CN111417718B - 由cd31阳性cd45阴性cd200阳性的哺乳动物细胞组成的细胞群及其应用 - Google Patents

由cd31阳性cd45阴性cd200阳性的哺乳动物细胞组成的细胞群及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供：基本上由细胞表面标记物CD31及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成的细胞群；基本上由细胞表面标记物CD31、CD157及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成的细胞群；细胞表面标记物CD31呈阳性、CD157及CD200中的至少一者呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物的血管内皮干细胞；及将该细胞群或该血管内皮干细胞作为有效成分的用于血管再生的药物。

Description

由CD31阳性CD45阴性CD200阳性的哺乳动物细胞组成的细胞 群及其应用
技术领域
本发明涉及一种由CD31阳性CD45阴性CD200阳性的哺乳动物细胞组成的细胞群、以及将该细胞群作为有效成分的药物。
背景技术
已知存在于骨髓中的造血干细胞通过在未分化的状态下进行分裂的能力(自我复制能力)与分化成祖细胞的能力而长期维持骨髓造血，所述祖细胞会生成作为成熟的血细胞的红细胞或白细胞、血小板。另一方面，一直认为形成血管内壁的血管内皮细胞在胎儿期产生，作为成熟的血管内皮细胞并通过缓慢分裂而终生维持血管。即，并没有考虑到血管系统中存在长期支持血管的干细胞。
本申请的发明人考虑是否在已有的血管中也存在可生成大量的血管内皮细胞的如血管内皮干细胞这样的细胞，并使用作为组织干细胞的分离法已为人所知的hoechst法，研究了血管内皮细胞是否具有异质性。hoechst法是利用了组织干细胞的药物(异物)排出能力比其他分化细胞高这一点的方法。若细胞摄取了作为DNA染色色素的hoechst33342，则hoechst33342的排出能力高的细胞的一部分显示干性。本申请的发明人将小鼠下肢的肌肉作为实验材料并对已有的血管进行了观察，结果发现，在整体的血管内皮细胞中存在1％左右的hoechst33342的排出能力高的侧群细胞(以下，记作“SP细胞群”)。比较未能排出hoechst的主群细胞(以下，记作“MP细胞群”)与SP细胞群可知，SP细胞群以约10％的比例含有由一个细胞生成大量血管内皮细胞的细胞，而MP细胞群中几乎不存在具有这种能力的细胞。此外，得知了若将这些血管内皮细胞移植到结扎小鼠的股动脉而引起缺血的小鼠的大腿肌中，则SP细胞群能够通过自我分化的血管内皮细胞而形成完整的血管，但MP细胞群几乎没有该能力。认为移植的SP细胞群作为MP细胞群对血管做出贡献，SP细胞群中存在血管内皮干细胞样的细胞，该细胞具有再生出新血管的能力(非专利文献1)。以往报道了骨髓中存在血管内皮祖细胞，并进行过使用了该细胞的血管再生治疗。然而，已知该细胞虽暂时分化为血管内皮细胞样的细胞，但不能持续作为血管内皮细胞做出贡献。此外，本申请的发明人确认了在肌肉的血管内皮细胞中发现的血管内皮干细胞样的细胞并不是源自骨髓的细胞(非专利文献1)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Naito H,Kidoya H,Sakimoto S,Wakabayashi T,TakakuraN.Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitorcell population in preexisting blood vessels.EMBO J.2012 Feb 15；31(4):842-55.
