KR101372966B1 - 표적 세포 유도용 피더 세포 - Google Patents

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Abstract

불멸화 유전자 및 자살 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포에 관한 것이다. 또한, 표적 세포 유동용 피더 세포를 이용하여 표적 세포의 시트를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

표적 세포 유도용 피더 세포{FEEDER CELL FOR TARGET CELL INDUCTION}
본 발명은 표적 세포 유도용 피더 세포 및 상기 표적 세포 유도용 피더 세포를 이용한 표적 세포의 시트의 제조 방법에 관한 것이다.
각막 상피 줄기 세포는 각막 윤부(corneal limbus)에 존재하는 것으로 여겨진다. 각막 윤부의 줄기 세포가 중증의 화학적 상해 및 화상, 또는 스티븐-존슨 증후군 및 유안 유천포창과 같은 난치성 질환으로 인해 손상을 받게 되면, 각막 상피의 표면이 결막 조직으로 덮여, 심각한 시력 손상이 발생할 수 있다. 이러한 손상에 대한 치료학적 방법으로는 각막 윤부 이식 방법 등이 있지만, 공여자의 부족과 동종 이식 거부 반응과 같은 문제들이 있다.
최근, 자가 세포로부터 배양한 각막 상피 세포를 이식하는, 즉 각막 상피 세포 및 구강 점막 세포 등의 자가 세포로부터 제조한 표피 세포의 시트를 이식하는 치료법이 시도되고 있다. 이러한 방법은 공여자 부족과 거부 반응 등의 상기한 문제들을 해결하기 위한 방법으로서, 이미 임상적으로 적용되고 있다.
이러한 표피 세포 시트의 공지된 제조 방법으로는, 각막 상피 세포 및 경구 점막 세포 등의 자가 세포를, 양막 및 콜라겐 등의 기질 상에서 또는 온도 반응성 배양 표면 상에서, 피더 세포, 일반적으로 미토마이신 C로 불활성화한 마우스 유래 섬유모세포(3T3 세포)와, 공-배양하는 것을 포함한다(예, WO 2004/078225, WO 2006/003818, 및 WO 2006/075602 참조).
그러나, 이 방법에서는 공-배양시 마우스 유래 세포를 사용하고 있어, 이종 세포로 인한 감염과 이종 세포의 오염 위험성이 있을 수 있다.
이러한 이종 세포의 오염과 같은 상기한 문제들을 해결하기 위한 방법으로, 피더 세포로서 인간 섬유모세포를 이용하여 각막 상피 세포 시트를 제조하는 방법이 공지되어 있다(WO 2005/087285 4 참조).
그러나, 각막 상피 세포 시트를 인간 섬유모세포를 이용하여 제조하더라도, 피더 세포를 제거하기 어려운 문제가 있다.
특허 문헌 1: WO 2004/078225호 특허 문헌 2: WO 2006/003818호 특허 문헌 3: WO 2006/075602호 특허 문헌 4: WO 2005/087285호
본 발명의 목적은 표적 세포 유도용 피더 세포, 상기 피더 세포를 이용하여 표적 세포 시트를 제조하는 방법, 표적 세포에 대한 유도 후보 인자의 기능을 결정하는 방법, 유도 후보 인자의 유전자에 의해 형질도입된 피더 세포 상에서 표적 세포를 배양하는 방법, 및 상기 표적 세포의 이식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기한 문제점을 해결하기 위해 광범위한 연구를 수행한 결과, 세포, 바람직하게는, 시트를 제조하고자 하는 표적 세포와 동종으로부터 유래되고, 또한 인간 각막 상피 세포와 해부학적으로 인접한 세포에 불멸화 유전자 및 자살 유전자를 도입하면, 피더 세포를 장기 계대 배양으로 유지시킬 수 있으며, 피더 세포가 불필요해지면 선택 약물로 사멸시킬 수 있으며, 이와 같이 선택 약물로 사멸시킬 수 있기 때문에 표적 세포를 피더 세포와 접착 배양할 수 있는, 우수한 이점을 가진, 피더 세포를 제공할 수 있다는 것을 알게 되었다.
또한, 본 발명자들은, 상기 피더 세포에 마커 유전자를 도입함으로써, 표적 세포에 피더 세포가 혼성되었을 때 시각적으로 확인할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과를 토대로, 본 발명자들은 더욱 연구하여 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은,
(1) 피더 세포가 불멸화 유전자 및 자살 유전자에 의해 형질도입된, 표적 세포 유도용 피더 세포,
(2) 상기 피더 세포가 상기 표적 세포에 인접한 세포로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(3) 상기 피더 세포가 인간 각막 실질 세포로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(4) 상기 피더 세포가 인간 피부 섬유모세포로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(5) 상기 불멸화 유전자가 hTERT 유전자인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(6) 상기 자살 유전자가 1형 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 유전자인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(7) 상기 피더 세포가 마커 유전자에 의해 형질도입된 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(8) 상기 마커 유전자가 EGFP 유전자인 것을 특징으로 하는 상기 (7)에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(9) 상기 표적 세포가 세포 배양시 피더 세포를 필요로 하는 인간 유래 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(10) 상기 표적 세포가 인간 각막 상피 세포, 인간 각막 내피 세포, 인간 결막 상피 세포 또는 인간 신장 유래 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(11) 상기 피더 세포가 상기 표적 세포의 자극성 인자의 유전자에 의해 추가로 형질도입된 것을 특징으로 하는 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(12) 상기 표적 세포에 대한 자극성 인자가 카드헤린(cadherin) 슈퍼패밀리, 인테그린 패밀리, 면역글로불린 슈퍼패밀리, 세크레틴 패밀리, 뉴롤리긴, 뉴로렉신 및 세포 표면 프로테오글리칸으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 세포 접착 분자; 상피 성장 인자(EGF) 패밀리, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 패밀리, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 패밀리 및 섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자; 또는 Jagged 패밀리 및 Delta 상 멤버으로부터 선택되는 하나 이상의 Notch 리간드인 것을 특징으로 하는 상기 (11)에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포,
(13) (a) 세포 배양용 캐리어 상에 상기 (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 유도용 피더 세포를 배양하는 단계, (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양용 캐리어 상에 표적 세포를 접종하여 정치(stand)되게 함으로써, 상기 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는, 표적 세포 시트의 제조 방법,
(14) (c) 상기 표적 세포 시트로부터 상기 표적 세포 유도용 피더 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 (13)에 기재된 제조 방법,
(15) 상기 (c) 단계에서의 분리는 표적 세포 시트에 자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체를 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 상기 (14)에 기재된 제조 방법,
(16) 상기 자살 유전자가 1형 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 유전자이고, 상기 자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체가 간시클로버(ganciclovir)인 것을 특징으로 하는 상기 (15)에 기재된 제조 방법,
(17) 상기 표적 세포가 인간 각막 상피 세포, 인간 각막 내피 세포, 인간 결막 상피 세포 또는 인간 신장 유래 세포인 것을 특징으로 하는 상기 (13) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법,
(18) 상기 (a) 또는 (b) 단계에 인간 혈청이 사용되는 것을 특징으로 하는 상기 (13) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 제조 방법,
(19)
(a') 세포 배양용 캐리어 상에 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 피더 세포를 배양하는 단계,
(b') 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 피더 세포에, 표적 세포에 대한 유도 후보 인자의 유전자를 형질도입하고, 수득되는 유도 후보 인자-형질도입된 피더 세포를 세포 배양용 캐리어 상에서 배양하는 단계,
(c') 상기 (a') 및 (b') 단계의 세포 배양용 캐리어 상에 각각 표적 세포를 접종하여 유지시킴으로써, 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계, 및
(d') 각 세포 배양용 캐리어 상에서 배양된 세포를 평가하는 단계를 포함하는,
표적 세포에 대한 유도 후보 인자의 기능을 결정하는 방법,
(20)
(i) 본 발명의 피더 세포에 표적 세포의 유도 후보 인자의 유전자를 형질도입하는 단계,
(ii) 상기 단계 (i)에서 수득되는 유도 후보 인자의 유전자 - 형질도입된 피더 세포를 세포 배양용 캐리어 상에서 배양하는 단계, 및
(iii) 상기 (ii) 단계의 세포 배양용 캐리어 상에, 표적 세포를 접종하여 표적 세포가 유지되게 함으로써, 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는 표적 세포의 배양 방법,
(21) 상기 (13) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 표적 세포 시트의 제조 방법에 의해 얻어진 표적 세포 시트를, 의도한 부위에 이식하는 단계를 포함하는, 표적 세포의 이식 방법에 관한 것이다.
본 발명의 피더 세포를 사용함으로써, 표적 세포의 배양과 표적 세포의 세포 시트 제조를 구현할 수 있다. 또한, 본 발명의 피더 세포를 사용함으로써, 인간 각막 내피 세포, 인간 결막 상피 세포, 인간 신장 유래 세포, 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포 등을 쉽고 간단하게 배양할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 인간 각막 실질 세포의 형질도입에 사용되는 재조합 렌티바이러스 벡터의 구성을 나타낸다. 도 1A는 hTERT 유전자, IRES-EGFP 유전자 및 네오마이신 내성 유전자가 도입된 실시예 1의 렌티바이러스 벡터를 나타낸다. 도 1B는 서열번호 3의 HSV-TK 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자가 도입된 실시예 1의 렌티 바이러스 벡터를 나타낸다. 도면에서, LTR는 긴 말단 반복체(Long terminal repeat)이고, EF는 인간 연장 인자(1α 서브유닛) 유전자의 프로모터이고, hTERT는 인간 텔로머라제 역전사 유전자이고, IRES는 내부 리보좀 진입부(Internal Ribosome Entry Site)이고, EGFP는 고감도 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein) 유전자이고, PGK는 포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase) 프로모터이고, Neomycinr은 네오마이신 내성 유전자이고, TK는 HSV 티미딘 키나제이고, Puromycinr는 퓨로마이신 내성 유전자이다.
도 2는 인간 각막 실질 세포의 형질도입 과정을 도시한 것이다.
도 3은 인간 각막 실질 세포의 간시클로버 처리에 대한 감수성을 나타낸 것이다. 좌측의 도면은 hTERT - 형질도입되었으나 HSV-TK 유전자는 도입되지 않은 인간 각막 실질 세포의, 간시클로버의 처치 후 세포 수 변화(%)를 나타낸 것이고, 우측 도면은 hTERT 유전자와 HSV-TK 유전자가 모두 형질도입된 인간 각막 실질 세포의, 간시클로버 처리 후 세포 수 변화(%)를 나타낸 것이다. 그래프에서 수치는 평균 ± 표준 편차(n=3)로 나타낸다.
도 4A는 인간 각막 상피 세포 시트의 제조 방법을 도시한 것이다. 도 4B는 위에서부터 차례대로 실시예 2에서 수득한, 피더 세포, 인간 각막 상피 세포, 인간 각막 상피 세포 시트를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 형질도입된 피더 세포 상에서 배양된 세포의 사진이다. 각 사진에서 표적 세포는 A가 인간 결막 상피 세포, B가 인간 각막 내피 세포, C가 인간 신장 유래 세포(293 T세포)이다.
