WO2007094301A1

WO2007094301A1 - 硝子体細胞株

Info

Publication number: WO2007094301A1
Application number: PCT/JP2007/052488
Authority: WO
Inventors: Hidetoshi Yamashita; Teiko Yamamoto; Kouichi Nishitsuka; Yoshiko Kashiwagi; Naoki Tojo
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2006-02-14
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2007-08-23
Also published as: EP1988157A4; JPWO2007094301A1; US20090068744A1; EP1988157A1

Abstract

　本発明は外因性不死化遺伝子を発現し得る硝子体細胞株、及びその製造方法を提供する。本発明の硝子体細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、網膜硝子体疾患の病因解明、網膜硝子体疾患の予防または／および治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は硝子体の生化学的・生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なばかりでなく、人工硝子体の生体材料として利用できる可能性がある。

Description

硝子体細胞株

技術分野

[0001] 本発明は、硝子体細胞株およびその製造方法等に関する。

背景技術

[0002] 硝子体は、網膜、毛様体、水晶体に囲まれた硝子体腔 (vitreous cavity)を満たすゲル様組織で、中間透光体を形成するとともに、眼球内圧の維持にも関与している。硝子体は、眼球容積の約 4Z5を占め、その 99%は水である。硝子体のゲル構造は、コラーゲン繊維とボール状になったヒアルロン酸 (HA)との二重の網目構造を呈し、これが強力な含水能力の原因である。硝子体の異常は、種々の網膜硝子体疾患（例えば、増殖性網膜硝子体疾患等)の原因となり、視力の低下を引き起こす。硝子体の機能や構造を詳細に解析することは、網膜硝子体疾患の治療薬を開発していく上で重要である。本発明者らは、増殖性網膜硝子体疾患の増殖組織を解析すること〖こより、該疾患の病態にヒアルロン酸産生が関与していることを報告している (Japanese Journal of Ophthalmology, vol.7, p.557- 564, 2003 :非特許文献 1)。

[0003] 硝子体細胞は、硝子体内に含まれる細胞であり、 HA等の多様な硝子体構成成分を産生する。そこで、硝子体細胞をインビトロで培養し、その機能を解析することが、網膜硝子体疾患の病態を解明し、該疾患の治療薬の開発を進める上で重要である

[0004] し力しながら、硝子体細胞は、その増殖能が非常に低ぐ実質的に長期的な培養が不可能であるか、培養できたとしてもその増殖は極めて困難である。また、新生仔から得られる硝子体細胞は、比較的培養が容易ではあるが、その増殖能には制限があり、また、長期継代では、細胞の巨大化や変性が起こる可能性もある。そこで、硝子体細胞としての本来の機能を維持したまま、長期の継代が可能な硝子体細胞株の開発が望まれる。

[0005] 一方、不死化遺伝子として知られるシミアン'ウィルス 40 (SV40)の大型 T抗原遺伝子をヒト水晶体上皮細胞に導入することにより、ヒト水晶体上皮細胞株が作製された [特開平 10— 52272 :特許文献 1、 Andley U.P.ら， Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3094-3102 (1994) :非特許文献 2]。しかし、これまでに、硝子体細胞を株化したという報告はない。

特許文献 1：特開平 10— 52272号公報

非特許文献 1 : Japanese Journal of Ophthalmology, 7: 557-564 (2003)

非特許文献 2 : Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35: 3094-3102 (1994)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] したがって、本発明の目的は、硝子体の生理学的 ·生化学的研究や増殖性網膜硝子体疾患などの網膜硝子体疾患の予防および治療薬の開発のための研究手段として有用であり、また、硝子体再生のため、生体中への移植が可能な硝子体細胞株を提供することである。

課題を解決するための手段

[0007] 本発明者らは、不死化遺伝子を機能的に組み込んだプラスミド発現ベクターでブタ硝子体細胞をトランスフエタトすることによって、硝子体細胞にインビト口での無限増殖能を付与し、半永久的に継代培養可能なクローナルなブタ硝子体細胞株を榭立することに成功して本発明を完成するに至った。