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明的技术问题在于，提供一种利用细胞表面标记物鉴定血管内皮干细胞及血管内皮干细胞群，并将该血管内皮干细胞及血管内皮干细胞群作为有效成分的药物。
解决技术问题的技术手段
为了解决上述技术问题，本发明包含以下的各个发明。
[1]一种细胞群，其基本上(本質的に)由细胞表面标记物CD31及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成。
[2]一种细胞群，其基本上由细胞表面标记物CD31、CD157及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成。
[3]根据所述[1]或[2]所述的细胞群，其包含血管内皮干细胞。
[4]根据所述[1]或[2]所述的细胞群，其中，所述哺乳动物细胞包含表达导入的基因的血管内皮干细胞。
[5]根据所述[1]～[4]中任一项所述的细胞群，其中，哺乳动物为人。
[6]一种哺乳动物的血管内皮干细胞，其中，细胞表面标记物CD31呈阳性、CD157及CD200中的至少一者呈阳性、CD45呈阴性。
[7]根据所述[6]所述的血管内皮干细胞，其表达导入的基因。
[8]根据所述[6]或[7]所述的血管内皮干细胞，其中，哺乳动物为人。
[9]一种药物，其将所述[1]～[5]中任一项所述的细胞群或所述[6]～[8]中任一项所述的血管内皮干细胞作为有效成分。
[10]根据所述[9]所述的药物，其用于血管再生、改善缺血、改善低营养、治疗血管畸形、改善血管畸形所引起的供血不足、促进脏器再生、或者予防和/或治疗由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病。
[11]根据所述[10]所述的药物，其中，由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病为血友病A、血友病B、血管性血友病、高血压、糖耐量异常、脂质代谢紊乱、代谢综合征或骨质疏松症。
[12]一种用于予防和/或治疗疾病的药物，其将所述[4]所述的细胞群或所述[7]所述的血管内皮干细胞作为有效成分，所述疾病通过导入的基因的产物而得到改善。
[13]根据所述[12]所述的药物，其中，通过导入的基因的产物而得到改善的疾病为血友病A、血友病B、血管性血友病、癌症、老年性黄斑变性、自身免疫性疾病、风湿病、痴呆症、糖尿病、高血压病、糖尿病肾病、骨质疏松症、肥胖或传染病。
[14]一种毒性评价方法，其为评价受试物质对血管的毒性的方法，所述毒性评价方法的特征在于，其包含：
(1)使用含有受试物质的培养基及不含有受试物质的培养基来培养所述[1]～[5]中任一项所述的细胞群的工序；
(2)测定培养后的细胞增殖水平的工序；及
(3)比较使用含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平与使用不含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平的工序。
发明效果
根据本发明，能够提供血管内皮干细胞群及血管内皮干细胞。使用本发明的细胞群或血管内皮干细胞，能够提供一种用于血管再生、改善缺血、改善低营养、治疗血管畸形、改善血管畸形所引起的供血不足、促进脏器再生、或治疗由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病的药物。此外，通过使用表达导入的基因的血管内皮干细胞，能够提供一种用于治疗通过导入的基因的产物而得到改善的疾病的药物。
附图说明
图1为示出对消化并分散小鼠的肝脏而制作的细胞进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析的结果的图，(A)为利用抗CD31抗体与抗CD45抗体进行染色并进行流式细胞分析的结果，(B)为利用抗CD157抗体与抗CD200抗体对(A)的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)进行染色并进行流式细胞分析的结果。
图2为分别对图1的(B)的级分A(CD157阳性CD200阳性)、级分B(CD157阴性CD200阳性)及级分C(CD157阴性CD200阴性)的各细胞进行集落形成实验的结果。
图3为示出将图1的(B)的级分A(CD157阳性CD200阳性)、级分B(CD157阴性CD200阳性)及级分C(CD157阴性CD200阴性)的各细胞移植到肝血管缺损模型小鼠的肝脏中，对肝脏的血管再生进行研究的结果的图。
图4为示出用抗EGFP抗体及抗CD31抗体对移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠的肝脏的冰冻切片进行染色的结果的图。