도 6은 인간 혈청을 사용하여 배양하여 수득한 인간 각막 상피 세포를 나타낸다.
도 7은 마우스 각막 손상 모델에 대한 인간 각막 상피 세포 시트의 이식을 나타낸 것이다. 도 7A는 배양한 각막 상피 세포 시트의 이식 과정을 나타낸 것이다. 도 7B는 마우스의 윤부를 포함한 각막 표면을 50% 에탄올에 노출시켜 각막 상피 세포층을 완전히 제거한지 15일된 마우스의 각막을 나타낸 것이다. 도 7C는 실시예 8에서 수득한 각막 상피 세포 시트를 이식한 지 7일된 마우스의 각막을 나타낸 것이다. 이식은, 마우스의 윤부를 포함하는 각막 표면을 50% 에탄올에 노출시켜 각막 상피 세포층을 완전히 제거한 직후에 수행된다. D는 상기 이식 후, 3-5층으로 중층화된 각막 상피 세포를 HE 염색하여 현미경 관찰한 결과로서, 화살표시는 중층화된 각막 상피 세포를 표시한다. E는 이식 후 각막 상피 세포에 대한 인간 미토콘드리아(녹색)와 DAPI(청색)의 염색 결과를 나타낸 것으로, 화살표시는 인간 각막 상피 세포를 가리킨다. F는 이식 후 각막 상피 세포에 대한 사이토케라틴 3(녹색)과 DAPI(청색)의 염색 결과를 나타낸 것으로, 화살표시는 인간 각막 상피 세포를 가리킨다.
도 8은 인간 각막 실질 세포의 형질도입에 사용되는 재조합 렌티바이러스 벡터의 구성을 나타낸 것이다. 도 8A는, 실시예 9의 DLL1- 및 블라스티시딘-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터, 또는 DLL4- 및 블라스티시딘-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 나타낸다. 도 8B는 실시예 9의 E-카드헤린- 및 하이그로마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 나타낸다. 도면에서, LTR는 긴 말단 반복체(Long terminal repeat)이고,ψ는 패키징(packaging) 신호이고, PUbC는 인간 유비퀴틴 C 유전자의 프로모터이고, DLL1은 Delta-like 1 유전자이고, DLL4는 Delta-like 4 유전자이고, PSV40는 SV40 유전자의 프로모터이고, EM7은 대장균 발현용 EM7 유전자 프로모터이고, Blasticidinr은 블라스티시딘-내성 유전자이고, PEF는 인간 연장 인자(1α서브유닛) 유전자의 프로모터이고, E-cadherin은 E-카드헤린 유전자이고, PPGK는 포스포글리세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase) 유전자의 프로모터이고, Hygromycinr은 하이그로마이신 내성 유전자이다.
도 9는 RT-PCR 결과이다. 도 9A는 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 RT-PCR 결과이고, 도 9B는 DLL1+, DLL4+ 또는 E-cadherin+, hTERT + TK 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 RT-PCR 결과이다.
도 10은 실시예 10의 인간 각막 상피 세포의 콜로니 형성율을 나타낸 것이다. 그래프의 값(%)은 평균값 ± 표준 편차(n=3)이다.
도 11은 인간 각막 실질 세포 형질도입체와 인간 피부 섬유모세포 형질도입체 상에서 배양한, 인간 각막 상피 세포의 콜로니 형성을 보여주는 사진이다. 도 11A는 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에 배양된 인간 각막 상피 세포의 콜로니 형성 결과를 나타낸 것이고, 도 11B는 hTERT + TK - 형질도입된 인간 피부 섬유모세포 상에서 배양된 인간 각막 상피 세포의 콜로니 형성 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 피더 세포로서 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에서 배양한 각막 내피 세포의 배양 결과를 보여주는 사진이다.
본 발명의 제1 구현예는, 피더 세포주가 불멸화 유전자 및 자살 유전자에 의해 형질도입된 것인, 표적 세포 유도용 피더 세포주에 관한 것이다. 이하, 제1 구현예에 대해 설명한다.
본 발명의 표적 세포 유도용 피더 세포주는 불멸화 유전자 및 자살 유전자를 코딩하는 DNA 서열을 발현 벡터를 사용하여 숙주 세포에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에서 "불멸화 유전자"는 세포에게 무한 분열 능력과 생존력을 제공하는 유전자를 의미하며, 이러한 유전자는 특별히 한정되지 않지만, 그 예로 c-myc, ras 등의 암 유전자; 아데노바이러스 E1A; SV40 유래의 대형 T 항원 유전자(SV40 대형 T 항원 유전자); 폴리오마바이러스 유래의 대형 T 항원 유전자; 파필로마바이러스 16형(HPV16)의 E6 및 E7 유전자; 및 인간 텔로머라제 역전사 효소(human telomerase reverse transcriptase: hTERT)의 유전자 등을 포함한다. 또한, 불멸화 유전자의 예로는, 텔로머라제 유래 유전자, 또는 텔로머라제의 발현 또는 활성을 조절하는 유전자(예를 들면, myc 유전자, 이 유전자는 텔로머라제 활성을 증가시킨다고 함)가 있다. 특히, SV40 대형 T 항원 유전자 또는 인간 텔로머라제 역전사진 효소가 바람직하다. 상기 SV40 대형 T 항원 유전자는 공지의 DNA형 종양 바이러스의 종양 항원(T 항원) 유전자이다. 상기 hTERT 유전자는 정상 세포의 TERT 유전자로부터 유래된다. 본 발명에서는, 특히 인간 텔로머라제 유전자(hTERT)가 바람직하다. SV40 대형 T 항원 유전자는, 특별히 한정되지 않지만, 야생형의 SV40 T 항원 유전자(SV40 TAg; Genbank NC_001669)를 사용할 수 있으며, 온도 감수성 돌연변이 SV40 tsT 항원 유전자를 사용할 수도 있다. 인간 텔로머라제 역전사 효소(hTERT)는, 특별히 한정되지 않지만, 전장의 인간 텔로머라제 역전사 효소의 이소형 1(hTERT; Genbank NM_003219; 서열번호 1, 아미노산 서열은 서열번호 2로 기재됨)이 바람직하다. 포유류의 체세포에서는 염색체 말단에 존재하는 텔로미어가 각 세포 분열시 마다 단축되므로, 일정한 분열 횟수를 거치고 나면 세포 증식은 정지되게 된다. 텔로머라제 역전사 효소는 텔로미어의 길이를 유지시키는 역할을 담당하는 효소로서, 이 유전자를 세포에 도입함으로써, 세포의 분열 횟수를 연장시켜 세포를 불멸화시킬 수 있음은 공지되어 있다(Counter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95, 14723-14728: 1998). 또한, 상기 불멸화 유전자는 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명에서, "자살 유전자"는 박테리아나 바이러스 유래의 효소로서, 활성이 낮은 항바이러스성 물질을 대사하여 강력한 세포독성 활성의 물질로 변환시키는 기능을 지닌 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. 이러한 자살 유전자가 세포에 도입되면, 세포는 항바이러스성 물질(이하, "자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체"라고도 함)의 투여에 의해 선택적으로 사멸하게 될 것이다. 따라서, 자살 유전자를 피더 세포에 도입하였을 때, 항바이러스성 물질을 목적에 따라 투여함으로써 피더 세포를 선택적으로 제거할 수 있다. 자살 유전자와 항바이러스성 물질의 조합은 특별히 한정되지 않지만, 1형 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제(Herpes Simplex Virus-thymidine kinase; HSV-TK, 이하, "TK"라고도 약칭함) 유전자와, 항바이러스성 물질로서 임상적으로 사용되고 있는 간시클로버(Ganciclovir: GCV) 또는 아시클로버(aciclovir: ACV)의 조합; 및 대장균의 시토신 탈아미노효소 유전자와 항균제인 5-플루오로시토신의 조합을 포함한다(Elion GB. Am. J. Med. 73, 7, 1982; Craig AM. Proc. Acad. Sci. USA 89, 33, 1992). HSV-TK 유전자(서열번호 3)와 간시클로버 또는 아시클로버의 조합은, 그 유효성이 이미 동물 실험을 통해 증명되었으며(Moolten FL, Wells JM:J Natl Cancer Inst. 82:297-300, 1990; Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, Ishii H, Oldfield EH. Science 1992; 256:1550), 인간 전립선암의 유전자 치료에 대한 임상적인 적용에서도 유효성이 확인되었는 바, 이 조합이 바람직하다. HSV-TK 유전자는 바이러스의 고유 티미딘 키나제로서, 376개의 아미노산(서열번호 4)으로 이루어진 HSV-TK를 코딩한다. HSV-TK의 기질 특이성은 인간 세포의 티미딘 키나제와는 다르며, 구아노신의 유사 물질인 아시클로버(ACV)이나 간시클로버(GCV)를 인산화하는 활성을 가지고 있다(Moolten FW and Wells JM. Tumor chemosensitivity conferred by inserted herpes themidine kinase genes: paradigm for a prospective cancer control strategy. Cancer Res 46:5276-5281, 1986., Reardon JE. Herpes simplex virus type 1 and human DNA polymerase interactions with 2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate analogues: kinetics of in corporation into DNA and induction of inhibition. J Biol Chem 264:19039-19044, 1989). 아시클로버 또는 간시클로버는 기질로서 키나제를 발현하지 않는 세포에 대해서는 독성을 나타내지 않지만, 바이러스에 감염된 결과로, 즉 HSV-TK의 형질도입 등으로 인해 HSV-TK를 발현하는 세포에서는, 아시클로버 또는 간시클로버가 모노포스페이트로 인산화되며, 이 모노포스페이트는 내인성의 구아닐레이트 키나제 및 티미딘 키나제에 의해 디- 또는 트리-포스페이트로 변환된다. 최종 산물인 트리포스페이트는 DNA 중합효소를 저해하고 DNA 연장을 중지시켜, 따라서 세포에 심각한 손상을 야기하여 궁극적으로 세포가 사멸되게 한다. 이러한 방식으로, HSV-TK는 아시클로버 또는 간시클로버와 조합하여 생물학적 활성을 발휘한다.
본 발명의 표적 세포 유도용 피더 세포주는 특별히 한정되지 않지만, 시각적으로 세포를 판별 가능하게 하는 마커 단백질 발현력을 가지는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 표적 세포 유도용 피더 세포주에 함유되는 마커 유전자의 예로는, EYFP(enhanced yellow fluorescent protein) 유전자, ECFP(enhanced cyan fluorescent protein) 유전자, DsRed1 유전자 및 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자를 들 수 있으며, 특히 EGFP 유전자가 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 표적 세포 유도용 피더 세포는 마커 단백질의 발현에 의해 시각적으로 세포의 존재를 확인할 수 있으며, 이식시 피더 세포의 오염 위험성을 낮출 수 있다.
