CN101014375A - 角膜上皮片及其制作方法 - Google Patents

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Abstract

提供具有类似角膜上皮的细胞层的角膜上皮片。进行如下步骤得到角膜上皮片：a)分别调制作为自体细胞的第1细胞以及与该第1细胞来源不同的第2细胞的步骤；b)把上述第1细胞以及上述第2细胞播种于胶原层上进行培养的步骤；c)上述第1细胞以及上述第2细胞增殖形成细胞层后，把该细胞层的最表层与空气进行接触的步骤。

Description

角膜上皮片及其制作方法
技术领域
本发明涉及角膜上皮片及其制作方法。本发明可用于需要移植角膜上皮的疾病(眼表面疾病)的治疗上。本发明尤其对双眼性的角膜性疾病提供有效的治疗手段。
背景技术
对于角膜被结膜上皮被覆而产生混浊的眼表面疾病，作为外科治疗目前施行角膜上皮移植术。但是，对于伴有严重炎症的难治性角结膜疾病(史蒂芬强森(Stevens-Johnson)综合征或眼类天疱疮、角膜腐蚀等)来说，其预后是非常不良的。其最大的原因，可以举出具有强抗原性的异体(allo)的角膜上皮被宿主的免疫系统所识别而受到排斥。尤其是，为了预防排斥反应而在术后将大量的免疫抑制剂全身或局部给药所致的合并症也成为其预后不良的重要原因。另一方面，在使用异体的角膜上皮的情况下，有供者不足的问题。因而，不用异体而用自体的角膜上皮组织进行移植被认为是很理想的。但是，在单眼性的疾病(角膜腐蚀等)中，曾见过用健康眼的角膜上皮移植到患眼中从而收到良好效果的报告，可是难治性角膜疾病的多数为双眼性，故实际上不能用这种方法。
另一方面，至今对于不适宜角膜移植的史蒂芬强森(Stevens-Johnson)综合征或眼类天疱疮、化学外伤、复发性翼状胬肉等的难治性角结膜疾病，作为外科治疗法，本发明者从平成11年以来，实施了以被京都府立医科大学伦理委员会承认的羊膜为基质的培养角膜上皮移植术获得了比较良好的治疗效果(参考非专利文献1～3)。另外，从平成14年以来，实施了京都府立医科大学的以人类为对象的、被医学研究审查委员会承认的培养自体口腔粘膜上皮移植术，使治疗效果得到提高(参考专利文献1、非专利文献4)。
专利文献1：国际公开第03/043542号小册子
非专利文献1：Noriko Koizumi et al.，Ophthalmology 2001；108：1569-74。
非专利文献2：Noriko Koizumi et al.，Arch Ophthalmol2001；119：298-300。
非专利文献3：Nakamura T et al.，Cornea.22；70-71：2003。
非专利文献4：Nakamura T et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci.2003；44：106-16。
发明内容
由于难治性角结膜疾病多数为双眼性，以羊膜为基质的培养角膜上皮移植术治疗法的多数不得不依赖利用他人(allo)的组织，因此排斥反应或细菌感染症等的问题大大影响术后效果是目前的现状。另外，通过培养自体口腔粘膜上皮移植手术的治疗法，虽可以使用自体(auto)口腔粘膜而可以避免排斥反应等危险性，但是有培养上皮片的透明性的问题或者在术后有产生血管新生等病例，期待着今后开发出更好的治疗法。
以上的情况中，本发明者们探索了用自体组织进一步发展眼表面再建术的可能性。结果想出了如下的新方法：将自体的细胞，以及与其来源不同的细胞组合培养使其杂交化，从而由此构建角膜上皮样的粘膜上皮层。这里，尝试了选择口腔粘膜上细胞作为自体细胞，另一方面选择角膜上皮细胞作为与其来源不同的细胞来构建角膜上皮片时，确认了来自二种细胞的细胞杂交化形成的细胞群，形成与角膜上皮类似的分化、重层化的粘膜上皮层。另外，用动物移植实验确认了这样得到的粘膜上皮层保持眼表面的恒常性，并且具备良好的存活性。
这里，活体中存在各种各样的粘膜上皮组织，它们具有粘膜上皮特有的许多共同点。考虑这一情况，认为例如即使是结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞等、构成其他粘膜组织的细胞，也可以与口腔粘膜上皮细胞同样，作为用于形成如上所述角膜上皮样的粘膜上皮层的自体细胞而利用。尤其是，结膜上皮细胞是构成角膜上皮近邻组织的细胞，因而可以考虑为有效的细胞源。
还有，一般来说，形成组织的细胞通过接受外部信号等而由其前体细胞或进而是未分化的细胞所生成。综合考虑这些情况，认为只要具有向上述细胞(口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞等)分化能力的，即使是未分化的细胞，也可以与这些细胞同样，作为形成粘膜上皮层时的自体细胞而使用。
另外，如后述的实施例所示，实验确认了即使将人的口腔粘膜上皮细胞和人羊膜上皮细胞杂交化的情况下，也可能形成类似角膜上皮的粘膜上皮层。即，判明了即使使用角膜上皮以外的细胞作为组合细胞，与作为自体细胞的口腔粘膜上皮细胞进行杂交化的时候，也可以形成角膜上皮样的粘膜上皮层。由此想到了构成角膜上皮的近邻组织的结膜上皮细胞，与羊膜上皮细胞同样是可以使用的细胞的一个有力候补。
如上所述，本发明者们精心研究的结果是，以实验确认了培养包括自体细胞的二种以上的细胞，使其杂交化，从而可构建角膜上皮样的粘膜上皮层。本发明基于以上的成果，提供以下构成。
即，作为本发明第一部分，提供如下的角膜上皮片：备有包含作为自体细胞的第1细胞和与该第1细胞来源不同的第2细胞的、重层化的细胞层。
在本发明的一种方式中，前述第1细胞是选自来自口腔粘膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞、来自鼻腔粘膜上皮的细胞、和来自其他粘膜上皮的细胞、以及来自可以构建这些任何一种粘膜上皮的未分化细胞中的一种以上的自体细胞，前述第2细胞是选自来自角膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞、以及来自羊膜上皮的细胞中的一种以上的细胞。
本发明的另一方式是以前述第1细胞为来自口腔粘膜上皮的细胞为特征。
本发明的又一方式是以前述第2细胞为他人的细胞为特征。