图5为示出对野生型小鼠、凝血因子Ⅷ基因杂合缺失小鼠、血友病模型小鼠(凝血因子Ⅷ基因缺失小鼠)、移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠及移植了CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠中的血浆中凝血因子Ⅷ进行测定的结果的图。
图6为示出对移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠与未移植细胞的血友病A模型小鼠的出血时间进行测定的结果的图。
图7为示出将SP细胞群的细胞或MP细胞群的细胞移植到进行了70％肝部分切除术的小鼠的肝脏中，并用荧光显微镜观察7天后的肝脏的结果的图，(A)为移植了SP细胞群的细胞的肝脏，(B)为移植了MP细胞群的细胞的肝脏。
图8为示出将SP细胞群的细胞或MP细胞群的细胞移植到进行了70％肝部分切除术的小鼠的肝脏中，并对7天后的肝脏的重量进行测定的结果的图。
图9为示出将SP细胞群的细胞移植到进行了70％肝部分切除术的小鼠的肝脏中，并对由7天后的肝脏制作的GFP阳性血管内皮细胞(GFP阳性CD31阳性CD45阴性细胞)(后)与移植前的SP细胞群的细胞(前)中的、Wnt2及HGF的mRNA表达量进行测定的结果的图，(A)为Wnt2的结果，(B)为HGF的结果。
图10为示出对消化并分散小鼠的视网膜、脑、心脏、皮肤、肌肉组织及肺而制作的细胞进行免疫荧光染色，回收各CD31阳性CD45阴性CD157阳性CD200阳性细胞并进行集落形成实验的结果的图。
图11为示出将由C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠的肝脏制作的1个CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞移植到肝脏中，用体视荧光显微镜观察1个月后的受体小鼠的肝脏的结果的图。
图12为示出对图11的受体小鼠的肝脏进行免疫荧光染色并用共聚焦显微镜进行观察的结果的图，(A)为利用抗GFP抗体进行染色的结果，(B)为利用抗CD31抗体进行染色的结果，下侧为上侧的虚线框内(窦周间隙)的放大图像。
图13的(A)为由图11的受体小鼠的肝脏制作细胞悬浮液，利用抗GFP抗体染色与前向散射光(FSC)进行流式细胞分析的结果，图13的(B)为利用抗CD157抗体与抗CD200抗体对(A)的框内的细胞(GFP阳性细胞)进行染色并进行流式细胞分析的结果。
图14为示出对消化并分散人的肝脏而制作的细胞进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析的结果的图，(A)为利用抗CD31抗体与抗CD45抗体进行染色并进行流式细胞分析的结果，(B)为利用抗CD157抗体与抗CD200抗体对(A)的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)进行染色并进行流式细胞分析的结果。
图15为分别对图14的(B)的CD200阳性级分(CD31阳性CD45阴性CD200阳性)及CD200阴性级分(CD31阳性CD45阴性CD200阴性)的各细胞进行集落形成实验的结果。
图16为示出对消化并分散人肾脏组织而制作的细胞进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析的结果的图，(A)为利用抗CD31抗体与抗CD45抗体进行染色并进行流式细胞分析的结果，(B)为利用抗CD157抗体与抗CD31抗体对(A)的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)进行染色并进行流式细胞分析的结果。
图17为示出对消化并分散人胎盘组织而制作的细胞进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析的结果的图，(A)为利用抗CD31抗体与抗CD45抗体进行染色并进行流式细胞分析的结果，(B)为利用抗CD157抗体与抗CD31抗体对(A)的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)进行染色并进行流式细胞分析的结果。
图18为示出对消化并分散人皮肤组织而制作的细胞进行免疫荧光染色及hoechst染色，回收CD31阳性CD45阴性细胞后，用流式细胞仪进行hoechst分析的结果的图。
具体实施方式
[血管内皮干细胞及包含血管内皮干细胞的细胞群]