본 발명에 사용되는 발현 벡터는 특별히 한정되지 않지만, 그 예로 플라스미드 벡터와 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는, 재조합 바이러스 벡터를 생산하는 세포의 배양 상층액의 여과물을 의도한 세포에 첨가하는 것만으로도 효율적으로 형질감염시킬 수 있다는 점에서, 바람직하다. 플라스미드 벡터의 예로는 pBR322와 pGEM이 있다. 바이러스 벡터의 예로는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 및 렌티바이러스와 같은 레트로 바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노-부속 바이러스, 파르보바이러스, 셈리키 삼림 바이러스, 백시니아 바이러스 및 센다이 바이러스가 있으며, 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스가 바람직하다. 다양한 종류의 프로모터를 포함하는, 전술한 발현 벡터의 구성은, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 이상 특별히 한정되지 않는다. 상기 발현 벡터에 포함되는 프로모터로는 SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MuMLV LTR, 인간 CMV, 인간 EF1α, 인간 UbC 및 PGK를 들 수 있다.
상기 유전자의 도입 방법은 특별히 한정되지 않지만, 이러한 방법의 예로는 렌티바이러스(Invitrogen의 ViraPower 렌티바이러스 발현 시스템), 레트로바이러스(IMGENEX의 RetroMax 레트로바이러스 발현 시스템, 다카라 바이오의 Retrovirus Constructive System, Ambiom의 pSilencer Retro System) 또는 아데노바이러스(MicroBix의 AdMax 시스템, Invitrogen의 ViraPower 아데노바이러스 발현 시스템)를 이용한 바이러스 시스템과; HVJ 리보솜 방법이 있다.
상기 불멸화 유전자 및 자살 유전자, 그리고 필요에 따라 마커 유전자의 도입의 순서는 특별히 한정되지 않으며, 이들 유전자들 중 임의의 것을 사용하여 개시할 수 있다. 그러나, 배양 용이성을 고려하여 불멸화 유전자를 첫번째로 도입하는 것이 바람직하다.
상기 유전자를 발현 벡터를 이용하여 도입시키는 숙주 세포는, 통상적으로, 표적 세포와 동종으로부터 유래된 세포이다. 또한, 숙주 세포는 해부학적으로 상기 표적 세포와 인접한 세포가 바람직하지만, 이로 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 표적 세포가 인간 각막 상피 세포 또는 인간 각막 내피 세포인 경우, 적합한 숙주 세포로서 인간 각막 실질 세포를 예시할 수 있다. 인간 각막 실질 세포는, 예를 들면, 회수한 눈 조직으로부터 각막 조직을 분리하고, 이를 가위 등으로 절편(약 1 mm 사각형)으로 자른 다음, 수득한 각막 절편을 IV형 콜라게나제로 소화시킴으로써 수득할 수 있다. 각막 실질 세포는 소 태아 혈청이나 송아지 혈청 10∼20%를 포함하는 적절한 액체 배지, 예를 들면, 이글 MEM 배지, 둘베코의 변형 이글 MEM 배지, 햄 배지 F12 및 카츠타 배지 DM-160에 현탁한다. 그 후 세포를 CO2 인큐베이터에서 배양하여, 형질감염시킨다. 숙주 세포는, 상기한 바와 같이, 표적 세포와 동종 유래 세포이라면 특별히 한정되지 않는다. 예컨대 숙주 세포로서, 피부 세포를 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 피부 섬유모세포를 사용할 수 있다. 예컨대, 인간 피부 세포 유래의 형질도입된 피더 세포를 사용하여 인간의 각막 상피 세포 시트 등을 제작할 수 있다.
상기 유전자에 의해 형질도입된 세포주의 확립 및 유지 방법은, 일반적인 동물세포 배양 기술이면 특별히 한정되지 않는다. 세포주는 액체 배지, 예를 들면, 이글 MEM 배지, 둘베코의 변형된 이글 MEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM), 햄 F12 배지(Ham's F12 medium) 및 카츠타 배지 DM-160에서 배양할 수 있다. 배양 온도, 배지 pH 및 이산화탄소 농도 등의 조건은, 동물세포 배양에서 통상적으로 사용되는 일반적인 조건을 적절하게 채용할 수 있다. 배지는 2∼3일마다 한번씩 신선한 배지로 교체하고, 세포 증식이 포화점에 이르렀을 때 세포를 계대 배양한다. 세포는 이질적인 세포군일 수도 있지만, 세포는 세포 증식이 일단 정지된 후에도 계속 배양하여, 재증식을 개시한 세포군을 분리함으로써 수득할 수 있는, 단일 클론 세포군인 것이 바람직하다. 단일 클론 세포군의 분리 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 다음과 같이 수행할 수 있다. 트립신과 EDTA 용액이 흡수된 소구경의 여과지를 대상 클론 세포군 상에 두고, 정치해 둔다. 그런 다음, 클론 세포군과 함께 여과지를 배양 용기에서 박리한다. 클론 세포군이 부착된 여과지를 다른 배양 용기로 이동시킨다. 다른 예로, 클론 세포군은 콜로닝 픽업, 제한 희석 방법, 세포 분류기를 이용한 방법 등으로도 분리할 수 있다.
본 발명의 피더 세포가 유도하고자 하는 표적 세포는, 세포 배양시 피더 세포를 필요로 하는 표적 세포이면 특별히 한정되지 않지만, 세포 배양시 피더 세포를 필요로 하는 인간 유래의 세포가 바람직하다. 특히, 표적 세포의 적합한 예로는, 인간 각막 상피 세포와 인간 결막 상피 세포 등의 눈 상피 세포; 인간 각막 내피 세포; 인간 iPS 세포(유도된 다능성 줄기 세포: induced pluripotent stem cell) 또는 인간 ES 세포(배아 줄기 세포: Embryonic Stem cell) 등의 줄기 세포를 포함한다. 확립된 세포주를 용이하게 증식시킬 수 있다는 점에서, 표적 세포로 인간 신장 유래 세포 등도 적합하다.
본 발명의 피더 세포는, 또한, 표적 세포 자극성 인자를 발현하도록 강제될 수 있다. 상기 표적 세포 자극성 인자는, 표적 세포의 종류에 특이적인 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 표적 세포 자극성 인자의 예로는, 카드헤린 슈퍼패밀리, 인테그린 패밀리, 면역글로불린 슈퍼패밀리, 세크레틴 패밀리, 뉴롤리긴, 뉴렉신 및 세포 표면 프로테오글리칸 등의 인간 세포 접착 분자; 상피 성장 인자(EGF) 패밀리, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 패밀리, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 패밀리 및 섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리 등의 성장 인자; Jagged 패밀리 및 Delta 유사 구성원 등의 Notch 리간드 등을 들 수 있다. 상기 자극성 인자의 유전자를 본 발명의 피더 세포에 도입함으로써, 피더 세포가 강제적으로 세포 표면에 상기 자극성 인자를 발현하도록 만들 수 있다. 또한, 피더 세포가, 세포 표면 상에 상기 자극성 인자를 비롯하여 세포-세포 상호작용에 영향을 줄 수 있는 다양한 인자를 발현하도록 강제할 수 있다. 이러한 인자의 발현은, 피더 세포가 각막 세포 또는 iPS 세포 등의 표적 세포의 증식과 분화에 영향을 부여할 수 있게 하며, 제어하기 어려운 표적 세포를 조절할 수 있게 해 준다. 예를 들면, DLL 단백질을 강제 발현하는 피더 세포를 사용하여, 세포 증식 억제 작용을 조절할 수 있다. 상기 증식 인자의 발현을 통해, 세포의 증식 촉진 효과 또는 정상 세포 형태의 유지 효과 등의 증식-유지 배양 효과를 개선시킬 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 피더 세포는 지금까지 제어하기 어려웠던 세포를 적절하게 조절하는 재활 의학에 강력한 도구가 될 수 있다. 상기 표적 세포의 자극성 인자의 유전자는, 특별히 한정되지 않으며, 1 또는 2 이상의 유전자를 본 발명의 피더 세포에 도입할 수 있다.
상기 카드헤린 패밀리는 클래식 카드헤린과 비-클래식 카드헤린을 포함한다. 클래식 카드헤린의 예로는 E-카드헤린, N-카드헤린, P-카드헤린, R-카드헤린, M-카드헤린, VE-카드헤린을 포함한다. 비-클래식 카드헤린의 예로는 데스모콜린(desmocollin), 데스모글레인(desmoglein), T-카드헤린, 프로트카드헤린 및 Fat가 있다. 인테그린 패밀리는 2개의 구분되는 1회-막 관통 단백질(α쇄 및 β쇄)을 포함하는 이종이량체 분자이다. α쇄는 19종이 있으며, β쇄는 8종이 있다. αβ 이종이량체는 25종 이상이 존재하고 있다. 이 분자의 대부분은 세포 밖으로 돌출되어 있으며, 세포내 도메인에는 칼린, 빈쿨린, 텐신 및 알파액티닌을 통해 액틴 필라멘트가 결합한다. 인테그린 패밀리에 속하는 것의 예로는, LFA-1, VLA1-5 및 VLA-4가 있다. 면역글로불린 슈퍼패밀리에는 면역계 패밀리와 신경계 패밀리가 있다. 면역계 패밀리에 속하는 것의 예로는 Ig, TCR, CD2, CD4, CD8, CD16(FcγRIII), CD56(NCAM-1), CD57, MHC(클래스 I, 클래스 II)가 있다. 신경계 패밀리에 속하는 것으로는, 예컨대 ICAM-1이 포함된다. 세크레틴 패밀리에 속하는 것으로는, 예컨대 E-세크레틴, P-세크레틴 또는 L-세크레틴이 있다. 뉴롤리긴의 예로는 뉴롤리긴 1, 뉴롤리긴 2 및 SynCAM1이 있다. 상기 Delta 유사 구성원의 예로는 DLL 1(Delta-like 1), DLL 3(Delta-like 3) 및 DLL 4 (Delta-like 4)가 있다. 상기 EGF 패밀리는 특별히 한정되지 않지만, 이의 구성원의 예로는 EGF, TGF-α, 안피레굴린(Amphiregulin: AR), HB-EGF, 에피레굴린(Epiregulin: EPR), 베타셀룰린(Betacellulin: BTC), 뉴레굴린(Neuregulins 1-4: NRG 1-4) 및 테라토카시노마-유래 성장 인자 (Teratocarcinoma Derived Growth Factor (Cripto 1))을 들 수 있다. 상기 VEGF 패밀리는 특별히 한정되지 않지만, 그 예로는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-D, VEGF-E, PlGF(태반 성장 인자)-1 및 PlGF-2를 들 수 있다. 상기 IGF 패밀리는 특별히 한정되지 않지만, 그 예로는 IGF-1과 IGF-2를 들 수 있다. 상기 FGF 패밀리는 특별히 한정되지 않지만, 그 예로는 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF)와 산성 섬유모세포 성장 인자(aFGF)를 들 수 있다. 상기 Jagged 패밀리의 예로는 JAG1과 JAG2를 들 수 있다.
본 발명의 제2 구현예는, (a) 세포 배양용 캐리어 상에서 전술한 바와 같이 제조한 표적 세포 유도용 피더 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양용 캐리어 상에 표적 세포를 접종한 다음 표적 세포가 정치되게 함으로써, 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는, 표적 세포 시트의 제조 방법에 관한 것이다.