本发明的再一种方式是以前述第2细胞为来自角膜上皮的细胞或者来自羊膜上皮的细胞为特征。
作为本发明的其他方式，提供备有前述细胞层以及胶原层的角膜上皮片。在该方式中，在胶原层上形成前述细胞层。胶原层优选来自羊膜或去除上皮的羊膜。
本发明的角膜上皮片的细胞层优选具有一个以上的以下性状或者特性：最表层的细胞没有角化；
最表层的细胞为扁平形状；
具有屏障功能。
作为本发明的第2部分，提供角膜上皮片的制作方法。本发明的制作方法包括：
a)分别调制作为自体细胞的第1细胞，以及与该第1细胞来源不同的第2细胞的步骤；
b)把前述第1细胞以及前述第2细胞播种到胶原层上进行培养的步骤；以及
c)前述第1细胞以及前述第2细胞增殖形成细胞层后，把该细胞层的最表层与空气接触的步骤。
在本发明的一方式中，前述第1细胞为选自口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞、及其他粘膜上皮细胞、和可以构建这些任何一种粘膜上皮的未分化细胞中的一种以上的自体细胞，前述第2细胞为选自角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、以及羊膜上皮细胞中的一种以上的细胞。
本发明的另一方式中，使用口腔粘膜上皮细胞作为前述第1细胞。
本发明的又一方式中，使用他人细胞作为前述第2细胞。
本发明的再一种方式中，使用角膜上皮细胞或羊膜上皮细胞作为前述第2细胞。
前述步骤b可以在以下任何一种条件下实施。
1)在支持细胞的共存下；
2)在支持细胞的共存下，并且在支持细胞和前述胶原层之间存在不能通过支持细胞的孔径的隔离膜的状态。
前述胶原层优选来自羊膜或去除上皮的羊膜。
附图说明
[图1]是模式地表示在羊膜上培养口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞时的器具等的状态的剖面图。在培养皿1里面静置培养插入容器2，在培养皿1底面形成3T3细胞层5。另外，表示在培养插入容器2的底面上静置羊膜3、在其上培养口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞4的状态。符号6是培养基。1培养皿(culture dish、第1容器)，2培养插入容器(cultureinsert、第2容器)，3羊膜，4口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞，53T3细胞层，6培养基。
[图2]是把口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞在羊膜上培养一天后的光学显微镜像(左)和荧光染色像(右)。RO表示兔子口腔粘膜上皮细胞(rabbit oral epithelium)。在荧光染色像中可确认表示来自口腔粘膜上皮细胞的细胞存在的Dil信号(橙色)。
[图3]是把口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞在羊膜上培养3天后的光学显微镜像(左)和荧光染色像(右)。RO表示兔子口腔粘膜上皮细胞(rabbit oral epithelium)。在荧光染色像中可确认表示来自口腔粘膜上皮细胞的细胞存在的Di1信号(橙色)。
[图4]是把口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞在羊膜上培养7天后的光学显微镜像(左)和荧光染色像(右)。RO表示兔子口腔粘膜上皮细胞(rabbit oral epithelium)。在荧光染色像中可确认表示来自口腔粘膜上皮细胞的细胞存在的Dil信号(橙色)。
[图5]表示在羊膜上形成的细胞层作免疫染色的结果。左为对于角蛋白1(K1)和10(K10)的染色性，中央为对于角蛋白3(K3)和角蛋白12(K12)的染色性，右为对于角蛋白4(K4)和角蛋白13(K13)的染色性。
[图6]是将实施例的角膜上皮片移植后，经过2天时的眼表面(前眼部)的状态(左)和眼表面的荧光素染色像(右)。
[图7]是将实施例的角膜上皮片移植后，经过1周时的眼表面(前眼部)的状态(左)和眼表面的荧光素染色像(右)。
[图8]是将实施例的角膜上皮片移植后，经过2周时的眼表面(前眼部)的状态(左)和眼表面的荧光素染色像(右)。
[图9]是移植后经过2周时的角膜上皮片的HE(Hematoxylin-Eosin)染色像。
[图10]表示移植后经过2周时的角膜上皮片作免疫染色的结果。左为对于角蛋白1(K1)和10(K10)的染色性，中央为对于角蛋白3(K3)和角蛋白12(K12)的染色性，右为对于角蛋白4(K4)和角蛋白13(K13)的染色性。
具体实施方式
本发明的第1部分涉及角膜上皮片。这里所说的“角膜上皮片”是指，至少在其一部分中具有类似于角膜上皮特征的片状结构体。
本发明的角膜上皮片备有特有的细胞层。该细胞层的特征为，包含自体细胞(本说明书中称为“第1细胞”)、以及与该自体细胞来源不同的细胞(本说明书中称为“第2细胞”)，进行重层化。本说明书中，包含如此来源不同的二种以上的细胞所构成的情况也称作“杂交”。另外，所谓“重层化”，是指由多个细胞层所构成。本发明的角膜上皮片典型的是具有4～8层左右的细胞层。
在细胞层中细胞的含有形态(杂交化的状态)没有特别的限定，例如各细胞可以分散存在，也可以是任意一种的细胞(或多种的细胞)一定地集中起来存在。还有，各细胞的含有率可以在细胞层全体中不均匀。
在本发明中的第1细胞是自体细胞。本说明书中的所谓“自体”是指使用本发明角膜上皮片的对象，即指接受移植者(受者)。另外，如此“自体”以外的人称为“他人”。
在与后述的第2细胞实施杂交化的情况下，只要是可能形成角膜上皮样的粘膜上皮层，就不特别限定第1细胞的种类。作为第1细胞的例子，可以举出口腔粘膜上皮、结膜上皮、鼻腔粘膜上皮等的来自粘膜上皮的细胞，或者可举出来自可以构建这些粘膜上皮的未分化细胞(即粘膜上皮干细胞)的细胞。在此，在本说明书中所谓“来自或来源”是以特定目的使用出发材料。因此，例如说来自口腔粘膜上皮(或来源)细胞是指以口腔粘膜上皮细胞作为出发材料而获得的细胞。还有，在本发明中所谓“可以构建粘膜上皮的未分化细胞”是指具有向构建该粘膜上皮的细胞分化能力的细胞。例如说可以构建口腔粘膜上皮的未分化细胞是指可以向口腔粘膜上皮细胞分化的细胞。作为未分化细胞的具体例，可以举出口腔粘膜上皮或结膜上皮等，构成特定的组织的细胞的前体或干细胞，或者分化度更低的上皮干细胞等。