[0008] 即ち、本発明は以下に関する。

[1]外因性不死化遺伝子を発現し得る硝子体細胞株。

[2]外因性不死化遺伝子が SV40大型 T抗原をコードするものである、 [1]記載の細胞株。

[3]ブタ由来である、 [1]記載の細胞株。

[4]下記（1)〜（3)の性質を有する、 [1]記載の細胞株：

(1)増殖速度の低下がみられなヽ；

(2) GFAP及び S 100の産生能を有する；及び

(3) TGF— β 1及び PDGF— BBの刺激によりヒアルロン酸産生が促進される。

[5]更に、以下の性質を有する、 [4]記載の細胞株：

(4) PDGF— ΒΒの刺激により HAS2の発現が上昇する。 [6]更に、以下の性質を有する、 [4]記載の細胞株：

(5) IL—1 αの刺激により VEGFの発現が上昇する。

[7]上記の性質が 20継代以上維持される、 [4]〜 [6]の、ずれかに記載の細胞株。

[8]生ウィルスの感染を介さずに榭立される、 [1]記載の細胞株。

[9]硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフエタトし、該細胞を培地中で継代培養することによって榭立される、 [1]記載の細胞株。

[10]硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフヱタトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む、硝子体細胞株の製造方法。

[11]外因性不死化遺伝子が SV40大型 Τ抗原をコードするものである、 [10]記載の製造方法。

発明の効果

[0009] 本発明の硝子体細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、網膜硝子体疾患の病因解明、網膜硝子体疾患の予防または

Ζおよび治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は硝子体の生化学的 •生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なば力りでなぐ人工硝子体の生体材料として利用できる可能性がある。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]硝子体細胞株の形態を示す写真である。

[図 2]試験プロトコールを模式的に示す図である。

[図 3]硝子体細胞株の HAS2の発現に対する PDGF— BB+TGF— β 1刺激の効果を示す図である。

[図 4]硝子体細胞株のヒアルロン酸産生に対する PDGF— BB+TGF— β 1刺激の効果を示す図である。

[図 5]PDGF— ΒΒ及び Ζ又は TGF— β 1刺激による HAS2発現に対する、 Smad2 、 3又は 4の強制発現の効果を示す図である。

[図 6]試験プロトコールを模式的に示す図である。 [図 7]硝子体細胞株の VEGF mRNA発現に対する IL—l a刺激の効果を示す図である。

[図 8]硝子体細胞株の VEGFタンパク質発現に対する IL 1 a刺激の効果を示す図である。縦軸は、ヒト VEGF標準品から導き出される、ブタ VEGF濃度の相対値である。

[図 9]硝子体細胞株の VEGF mRNA発現に対する IL 1 β、 TGF β、 PDGF— A A、 PDGF— BB又は TNF a刺激の効果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 本発明の硝子体細胞株は、外因性不死化遺伝子を含有し、該不死化遺伝子の発現の結果として、インビト口での無限増殖能を獲得した細胞群である。

[0012] 本発明の硝子体細胞株は、哺乳動物由来である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ノ、ムスター、モルモット等のげつ歯類やゥサギ等の実験動物、ブタ、ゥシ、ャギ、ヒッジ等の偶蹄類、ゥマ等の奇蹄類、ィヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、ァカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。本発明の硝子体細胞株は、好ましくは、ブタ由来である。

[0013] ここで「不死化遺伝子」とは、細胞を不死化し、無限増殖能を獲得させる遺伝子をいい、例えば c myc, ras等の癌遺伝子、アデノウイルス E1A、 SV40由来の大型 T抗原遺伝子（SV40大型 T抗原遺伝子）、ポリオ一マウィルスの大型 T抗原遺伝子、パピローマウィルスの E6及び E7遺伝子などが挙げられる。また、本発明において「外因性不死化遺伝子」とは、本発明の硝子体細胞株の起源となる硝子体細胞が生来有していない、細胞外から新たに導入される不死化遺伝子を意味する。したがって、本発明の細胞株が由来する哺乳動物以外に由来する不死化遺伝子のほか、たとえば、本発明の細胞株が由来する哺乳動物の癌遺伝子であっても、標的細胞内で発現可能な (すなわち、正常の内因性癌遺伝子が受けている発現抑制を受けない)形態に改変されたものも外因性不死化遺伝子に属するものとする。本発明の外因性不死化遺伝子として、好ましくは、ウィルス由来の不死化遺伝子、より好ましくは SV40 大型 T抗原遺伝子が用いられる。