이하, 제2 구현예에 대해 설명한다. 표적 세포가 인간 각막 상피 세포인 경우를 예를 들어 인간 각막 상피 세포 시트의 제조 방법의 모식도를 도 4A에 나타낸다.
단계 (a)에서, 피더 세포 배양용 캐리어는 특별히 한정되지 않지만, 적합한 예로 온도 반응성 세포 배양 표면, 양막 및 콜라겐 겔을 들 수 있다. 단계 (a)에서, 피더 세포용 배양용 캐리어 상에서 피더 세포를 배양하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예로는 온도 반응성 세포 배양 표면, 양막 또는 콜라겐 겔의 표면 상에 표적 세포 유도용 피더 세포를 접종하는 방법; 및 콜라겐 겔내에 표적 세포 유도용 피더 세포를 포매(embedding)시켜 피더 세포를 배양하는 방법이 있다. 온도 반응성 세포 배양 표면은 특별히 한정되지 않지만, 적합한 예로는 JP-2006-320304-A 또는 JP-2008-271912-A에 기술된 온도 반응성 세포 배양 표면을 포함한다. 온도 반응성 세포 배양 표면의 시판 제품의 예로는 UpCell(상품명; CellSeed Inc.)을 들 수 있다. 양막 또는 콜라겐 겔은 표적 세포의 배양 기질로서 작용한다. "양막"은 포유류의 자궁내 태반의 최심부 표면을 덮고 있는 막으로, 콜라겐이 풍부한 실질 조직 상에 형성되어 있는 표피층과 기저막으로 구성된다. 바람직한 양막은 인간 양막이다. 인간 양막은, 예를 들면, 분만 후 후산으로서 수득되는, 인간 태아막, 태반 등으로부터 회수할 수 있다. 구체적으로는, 분만 직후에 얻어지는, 인간 태아막, 태반 및 탯줄을 포함하는 통합 유닛(integrated unit)을 처리 및 정제함으로써, 인간 양막을 준비할 수 있다. 처리 및 정제 방법은 JP-5-5698-A에 기술된 방법 등의 공지의 방법을 채용할 수 있다. 즉, 분만 후 수득되는 태아막에서 양막을 박리하고, 초음파 세정 등의 물리적 처리 및 효소 처리 등에 의해 잔류 조직을 제거한 다음, 양막을 필요에 따라 세정함으로써 준비할 수 있다.
이렇게 준비한 인간 양막은 사용할 때까지 동결 보존할 수 있다. 인간 양막은 예컨대 -80℃에서, DMEM와 글리세롤의 동일 부피 비의 혼합 용액 중에서 동결시킬 수 있다. 동결 보존으로 조작성이 개선되고 항원성 저하가 기대된다.
수득한 양막은 그대로 사용할 수도 있지만, 소파 시술 등으로 양막으로부터 표피를 제거하는 것이 바람직하다. 표피를 제거하면 항원성이 저하될 것이다. 예를 들어, 전술한 바와 같이 동결 보존된 인간 양막을 해동한 후, EDTA나 단백질 분해 효소로 처리하여 세포 간의 접착을 약화시킨 다음, 세포 스크랩퍼 등을 사용하여 표피를 긁어냄으로써, 표피가 제거된 인간 양막을 제조할 수 있다. 또한, 양막은 미리 건조 처리하는 것이 바람직하다. 건조 처리 방법의 예로는 동결건조, 풍건, 진공 건조, 감압 건조를 포함한다. 이 중에서도, 동결건조를 사용하는 것이 바람직하다. 그 이유는 동결건조시 양막의 유연성이 쉽게 저하되지 않기 때문이다.
콜라겐 겔의 원료로 사용되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, II형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 콜라겐으로는 여러가지 종류의 혼합 콜라겐을 들 수 있다. 이러한 콜라겐은 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부와 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화 방법, 알칼리 가용화 방법, 효소 가용화 방법 등에 의해 추출 및 정제할 수 있다. 항원성을 저감시키기 위해서는, 펩신 및 트립신과 같은 분해 효소 처리로 텔로펩타이드를 제거하여 수득한, 소위 아텔로콜라겐(atelocollagen)을 사용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔의 원료로서, 양막 유래 콜라겐, 특히 인간 양막 유래의 콜라겐을 사용할 수도 있다. 본원에서, "양막 유래"라는 표현은 "넓은 의미로 출발 물질로서 양막으로부터 수득되는" 것을 의미한다.
상기 피더 세포를 콜라겐 겔 내부에 포매시켜 배양한 경우(이하, 형질도입된 피더 세포라고도 함), 콜라겐 겔-포매 배양 방법을 이용할 수 있다. 이 경우의 콜라겐 겔의 제조 방법은 아래에서 예시된다. 예컨대, I형 콜라겐으로부터 중화된 콜라겐 용액을 제조한다. 이 용액을 배양 용기(예, 배양 인서트)에 붓고, 실온에서 10분간 정치시켜 용액이 겔이 되게 한다. 다음으로, 이 겔을, 전술한 방법에 따라 배양시킨 대수 증식기의 피더 세포와 혼합하여, 이 혼합물이 다시 겔이 되게 한다. 이러한 과정에 의해, 피더 세포가 함유된 콜라겐 겔을 수득할 수 있다.
피더 세포를 콜라겐 겔의 표면 상에 접종하는 경우, 부착된 콜라겐 겔 배양 방법 또는 부유 콜라겐 겔 배양 방법을 이용할 수 있다. 부착 콜라겐 겔 배양 방법의 경우, 피더 세포의 현탁액을 배양 디쉬에 형성되어진 콜라겐 겔 상에 접종하고, 세포가 상기 겔에 부착된 후, 세포를 단일층 배양 방법과 동일한 방식으로 배양한다. 겔에 혈청 또는 그외 생리 활성 물질을 첨가하는 경우에는, 이러한 물질들을 겔 제조용 콜라겐 혼합액에 혼합한다. 그러나, 배지는 쉽게 겔을 투과하므로, 콜라겐 겔에 혈청 등을 반드시 첨가할 필요는 없다. 부유 콜라겐 겔 배양법의 경우, 세포를 상기 부착 콜라겐 겔 배양법으로 배양하고, 세포가 상기 콜라겐 겔에 부착되어 단일층을 형성한 후, 겔을 배양 디쉬에서 벗겨, 피더 세포를 함유하고 있는 배지 중에 부유시킨다. 겔은, 주사 바늘이나 핀셋의 팁으로 배양 디쉬의 안쪽 가장자리를 한번 돌린 다음 겔 아래에서 중앙 쪽으로 팁을 밀어, 겔을 벗기고 부유시킬 수 있다. 콜라겐 겔은 시판 제품, 예컨대 콜라겐 겔 배양 키트(Nitta Gelatin, Inc.)를 이용하여 제조할 수 있다.
단계 (a)에서, 배양 온도, 배지 pH 및 이산화산소 농도 등의 조건은 특별히 한정되지 않으며, 동물세포 배양에 통상적으로 사용되는 조건을 적절히 사용할 수 있다. 피더 세포는 통상적으로 컨플루언시가 될 때까지 배양한다. 예컨대, 피더 세포가 표피 세포처럼 다층을 형성하는 세포인 경우에는, 피더 세포는 약 1 내지 2주간 추가적으로 배양하여 다층을 형성시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 생체에서와 유사한 상태의 피더 세포를 수득할 수 있다.
단계 (a)에 사용되는 형질도입된 피더 세포는 미리 미토마이신 C 등으로 불활성화하는 것이 더욱 바람직하다. 이러한 불활성화는, 다음 단계 (b)에서 피더 세포의 증식에 의해 표적 세포의 증식 저해를 방지하여, 표적 세포의 증식 효율을 개선시키기 위한 의도이다. 이러한 불활성화는 또한 방사선 처리 등에 의해서도 수행할 수 있다. 그 후, 피더 세포를 양막 또는 콜라겐 겔 상에 접종 및 배양하여, 양막 또는 콜라겐 겔의 표면 상에 층을 형성시킨다.
단계 (b)에서, 표적 세포는 필요에 따라 일반적인 동물 세포 배양 기술에 의해 배양할 수 있으며, 또는 다른 예로 표적 세포를 시판 제품으로 구입할 수 있다. 예를 들면, 표적 세포가 각막 상피 세포인 경우, 각막 상피 세포는 각막 윤부 조직으로부터 얻을 수 있다. 즉, 예컨대, 각막 윤부 조직으로부터 내피 세포를 박리 및 제거하고, 결막을 절제하여, 단일 세포 현탁액을 제조한 다음, 현탁액을 질소 탱크에서 저장한 후, 현탁액을 37℃에서 급속 해동시켜, 각막 상피 세포 부유액을 수득하고, 필요에 따라 계대 배양함으로써, 각막 상피 세포를 수득할 수 있다. 세포의 계대 배양에 사용할 수 있는 배지로는, 예를 들면, 무혈청 배지, 예컨대 EpiLifeTM(Cascade Biologics, Inc.) 및 MCDB153 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.), 이들 배지의 아미노산 조성 등을 변경하여 제조한 배지를 포함한다. 예컨대, 표적 세포가 각막 상피 세포인 경우, 각막 상피 세포는 각막 상피 시트의 이식을 받게 될 사람(수용자)으로부터 준비하는 것이 바람직하다. 즉, 표적 세포의 공여자는 표적 세포 시트의 수용자와 동일한 것이 바람직하다. 이러한 자가 세포를 사용함으로써, 면역 거부를 예방할 수 있다.
단계 (b)에서는, 표적 세포를, 단계 (a)에서 세포 배양용 캐리어 상에 배양한 피더 세포 상에, 접종(탑재)한다. 예컨대, 표적 세포가 인간 각막 상피 세포인 경우, 각막 상피 세포는, 예를 들면, 바람직하게는 약 1 x 103 - 1 x 106 cell/cm2, 보다 바람직하게는 약 1 x 104 - 1 x 105 cell/cm2의 세포 밀도로 접종할 수 있다. 세포가 상기 범위인 경우, 각막 상피 세포는 본래의 성질을 유지하면서 증식할 수 있다.
단계 (b)에서의 표적 세포의 배양은 이종세포의 부재 하에 수행한다. 본 발명에서, "이종 세포의 부재 하에"라는 표현으로 표시되는 조건은, 예컨대, 표적 세포가 각막 상피 세포인 경우, 각막 상피 세포에 이종인 세포가 각막 상피 세포의 배양에 사용되지 않는 것을 의미한다. 구체적으로는, 각막 상피 세포로서 인간 세포를 사용하는 경우, 마우스 및 랫 등의 인간 이외의 동물 종으로부터 유래된 세포는 배지에 존재(공존)하지 않는 조건을 의미한다. 표적 세포를 이러한 조건에서 배양하면, 최종적으로 얻어지는 이식 물질(즉, 각막 상피 시트)에 이종 물질(이종 세포 자체를 포함함)이 오염될 위험성이 없어진다.
본 발명의 제2 구현예에서, 인간 혈청을 필요에 따라 각각의 단계에 적절하게 첨가할 수도 있다. 인간 혈청의 첨가량과 농도는 통상적인 세포 배양 방법에 따라 결정할 수 있으며, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지 않는다. 예컨대 인간 혈청 5%∼10%로 사용할 수 있다.
