분 정도 소요되었다. 그러나 본 개시내용에 따른 치수줄기세포 배양용기를 사용한 실험결과, 약 6.7 x 105±0.7로 나타났으며, 그 소요시간은 1분이내로 확인되었다.
결과적으로, 상기와 같은 치수줄기세포 배양용기를 활용함으로써, 치수줄기세포를 수득한 경우에, 종래 방법에 비하여 훨씬 많은 수의 치수줄기세포를 단시간에 수득할 수 있다는 장점이 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하였지만, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
10 : 용기본체
11 : 원뿔
13 : 볼록부
15 : 하부캡
20 : 커버
30 : 혼합효소
40 : 차단막
50 : 가압부
110 : 외측부
120 : 내측부
210 : 외측결합부
220 : 내측결합부
230 : 수용부

Claims (5)

  1. 치수줄기세포의 분리 및 보관용 치수줄기세포 보관용기로서,
    상기 치수줄기세포 보관용기는
    세포배양액이 담겨있는 용기본체(10);
    상기 용기본체(10)와 결합하는 커버(20);
    상기 커버(20)의 내부에 수용되는, 치아에서 치수줄기세포를 추출하기 위한 혼합효소(30);
    상기 혼합효소(30)가 커버(20)에서 이탈되지 않도록 지지해주는 차단막(40); 및
    상기 커버(20) 상부에 위치하는 가압부(50);를 포함하고,
    상기 용기본체에는 치아가 투입되며,
    상기 가압부는 하부를 향해 가압하면 차단막(40)이 찢어지면서 혼합효소(30)가 용기본체(10)로 전달되어 혼합효소와 치아가 혼합될 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 치수줄기세포 보관용기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 커버(20)는,
    상기 용기본체(10) 입구의 외측부와 결합되는 외측결합부(210);
    상기 용기본체(10) 입구의 내측부와 결합되는 내측결합부(220);
    하부가 개방되고, 상기 내측결합부(220)와 상호 지지되어 혼합효소(30)를 수용하는 수용부(230);를 더 포함하고,
    상기 차단막(40)은 상기 내측결합부(220) 하단에 구성되어 수용부(230)에 수용되는 혼합효소(30)가 이탈되는 것을 방지하는 것을 특징으로 하는 치수줄기세포 보관용기.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 혼합효소(30)는 collagenase type I, DNase I, papain, 및 dispase로 이루어지는 것으로부터 선택된 두 개 이상인 것을 특징으로 하는 치수줄기세포 보관용기.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 용기본체(10)의 하부면은 원뿔(11) 형상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 치수줄기세포 보관용기.
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