[0014] 本発明の硝子体細胞株は、好ましくは、組織より分離された硝子体細胞に、上記の外因性不死化遺伝子を機能的に担持する、すなわち標的細胞内で発現可能な形態で担持する発現ベクターをトランスフエタトし、該細胞を適当な培地中で継代培養すること〖こよって樹立することができる。

[0015] 硝子体細胞は、例えば、摘出された眼組織力も硝子体組織を離断し、はさみ等で細かく (約 2mm角）に切断し、得られた硝子体断片を、ゥシ胎児血清や仔ゥシ血清 1 0〜20%を含む適当な液体培地、例えばイーグル MEM培地、ダルベッコの改良ィーグル MEM培地、ハム培地 F12、勝田培地 DM— 160等に懸濁し、 COインキュ

2 ベータ一中で 2日間程度培養することにより、培養容器上に接着した線維芽細胞様の細胞として単離することが出来る。単離された硝子体細胞がトランスフエクシヨンに供される。

[0016] 本発明で使用される発現ベクターとしては、プラスミドベクターやウィルスベクターが例示される。不死化遺伝子の導入過程にお！ヽて生ウィルスの感染を介さずに細胞株を榭立することが可能であり、細胞内でウィルス粒子の産生の可能性がないので、発現ベクターは好ましくは、プラスミドベクターである。ウィルスゲノムをベクターとして使用する場合は、該ベクターが導入された細胞内で、少なくとも完全なウィルス粒子が産生されな、ように遺伝子の一部を欠失または変異させておくことがより好ま、。

[0017] 外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターの構築方法として、例えば、外因性不死化遺伝子に SV40大型 T抗原遺伝子を使用する場合には、以下の方法が例示される。 SV40ゲノミック DNAの初期領域に存在する不死化遺伝子 (すなわち、大型 T抗原遺伝子)を含む DNA断片を適当な制限酵素を用いて切り出し、硝子体細胞中で該遺伝子を発現可能なプロモーターを含有するプラスミドベクターに挿入する。プロモーターとしては、 SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（RS V)プロモーター、 MuMLV LTR等が挙げられる。 SV40初期プロモーターを用いる場合、 SV40ゲノミック DNA力該プロモーターと大型 T抗原コード領域の両方を含む DNA断片を切り出してもょ、。

[0018] プラスミドベクターとしては pBR322、 pGEM等が挙げられる。また、さらに転写終結シグナル、外因性不死化遺伝子の発現をェンノヽンスする特異的な配列などを当該ベクターの適当な位置に配することもできる。このようにして構築された外因性不死化遺伝子発現ベクターは、適当な宿主中、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌等で大量に合成させ、常法により回収精製した後、常用の遺伝子導入法、例えばリン酸カルシゥム共沈法、マイクロインジェクション法、ポリエチレングリコール法、エレクト口ポレーシヨン法等により硝子体細胞に導入される。

[0019] ウイノレスベタターとしては、モロ-一マウス白血病ゥイノレス、レンチウイノレス等のレトロウィルス、アデノウイルス、ヘルぺスウィルス、アデノ随伴ウィルス、パルボウイルス、セムリキ森林ウィルス、ワクシニアウィルス、センダイウィルス等が挙げられる。レトロゥィルスによる遺伝子導入は、遺伝子が染色体へ組み込まれるように導入されるので、好ましい。また、レンチウィルスは分裂及び非分裂細胞の両方に感染し、遺伝子を導入することができる。ウィルス粒子を含む培養液中で硝子体細胞を培養することにより、外因性不死化遺伝子が硝子体細胞内へ導入される。この際、遺伝子導入試薬としてレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリプレン等を用いることにより、導入効率を高めることが出来る。