本申请的发明人发现，从肌肉组织的血管中获得的血管内皮细胞中存在1％左右的药物(异物)排出能力高的细胞(SP细胞群)，其中存在血管内皮干细胞样的细胞；药物(异物)排出能力低的大多数的血管内皮细胞(MP细胞群)中几乎不存在血管内皮干细胞样的细胞(非专利文献1)。然后，本申请的发明人确认到，从肝脏的血管中获得的血管内皮细胞也同样能够分为药物(异物)排出能力高的SP细胞群级分与药物(异物)排出能力低的MP细胞群级分，SP细胞群中存在10％左右的血管内皮干细胞样的细胞，而MP细胞群中几乎不存在血管内皮干细胞样的细胞。此次，本申请的发明人为了找到能够有效区分血管内皮干细胞样的细胞与其他血管内皮细胞的标志物分子，使用肝脏的SP细胞群与MP细胞群，综合分析了在SP细胞群中的表达高于在MP细胞群中的表达的基因，从超过100个的SP细胞群高表达基因中，找出了能够鉴定血管内皮干细胞样的细胞(以下，记作“血管内皮干细胞”)的细胞表面标记物。
本发明提供一种包含哺乳动物的血管内皮干细胞的细胞群。在本说明书中，血管内皮干细胞是指具有在未分化的状态下进行分裂的能力(自我复制能力)与分化成血管内皮细胞的能力的细胞。本发明的第一细胞群为基本上由细胞表面标记物CD31及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成的细胞群。本发明的第一细胞群中也可以以难以利用通常的操作排除的程度的比例含有杂细胞(除CD31阳性/CD200阳性/CD45阴性细胞以外的细胞)。
CD31为属于免疫球蛋白超家族的分子量为140kDa的单链膜糖蛋白，也被称作PECAM-1，可用作内皮细胞的细胞表面标记物。CD45为作为白细胞共同抗原(LCA：Leukocytecommon antigen)而众所周知的单链跨膜蛋白，至少存在五种同工型。在本发明中，CD31阳性CD45阴性被定位为血管内皮细胞的细胞表面标记物。因此，在本说明书中，CD31阳性CD45阴性细胞与血管内皮细胞可互换使用。
CD200为属于含有两个免疫球蛋白样结构域(V、C)与单个跨膜结构域及较短的胞浆域(cytoplasmic domain)的免疫球蛋白超家族的高度保守的膜糖蛋白，胸腺、B细胞、活化的T细胞及B细胞、树突状细胞、神经元、内皮细胞等多种细胞在细胞表面表达CD200。本申请的发明人发现，在CD200阳性的血管内皮细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)中存在血管内皮干细胞。本发明的第一细胞群所含有的血管内皮干细胞可以为约2％，可以为约3％，可以为约4％，可以为约5％，可以为约6％，可以为约7％，可以为约8％，可以为约9％，也可以为约10％。本发明的第一细胞群所含有的血管内皮干细胞可以为1～3％，可以为2～4％，可以为3～5％，可以为4～6％，可以为5～7％，可以为6～8％，可以为7～9％，也可以为8～10％。
本发明的第二细胞群为基本上由细胞表面标记物CD31、CD157及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成的细胞群。本发明的第二细胞群中也可以以难以利用通常的操作排除的程度的比例含有杂细胞(除CD31阳性/CD157阳性/CD200阳性/CD45阴性细胞以外的细胞)。
CD157为糖基磷脂酰肌醇锚定型膜蛋白，在单核细胞、中性粒细胞、所有的淋巴系及髓系的祖细胞中表达。本申请的发明人发现，在CD200阳性的血管内皮细胞(第一细胞群)中存在CD157阳性与CD157阴性的两种细胞群，还发现CD157阳性细胞群中含有很多血管内皮干细胞，CD157阴性细胞群中含有很多与血管内皮干细胞相比分化阶段更进一步的血管内皮祖细胞。本发明的第二细胞群所含有的血管内皮干细胞可以为约20％，可以为约30％，可以为约40％，可以为约50％，可以为约60％，可以为约70％，可以为约80％，可以为约90％，也可以为约95％。本发明的第二细胞群所含有的血管内皮干细胞可以为20～40％，可以为30～50％，可以为40～60％，可以为50～70％，可以为60～80％，可以为70～90％，可以为80～95％，也可以为90～99％。
本发明的细胞群只要为由哺乳动物细胞组成的细胞群即可。哺乳动物没有特别限定，例如可列举出人、猴、牛、猪、犬、小鼠、大鼠、兔等。当本发明的细胞群为人的细胞群时，能够安全地移植给人。
本发明也可以为不形成细胞群的血管内皮干细胞。即，本发明中包含血管内皮干细胞。本发明的血管内皮干细胞可以为细胞表面标记物CD31及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物的血管内皮干细胞，也可以为细胞表面标记物CD31、CD157及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物的血管内皮干细胞。哺乳动物没有特别限定，例如可列举出人、猴、牛、猪、犬、小鼠、大鼠、兔等。当本发明的血管内皮干细胞为人的血管内皮干细胞时，能够安全地移植给人。