本发明中的细胞层可以包含不同的二种以上的第1细胞。例如，可以在包含来自口腔粘膜上皮的细胞和来自结膜上皮的细胞的状态下构建细胞层。
在本发明中的“口腔粘膜上皮”包括口腔内缘粘膜上皮部、口唇部、上颚部、颊部等。其是来自口腔粘膜上皮的细胞，可以以表达口腔粘膜上皮特异的角蛋白4、或角蛋白13作为指标而确认。另外，也可以以表达角蛋白3作为指标。已知该角蛋白3是一种角膜特异的角蛋白，但也确认在口腔粘膜上皮中被表达。还有，在表达作为该角膜特异的角蛋白的角蛋白3方面，可以说优选把口腔粘膜上皮细胞作为制作角膜上皮移植用组合物的材料而使用。
另外，也可依据研究口腔粘膜上皮细胞特异的基因的表达，确认其是来自口腔粘膜上皮的事实。
还有，来自口腔粘膜上皮以外的组织的细胞的情况也同样，可以通过检测在该组织中特异的标记物或者基因的表达来确认其来源。
作为第2细胞的具体例，可举出来自角膜上皮、结膜上皮、或羊膜上皮的细胞。其中优选第2细胞为来自角膜上皮或结膜上皮的细胞。这是因为由来自眼表面组织的细胞构建的细胞层，具有更接近于角膜上皮的特性。特别优选第2细胞为来自角膜上皮的细胞。这是因为可成为更接近于角膜上皮特性的细胞层。
第2细胞可以是自体细胞或他人的细胞。如果是由自体细胞构建的细胞层，则成为没有或很少免疫排斥问题的细胞层。如果是由他人的细胞构建的细胞层，则作为原材料的细胞容易得到，因此从制作的观点看是有利的细胞层。本发明的细胞层也可以包含不同的二种以上的第2细胞。例如，可以在包含来自角膜上皮的细胞和来自结膜上皮的细胞的状态下构建细胞层。
在本发明的角膜上皮片中的细胞层为来自角膜上皮的细胞的根据是：例如，可以以表达角膜上皮特异的角蛋白3或角蛋白12作为指标来确认。另外，也可以以表达角蛋白4为指标。
还有，同样在来自角膜上皮以外组织的细胞的情况中，通过检测在该组织中特异的标记物或者基因的表达来确认其来源。
在本发明的角膜上皮片中的细胞层优选具有以下性状或特性中的几个。特别优选具有以下全部的形状或特性。
(1)最上层的细胞没有角化。这是角膜上皮具有的一个特征。通过确认该特征，本发明的角膜上皮片类似于角膜上皮，能期望发挥与角膜上皮同样的功能。还有，所谓角化，也可称为角质化，是指细胞内生成角蛋白，失去核等的细胞内小器官的现象。细胞是否角化，可以通过例如细胞的扁平化或有无核作为指标来确认。
(2)最上层的细胞为扁平状。即，口腔粘膜上皮细胞层这样构成：在含有近似圆柱形状的细胞的层上形成含有扁平状的细胞的层。认为通过扁平状的细胞覆盖最上层，细胞间的气密性提高，可以起到以下的屏障功能。在角膜上皮中最上层的细胞也是扁平状。通过确认该特征，本发明的角膜上皮片与角膜上皮类似，可以期待发挥与角膜上皮同样的功能。
(3)具有屏障功能。屏障功能是指防止来自表层的液体、气体等的浸润或液体通过表层而放散等的功能。通过具有如此屏障功能，移植后可以在其表面保持水分(泪)，而且可防止必要以上的水分放散。角膜由于具有屏障功能可保持其表面的水分，因此发挥耐受眨眼的功能。因而具有屏障功能是寻求角膜用移植材料的一个重要的特征。通过确认该特征，本发明的角膜上皮片与角膜上皮类似，可期待发挥与角膜上皮同样的功能。是否具备屏障功能，例如，可以通过含有西洋辣根过氧化物酶(Horseradishperoxidase)等标识物质的溶液的浸润程度来检测。
本发明的角膜上皮片，可用于对角膜损伤、缺损的患者的移植材料(代替角膜上皮)。移植的时候，优选用手术用缝合线把移植片与周围的组织固定，促进其存活。还有，移植后，优选用治疗用隐形眼镜暂时地覆盖移植部表面来进行保护。
本发明的角膜上皮片的一个形态为，上述细胞层是在胶原层上形成的。即，在该形态中备有细胞层还有胶原层。在此的胶原层优选为来自羊膜。通过羊膜的高活体亲和性和低免疫原性，可以成为活体亲和性更好而且免疫原性低的角膜上皮片。从制作角膜上皮片的角度，也优选使用来自羊膜的胶原层。即，如后所述，备有胶原层的角膜上皮样片是以胶原层作为基质在其上播种规定的细胞，进行培养而形成获得的，羊膜由于具有细胞在其上良好的附着和增殖的特性，若使用来自羊膜的胶原层，则细胞可以良好地附着、增殖、形成细胞层。
胶原层更优选来自用搔爬处理等除去上皮的羊膜。这是由于通过不含有上皮成分，可以形成进一步降低免疫原性的角膜上皮片。另外，由于细胞在除去上皮的羊膜上更好地附着、增殖，因而可以得到以更短的时间构建高品质的角膜上皮片的制作上的优点。
胶原层是以除去上皮的羊膜为原材料，这可以通过检测胶原层中不含羊膜上皮层的细胞来确认。另外，作为羊膜，特别优选使用人羊膜。
如上所述，本发明的角膜上皮片可以对角膜损伤、缺损等患者作为移植材料(代替角膜上皮)而使用，在备有胶原层的角膜上皮片的情况下，使胶原层成为眼球侧的方式移植到角膜上皮缺损部位。另外，在胶原层上形成细胞层以后，通过去除胶原层而获得的角膜上皮片的情况，通常将存在胶原层的侧成为眼球侧的方式移植到角膜上皮缺损部位。
移植的时候，优选用手术用缝合线把移植片固定于周围的组织，促进存活。另外，在移植后，优选用治疗用隐形眼镜暂时覆盖移植部表面来进行保护。
本发明的角膜上皮片可由以下方法(本发明的第2部分)制作。本发明的第2部分是涉及角膜上皮片的制作方法，包括以下的步骤而构成。
a)分别调制作为自体细胞的第1细胞以及与该第1细胞来源不同的第2细胞的步骤。
b)把前述第1细胞以及前述第2细胞播种在胶原层上进行培养的步骤。
c)前述第1细胞以及前述第2细胞增殖形成细胞层后，使该细胞层的最表层与空气接触的步骤。
本发明的制作方法的特征之一是共培养二种类以上的细胞。如后述实施例(共培养口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞)所示，根据具备这样的特征的方法，观察到良好的细胞增殖及与之相伴迅速形成的细胞层。如此，通过共培养二种以上的细胞，可以达到在更短时间形成细胞层的效果。