[0020] トランスフエクシヨン後の細胞は、液体培地、例えばイーグル MEM培地、ダルべッコの改良イーグル MEM培地、ハム培地 F12、勝田培地 DM— 160等で培養される。培養温度、培地 pH、 CO濃度等の条件は、動物細胞培養において通常使用され

2

る一般的な条件を適宜採用することができる。 2〜3日ごとに新鮮な培地に交換し、細胞増殖が飽和点に達した時に継代する。ー且、細胞増殖が止まってからも培養を続け、再増殖を始めた細胞群を単クローンの細胞群として分別する。クローンの分離は以下のようにして行うことができる。トリプシンと EDTA溶液を浸染させた小径の濾紙を目的のクローン細胞群上に静置し、培養容器より細胞を剥離して濾紙に付着させる。濾紙小片に付着したクローン細胞群を、濾紙ごと別の培養容器に移す。また、コロニーをピックアップする方法、限界希釈法や、セルソーターを用いる方法によってもクローンを分離することが出来る。クローナルな細胞株は、個々の細胞の性質が均一であるため、従来不均一な硝子体細胞を用いて行われて、た硝子体の生理学的 · 生化学的研究、網膜硝子体疾患の病因解明および予防'治療薬の開発等のための有用なモデル細胞となり得る。

[0021] 上記のようにして得られた硝子体細胞株は一般的な動物細胞培養技術により継代培養することができる。細胞の増殖能の指標として、下式により算出される細胞集団倍カ卩数（cell population doubling level ;PDL)が用いられる。

N. =第¾1代培養終了時の細胞数

N =第 1継代培養開始時の細胞数

0

本発明の細胞株の PDLは、通常 1継代ごとに、通常約 1. 1〜2. 0、好ましくは 1. 4 〜1. 5ずつ増加する。

[0022] 本発明の細胞株は、下記（1)〜（3)の性質を有し得る：

(1)増殖速度の低下がみられなヽ；

(2) GFAP及び S 100の産生能を有する；及び

(3) TGF— β 1及び Ζ又は PDGF—BBの刺激によりヒアルロン酸産生が促進される

[0023] ここで、 GFAP及び S 100を産生することは、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。 GFAP (Glial Fibrillary Acidic Prote inZグリア線維性酸性タンパク質）は、分子量約 50kDaの中間径フィラメントである。 S 100は、 EFハンドと呼ばれる loop-helix- loop構造のカルシウム結合モチーフを 2つ有する、分子量約 lOkDaの酸性タンパク質である。 TGF- β 1及び Ζ又は PDGF —ΒΒの刺激によりヒアルロン酸産生が促進されることも、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有して、ることの指標である。増殖性網膜硝子体疾患等の病態にヒアルロン酸産生が関与することが報告されていることから (Japanese Jou rnal of Ophthalmology, vol.7, p.557- 564, 2003)、本発明の細胞株は、特に、サイト力イン刺激による硝子体細胞力のヒアルロン酸産生のこれらの疾患への関与について研究するための強力なツールとなる。

[0024] 本発明の細胞株は、上記の性質に加えて、更に下記 (4)の性質を有していてもよい。

(4) PDGF— BBの刺激により HAS2の発現が上昇する。

[0025] 「遺伝子の発現」とは、該遺伝子をコードする mRNA又は該遺伝子産物（タンパク質）の発現を意味する。 HAS2 (Hyaluronan synthase 2)はヒアルロン酸の合成酵素である。 PDGF— BBの刺激により HAS2の発現が上昇することも、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。

[0026] 本発明の細胞株は、上記の性質に加えて、更に下記（5)の性質を有していてもよい。

(5) IL—1 αの刺激により VEGFの発現が上昇する。

[0027] たとえば、本発明の細胞株を IL— 1 aで刺激すると、 RT— PCR解析等による VEG F mRNAレベルは、非刺激コントロールの mRNAレベルと比較して、 12時間後で 2 倍以上、 48時間後では 2. 5倍以上となる。 IL—1 αの刺激により VEGFの発現が上昇することも、本発明の細胞株が硝子体細胞としての生理学的特徴を有していることの指標である。