本发明的细胞群及本发明的血管内皮干细胞能够由任意的脏器制作。已确认到例如能够由肝脏、视网膜、脑、心脏、皮肤、肌肉(骨骼肌)、肺、肾脏、胎盘等制作(参考实施例1、4、6、7)。本发明的细胞群的制作方法没有特别限定，例如能够使用下述方法：用市售的细胞分散用试剂消化并分散已分离的脏器而制作细胞悬浮液，利用抗CD31抗体、抗CD45抗体、抗CD200抗体对该细胞悬浮液进行染色后，使用流式细胞技术回收CD31阳性CD45阴性CD200阳性细胞(第一细胞群)。或者，能够使用下述方法：利用抗CD31抗体、抗CD45抗体、抗CD157抗体、抗CD200抗体对上述细胞悬浮液进行染色后，使用流式细胞技术回收CD31阳性CD45阴性CD157阳性CD200阳性细胞(第二细胞群)(参考实施例1)。
血管内皮干细胞也可以为表达导入的基因的血管内皮干细胞。表达导入的基因的血管内皮干细胞、及包含表达导入的基因的血管内皮干细胞的细胞群也包含在本发明中。导入的基因没有特别限定，可以为编码对生物体发挥有利效果的基因产物的基因。此外，导入的基因也可以为编码分泌至细胞外的基因产物的基因。作为这样的导入的基因，可列举出编码识别特定抗原的抗体的基因、编码细胞因子的基因、编码与特定核酸序列杂交的核酸的基因等。
表达导入的基因的血管内皮干细胞能够使用公知的基因重组技术制作。例如能够通过以下方式制作：将整合了所需基因的表达载体转染到以上述方式制作的CD31阳性CD45阴性CD200阳性细胞或CD31阳性CD45阴性CD157阳性CD200阳性细胞中。
[药物]
本发明提供一种将上述本发明的细胞群作为有效成分的药物。本申请的发明人确认到，若将本发明的细胞群移植到肝血管缺损模型小鼠的肝脏中，则血管可通过本发明的细胞群所含有的血管内皮干细胞而再生(参考实施例1)。此外，本发明提供一种将上述本发明的血管内皮干细胞作为有效成分的药物。本申请的发明人确认到，若将1个本发明的血管内皮干细胞移植到受体小鼠的肝脏中，则其作为构成血管的血管内皮细胞定殖、增殖，并长期得以维持(参考实施例5)。
本发明的药物可适宜地用作用于血管再生的药物。由于本发明的药物能够再生血管，因此能够用于改善起因于血管功能降低的缺血及低营养。因此，本发明的药物对脑梗塞、心肌梗塞、Buerger病等缺血性疾病的治疗是有效的。这些缺血性疾病可以为起因于动脉硬化、血栓、动脉炎等动脉疾病的疾病，也可以为起因于高脂血症、糖尿病、高血压、痛风、衰老等生活习惯病的疾病。此外，本发明的药物能够适宜地用于血管畸形的治疗或血管畸形所引起的供血不足的治疗。作为血管畸形，可列举出动静脉瘘、烟雾病等。进一步，本发明的药物也能够用于创面愈合。
本发明的药物能够用于促进脏器的再生。本申请的发明人确认到，若将本发明的细胞群移植到70％肝部分切除的小鼠的肝脏中，则可促进肝脏的再生(参考实施例3)。靶脏器没有特别限定，只要为能够利用本发明的药物而再生血管的脏器，则无论是何种脏器均能够促进再生。已明确了，利用血管内皮细胞所分泌的体液因子或粘附因子，可在所有脏器中诱导脏器所特有的细胞(包含干细胞)的长期的细胞生存及细胞增殖。因此，伴随着脏器的血管再生，该脏器的再生得到促进。因此，本发明的药物能够治疗通过脏器再生而得到改善的疾病。例如若促进肝脏的再生，则可予防或治疗肝硬化、肝纤维化、肝炎、脂肪肝、肝衰竭等。对于其他脏器也相同。
本发明的药物能够用于治疗由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病。例如，若对因基因缺陷而不分泌分子、或分子的分泌量减少进而引起疾病的患者应用包含具有正常基因的血管内皮干细胞的本发明的药物，则会由再生血管的血管内皮细胞中分泌所需量的分子，能够有效地治疗疾病。本申请的发明人确认到，对血友病A模型小鼠的肝脏给予由具有正常的凝血因子Ⅷ基因的小鼠的肝脏制作的本发明的细胞群，其结果，从出血到止血为止的时间显著缩短(参考实施例2)。
作为由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病，例如可列举出血友病A、血友病B、血管性血友病、高血压、糖耐量异常、脂质代谢紊乱、代谢综合征、骨质疏松症等。表1示出了这些疾病与分泌的分子的对应关系。
[表1]
本发明的药物能够选择并使用适合于再生血管的靶脏器的本发明的细胞群或本发明的血管内皮干细胞。作为适合于再生血管的靶脏器的本发明的细胞群，可以为由源自发育阶段的三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)中的、相同胚层的脏器制作的本发明的细胞群。源自内胚层的脏器为胃、肠、肺、肝脏、胰脏等，源自中胚层的脏器为肌肉、骨、血管、心脏、肾脏、脾脏、睾丸、子宫等，源自外胚层的脏器为脑、神经、皮肤、晶状体等。优选使用由与该靶脏器相同的脏器制作的本发明的细胞群。
本发明提供一种将包含表达导入的基因的血管内皮干细胞的细胞群或表达导入的基因的血管内皮干细胞作为有效成分的药物。表达导入的基因的血管内皮干细胞在移植的脏器或组织的血管中作为血管内皮细胞定殖，且同时继续并持续地表达导入的基因的产物并将其分泌到血液中，经由血流将导入的基因的产物送至疾病部位，因此能够适宜地用于予防和/或治疗通过导入的基因的产物的作用而得到改善的疾病。