作为第1细胞优选采用口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞、或其他的粘膜上皮细胞、或者可以构建这些任意一种粘膜上皮的未分化细胞。另外，作为第2细胞优选采用角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、或者羊膜上皮细胞。这些细胞是从其存在的活体组织中采取的。具体的例如，用手术刀采取存在目的细胞的组织的一部分后，经过去除结缔组织、分离细胞等处理，调制成细胞浮游液(悬浊液)的形态。还有，作为第1细胞也可以采用不同的二种以上的细胞。第2细胞也同样可以采用不同的二种以上的细胞。
作为第1细胞的采取源，在合适的口腔粘膜上皮中提示有干细胞的存在，想必容易实施向形成上皮细胞层的分化诱导。另外，利用口腔粘膜上皮细胞，具有如下优点：容易采取，可大量采取细胞，进而在处置双眼性患者的情况下也可以用自体的细胞调制移植材料等。尤其是，对于不能采取角膜上皮细胞的患者，可以适用来自自体细胞的移植材料的优点是，可以大幅解除临床上极其重要的排斥反应的问题。
作为口腔粘膜上皮细胞可以采用存在于齿根部的细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)、口唇部细胞、上颚部细胞、颊部细胞等。其中口腔内缘粘膜上皮细胞由于其增殖性能高，而且抗原性低，故特别优选采用。口腔粘膜上皮细胞可以从目的细胞存在的地方用手术刀等实施切除，或进行搔爬来采取。对于口腔内缘粘膜上皮细胞，可以把拔牙上附着的口腔粘膜上皮从牙釉质牙骨质移行部分离，由此进行采取。还有，为去除结缔组织等不纯物，优选实施用分散酶或胰蛋白酶等酶处理，及过滤处理。
根据本发明制作的角膜上皮片可以采用从准备进行移植的患者以外的口腔所采取的口腔粘膜上皮细胞，但若考虑免疫排斥反应，优选从患者自体的口腔采取口腔粘膜上皮细胞进行培养。
口腔粘膜增殖能高，通常，术后数日内服抗生剂，漱口药水(Isodine)消毒等来治愈创伤，因而采取粘膜引起的患者自体的侵害认为是轻度的。
另一方面，作为第2细胞可以优选用他人(allo)的角膜上皮细胞。这样的角膜上皮细胞，例如可以从眼库(Northwest eye bank等)、没有感染症的供者的眼球中获得。作为第2细胞可以使用的细胞不限于角膜上皮细胞，也可以使用结膜上皮细胞、羊膜上皮细胞等。但是，若采用在活体中构成角膜上皮的角膜上皮细胞或在其近邻中存在的结膜上皮细胞，则认为可构建更好地再现角膜上皮特性的角膜上皮片。如后述的实施例所示，在使用角膜上皮细胞作为第2细胞的情况中，确认可以构建近似于角膜上皮的细胞层。这一事实支持上述的预想，并且印证了特别优选角膜上皮细胞作为第2细胞。另一方面，如后述的实施例所示，即使使用羊膜上皮细胞作为第2细胞的情况，也被确认可形成良好地再现角膜所要求的特性的细胞层。这一事实表明，可以优选使用羊膜上皮细胞作为第2细胞。
可以利用自体的细胞作为第2细胞，但是采用他人的细胞，可以更容易获得细胞。例如，为双眼性患者制作治疗用角膜上皮片的情况中，也可以取得作为第2细胞的角膜上皮细胞。
分别调制的第1细胞和第2细胞(以下，把这些归纳称作“第1细胞等”)播种在胶原层上，进行培养(步骤b)。通常，调制成细胞浮游液形态的第1细胞和第2细胞分别往胶原层上滴落，实施培养。
典型的是，第1细胞播种和第2细胞的播种同时(这里的“同时”当然包括文字所表示的同时，也包括一方播种后没有实质性的时间间隔而播种另一方的情况)实施，例如，在播种第1细胞后经过数分～数小时的时间，播种第2细胞等，也可以用不同的时机播种两者。这样通过错开播种时期，如构建富有来自第1细胞的细胞区域局部存在的细胞层等，可以改变或调整细胞层的构成以及与其伴随的特性。
播种的第1细胞等的比率没有特别的限定，典型的是，大体上使第1细胞和第2细胞的播种数相同。还有，作为第1细胞采用口腔粘膜上皮细胞，作为第2细胞采用角膜上皮细胞的实验中，比较第1细胞的数与第2细胞的数的比为3∶7的情况、5∶5的情况、以及7∶3的情况的结果，确认对这些细胞的增殖以及重层化，它们之间没有明显的差异(不出示数据)。
这里，成为胶原层原材料的胶原的种类没有特殊的限定，可采用I型胶原、III型胶原、IV型胶原等。也可以采用多种胶原的混合体。这些胶原可以是从猪、牛、羊等的动物的皮肤、软骨等的结缔组织中用酸溶解法、碱溶解法、酶溶解法等提取、精制。还有，从降低抗原性的目的出发，优选采用通过用胃蛋白酶和胰蛋白酶等分解酶处理去除了端肽、所谓的组织修复胶原。
作为胶原层，优选采用来自羊膜，尤其优选采用来自人的羊膜的胶原层。这里，所说的来自羊膜是意味着以羊膜为出发原料所广泛得到的物质。人羊膜覆盖子宫和胎盘的最表层，在富有胶原的实质组织上形成基底膜，上皮层而构成。人羊膜例如可以在分娩时从作为产后所得到的人胎儿膜、胎盘等中采取。具体来说，通过处理、精制分娩后立刻获得的含有人胎儿膜、胎盘以及脐带的一体物，可以调制成人羊膜。处理、精制的方法，可采用特开平5-5698号中记载的方法等公开的方法。即，可以从分娩时获得的胎儿膜中剥离羊膜，经超声波洗净等物理处理以及酶处理等去除残存组织，经过适宜的洗净工序来调制人羊膜。
如此调制的人羊膜可以冻结保存到使用时为止。人羊膜的冻结，例如可以在-80℃下、DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和甘油以等体积比混合的液体中实施。通过冻结保存不仅可以提高操作性，也可期待降低抗原性。
羊膜可以原样作为胶原层使用，但优选使用经过搔爬处理从羊膜中去除上皮的羊膜。例如，把如上所述冻结保存的人羊膜解冻后，用EDTA和蛋白分解酶处理，缓解细胞间的连接，然后用细胞刮器等搔爬上皮，从而可以调制去除上皮的人羊膜。
使用去除上皮的羊膜作为胶原层的情况，优选在去除上皮而表露的一面侧(即基底膜侧)播种第1细胞等。在该面侧上富含IV型胶原，因此认为播种的第1细胞等的增殖、重层化会良好地进行。
可以将第1细胞及第2细胞分别以例如细胞密度为约1×103个/cm2以上，优选约1×103个/cm2～约1×105个/cm2，更优选约1×104个/cm2～约1×105个/cm2的方式播种在胶原层上。
优选第1细胞等的培养在支持细胞存在的条件下实施。所谓支持细胞也称饲养(feeder)细胞，在培养液中供给成长因子等。由于在与支持细胞的共存下培养，所以提高细胞的增殖效率。支持细胞中，可采用3T3细胞(瑞士鼠3T3细胞、鼠NIH3T3细胞、3T3J2细胞等)等。其中，从增殖效率和操作容易等观点看，优选鼠NIH3T3细胞作为支持细胞而使用。