[0028] また、本発明の細胞株の VEGF発現は、 IL— 1 j8、 TGF β、 PDGF—AA、 PDG F— BB又は TNF a刺激によっては有意な変化を示さない。たとえば、本発明の細胞株をこれらのサイト力インで刺激しても、 RT—PCR解析等による 48時間後の VEGF mRNAレベルは、非刺激コントロールの mRNAレベルの 0. 5〜1. 5倍の範囲内である。したがって、本発明の細胞株は、特に、 IL—1ひ刺激による VEGF発現のメカ -ズムの解析に有用である。

[0029] 本発明の細胞株は、通常、細胞の巨大化 ·変性が実質的にみられない。「細胞の巨大化 ·変性が実質的にみられない」とは、細胞の顕微鏡観察により、一部に伸張した細胞がみられることはあっても、その大多数 (例えば約 95%以上）は本来の硝子体細胞の形態的特徴を示すことを意味する。本発明の細胞株を長期（例えば約 40継代以上）に亘り継代すると、細胞形態が伸張する傾向を示す場合があるが、この伸張した細胞株も本発明の範囲内である。

[0030] 本発明の硝子体細胞株は、 20継代以上、好ましくは 35継代以上にわたり上記性質が安定に維持されている。

[0031] 本発明の細胞株は硝子体の生理学的'生化学的研究、網膜硝子体疾患の病因解明及び予防'治療薬の開発、並びに眼疾患用医薬品の安全性試験等のための有用なモデル細胞となり得る。且つ当該細胞は安定な供給が可能であるから、硝子体再生を目的とした移植や人工硝子体の有用な材料となり得る。また、本発明の細胞株は硝子体特異的蛋白質である GFAP及び S 100の産生能を有し、ヒアルロン酸産生能を有することから、該細胞株の大量培養により該物質を大量に製造することもできる。また、本発明の細胞株を IL-1 aにより刺激することにより VEGF発現が促進することから、この発現誘導を抑制する化合物を選択することにより、硝子体細胞から放出される VEGFが関与する、血管内皮の増殖、血管透過性の亢進、新生血管の増殖等の症状を予防 '治療し得る化合物をスクリーニングすることができる。

[0032] 以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。

実施例 1

[0033] (ブタ硝子体組織の単離及びブタ硝子体細胞の調製）

2歳齢のブタの眼組織より硝子体を摘出し、はさみで 2mm角に切断した。得られた硝子体断片を DMEM (GIBCO) (10% FBS, lOOU/ml ペニシリン及び 100 g/ml ストレプトマイシン含有）中に懸濁し、 10cm培養ディッシュ上で、 37°C、 5% COにて培養した。 2日後、ディッシュ上に接着した線維芽細胞様の細胞として、硝

2

子体細胞が得られた。

[0034] (不死化遺伝子 SV40大型 T抗原の導入及び細胞株の単離）

上記で得られた硝子体細胞に、 SV40大型 T抗原の配列が組み込まれたベクター（ RIKEN Tag- LTR- pUC18 sense #4)をリン酸カルシウム法（BD Calphos Mammalian T ransfection Kit)を用いて導入した。

80%コンフルェントのときに、培養ディッシュに 0. 25% トリプシン/ EDTAを 4ml 加え、 37°C、 5% COにて 5分間処理することにより、細胞を剥がし、その後上記 D

2

MEMを同量カ卩えることによりトリプシンを失活させた。その後、 380 X gにて 2分間、遠心分離することにより細胞を回収した。細胞を 1： 10希釈となるように培養ディッシュに播き、 37°C、 5%COにて更に培養した。

2

4日間培養後、コロニーを形成している細胞を選択し、該細胞をトリプシンで剥がし、コロニー毎に 12穴プレート中で培養した。 80%コンフルェント程度になったところで、細胞を 60mm培養ディッシュに継代し、更に 80%コンフルェント程度になったところで、細胞を凍結保存した（5% DMSO/10%FBS/DMEM) ₀ [0035] (細胞の継代）