将包含表达导入的基因的血管内皮干细胞的细胞群或表达导入的基因的血管内皮干细胞作为有效成分的药物，能够将导入的基因的产物对治疗有效的所有疾病作为治疗对象。例如可列举出：包含导入了编码凝血因子Ⅷ的基因的血管内皮干细胞的血友病治疗用药物；包含导入了编码凝血因子IX的基因的血管内皮干细胞的血友病治疗用药物；包含导入了编码抗凝血因子Ⅷ抗体的基因的血管内皮干细胞的血友病治疗用药物；包含导入了编码血管性血友病因子的基因的血管内皮干细胞的出血性疾病用药物(血管性血友病等)；包含导入了编码抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体的基因的血管内皮干细胞的血管增殖性疾病(癌症、老年性黄斑变性等)治疗用药物；包含导入了编码抗炎细胞因子(IL6等)抗体的基因的血管内皮干细胞的自身免疫性疾病(风湿病等)治疗用药物；包含导入了编码抗淀粉样蛋白β抗体的基因的血管内皮干细胞的痴呆症治疗用药物；包含导入了编码胰岛素的基因的血管内皮干细胞的糖尿病治疗用药物；包含导入了编码巨细胞病毒基因的IE2的mRNA的反义核酸的基因的血管内皮干细胞的获得性免疫缺陷综合症(AIDS)治疗用药物；包含导入了编码作为Tie2的激动剂的血管生成素-1的基因的血管内皮干细胞的血管通透性疾病(高血压病、糖尿病肾病等)治疗用药物；包含导入了编码Noggin的基因的血管内皮干细胞的骨质疏松症治疗用药物；包含导入了编码肥胖基因产物(瘦素等)的基因的血管内皮干细胞的肥胖抑制用药物；包含导入了编码癌抗原的基因的血管内皮干细胞的癌症疫苗治疗法用药物；包含导入了编码病毒抗原的基因的血管内皮干细胞的传染病予防及治疗用药物等。
本发明的药物能够以细胞悬浮液的形态给予至生物体内，所述细胞悬浮液通过将本发明的细胞群或本发明的血管内皮干细胞混悬于可给予至生物体内的适宜的溶液而得到。作为可给予至生物体内的溶液，例如可列举出生理盐水、PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)、其他生理盐类溶液。细胞群或血管内皮干细胞的制作通常在给予前进行，也可以使用冷冻保存的细胞群或血管内皮干细胞而在临用前配制。对于本发明的药物，能够将本发明的细胞群或血管内皮干细胞的细胞悬浮液直接给予至再生血管的靶脏器中、或给予至再生血管的靶脏器的上流的静脉内。给予量根据再生血管的靶脏器、患者年龄、体重等的不同而不同，因此不能一概而论，但医生能够考虑所述状况来进行判断，从而确定适宜适当的给予量。例如，可以每次给予1个～1×109个细胞。给予的频率能够在1次/天～1次/周的范围内适当选择。给予量及给予频率能够根据患者的情况而适当增减。
[血管毒性的评价方法]
本发明提供一种使用上述本发明的细胞群的血管毒性的评价方法。本发明的血管毒性评价方法能够通过使受试物质与上述本发明的细胞群接触，测定细胞增殖水平而实施。具体而言，例如可列举出包含以下工序的方法：
(1)使用含有受试物质的培养基及不含有受试物质的培养基来培养所述[1]～[3]中任一项所述的细胞群的工序；
(2)测定培养后的细胞增殖水平的工序；及
(3)比较使用含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平与使用不含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平的工序。
受试物质没有特别限定，例如可列举出核酸、肽、蛋白质、非肽类化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、细胞培养上清液、植物提取液、哺乳动物的组织提取液、血浆等。然而，受试物质并不限定于此。受试物质可以为新型的物质，也可以为公知的物质。这些受试物质也可以形成盐。作为受试物质的盐，可以为与生理学上可接受的酸或碱的盐。
用于培养本发明的细胞群的培养基能够从可用于培养血管内皮细胞的公知的培养基中适当选择。培养方法也能够适当地选择并使用公知的血管内皮细胞的培养方法。培养时间没有特别限定，优选根据所使用的受试物质进行适当设定。
测定细胞增殖水平的方法没有特别限定，能够从公知的方法中适当地选择并使用。具体而言，例如可列举出目视或使用细胞计数器对细胞数进行计数的方法、结晶紫染色法、MTT法、使用其他各种细胞增殖测定试剂盒的方法等。
当使用含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平低于使用不含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平时，即，当受试物质为抑制血管内皮干细胞的增殖的物质时，能够评价为该受试物质对血管具有毒性。例如，当使用含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平为使用不含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平的90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下时，也可以评价为该受试物质对血管具有毒性。