단계 (b)에서, 표적 세포의 배양에 사용되는 배지는, 대상 세포의 증식을 뒷받침하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 배지의 예로는, MCDB153 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.); EpiLifeTM(Cascade Biologics, inc.); 이들 배지의 아미노산 조성 등을 변경하여 제조한 배지; 및 표피 세포의 증식에 통상적으로 사용되는 DMEM와 햄 F12 배지를 소정의 비율로 혼합하여 제조한 배지를 들 수 있다. 표적 세포가 인간 각막 상피 세포인 경우, 배지의 예로는 FBS(5∼10%), 인슐린(예, 5 ㎍/ml), 콜레라 독소(예, 1 nM), 표피 세포 성장 인자(EGF)(예, 10 ng/ml), 페니실린(예, 100 U/ml) 및 스트렙토마이신(예, 100 ㎍/ml)이 첨가된, DMEM/햄 F12의 혼합 배지(혼합 부피비 1 : 1)가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, 사용가능한 배지로는, 상기 DMEM/햄 F12 혼합 배지에 글루타민, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 등이 추가로 보충된 것도 포함할 수 있다. 배양 온도, 배지 pH, 이산화탄소 농도 등의 조건은, 동물 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배양 조건을 적절하게 사용한다. 배양 시간은, 특별히 한정되지 않지만, 2∼3주가 바람직하다.
또한, 본 발명의 표적 세포 시트의 제조 방법은, 필요에 따라, (c) 표적 세포 유도용 피더 세포를 표적 세포 시트로부터 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 단계 (c)에서, 상기 단계 (b)에서 배양한 표적 세포 시트는, 자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체를 이용하여 처리하여 피더 세포를 선택적으로 제거함으로, 얻을 수 있다. 세포 배양용 캐리어로서 양막 또는 콜라겐 겔을 사용하는 경우에는, 양막 및 콜라겐 겔을 반드시 제거하지 않아도 된다. 본 발명의 세포 시트 제조에 콜라겐 겔을 사용하고, 수득한 세포 시트를 이식하는 경우, 생체내 세포의 생착 측면에서, 필요에 따라 세포 시트에 콜라게나제를 처리할 수도 있지만, 콜라게나제 처리를 생략할 수도 있다. 콜라게나제 처리와 자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체 처리의 처리의 순서는 특별히 한정되지 않는다. 세포 배양용 캐리어로서 온도 반응성 세포 배양 표면을 이용하는 경우, 세포 시트의 수득은, 상기 항바이러스성 물질을 처리한 후, 아래와 같이 수행된다: 예컨대 배양 디쉬 온도를 배양 온도(예, 약 37℃)에서 배양 온도 보다 낮은 온도(예, 32℃ 이하)로 바꾸고, 배양 디쉬를 약 30분간 정치시키거나 또는 배지를 부드럽게 피펫팅함으로써, 세포 시트를 수득할 수 있다.
자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체(항바이러스성 물질)로서 간시클로버를 사용하는 경우, 간시클로버의 첨가량은 배양 후의 세포 상태에 따라 다를 수 있기 때문에 특별히 한정되지 않지만, 간시클로버의 농도는 바람직하게는 약 1 x 10-2 - 1 x 10-6 M, 더 바람직하게는 약 1 x 10-3 - 1 x 10-5 M이다. 처리 시간은 특별히 한정되지 않지만, 약 4 내지 14일이 바람직하며, 더 바람직하게는 약 6 내지 10일이다. 콜라게나제 처리에 사용되는 콜라게나제의 농도는 배양 이후의 세포 상태에 따라 다르므로 특별히 한정되지 않지만, 약 0.01 내지 0.5%가 바람직하다. 처리 시간은 약 0.1 내지 2시간이 바람직하고, 약 0.5 내지 1 시간이 더 바람직하다. 처리 온도는 특별히 한정되지 않지만, 약 30 내지 40℃가 바람직하다.
단계 (b)의 결과로, 표적 세포가 세포 배양용 캐리어 상에 증식되게 된다. 수득할 세포가, 예를 들면, 각막 상피 세포와 같이 다층을 형성하는 세포인 경우에는, 다층 형성을 촉진시키기 위해, 세포층의 표층을 공기와 접촉시키는 단계 (단계 d)를 수행할 수도 있다. 이 단계를 본원에서 "에어 리프팅(Air-lifting)"이라고 한다. 단계 (d)의 목적은 세포층을 형성하는 세포의 분화와 세포의 배리어 특성을 유도하는 것이다. 상기 단계 (d)는 단계 (b) 이후에 수행할 수 있으며, 또한 단계 (c) 이후에 수행할 수도 있다.
이 단계는, 배지의 일부를 피펫 드롭퍼, 피펫 등을 사용하여 일시적으로 제거함으로써 배양 배지의 수위를 낮추고, 이로써 일시적으로 세포층의 최상 표면이 배지 표면 위로 나오게 함으로써 행할 수 있다. 다른 예로, 이 단계는, 세포층을 콜라겐 매트릭스와 함께 들어올려, 최상단 표면을 배지 표면으로부터 일시적으로 나오게 함으로써 행할 수도 있다. 또한, 다른 예로, 튜브 등을 사용하여 공기를 배지 안으로 송출하여, 세포층의 최상단 표면이 공기와 접촉되게 할 수도 있다. 조작의 용이성 관점에서, 배지 수위를 낮춤으로써, 세포층의 최상단 표면을 배지 표면 위로 나오게 함으로써 행하는 것이 바람직하다.
단계 (d)의 지속 시간, 즉 다층화된 세포층의 최상단 표면을 공기와 접촉시키는 시간은, 세포 상태, 배양 조건 등에 따라 바뀔 수 있지만, 예컨대 바람직하게는 3일 내지 3주이고, 더 바람직하게는 약 5일 내지 2주이다.
또한, 표적 세포 시트의 제조 방법에 있어서, 세포 시트는 전술한 표적 세포로부터 유사하게 제조할 수 있다. 표적 세포가 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포 등의 줄기 세포인 경우, 줄기 세포를 세포 시트로서 회수할 수 있다. 다양한 분화 유도 인자를 도입하면, 다양한 분화된 세포를 세포 시트로서 회수할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는, 예로,
(a) 세포 배양용 캐리어 상에서, 전술한 바와 같이 수득되는, 표적 세포 유도용 피더 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양용 캐리어 상에 인간 각막 내피 세포를 접종한 다음 상기 인간 각막 내피 세포를 정치시켜, 인간 각막 내피 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는, 인간 각막 내피 세포의 배양 방법;
(a) 세포 배양용 캐리어 상에서, 전술한 바와 같이 수득되는, 인간 각막 실질 세포주를 배양하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양용 캐리어 상에 결막 상피 세포를 접종한 다음 상기 인간 결막 상피 세포를 정치시켜, 인간 격막 상피 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 결막 상피 세포의 배양 방법; 및
(a) 세포 배양용 캐리어 상에, 전술한 바와 같이 수득되는 표적 세포 유도용 피더 세포를 배양하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양용 캐리어 상에 인간 신장 유래 세포를 접종한 다음 상기 인간 신장 유래 세포를 정치시켜, 상기 단계 (b)에서 제조된 인간 신장 유래 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 인간 신장 유래 세포의 배양 방법을 포함한다.
본 발명의 피더 세포를 이용한 배양 방법에 따라, 표적 세포의 종류에 따라, 의도한 표적 세포의 세포 배양 밀도를 적절하게 정할 수 있다. 예를 들면, 표적 세포를 고밀도로 배양할 필요가 없으며, 저밀도 배양된 경우라도, 생체에서와 거의 비슷한 상태인 표적 세포를 수득할 수 있다. 세포의 밀도는 표적 세포의 종류에 따라 적절하게 조절할 수 있기 때문에, 세포의 밀도는 특별히 한정되지 않지만, 표적 세포의 세포 밀도는 예컨대 0.5 x 101 - 9 x 102 cell/cm2일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예는,
(a') 세포 배양용 캐리어 상에서 본 발명의 표적 세포 유도용 피더 세포를 배양하는 단계,
(b') 본 발명의 피더 세포에, 표적 세포에 대한 유도 후보 인자의 유전자를 형질도입하고, 유도 후보 인자가 형질도입된 피더 세포를 세포 배양용 캐리어 상에서 배양하는 단계,
(c') 상기 (a') 단계 및 (b') 단계의 각각의 세포 배양용 캐리어 상에 표적 세포를 접종하고, 표적 세포를 정치시킴으로써, 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계, 및
(d') 각각의 세포 배양용 캐리어 상에 배양된 세포를 평가하는 단계를 포함하는, 표적 세포에 대한 유도 후보 인자를 결정하는 방법을 포함한다.
유도 후보 인자는 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지 않으며, 유도 후보 인자는, 예컨대 표적 세포 자극성 인자일 수 있다. 세포의 배양 과정은 상기 과정과 동일한 방식으로 수행할 수 있다. 표적 세포와 세포 배양용 캐리어도 전술한 것과 동일할 수 있다. 세포의 평가 단계에서, 평가 방법은 표적 세포의 종류에 따라 통상적인 방법 중에서 적절하게 선택할 수 있다. 예컨대, 콜로니 형성 수를 계수함으로써, 세포 증식에 대한 효과를 평가할 수 있다. 본 발명에 의해, 표적 세포에 대한 유도 후보 인자의 기능을 평가 및 결정할 수 있으며, 이로써 표적 세포에 대한 자극 인자를 스크리닝할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예는,
(i) 본 발명의 피더 세포에 표적 세포에 대한 유도 후보 인자를 형질도입하는 단계,
(ii) 단계 (i)에서 수득한 유도 후보 인자가 형질도입된 피더 세포를 세포 배양용 캐리어 상에서 배양하는 단계, 및
(iii) 단계 (ii)의 세포 배양용 캐리어 상에 표적 세포를 접종하고, 표적 세포를 정치시켜, 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 배양 방법을 포함한다.
유도 후보 인자는, 본 발명의 효과를 방해하지 않는 한 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 전술한 표적 세포의 자극 인자일 수 있다. 세포의 배양 과정은 상기 방법과 동일한 방식으로 수행할 수 있다. 표적 세포와 세포 배양용 캐리어도 전술한 것과 동일한 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예는, 상기 표적 세포 시트의 제조 방법에 의해 얻어진 표적 세포 시트를 목적 부위(예로, 인간 각막 표면이 있으나, 이로 한정되지 않음)에 이식하는 단계를 포함하는, 표적 세포의 이식 방법을 포함한다.
실시예
이하 본 발명은 실시예를 들어 설명되지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
아래 방법에 따라, hTERT 유전자 및 TK 유전자에 의해 형질도입된 인간 각막 실질 세포주(이하, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포라고 함)를 제조하였다. hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 제조 모식도는 도 2에 나타낸다.
1. 인간 각막 실질 세포의 배양
수입한 각막(USA Eye Bank)의 각막공막 조직 단편으로부터 표피 세포와 내피세포를 제거(겸자로 긁어냄)하였다. 이렇게 수득한 각막 실질을 여러 조각으로 자른 다음, DMEM, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 포함된 35 mm 디쉬에 내피 측이 밑으로 오도록 넣어, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다.