単離されたコロニーを同様の条件で、第 40継代まで引続き培養した。培養を通じて、細胞は一定の比率で継代し続けることが可能であったことから、細胞の増殖速度の低下は認められな力つた。 5継代ごとに PDLを算出した。得られた細胞株の PDLは、 1継代ごとに、約 1. 4〜1. 5ずつ増加した。

顕微鏡下で細胞の形態を観察した。 DMIRBE顕微鏡 (Leica社製）に接続された冷却 CCDカメラ DP— 70 (ォリンパス社製)で細胞の様相を撮影した。撮影条件は以下の通り：対物レンズ 5倍 Z接眼レンズ 10倍 Z光量 9. 0V。細胞は単層からなり、線維芽細胞様の形態を呈した（図 1)。 40代継代後の細胞の一部に、伸張した細胞形態を呈する傾向が認められたものの、細胞の巨大化や変性はほとんど認められなかった。

[0036] (SV40大型 T抗原の発現確認）

細胞から全 RNAを単離し、 cDNAを合成し、 RT— PCR法により不死化遺伝子 SV 40大型 T抗原の mRNA発現を確認した。

[0037] (硝子体細胞株の表現型の解析）

硝子体細胞株は、 GFAP及び S 100タンパク質を発現していた。このことから、得られた硝子体細胞株は硝子体細胞としての生理学的特徴を保持していることが示された。

次に、榭立された硝子体細胞株における、ヒアルロン酸シンターゼ (HAS) 2の発現及びヒアルロン酸産生に対する PDGF— BB及び Z又は TGF— β 1の影響を調べた。該発現は RT— PCRにて観察した。

即ち、硝子体細胞株が 50〜60%コンフルェントのときに、該細胞の培地をゥシ血清を 1%を含んだ DMEMに交換し、 24時間培養後、 TGF- β 1 (10ng/ml)及び PDGF— BB (lOngZml)により細胞を刺激した。一部の試験においては、培地交換から 6時間後に、 Smad2、 3又は 4を細胞株にトランスフエクシヨンした。サイト力イン刺激の 3、 6、 24及び 48時間後に、細胞及び培養上清を回収した（図 2)。細胞力も全 R NAを抽出し、 cDNA合成を行い、 HAS2に特異的なプライマーを用いて RT— PCR を行った。 PCRは、 Roche FastStart High Fidelity PCR Systemを用い、 Gene Amp P CR System 9700 (Applied Biosystems)上で行った。 PCRの条件は以下の通り：

95°C 2分間 → (95°C 30秒 → X。C 30秒 → 72°C 30°C) XYサイクル

→ 72°C 7分

X= 50, Y= 35 - - -HAS2

X=60、 Υ= 25 · · 'beta— Actin

また、培養上清中のヒアルロン酸濃度をヒアルロン酸測定キット（生化学工業株式会社)を用いて測定した。

[0038] その結果、硝子体細胞株を TGF— β 1 ( 1011₈71111)及び1³00 ー88 ( 1011₈71111 )により刺激すると、刺激から 6時間後に HAS2の mRNA発現量が上昇した（図 3)。該刺激により、培養上清中の HA濃度が経時的に上昇したことから、 TGF- β 1及び PDGF— BBの刺激により硝子体細胞株におけるヒアルロン酸合成が亢進したことが示唆された（図 4)。このことから、得られた硝子体細胞株は硝子体細胞としての生理学的特徴を保持して、ることが示された。

Smad2、 3又は 4の強制発現により、 TGF— β 1刺激による HAS2の発現が認められた（図 5)。このことから、 TGF— β 1の作用は Smad2、 3及び 4の経路を介するものであることが示唆された。 TGF- β 1と PDGF— BBとの相乗効果は認められなかつた。

実施例 2

[0039] 実施例 1にお!/、て榭立した硝子体細胞株における、サイト力イン刺激に対する VEG F発現の変化を調べた。 VEGFの mRNAレベルでの発現は RT-PCRにより、またタンパク質レベルでの発現は ELISAにより調べた。