优选把支持细胞事先用丝裂酶素C等实施非活性化。这是为了防止随着支持细胞自我增殖而阻碍第1细胞等的增殖，来提高第1细胞等的增殖效率。如此的不活性化，也可以通过放射线处理等来实施。
支持细胞的细胞密度可以是，如约1×102个/cm2以上，优选1×102个/cm2～约1×107个/cm2，更优选约1×103个/cm2～约1×105个/cm2。用与第1细胞等的对比来说，例如相对第1细胞和第2细胞的合计数，可以将使用的支持细胞数在1/103倍～1×102倍，优选1/102～1倍的条件下实施培养。若支持细胞数少，则第1细胞等的增殖率降低，在过于少的情况下，得不到第1细胞等的良好的增殖及重层化。另一方面，在支持细胞数过多的情况下，第1细胞等的增殖率反而下降，因而不优选。
第1细胞等的培养在支持细胞共存下实施的情况中，优选支持细胞和胶原层之间设置支持细胞不能通过的孔径的隔离膜。通过利用这一隔离膜，在培养时可防止支持细胞侵入到胶原层侧(即，第1细胞等侧)。其结果，不用担心最终获得的角膜上皮片内混入支持细胞。这就意味着可以制作没有支持细胞所致的免疫排斥问题的角膜上皮片，临床上有非常重要的意义。
作为隔离膜，可以适当选择使用具有支持细胞不能通过的孔径的众所周知的隔离膜。例如，可使用聚碳酸酯制的，孔径约0.4μm～3.0μm的膜。隔离膜的材质没有特别的限定，除了聚碳酸酯以外，也可以是聚酯等。这样的隔离膜在市场上出售，可以容易得到。
作为使用隔离膜情况的培养方法的例子可举出以下的方法。首先，通过在试皿等容器中(第1容器)播种培养非活性化的支持细胞，在容器表面形成支持细胞层。其次，用隔离膜形成底面的第2容器设置于第1容器内。这时，调整第2容器的位置使第2容器的底面处于培养液中。继而，第2容器的底面，即隔离膜上形成胶原层。然后，在胶原层上播种第1细胞等，实施培养。
在第2容器的底面预先形成胶原层(例如，在第2容器的底面放置去除上皮的羊膜。这个状态下可以暂时实施干燥处理。)，将该第2容器设置于播种支持细胞的第1容器内，然后可以在胶原层上播种第1细胞等，进行培养。
培养第1细胞时采用的培养液，只要能使该细胞增殖重层化就没有特别的限定。例如，在上皮细胞的成长中通常使用DMEM(Dulbecco’smodified Eagle’s medium)和Ham’s F12培养基(Ham’s F12 medium)以规定比例混合，并添加FBS、成长因子、抗生物质等的培养基。具体例可举出，添加FBS(10％)、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM)、上皮细胞生长因子(EGF)(10ng/ml)、以及青霉素一链霉素(50IU/ml)的，DMEM和Ham’s F12培养基的混合培养基(混合体积比1∶1)。还有，可采用进一步添加三碘甲状腺原氨酸(例如2nM)，谷氨酰胺(例如4mM)，转铁蛋白(例如5mg/ml)，腺嘌呤(例如0.18mM)以及/或氢化可的松(例如0.4mg/ml)的DMEM/Ham’s F12混合培养基。
通过在胶原层上培养第1细胞以及第2细胞，这些细胞增殖形成细胞层(在这个过程中认为至少一部分细胞分化)。形成细胞层后实施该细胞层表面与空气接触的步骤(步骤c)。还有，这一步骤在本说明书中称空气上举(Air-lifting)。这个步骤c是为了使形成细胞层的细胞分化，以及诱导屏障功能而实施的。
这个步骤可以如下进行：通过用滴液管、移液管等暂时地去除一部分培养液使培养液表面降低，由此可以使细胞层的最表层暂时露出于培养液外。或者，可以通过将细胞层连同胶原层一起往上提升，将最表层暂时的露出于培养液表面。进一步，可以用管等把空气送入培养液中，使细胞层的最上层与空气接触。从操作容易的观点看，优选通过降低培养液表面使细胞层的最表层露出的方法。
实施步骤c的时间，即把重层化的细胞层的最表层与空气接触的时间因细胞的状态和培养条件等而变化，例如3天～2周左右，优选为1周之内，更优选为3日以内。
根据以上的本发明的方法，在胶原层上，形成第1细胞等重层化的角膜上皮样的细胞层。这样得到的角膜上皮片，可以与作为第1细胞等的培养基质而采用的胶原层一起，作为移植材料(代替角膜上皮)而用于对角膜损伤、缺损的患者。这个情况下，以胶原层成为眼球侧的方式向角膜上皮缺损部位移植。移植的时候，优选用手术用缝合线把移植片固定于周围的组织，促进存活。还有，移植后，优选用治疗用隐形眼镜把移植表面暂时被覆保护。
还有，去除胶原层的一部分、或者去除全部的物质可作为移植片使用。该胶原层的去除可以适当组合EDTA等化学处理、蛋白分解酶等的酶处理，以及用镊子等搔爬等的物理处理来进行。
下面具体表示移植术的一个例子。首先，在角结膜疾病患者的角膜轮部上切开瘢痕组织。继而，切除侵入角膜上的瘢痕结膜组织，露出角膜实质后，在轮部的稍微内侧缝合角膜上皮片。手术手技按常规，是与本发明者们所属单位已经有70例以上的临床应用实际采用的移植术(有关培养角膜上皮细胞所得到的角膜上皮片，和培养口腔粘膜上皮细胞所得到的角膜上皮片的移植术)相同，认为其手法可以非常稳定地实施。
以下，说明本发明的实施例(包括实验例)
实施例1
<杂交型角膜上皮片的制作及评价>
1-1羊膜的采取
对于没有全身合并症的准备剖腹产的孕妇事先会同妇产科医生进行认真的说明、取得同意后，在手术室剖腹产时采取羊膜。操作要注意清洁，按手术操作洗手后穿上手术袍。分娩前准备清洁的采取羊膜用搪瓷盘和洗净用生理食盐水。分娩后将胎盘组织移到搪瓷盘上，用手把羊膜组织从胎盘剥离。羊膜和胎盘的愈合牢固的部分用剪刀切除。
1-2.羊膜的处理
羊膜处理的过程是按(1)洗净、(2)修整、(3)保存的顺序实施。在全部过程中，优选在清洁的通风橱内操作，全部使用灭菌处理的容器和器具，使用灭菌的一次性(可任意处理的)的等。采取的羊膜上附着的血液成分用生理盐水边洗净边去除，再用充分量的生理盐水(添加0.005％氧氟沙星)洗净。然后把羊膜移到试皿内的磷酸缓冲液(PBS)中，用剪刀进行约4×3cm左右的分割。分割后进一步在数个试皿中浸入保存液，从中选择状态好的羊膜。
1-3.羊膜的保存
2cc的灭菌低温管中各注入1cc的保存液，把每一片采取、洗净选择的羊膜标记后，保存于-80℃的冷冻装置中。保存液中使用50％灭菌处理的甘油混于DMEM(Dulbecco’S Modofied Eagle Medium：GIBCOBRL社)中。保存的羊膜使用期限是3个月，若过期就进行焚烧处理。