2. 렌티바이러스의 벡터 제조
도 1에 나타낸 렌티바이러스의 제조에 필요한 목적 유전자 발현 벡터와 패키징 플라스미드를 사용하여, 하기 방법에 의해, 형질도입된 렌티바이러스 벡터를 제조하였다.
(1) hTERT-, GFP- 및 네오마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 제조
렌티바이러스 벡터의 긴 말단 반복체(LTR) 사이에 놓인 EF1 프로모터의 하류에, 서열번호 1의 hTERT 유전자 단편과 IRES-EGFP 유전자 단편을 서브클로닝하였다. 또한, 더 하류에, 네오마이신 내성 유전자를 PGK 프로모터의 하류 위치에 배치하였다. 이 렌티바이러스 벡터는 도 1A에 도시한다.
(2) TK- 및 퓨로마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 제조
렌티바이러스 벡터의 EF1 프로모터 하류에 서열번호 3의 TK 유전자 단편을, 서열번호 5 및 6의 프라이머를 사용하여 서브 클로닝 하였다. 또한, 그 하류에, 퓨로마이신-내성 유전자를 PGK 프로모터의 하류 위치로 배치하였다. 이 렌티바이러스 벡터는 도 1B에 도시한다.
(3) hTERT-, GFP- 및 네오마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스(재조합 hTERT 렌티바이러스) 및 TK- 및 퓨로마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스(재조합 TK 렌티바이러스)의 제조
10 cm 디쉬에 293 T세포를 약 2 x 106개 접종하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 배양 개시 후 1∼2일 후(50∼80% 칸플루언트), 형질감염하기 약 3시간 전에, 배지를 교체하였고, 형질감염 키트(상품명: CalPhosTM Mammalian Transfection Kit( Clontech Laboratories, Inc))를 사용하여, 상기에서 제조한 hTERT-, GFP- 및 네오마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터 플라스미드와, 패키징 플라스미드(pLP1(gag/pol), REV 플라스미드(pLP2(Rev)) 및 엔벨로프 플라스미드(pLP/VSVG(VSV-G)를, 상기 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 1일 후, 배지를 교체하였다. 배지 교체 후 1일 후, 배양 상층액을 (0.45㎛ 필터로 여과) 취하고, 초원심분리(4℃, 20000 rpm, 2 시간)하였다. 침강물을 DMEM 배지에 현탁하여, 하여, hTERT-, GFP- 및 네오마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스(이하, "재조합 hTERT 렌티바이러스"라고 함)를 제조하였다(-80℃에 보관).
마찬가지로, TK- 및 퓨로마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스 벡터를 사용하여, TK- 및 퓨로마이신-내성 유전자를 발현하는 렌티바이러스(이하, "재조합 TK 렌티바이러스"라고 함)를 제조하였다(-80℃에 보관).
3. hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포(피더 세포)의 제작
전술한 바와 같이 배양한 인간 각막 실질 세포에, 상기 hTERT 재조합 렌티바이러스를 감염시켰다. 감염 후 3일째부터, G418(800 ㎍/ml)을 이용한 선별을 실시하여, hTERT가 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 수득하였다. 또한, hTERT가 형질도입된 인간 각막 실질 세포에 상기 TK 재조합 렌티바이러스를 감염시켰다. 감염 후 3일째부터, 1 ㎍/ml의 퓨로마이신을 이용하여 선별하여, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 수득하였다. 제조 방법의 모식도는 도 2에 나타낸다.
4. 결과
hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포는 마커 단백질인 EGFP의 발현(형광)에 의해 hTERT 유전자의 도입을 확인할 수 있었다. 또한, hTERT-형질도입 전의 인간 각막 실질 세포는, 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서(배지: DMEM, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신), 최대 약 9세대까지만 유지시킬 수 있었는데, hTERT 유전자를 도입한 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포는 50세대 이상으로 장기 계대 배양이 가능하였다.
비교예
TK가 형질도입되지 않는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방식으로 hTERT가 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 제조하였다.
시험예
아래 방법으로 형질도입된 인간 각막 실질 세포에 대한 간시클로버 처리 감수성을 조사하였다. 24웰 플레이트에, 비교예의 hTERT가 형질도입된 인간 각막 실질 세포와, 실시예 1의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를, 2 x 104 cell/cm2로 접종하여, 37℃, 5% 이산화탄소 조건하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 접종 1일째에 간시클로버 처리를 개시하였다(처리 농도: 0, 10-7, 10-6, 10-5, 및 10-4 M; 시간 간격: 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12일). 각각의 시점에, 각 농도에 대해 웰 3개를 사용하여, 각 타입의 형질도입된 인간 각막 실질 세포에 대한 간시클로버 처리 감수성을 측정하였다(n=3). 각 시점에, 트립판 블루 염색으로 세포의 수를 계수하였다. 트립판 블루 염색으로 계수하기 위해 적혈구계(hematometer, 제품명: Burker-Turk deep 1/10 mm, 제품 번호: Tokyo No.0880, ERMA, Inc.)를 사용하였다. 염색 후, 각 샘플을 적혈구계의 카운팅 챔버에 넣었다. 그 후 즉시 세포의 수를 측정하였다. 측정 결과는 도 3에 나타내었다. 간시클로버 처리 0일째의 각 농도에 따른 세포의 평균 수를, 각 시간대의 세포수 결과에 대한 베이스라인(100%)으로 사용하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 비교예의 hTERT - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 수는, 간시클로버 처리 후 12일째에 모든 처리 농도에서도 감소되지 않았다(도 3, 좌측). 반면에, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포는, 간시클로버 처리 6일째에, 10-4 M 처리군 세포가 모두 사멸하였다(도 3, 우측). 또한, 다른 처리 농도 군(10-7, 10-6, 및 10-5 M)에서도, 간시클로버 처리 후 8일째부터 세포수의 농도 의존적인 감소가 나타났다.
실시예 2
인간 각막 상피 세포 시트를 아래 방법으로 제조하였다. 인간 각막 상피 세포 시트의 제조 방법의 모식도는 도 4A에 나타낸다.
1. 콜라겐 겔 상에, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 배양
콜라겐 겔 배양 키트(Nitta Gelatin)를 사용하여 6웰 플레이트에 콜라겐 겔(I형 콜라겐)을 제조하였다. 이 콜라겐 겔 상(Nitta Gelatin)에, 상기 실시예 1에서 제조한 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 접종하고, 37℃, 5% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 배양에 의해 수득되는 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포(피더 세포)의 사진을 도 4B(상단)에 나타내었다.
2. 인간 각막 상피 세포의 제조
수입 각막(USA Eye Bank)으로부터 수득한 각막공막 조직 조각을 2.4 U/ml 디스파제(Dispase) 용액 중에서 37℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 다음으로, 이 조직에 0.02% EDTA 용액을 실온에서 2분간 처리한 후, PBS로 2회 세정하였다. 수득한 세포 매스를 각막 상피 세포 배양 배지(DMEM/F-12, 5% FBS, 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1 nM 콜레라 독소, 10 ng/ml EGF, 100 U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)에 침지하여, 현미경 하에서 겸자를 사용하여 각막 윤부 주변의 각막 상피 줄기 세포를 박리하였다. 수득한 각막 상피 줄기 세포를 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 0.25% 트립신-EDTA 용액을 1 ml 첨가하고, 세포 현탁물을 37℃에서 15 내지 20분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 동량(1 ml)의 각막 상피 세포 배양 배지를 첨가하고, 세포 현탁물을 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 세포를 각막 상피 세포 배양 배지에 현탁하여, 인간 각막 상피 세포의 현탁물을 수득하였다.
3. 인간 각막 상피 세포의 접종 및 배양
상기 현탁액을 콜라겐 겔 상에서 배양한 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에 약 6 x 104 cell/cm2의 세포 밀도가 되게 접종하고, 37℃, 5% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM/F-12, 5% FBS, 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1 nM 콜레라독소, 10 ng/ml EGF, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 접종 후 3 또는 4일째에 배지를 교체하고, 18일간 배양하였다. 배양하여 수득한 인간 각막 상피 세포의 사진은 도 4B(중단)에 나타내었다.
4. 항바이러스성 물질의 처리 및 콜라게나제의 처리
배양 후, 간시클로버 10-4 M을 첨가하여 세포를 약 1주일 배양하여(배지를 2 또는 3일마다 교체함), hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 완전히 사멸시켰다. 이어, 콜라게나제 용액(0.1%)을 첨가하여, 37℃에서 약 30분간 인큐베이션하였고, 이로써 각막 상피 세포 시트가 회수되었다. 그러나, 콜라게나제 처리가 꼭 필요한 것은 아니다. 수득한 각막 상피 세포 시트의 사진은 도 4B(하단)에 나타내었다.
실시예 3
세포를 콜라겐 겔 상에 접종하기 전에 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포에 미토마이신 C(8 ㎍/ml)을 37℃에서 2시간 처리하는 것을 제외하고는, 실시예 2의 "콜라겐 겔 상에서의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 배양"과 동일한 방식으로 각막 상피 세포 시트를 회수하였다.
실시예 2 및 3으로부터, 본 발명의 피더 세포를 이용하여 인간 각막 상피 세포 시트를 제조할 수 있다는 것이 확인되었다. 본 발명의 제조 방법은, 피더 세포로서 일반적으로 사용되고 있는 마우스 3T3 세포를 사용할 필요가 없기 때문에, 이종 세포로 인한 감염 위험성을 피할 수 있다. 또한, 초대 배양으로 수득되는 인간 각막 실질 세포는 수 세대로만 유지될 수 있어 이식에 사용하는데 제한이 있지만, 본 발명의 피더 세포주는 TERT 유전자의 도입으로 인해 장기 계대를 통해 유지시킬 수 있다. 또한, 피더 세포의 오염 위험성 측면에서 피더 세포에 마커 유전자와 자살 유전자(TK)를 도입하였기 때문에, 피더 세포가 필요없어지게 되면 간시클로버로 세포를 사멸시킬 수 있으며, 피더 세포의 오염을 가시적으로 관찰할 수 있다. 피더 세포는 간시클로버에 의해 사멸시킬 수 있으므로, 각막 상피 세포와의 접착 배양 역시 가능하다. 간시클로버는 항-헤르페스바이러스 제제로서 임상적으로 이용가능하기 때문에, 세포 시트 제조시 피더 세포로 오염되었고, 이 세포 시트가 이식되었을 때에도, 간시클로버를 투여함으로써 피더 세포를 사멸 및 제거할 수 있다.
실시예 4
1. 콜라겐 겔 상에서의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 배양
실시예 2의 "콜라겐 겔 상에서의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 배양"과 동일한 방식으로, 콜라겐 겔 상에서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 배양하였다.
2. 인간 결막 상피 세포의 제조
PBS로 2번 세정한 후의 과정을 아래의 과정으로 대체하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2의 "인간 각막 상피 세포의 제조"와 동일한 방식으로, 인간 결막 상피 세포를 제조하였다.