即ち、硝子体細胞株が 50〜60%コンフルェントのときに、該細胞の培地をゥシ血清 1%を含んだ DMEMに交換し、 24時間培養後、サイト力イン（IL- 1 a、 IL- 1 β、 TNF a 、 PDGF-AA、 PDGF-BB又は TGF jS ) (lOng/ml)で 48時間刺激した（図 6)。刺激した細胞から全 RNAを抽出し、 cDNA合成を行い、 VEGFのプライマーを用いて PCRを施行した。刺激した細胞の培地を ELISAに用いた。ブタ VEGFに対する適切な抗体が無いため、ヒト VEGFに対する抗体を用いた ELISAにより VEGFタンパク質濃度の測定を行い、結果をヒト VEGF標準品から導き出される参考値として算出した。 PCRは TOYO BO KOD plusのキットを用い、 Gene PCR System 9700(Applied Biosystem)にて行つた。 PCRの条件は以下の通りである：

95°C 120秒；

(95°C 15秒、 62°C 30秒、 68°C 30秒） X 30 cycle；

68°C 90秒。

ELISAは三菱ビーシーエルに依頼した。

[0040] その結果、硝子体細胞株を IL-1 aにより刺激すると、 VEGFの mRNA発現量が経時的に上昇した（図 7)。該刺激により、培養上清中の VEGFタンパク質濃度も経時的に上昇したことから、 IL-1 αの刺激により硝子体細胞株における VEGFタンパク質の産生が亢進したことが示唆された（図 8)。

一方、硝子体細胞株を他のサイト力イン（IL-1 β、 IL- 6、 TNF a、 PDGF- AA、 PDGF - BB又は TGF β )により刺激しても、 VEGFの mRNA発現量の有意な変化は認められなかった（図 9)。

このことから、実施例 1で得られた硝子体細胞株は、特に、 IL-1 α刺激による VEGF 発現のメカニズムの解析に有用であることが示唆された。 IL-1ひ刺激による VEGFの発現を抑制することができれば、血管内皮の増殖抑制、血管透過性の亢進抑制、新生血管の増殖抑制につながると考えられる。

産業上の利用可能性

[0041] 本発明の硝子体細胞株は、十分な細胞数を得ることができ、また一定の継続した増殖能を有することから、網膜硝子体疾患の病因解明、網膜硝子体疾患の予防または Zおよび治療薬の開発に有利に利用できる。さらに、該細胞株は硝子体の生化学的 •生理学的研究、さらに細胞の分化機構の研究に非常に有用なば力りでなぐ人工硝子体の生体材料として利用できる可能性がある。

本出願は日本で出願された特願 2006— 036953 (出願日： 2006年 2月 14日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

[I] 外因性不死化遺伝子を発現し得る硝子体細胞株。

[2] 外因性不死化遺伝子が SV40大型 T抗原をコードするものである、請求項 1記載の細胞株。

[3] ブタ由来である、請求項 1記載の細胞株。

[4] 下記（1)〜（3)の性質を有する、請求項 1記載の細胞株：

(1)増殖速度の低下がみられなヽ；

(2) GFAP及び S 100の産生能を有する；及び

[5] 更に、以下の性質を有する、請求項 4記載の細胞株：

(4) PDGF— ΒΒの刺激により HAS2の発現が上昇する。

[6] 更に、以下の性質を有する、請求項 4記載の細胞株：

(5) IL—1 αの刺激により VEGFの発現が上昇する。

[7] 上記の性質が 20継代以上維持される、請求項 4〜6の、ずれかに記載の細胞株：

[8] 生ウィルスの感染を介さずに榭立される、請求項 1記載の細胞株。

[9] 硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフエタトし、該細胞を培地中で継代培養することによって榭立される、請求項 1記載の細胞株。

[10] 硝子体細胞に、外因性不死化遺伝子を機能的に担持する発現ベクターをトランスフエタトし、該細胞を培地中で継代培養することを含む、硝子体細胞株の製造方法。

[II] 外因性不死化遺伝子が SV40大型 Τ抗原をコードするものである、請求項 10記載の製造方法。