此外，当使用含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平与使用不含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平相比大幅上升时，即，当受试物质为异常地促进血管内皮干细胞的增殖的物质时，也能够评价为该受试物质对血管具有毒性。例如，当使用含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平为使用不含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平的200％以上、250％以上、300％以上时，也能够评价为该受试物质对血管具有毒性。
由于从成年哺乳动物回收的血管内皮细胞在体外(in vitro)几乎不增殖，因此很难将其用于以细胞增殖为指标的体外的血管毒性评价中。另一方面，由于本发明的细胞群能够在体外增殖，因此能够用于以细胞增殖为指标的体外的血管毒性评价中。因此，本发明的血管毒性评价方法在能够简便且迅速地评价受试物质的血管毒性这一点上是非常有用的。特别是想评价对血管内皮细胞的毒性时，本发明的血管毒性评价方法是有用的。进一步，就能够通过从患者自身制作本发明的细胞群，进而评价受试物质对患者等自身的血管的影响这一点而言，是非常有用的。
本发明中也包含以下的各个发明。
[A]一种血管再生方法，其包含给予所述[1]～[5]中任一项所述的细胞群或所述[6]～[8]中任一项所述的血管内皮干细胞的工序。
[B]根据[A]所述的方法，其改善缺血及低营养。
[C]根据[A]所述的方法，其治疗血管畸形或血管畸形所引起的供血不足。
[D]根据[A]所述的方法，其促进脏器的再生。
[E]根据[A]所述的方法，其治疗由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病。
[F]根据[E]所述的方法，其中，由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病为血友病A、血友病B、血管性血友病、高血压、糖耐量异常、脂质代谢紊乱、代谢综合征或骨质疏松症。
[G]用于血管的再生的所述[1]～[5]中任一项所述的细胞群或所述[6]～[8]中任一项所述的血管内皮干细胞。
[H]根据[G]所述的细胞群或血管内皮干细胞，其改善缺血及低营养。
[I]根据[G]所述的细胞群或血管内皮干细胞，其治疗血管畸形或血管畸形所引起的供血不足。
[J]根据[G]所述的细胞群或血管内皮干细胞，其促进脏器的再生。
[K]根据[G]所述的细胞群或血管内皮干细胞，其治疗由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病。
[L]根据[K]所述的细胞群或血管内皮干细胞，其中，由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病为血友病A、血友病B、血管性血友病、高血压、糖耐量异常、脂质代谢紊乱、代谢综合征或骨质疏松症。
[M]所述[1]～[5]中任一项所述的细胞群或所述[6]～[8]中任一项所述的血管内皮干细胞在血管再生用药物的制备中的应用。
[N]根据[M]所述的应用，其中，血管再生用药物改善缺血及低营养。
[O]根据[M]所述的应用，其中，血管再生用药物治疗血管畸形或血管畸形所引起的供血不足。
[P]根据[M]所述的应用，其中，血管再生用药物促进脏器再生。
[Q]根据[M]所述的应用，其中，血管再生用药物治疗由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病。
[R]根据[Q]所述的应用，其中，由血管内皮细胞分泌的分子的异常所引起的疾病为血友病A、血友病B、血管性血友病、高血压、糖耐量异常、脂质代谢紊乱、代谢综合征或骨质疏松症。
[S]一种疾病的治疗方法，其包含给予所述[4]所述的细胞群或所述[7]所述的血管内皮干细胞的工序，所述疾病通过导入的基因的产物而得到改善。
[T]用于治疗疾病的所述[4]所述的细胞群或所述[7]所述的血管内皮干细胞，其中，所述疾病通过导入的基因的产物而得到改善。
[U]所述[4]所述的细胞群或所述[7]所述的血管内皮干细胞在疾病的治疗用药物的制备中的应用，其中，所述疾病通过导入的基因的产物而得到改善。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于此。