수득되는 세포 매스를 PBS로 세정한 다음, 결막만을 적출하였다. 수득한 결막을 결막 상피 세포 배양 배지(DMEM/F-12, 5% FBS, 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1 nM 콜레라 독소, 10 ng/ml EGF, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)에 침지하여, 가위로 여러 조각으로 잘랐다. 이들 세포 조각들을 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 0.25% 트립신 EDTA 용액을 1 ml 첨가하여, 세포 현탁물을 37℃에서 15∼20분간 인큐베이션하였다. 다음으로, 결막 상피 세포 배양 배지를 동량(1 ml)으로 세포에 첨가하였다. 필터로 세포괴(cell lump)를 제거한 다음, 세포 현탁물을 하고, 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 세포를 결막 상피 세포 배양 배지에 현탁하여, 인간 결막 상피 세포의 현탁물을 수득하였다.
3. 인간 결막 상피 세포의 접종 및 배양
상기 현탁액을, 콜라겐 겔 상에서 배양한 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에 약 4 x 104 cell/cm2의 세포 밀도로 접종하여, 37℃, 5% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM/F-12, 5% FBS, 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1 nM 콜레라 독소, 10 ng/ml EGF, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 접종 후 3 또는 4일째에 배지를 교체하고, 18일간 배양하였다.
이로써, 피더 세포로서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에서 인간 결막 상피 세포를 배양할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 배양으로 수득한 세포의 사진은 도 5A에 나타내었다.
실시예 5
실시예 2에 기재된 "콜라겐 겔 상에서의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 배양"과 동일한 방식으로 콜라겐 겔 상에서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 배양하였다. 다음으로, 불멸화된 인간 각막 내피 세포를 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에 접종하여, 37℃, 10% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 30 ㎍/ml L-글루타민, 2 ng/ml b-FGF, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신).
이로써, 피더 세포로서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에서 인간 각막 내피 세포를 배양할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 배양으로 수득한 세포의 사진은 도 5B에 나타내었다.
실시예 6
실시예 2에 기재된 "콜라겐 겔 상에서의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 배양"과 동일한 방식으로 콜라겐 겔 상에서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 배양하였다. 인간 신장 유래 세포(293 T세포)를 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에 접종하여, 37℃, 5% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신).
이로써, 피더 세포로서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에서 인간 신장 유래 세포를 배양할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 배양으로 수득한 세포의 사진은 도 5C에 나타내었다.
상기 실시예 4 내지 6의 결과로부터, 본 발명의 피더 세포는 각막 상피 세포 뿐만 아니라 결막 상피 세포, 각막 내피 세포, 신장 유래 세포 등의 다양한 세포의 배양에도 적용가능한 것으로 확인되었다.
실시예 7
FBS에 대신 인간 혈청(Lonza, No.14-402 E)을 배지에 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 배양(배지: DMEM, 10% 인간 혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml스트렙토마이신) 및 실시예 2의 인간 각막 상피 세포의 배양(배지: DMEM/F-12, 5% 인간 혈청, 인슐린-트랜스페린-셀레늄, 1 nM 콜레라 독소, 10 ng/ml EGF, 100 U/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)과 동일한 방법으로, 인간 각막 상피 세포의 배양을 실시하였다. 그 결과, 인간 각막 상피 세포를 배양할 수 있었다. 인간 혈청을 이용한 배양에 의해 수득한 인간 각막 상피 세포의 사진은 도 6에 나타내었다.
실시예 8
수컷 ICR 마우스(SLC)에 인간 각막 상피 세포 시트를 이식하였다. 이식 과정에 대한 모식도는 도 7A에 나타내었다. 이식은 넴부탈의 복강내 투여에 의한 마취하에 행하였다. 마우스의 윤부를 포함한 각막 표면을 50% 에탄올에 약 30초간 노출시키고, 표층 각막절제를 수행하였다. 즉, 50% 에탄올 노출에 의해 각막 상피의 세포층을 완전하게 제거한 직후에, 실시예 2와 동일한 방법으로 제조한(콜라게나제 처리 안함) 인간 각막 상피 세포 시트를 직경 5 mm 원으로 트레핀으로 잘라, 상기 각막 표면 상에 인간 각막 상피 세포 시트를 이식하였다. 상기 세포 시트와 눈꺼풀을 수술용 8.0 봉합사로 봉합하였다. 인간 각막 상피 세포 시트를 이식하지 않는 대조군 마우스와 비교하여 이식 효과를 평가하였다. 이식 후, 항생제와 스테로이드제를 투여하였다. 이식 7일 후 안구를 적출하여 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 3-4시간 고정하였다. 이 결과는 도 7B(대조군)와 도 7C(이식한 피검물)에 나타내었다. 테크노비트 포매(Technovit 8100, Heraeus Kluzer)로 샘플을 준비하고, 5 ㎛ 절편을 만들었다. 이 절편을 HE(헤마톡실린-에오신) 염색하고, 면역염색하였다. HE 염색은 통상적인 방법으로 수행하였고, 그 결과는 도 7D에 나타내었다. 면역 염색은 아래 방법으로 수행하였다. 절편을 0.05% 트립신-EDTA로 37℃에서 10분간 처리한 다음 PBS로 헹구었다. 단편에 차단 용액(Block Ace (DS pharma biomedical) 및 0.3% tritonX-100)을 실온에서 1시간 동안 처리한 다음 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 반응시켰다(1차 항체: 마우스 단일클론 항-사이토케라틴 3 항체(1:50 (Progen)), 또는 마우스 단일클론 항-인간 미토콘드리아 항체(1:10 (Millipore))). 절편을 PBS로 헹군 후, 실온에서 2차 항체와 60분간 반응시켰다(2차 항체: Alexa Fluor 488 항-마우스 IgG 항체(1:200; Invitrogen). 절편을 PBS로 헹군 다음, 핵 염색(0.1 ㎍/ml DAPI; Sigma)을 실온에서 5분간 실시하였다. 절편을 다시 PBS로 헹군 다음, 수용성 포매제(mounting medium)로 실링하였다.
도 7B에 명확하게 나타난 바와 같이, 사람 각막 상피 세포 시트를 이식하지 않은 마우스 피검체(대조군)에서는, 처치 후 15일째에 각막이 혈관을 수반한 결막 조직으로 완전히 덮혀 투명성이 소실되었다. 반면에, 도 7C에 나타낸 바와 같이, 이식이 행해진 눈에서는, 이식 후 7일째에 결막 조직에 의한 침입은 관찰되지 않았고, 각막의 투명성은 유지되었다. 도 7D에 나타낸 현미경 관찰 결과로부터, 각막 상피 세포가 3 내지 5개의 층으로 형성되어 있음을 관찰하였다. 또한, 도 7F의 면역 염색 결과에서, 각막 상피 세포의 마커인 사이토케라틴 3의 발현도 관찰되었다. 또한, 도 7D 및 도 7F에 나타낸 각막 상피 세포가 인간 유래의 이식된 세포임을 검증하기 위한 목적으로, 인간 미토콘드리아에 대한 면역 염색을 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과는 도 7E에 나타내었다. 이 결과는, 각막 상피 세포가 인간 유래의 세포임을 보여준다. 전반적으로, 상기한 결과들은, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 이용하여 제조되는 인간 각막 상피 세포 시트가 마우스 각막 상피 손상 모델에 이식할 수 있으며 생체 친화적일 수 있음을 나타낸다.
실시예 9
아래 방법으로 실시예 1에서 수득한 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포에, 하기 렌티바이러스를 이용하여 표적 세포 유도용 후보 인자를 도입함으로써, 유도 인자를 발현하는 세포를 제조하였다.
1. 렌티바이러스 벡터의 제조
도 8에 나타낸 렌티바이러스 제조에 필요한 목적 유전자 발현 벡터와 패키징 플라스미드를 이용하여, 아래 방법으로 형질도입된 렌티바이러스 벡터를 제조하였다.
(1) DLL1/DLL4- 및 블라스티시딘-내성 유전자 발현 렌티바이러스 벡터의 제작
렌티바이러스 벡터(pLenti6/UbC/V5-DEST, Invitrogen)의 UbC 프로모터의 하류에 Delta-like 1(DLL1) 또는 Delta-like 4(DLL4) 유전자 단편을 서브 클로닝하여, DLL1/DLL4- 및 블라스티시딘-내성 유전자 발현 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 이 렌티바이러스 벡터는 도 8A에 나타낸다.
(2) E-cadherin- 및 하이그로마이신-내성 유전자 발현 렌티바이러스 벡터의 제작
렌티바이러스 벡터의 EF1 프로모터 하류에 E-cadherin 유전자 단편을 서브 클로닝하였다. 또한, 하류에, 하이그로마이신-내성 유전자를 PGK 프로모터의 하류에 배치함으로써, E-cadherin 및 하이그로마이신-내성 유전자 발현 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 이 렌티바이러스 벡터는 도 8B에 나타낸다.
(3) DLL1-블라스티시딘-내성 유전자 발현 렌티바이러스(DLL1 재조합 렌티바이러스), DLL4-블라스티시딘-내성 유전자 발현 렌티바이러스(DLL4 재조합 렌티바이러스) 및 E-cadherin·하이그로마이신-내성 유전자 발현 렌티바이러스(E-cadherin 재조합 렌티바이러스)의 제작
상기 렌티바이러스의 제작 방법과 동일한 방법으로, DLL1-블라스티시딘-내성 유전자 발현 렌티바이러스(이하, "DLL1 재조합 렌티바이러스"라고 함), DLL4-블라스티시딘-내성 유전자 발현 렌티바이러스(이하, "DLL4 재조합 렌티바이러스"라고 함), E-cadherin·하이그로마이신-내성 유전자 발현 렌티바이러스(이하, "E-cadherin 재조합 렌티바이러스"라고 함)를 제조하였다(-80℃에 보관함).
2. DLL1, DLL4 또는 E-cadherin+, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포의 제작
실시예 1에서 수득한 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포에, 상기 DLL1, DLL4, E-cadherin 재조합 렌티바이러스를 각각 감염시켰다. 감염 후 2일째부터, 블라스티시딘(10 ㎍/mL) 또는 하이그로마이신(50 ㎍/ml)으로 선별을 수행하여, DLL1, DLL4 또는 E-cadherin+, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 제조하였다. hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포, 및 DLL1, DLL4 또는 E-cadherin+, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포로부터, RNA를 추출하였다(RNeasy Mini Kit, Qiagen). 각 세포에 DNase I(Invitrogen)을 처리한 다음, 각 세포의 cDNA을 합성하였다(First-strand cDNA Synthesis System for Quantitative RT-PCR, Marligen biosciences). 제조된 cDNA를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응 조건은 아래에 나타낸다. PCR 프라이머는 DLL1(470 bp), DLL4(249 bp), E-cadherin(172 bp) 및 대조군으로서 GAPDH(255 bp)에 대해 설계하여, 서열번호 7 내지 14의 프라이머를 사용하였다. PCR 반응 산물은 2% 아가로스겔에서 전기영동하였다.