1-4.羊膜上皮的处理
羊膜处理其上皮后，用于培养。首先，将在-80℃下保存的羊膜在室温下解冻后，在试皿中用灭菌的磷酸缓冲液(PPS)充分洗净。洗净后在0.02％EDTA溶液(Nacalai tesque公司)中在37℃下保存2小时后，用细胞刮器(cell scraper)(Nunc公司USA)机械地搔爬上皮，作为培养的基质使用。还有，通过该处理方法，用光学和电子显微镜的观察(扫描型电子显微镜)确认了1层的羊膜上皮被搔爬得很彻底。
1-5.口腔粘膜上皮细胞的回收
6周龄的日本白色家兔拔牙后，从牙釉质牙骨质移行部谨慎地分离牙上附着的口腔粘膜上皮。还有，这一连串的操作，使用灭菌后的器具、尽可能无菌操作。
把采取的口腔粘膜上皮在室温条件下30分钟2次浸渍于含有50IU/ml的青霉素-链霉素、庆大霉素的磷酸缓冲液中。其后，将组织在37℃下浸渍在含有1.2U分散酶(Nacalai tesque公司)的磷酸缓冲液(PBS)中1小时，然后用0.05％胰蛋白梅-EDTA溶液(GIBCOBRL公司)浸渍处理30分钟，分离细胞。通过在含有10％牛胎儿血清(FBS)的DMEM中浸渍使酶活性终止。其后，用60μm的细胞滤器(cell filter)去除多余的组织，分离口腔粘膜上皮细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)(口腔粘膜上皮细胞悬浮液)。
1-6.角膜上皮细胞的回收
从6周龄的日本白色家兔(与采取口腔粘膜上皮细胞的个体不同的兔)的角膜轮部，用手术刀采取约5×10mm的角膜轮部组织片。
将采取的组织片在含有50IU/ml的青霉素-链霉素、庆大霉素的磷酸缓冲液(PBS)中在室温条件下浸渍30分钟、浸渍2次。然后，将组织用含有1.2U分散酶(Nacalai tesque公司)的磷酸缓冲液(PBS)在37℃条件下浸渍1小时，继续用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液(GIBCOBRL公司)浸渍处理15分钟，分离细胞。通过在含有10％牛胎儿血清(FBS)的DMEM中浸渍的方法使酶活性终止。其后，用60μm的细胞滤器去除多余的组织，单离角膜上皮细胞(角膜上皮细胞悬浮液)。
1-7.共培养细胞的调制
作为共培养细胞(支持细胞)，使用NIH-3T3细胞(以下简称“3T3细胞”)。将事前培养的用75F烧瓶(BD Falcon公司)长满的3T3细胞在0.05％丝裂酶素C溶液中浸渍2小时，抑制3T3的增殖活性。接着，用磷酸缓冲液(PBS)洗净数次去除丝裂酶素C后，用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液处理的方法，调制3T3细胞悬浮液。
1-8.细胞培养以及粘膜上皮的诱导
将搔爬上皮的人羊膜作为基质，把口腔粘膜上皮细胞及角膜上皮细胞与实施上述处理的3T3细胞按以下的步骤进行共培养。作为培养器具使用6孔的培养皿(culture dish)(Corning公司，纽约)和培养插入容器(culture insert)(聚碳酸酯制、平均孔径3.0μm、Corning公司，纽约)。
首先，在培养皿上以约1×104个/cm2的细胞密度播种3T3细胞悬浮液，在37℃、5％CO2的条件下培养。还有，在培养插入容器上将搔爬的上皮侧朝上把羊膜基质静置贴附，在室温下干燥10分钟。其后，在贴附羊膜的培养插入容器上各自以约1×104个/cm2的细胞密度播种口腔粘膜上皮细胞悬浮液以及角膜上皮细胞悬浮液。
以上操作后，如图1所示，在培养皿内设置培养插入容器，同一个培养基中培养3T3细胞、口腔粘膜上皮细胞以及角膜上皮细胞。还有，图1是表示培养中的状态的模式剖面图。培养插入容器2静置于培养皿1内，在培养皿1底面上形成3T3细胞层5。再有，显示了如下状态：在培养插入容器2的底面上静置羊膜3，在其上培养有口腔粘膜上皮细胞以及角膜上皮细胞4。符号6为培养基。
使用如下培养基：在DMEM/HUM’s F12混合培养基(混合体积比1∶1)中添加10％FBS、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(0.1nM)、青霉素-链霉素(50IU/ml)、人重组上皮细胞生长因子(EGF)(10ng/ml)。
在上述的培养基中培养了约7天(Submerge)。其后，分化诱导粘膜上皮，利用所谓的空气上举法培养约3天。所谓空气上举法是将培养基的液面达到在羊膜上形成的细胞层面为止，把该细胞层的表面暴露在空气中的方法。Submerge中隔日更换培养基，空气上举之后是每日更换培养基进行培养。
通过用以上的方法培养，大约10天(包括用空气上举法培养的3天)形成了5～6层的重层化的细胞层。
1-9.构成细胞层的细胞的鉴定
由以下步骤确认用以上的方法获得的羊膜上的细胞层是口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞杂交化而形成的。首先，在播种于羊膜上之前的口腔粘膜上皮细胞悬浮液中添加Di1色素，在室温下放置约15分钟(Di1标记)。由此获得的标记化的口腔粘膜上皮细胞与角膜上皮细胞一起，播种在去除上皮的羊膜上。其后，在与上述同样的条件下进行培养。在培养开始后经过1天、3天以及7天的时间上，用光学显微镜及荧光显微镜观察形成的细胞层。其结果示于图2(培养1天)、图3(培养3天)及图4(培养7天)中。在各图中，左栏表示光学显微镜像，右栏表示荧光显微镜像。在培养的第1天，可见细胞良好增殖得样子(图2左)。另外，可见Di1标记散在分布(图2右)、口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞混在的状态。在培养的第3天，可观察到细胞规则、整齐地排列的状态(图3左)。另外，Di1标记依然处于散在分布(图3右)，可以确认二种细胞(口腔粘膜上皮细胞和角膜上皮细胞)处于杂交化的状态，形成增殖的细胞层。在培养的第7天也可观察到与培养第3天同样良好的细胞增殖、及细胞杂交化(图4)。另外，伴随着细胞的增殖及重层化，观察到Di1标记的区域增加了(图4右)。