≪PCR 조건≫
94℃에서 5분 -> 35회 (94℃에서 30 초 -> 60℃에서 30 초 -> 72℃에서 30 초) -> 72℃에서 10분
RT-PCR 결과, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포에서 DLL1, DLL4 및 E-cadherin의 발현은 관찰되지 않았다(도 9A). 한편, 각 재조합 렌티바이러스로 감염된 세포에서는 각 유전자 DLL1, DLL4 및 E-cadherin의 발현이 관찰되었다(도 9B). 이상의 결과로, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포에 표적 세포 유도용 유도 인자를 추가로 도입할 수 있는 것이 확인되었다. 즉, 본 발명의 형질도입된 인간 각막 실질 세포에 다양한 종류의 유도 인자를 도입함으로써, 배양하기 어렵거나 또는 분화를 유도하기 어려운 표적 세포를 유도하기 위한 피더 세포로서 제공할 수 있다.
실시예 10
실시예 2의 "인간 각막 상피 세포의 제조" 및 "인간 각막 상피 세포의 접종 및 배양"과 동일한 방법으로, 인간 각막 상피 세포를 아래에 기술한 피더 세포 상에 배양하였다. 피더 세포로서 실시예 1의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포와 실시예 9의 DLL1+hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 각각 사용하였고, 인간 각막 상피 세포 1000개 접종하였다(각각 3개의 웰). 접종하고 12일째에, 세포를 10% 포름알데하이드로 30분간 실온에서 고정하였다. 세포를 1% 로다민 용액(Wako)으로 실온에서 10분간 염색한 후 PBS로 헹구었다. 염색된 콜로니의 수를 육안 관찰에 의해 계수하였다. 콜로니의 계수 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, DLL1 + hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 피더 세포로 사용한 경우(우측), hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 피더 세포로서 사용한 경우(좌측)와 비교하여, 콜로니 형성이 억제되었다. 이러한 결과로, DLL1에 각막 상피 세포의 콜로니 형성 억제 기능이 있음이 밝혀졌다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 형질도입된 인간 각막 실질 세포에 다양한 인자를 도입함으로써, 표적 세포에 도입된 인자의 기능을 평가할 수 있다.
실시예 11
하기 방법으로 인간 피부 섬유모세포에 hTERT + TK 유전자를 형질도입하였다. 또한, 인간 각막 상피 세포의 콜로니 형성을 관찰하였다.
1. hTERT + TK - 형질도입된 인간 피부 섬유모세포(피더 세포)의 제조
정상적인 인간 피부 섬유모세포(Kurabo Industries Ltd.; 제품 번호: KF-4109)에 실시예 1에서 사용한 재조합 hTERT 렌티바이러스 및 재조합 TK 렌티바이러스를 감염시켰다. 감염 후 2일째부터 G418(800 ㎍/ml) 및 퓨로마이신(1 ㎍/ml)으로 선별을 수행하여, hTERT + TK - 형질도입된 인간 피부 섬유모세포를 제조하였다(배지: 정상적인 인간 피부 섬유모세포 증식용 저혈청 배지(Medium 106S, Kurabo Industries Ltd.; 제품 번호: M-106-500S), 저혈청성 증식 첨가제(LSGS, Kurabo Industries Ltd.; 제품 번호: S-003-5), 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신).
2. 인간 각막 상피 세포의 제조, 및 인간 각막 상피 세포의 접종 및 배양
상기에서 수득한 hTERT + TK - 형질도입된 인간 피부 섬유모세포와 실시예 1의 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 피더 세포로서 각각 사용하였고, 실시예 2의 "인간 각막 상피 세포의 제조" 및 "인간 각막 상피 세포의 접종 및 배양"과 동일한 방법으로, 인간 각막 상피 세포를 각각의 피더 세포 상에서 배양하였다. 상기 각각의 피더 세포 상에 인간 각막 상피 세포 1000개를 접종하였다. 접종 후 10일째에 세포를 10% 포름알데하이드로 실온에서 30분간 고정하였다. 세포를 1% 로다민 용액(Wako)으로 실온에서 10분간 염색한 다음 PBS로 헹구었다. 결과는 도 11에 나타낸다.
3. 결과
도 11B의 결과, 피더 세포로서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 피부 섬유모세포 상에 인간 각막 상피 세포를 배양한 경우, 피더 세포로서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 사용한 경우(도 11A)와 동일하게 인간 각막 상피 세포의 콜로니가 형성되었다. 그 결과, hTERT + TK - 형질도입된 인간 피부 섬유모세포를 각막 상피 세포의 배양에 이용할 수 있음이 확인되었다. 이상의 결과로, 다른 종류의 세포주도 hTERT 및 TK 유전자를 도입함으로써 피더 세포로서 사용할 수 있다는 것이 검증되었다. 즉, 표적 세포의 배양에 최적인 피더 세포에 hTERT + TK 유전자를 도입하므로써, 표적 세포의 유도와 표적 세포의 시트 제조가 가능하게 되었다.
실시예 12
1. hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에서의 인간 각막 내피 세포의 배양
수입 각막(USA Eye Bank)의 각막공막 조직편으로부터 데스메막(Descemet membrane)이 포함된 각막 내피 세포를 입체 현미경하에서 겸자를 사용하여 회수하고, 이를 FNC 코팅 믹스(Athena Enzyme Systems)로 코팅된 6웰 플레이트에 각막 내피측이 아래에 있도록 넣고, 37℃, 10% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 25 ng/ml b-FGF, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 다음으로, 6웰 플레이트에, 미토마이신 C(8 ㎍/ml)으로 처리된 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포를 2 x 104 cell/cm2로 접종하여, 37℃, 5% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 접종 후 1일째에, hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에 인간 각막 내피 세포를 고밀도(2 x 104 cell/cm2) 및 저밀도(2 x 101cell/cm2)로 접종하여, 37℃, 10% 이산화탄소 조건 하에서 배양하였다(배지: DMEM, 10% FBS, 25 ng/ml b-FGF, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신). 그리고, 대조군으로서, FNC 코팅 믹스로 코팅된 6웰 플레이트(피더 세포 없음)에 인간 각막 내피 세포를 고밀도(2 x 104 cell/cm2) 및 저밀도(2 x 101cell/cm2)로 접종하여, 배양하였다. 접종 후, 26일째에 세포 관찰을 행하였다. 관찰 결과는 도 12에 나타낸다.
2. 결과
피더 세포의 존재 또는 부재와는 무관하게, 각막 내피 세포를 고밀도로 배양하였을 때, 각막 내피 세포는, 세포 형태가 육각형인 생체에서의 각막 내피 세포의 형태와 유사한 세포 형태를, 배양하는 동안에, 유지할 수 있었다(도 12, 상단 좌측과 우측). 각막 내피 세포를 피더 세포 상에서 저밀도로 배양한 경우, 각막 내피 세포는 고밀도로 배양한 각막 내피 세포의 형태와 비슷한 형태를 보였지만(도 12, 하단 우측), 피더 세포를 사용하지 않은 경우, 저밀도의 각막 내피 세포는 섬유모세포와 비슷한 세포 형태를 보였다(도 12, 하단 좌측). 이러한 결과로, 피더 세포로서 hTERT + TK - 형질도입된 인간 각막 실질 세포 상에 인간 각막 내피 세포를 배양하면, 생체에서의 각막 내피 세포와 비슷한 상태를 갖는 인간 각막 내피 세포를 신속하게 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 표적 세포 유도용 피더 세포는 세포의 배양과 세포 시트의 제조에 유용하다. 특히, 피더 세포는 각막의 재생을 목적으로 하는 이식에 이용할 수 있는 인간 각막 상피 세포 시트를 제조하는데 유용하다.
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Claims (19)

  1. 불멸화 유전자(immortalizing gene) 및 자살 유전자가 형질도입된, 생체로부터 이미 분리된 표적 세포 유도용 피더 세포(feeder cell).
  2. 제1항에 있어서, 상기 피더 세포는 상기 표적 세포에 인접하는 세포로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 피더 세포는 인간 각막 실질 세포(corneal stromal cell)로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 피더 세포는 인간 피부 섬유모세포로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 불멸화 유전자는 hTERT 유전자인 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  6. 제5항에 있어서, 상기 자살 유전자는 1형 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 유전자인 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  7. 제1항에 있어서, 마커 유전자가 추가로 형질도입된 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 마커 유전자는 EGFP 유전자인 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  9. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포는 세포 배양시에 피더 세포를 필요로 하는 인간 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포는 인간 각막 상피 세포, 인간 각막 내피 세포, 인간 결막 상피 세포 또는 인간 신장 유래 세포인 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  11. 제1항에 있어서, 표적 세포 자극성 인자의 유전자가 추가로 형질도입된 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 표적 세포 자극성 인자가 카드헤린(cadherin) 슈퍼패밀리, 인테그린 패밀리, 면역글로불린 슈퍼패밀리, 세크레틴 패밀리, 뉴롤리긴, 뉴로렉신 및 세포 표면 프로테오글리칸으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 세포 접착 분자; 상피 성장 인자(EGF) 패밀리, 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF) 패밀리, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 패밀리 및 섬유모세포 성장 인자(FGF) 패밀리로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자; 또는 Jagged 패밀리 및 Delta 유사(like) 멤버로부터 선택되는 하나 이상의 Notch 리간드인 것을 특징으로 하는 표적 세포 유도용 피더 세포.
  13. (a) 세포 배양용 캐리어 상에 제1항에 따른 생체로부터 이미 분리된 표적 세포 유도용 피더 세포를 배양하는 단계,
    (b) 상기 (a) 단계의 세포 배양용 캐리어 상에, 단리된 표적 세포를 접종하여 상기 표적 세포가 정치되게 함으로써, 상기 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는, 표적 세포 시트의 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법이 (c) 상기 표적 세포 시트로부터 상기 표적 세포 유도용 피더 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 세포 시트의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 분리는 상기 표적 세포 시트에 자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체를 처리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 표적 세포 시트의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 자살 유전자가 1형 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 유전자이고, 상기 자살 유전자-유도성 독성 물질의 전구체가 간시클로버(ganciclovir)인 것을 특징으로 하는 표적 세포 시트의 제조 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 표적 세포가 인간 각막 상피 세포, 인간 각막 내피 세포, 인간 결막 상피 세포 또는 인간 신장 유래 세포인 것을 특징으로 하는 표적 세포 시트의 제조 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 (a) 또는 (b) 단계에 인간 혈청이 사용되는 것을 특징으로 하는 표적 세포 시트의 제조 방법.
  19. (a') 세포 배양용 캐리어 상에 제1항에 따른 생체로부터 이미 분리된 피더 세포를 배양하는 단계,
    (b') 제1항에 따른 피더 세포에, 표적 세포 유도용 후보 인자의 유전자를 형질도입하고, 수득되는 유도용 후보 인자의 유전자가 형질도입된 피더 세포를 세포 배양용 캐리어 상에서 배양하는 단계,
    (c') 상기 (a') 및 (b') 단계의 각각의 세포 배양용 캐리어 상에, 단리된 표적 세포를 접종하고 표적 세포를 정치시킴으로써, 표적 세포를 배양 및 증식시키는 단계, 및
    (d') 상기 각각의 세포 배양용 캐리어 상에서 배양된 세포를 평가하는 단계를 포함하는, 표적 세포 유도용 후보 인자를 결정하는 방법.
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