1-10.细胞层的组织学特性的评价
用光学显微镜观察了用上述方法(1-1.～1-8.)最终获得的细胞层。其结果为，在细胞层的基底侧(羊膜侧)存在呈大体圆柱形的类似于基底细胞的细胞群。还有，最表层的细胞呈扁平形而具有核，与皮肤不同，可确认其表面没有角化。以上用光学显微镜观察显示了在羊膜上形成类似于角膜的上皮层(角膜上皮片)。
接着，为了研究细胞层的组织学特性实施了免疫染色。首先，将获得的细胞层与羊膜一起以适当的大小切除，在OCT混合物中冻结包埋。其后用恒冷切片机薄切，制作玻片切片。在免疫染色中，进行了作为代表性的细胞骨架蛋白的角蛋白的相关检测。即，检测了表皮中特异的角蛋白1/10，角膜特异的角蛋白3/12，以及粘膜特异的角蛋白4/13。方法如以下所述。用磷酸缓冲液(PBS)洗净玻片切片后，用1％牛胎儿血清(FBS)实施阻遏抑制非特异的抗体反应。其后，与各角蛋白的抗体(1次抗体)在室温下实施1小时的反应。反应后在含有triton-X的PBS中洗净15分钟、洗净3次，接着在室温下进行荧光标识化抗体(2次抗体)1小时的反应。反应后，在磷酸缓冲液(PBS)中洗净15分钟、洗净3次，封入后用共焦显微镜观察其组织。
对于细胞层的各种角蛋白的抗体反应如下所述。首先，对表皮特异的角蛋白1以及10的染色性，在哪一个也没有观察到(图5左)。另一方面，对角膜特异的角蛋白3的染色性在广范围地观察到(图5中央上)。角蛋白3在角膜上皮细胞以及口腔粘膜上皮中观察到，认为在培养条件下其性质也被保持。还有，对角蛋白3的染色性在细胞层上部中很强。对角蛋白12的染色性也在广范围内观察到(图5中央下)。尤其在细胞层上部观察到强的染色性。该染色性，考虑是由于使用的角膜上皮细胞所引起的，说明培养后其性质也被保持下来。
对粘膜特异的角蛋白4以及13也几乎在全体范围内观察到染色性(图5右)。
从以上结果，所形成的细胞层的组织学的性质是，从细胞骨骼的方面，保持角膜特异的角蛋白(角蛋白3以及12)，近似于活体上的角膜上皮。还有，没有表皮那样向角化方向分化，具有非角化型粘膜上皮的性质，并且判明了角膜特异的角蛋白也同时保持下来。
1-11.移植试验
遵照上述方法(1-1.～1-8.)，制作在羊膜上形成有细胞层的片(以下称“角膜上皮片”)。具体而言，首先，从6周龄日本白色家兔调制口腔粘膜上皮细胞(自体细胞)，并且从不同的个体(6周龄日本白色家兔)调制角膜上皮细胞(异体角膜上皮细胞)。其后，在去除上皮的羊膜上播种这两种细胞，接着进行培养，获得角膜上皮片。
另一方面，对实施采取口腔粘膜上皮细胞的家兔，从轮部外侧4mm处使用月牙型手术刀把角膜和结膜上皮以100μm厚度全部去除。由于这个操作而不存在含有角膜上皮干细胞的上皮细胞，可以认为是人为地再现的眼表面干细胞疲痹症。接着，上述的角膜上皮片移植到轮部的稍靠内侧的区域。移植时，用10-0尼龙线缝合周围的组织。移植后，在移植片上面缝合治疗用隐形眼镜。术后，每2次/日涂敷抗生剂和类固醇眼软膏。在移植后的眼表面，显示出与移植前的角膜上皮移植用片同样的透明性(结果没有图示)。
实施移植术的眼表面移植后隔2日、1周、以及2周进行观察。同时，实施了荧光素染色试验。荧光素染色试验是如下实施的：在荧光素试验纸上含浸抗生剂的点眼等水分后直接涂敷在眼表面上，进行2、3次眨眼后，观察眼表面的荧光素染色性。若残存角膜上皮，由于其紧密的细胞间连接结构而无法浸润荧光素色素，看不到荧光素所致的染色。
移植后2日，移植片(角膜上皮片)还保持透明性(图6左)。而且根据荧光素染色，可确认角膜上皮片在眼表面完好地残留着(图6右)。另一方面，根据移植片(角膜上皮片)不显示染色性，可确认角膜上皮片具有与角膜上皮同样的屏障功能。尤其，在移植片周围全周都能看到荧光素的染色性，可以确认在移植部位存在的组织不是周围的残存结膜上皮的污染组织。
还有，通常的角膜上皮中细胞之间由于以紧密连接的结构形式结合，所以从其表面无法浸润荧光素的色素。即，在荧光素染色试验中不显示染色性。另外，细胞间的连接松缓，细胞自身剥离而阻碍屏障功能时，发生荧光素色素浸润而对组织染色。因此，依据荧光素染色检测染色性，可确认移植的角膜上皮片是否具有同角膜上皮同样的屏障功能。
另一方面，即使移植1周后移植片(角膜上皮片)也残存于眼表面，而且与移植后2天的状态相比较，可以确认明显向周围伸展(图7左)。还有，移植片不显示荧光素染色性，且确认了保持着角膜上皮所必要的屏障功能(图7右)。透明性也与移植后2天时没有变化，依然保持高的透明性(图7左)。
移植后2周的眼表面状态，与移植后1周相比较没有特殊变化。即，移植片(角膜上皮片)残存于眼表面，其透明性很高(图8左)。还有，移植片不显示荧光素染色性(图8右)，可以确认保持了屏障功能。
从以上的结果证实：用上述方法获得的角膜上皮片，具有在眼表面良好的存活性，其可以长期维持。还可以确认：移植后向周围伸展，并作为角膜上皮长期发挥必要的屏障功能，而且保持高的透明性。即，用上述方法获得的角膜上皮片作为角膜上皮的替代品发挥良好的功能，证明其在角膜损伤、缺损等的情况下，可以优选作为用于眼表面再建的移植材料而使用。
1-12.移植后的角膜上皮片的组织学的特性评价
接着，摘取移植后2周的角膜上皮片，研究其组织学的特性。在图9中表示角膜上皮片的HE染色像(右是放大图)。在羊膜(记号*)之上，可以确认与角膜上皮同样、细胞按规则整齐排列而构成的细胞层。这个细胞层，越是上层扁平状的细胞越多，维持与角膜上皮极其近似的结构。
图10中，表示对各种角蛋白的染色试验的结果。大致显示与移植前的角膜上皮片同样的染色性。即，看不到对表皮特异的角蛋白1以及10的染色性(图10左)，而可看到对角膜特异的角蛋白3以及12的染色性(图10中央)，另外，可看到对粘膜特异的角蛋白4以及13的染色性(图10右)。如上，可以确认角膜上皮片即使在移植后，也保持角膜上皮特异的角蛋白(角蛋白3以及12)。这一结果，从组织学的观点强有力地支持角膜上皮片能够长期发挥与角膜上皮同样的功能。
实施例2
<利用人细胞的杂交型角膜上皮片的制作及评价>
与上述1-5.(口腔粘膜上皮细胞的回收)中所述的方法同样地征得同意后，由健康的志愿者，调制人口腔粘膜上皮细胞悬浮液。另外，将从眼库(Northwest eye bank)得到的角膜，用上述1-6.(角膜上皮细胞的回收)中所述的同样的方法处理，获得人角膜上皮细胞悬浮液。将如此调制的人口腔粘膜上皮细胞以及人角膜上皮细胞，以搔爬了上皮的人羊膜为基质，与3T3细胞共培养，经过约14天的培养(包括用空气上举法培养3天)，形成了角膜上皮样的细胞层。搔爬了上皮的人羊膜的调制方法，以及与3T3的共培养条件如上述1-1.(羊膜的采取)～1-4.(羊膜上皮的处理)中所述。
检测获得的细胞层的形态、组织、免疫染色等的结果，与家兔动物模型相同。即，制成的杂交型培养细胞层形成为4～8层的重层化的细胞层，见不到对表皮特异的角蛋白1以及10的染色性，可见到对角膜特异的角蛋白3以及12的染色性，还有，也见到了对粘膜特异的角蛋白4以及13的染色性。
由以上的结果可以确认：即使是利用人口腔粘膜上皮细胞和人角膜上皮细胞的情况下，其也可以通过杂交化而形成角膜上皮样的细胞层。
实施例3
<利用羊膜上皮细胞的杂交型角膜上皮片的制作及评价>
与上述1-5.(口腔粘膜上皮细胞的回收)中所述的方法相同征得同意后，从健康的志愿者中，调制了口腔粘膜上皮细胞悬浮液。另外，按照上述1-1.(羊膜的采取)以及1-2.(羊膜的处理)中所述的方法获得人羊膜。其后，用0.05％胰蛋白酶-EDTA溶液(GIBCOBRL公司)处理15分钟，分离上皮细胞(人羊膜上皮细胞悬浮液)。把如此调制的人口腔粘膜上皮细胞以及人羊膜上皮细胞，以搔爬了上皮的羊膜作为基质，与3T3细胞共培养，经过培养约14天(包括用空气上举法培养3天)就形成了角膜上皮样的细胞层。搔爬了上皮的羊膜的调制方法，以及与3T3细胞共培养的条件如上述1-1.(羊膜的采取)～1-4.(羊膜上皮的处理)中所述。
检测获得的细胞层的形态、组织、免疫染色等的结果，制成的杂交型培养细胞层形成为4～8层重层化的细胞层，见不到对表皮特异的角蛋白1以及10的染色性，可见到对角蛋白3以及12的染色性，还有，对粘膜特异的角蛋白4以及13也见到其染色性。
从以上的结果可以确认：即使利用人口腔粘膜上皮细胞和人羊膜上皮细胞的情况下，其也可以通过杂交化而形成角膜上皮样的细胞层。
工业上利用的可能性
本发明的角膜上皮片，具有与角膜上皮极为类似的结构，移植后的存活性良好。还具有角膜上皮为发挥其功能所必要的屏障功能，而且透明性也高。这样，根据本发明提供的角膜上皮片，作为用于角膜上皮再建的移植材料是极佳的材料。
近年对难治性角结膜疾病的外科再建术在飞快地进步，通过羊膜移植、培养角膜移植术的应用，其手法已基本确立。但是由于难治性角结膜疾病的大部分是双眼性疾病，而用他人(allo)的组织移植，在术后必须通过长期使用免疫抑制剂来抑制排斥反应和严格执行细菌感染预防的术后管理，而使患者的生存质量(QOL)明显降低是目前的现状。本发明的利用杂交型角膜上皮片的移植术是用包含自体(auto)细胞的组织实施眼表面再建术，可以限制术后免疫抑制剂的使用，另外，由于含有自体组织因而认为其存活率也比以往的异体移植好，所以能明显提高患者的QOL。
该发明，不受上述发明的实施方式以及实施例的说明的任何限制。在不偏离所述的权利要求范围，在本领域的技术人员容易想到的范围内的种种变化方式也包括在本发明中。
在本说明书中出示的论文、公开专利公报、以及专利公报等内容，通过援用其全部内容为根据而引用。

Claims (15)

1.一种角膜上皮片，其特征为，备有包含作为自体细胞的第1细胞和与该第1细胞来源不同的第2细胞的、重层化的细胞层。
2.根据权利要求1中所述的角膜上皮片，其特征为，上述第1细胞是选自来自口腔粘膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞、来自鼻腔粘膜上皮的细胞、和来自其他粘膜上皮的细胞以及来自可以构建这些任何一种粘膜上皮的未分化细胞中的一种以上的自体细胞；
上述第2细胞是选自来自角膜上皮的细胞、来自结膜上皮的细胞以及来自羊膜上皮的细胞中的一种以上的细胞。
3.根据权利要求2中所述的角膜上皮片，其特征为，所述第1细胞是来自口腔粘膜上皮的细胞。
4.根据权利要求2或3中所述的角膜上皮片，其特征为，所述第2细胞是他人的细胞。
5.根据权利要求2～4中任意一项所述的角膜上皮片，其特征为，所述第2细胞是来自角膜上皮的细胞或来自羊膜上皮的细胞。
6.根据权利要求1～5中任意一项所述的角膜上皮片，其特征为，进一步备有胶原层，在该胶原层上形成所述细胞层。
7.根据权利要求6中所述的角膜上皮片，其特征为，所述胶原层是来自羊膜或去除上皮的羊膜。
8.根据权利要求1～7中任意一项所述的角膜上皮片，其特征为，所述细胞层备有一个以上的以下性状以及特性：
最表层的细胞没有角化；
最表层的细胞是扁平形状；
具备屏障功能。
9.一种角膜上皮片的制作方法，其特征为，包括以下步骤：
a)分别调制作为自体细胞的第1细胞以及与该第1细胞来源不同的第2细胞的步骤；
b)把所述第1细胞以及所述第2细胞播种于胶原层上进行培养的步骤；以及
c)所述第1细胞以及所述第2细胞增殖形成细胞层后，把该细胞层的最表层与空气进行接触的步骤。
10.根据权利要求9中所述的制作方法，其特征为，所述第1细胞是选自口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞、和其他粘膜上皮细胞以及可以构建这些任何一种粘膜上皮的未分化细胞中的一种以上的自体细胞；
所述第2细胞是选自角膜上皮细胞、结膜上皮细胞以及羊膜上皮细胞中的一种以上的细胞。
11.根据权利要求10中所述的制作方法，其特征为，所述第1细胞是口腔粘膜上皮细胞。
12.根据权利要求10或11中所述的制作方法，其特征为，所述第2细胞是他人的细胞。
13.根据权利要求10～12中任意一项所述的制作方法，其特征为，所述第2细胞是角膜上皮细胞或羊膜上皮细胞。
14.根据权利要求9～13中任意一项所述的制作方法，其特征为，所述步骤b是在以下任意一个条件下进行的：
1)在支持细胞的共存下；
2)在支持细胞的共存下，并且在支持细胞与所述胶原层之间存在支持细胞不能通过的孔径大小的隔离膜的状态。
15.根据权利要求9～14中任意一项所述的制作方法，其特征为，所述胶原层是来自羊膜或去除上皮的羊膜。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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