[实施例1：基于细胞表面标记物的小鼠肝脏血管内皮干细胞的鉴定]
使用从小鼠肝脏的血管内皮细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)中获得的SP细胞群及MP细胞群，综合分析与MP细胞群相比，在SP细胞群中的表达更高的基因，找出了超过100个的基因。尝试从这些基因中鉴定出，在SP细胞群中存在10％左右的血管内皮干细胞的细胞表面标记物。
1-1小鼠肝脏血管内皮细胞的表面标记物分析
(1)使用动物及细胞制作
从Japan SLC,Inc.购买了C57BL/6小鼠及C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠(俗称绿色小鼠(green mouse))。实验中使用了8～12周龄的小鼠。在麻醉下将小鼠开腹，摘取肝脏。将肝脏剪碎后，浸渍于分散酶II(Dispase II)(Roche Applied Science制造)、胶原酶(Wako公司制造)及II型胶原酶(Worthington Biochemical Corp.制造)的混合溶液中，于37℃震荡、消化细胞外基质。使消化后的肝脏通过孔径为40μm的过滤器，得到分散的细胞悬浮液。用ACK(Ammonium-Chloride-Potassium)溶液(0.15M NH4Cl,10mM KHCO3,and 0.1mM Na2-EDTA)使红细胞发生溶血，剩余细胞供于以下实验。
(2)免疫荧光染色及流式细胞分析
对上述(1)中制作的细胞进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析。作为单克隆抗体，使用抗CD31抗体(克隆号MEC13.3，BD Biosciences公司制造)、抗CD45抗体(克隆号30-F11，BD Biosciences公司制造)、抗CD157抗体(克隆号BP3，BioLegend,Inc.制造)、抗CD200抗体(克隆号OX90，BioLegend,Inc.制造)。在流式细胞分析中，为了去除死细胞，在染色的细胞中添加碘化吡啶(PI，2μg/mL，Sigma-Aldrich Co.LLC制造)，对死细胞的核进行染色。流式细胞分析中使用了FACS Aria II SORP(BD Bioscience公司制造)及FlowJo Software(Treestar Software公司制造)。
(3)结果
将结果示于图1。回收(A)的散点图的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)作为肝脏的血管内皮细胞。接着，对回收的细胞中的CD157表达量(X轴)与CD200表达量(Y轴)进行分析，将结果示于(B)的散点图中。其结果表明，可将肝脏的血管内皮细胞分为CD157阳性CD200阳性的级分A、CD157阴性CD200阳性的级分B及CD157阴性CD200阴性的级分C这三个级分。此后，分别回收各级分，进行以下实验。
1-2用CD157及CD200划分的细胞的集落形成实验
(1)实验方法
将级分A(CD157阳性CD200阳性)、级分B(CD157阴性CD200阳性)及级分C(CD157阴性CD200阴性)的细胞接种于24孔培养板中。将OP9基质细胞(日本理化学研究所细胞库)作为饲养细胞，分别以5000个/孔进行接种。关于培养基，使用了含有10％FCS及VEGF(10ng/mL；PeproTech,Inc.制造)的RPMI培养基(Sigma-Aldrich Japan)。培养10天后，将孔中的细胞固定，用抗CD31抗体(BD Biosciences公司制造)进行染色。另外，级分A的细胞群为本发明的第二细胞群，级分A与级分B的混合细胞群为本发明的第一细胞群。
(2)结果
将结果示于图2。左侧为级分C的结果，中央为级分B的结果，右侧为级分A的结果。级分A的CD157阳性CD200阳性细胞形成了很多CD31阳性的大型的集落。级分B的CD157阴性CD200阳性细胞具有集落形成能力，但集落的大小或数目比不上级分A的细胞。级分C的CD157阴性CD200阴性细胞作为CD31阳性细胞而存活，但是集落形成能力几乎消失。根据这些结果认为，CD157阳性CD200阳性细胞(级分A)为血管内皮细胞干细胞级分，以该细胞为起点，分化成保留一部分CD157阴性CD200阳性(级分B)的干细胞功能的血管内皮祖细胞，终末分化成CD157阴性CD200阴性的成熟血管内皮细胞。即，认为本发明的第二细胞群为以血管内皮细胞干细胞为主的细胞群、本发明的第一细胞群为血管内皮细胞干细胞与保留了一部分干细胞功能的血管内皮祖细胞的混合细胞群。
1-3使用了肝血管缺损模型小鼠的干细胞功能的确认
(1)肝血管缺损模型小鼠
将野百合碱(Sigma-Aldrich Co.LLC制造)以300mg/kg的用量腹腔给药至C57BL/6小鼠，并在同一天全身照射30rads/g的放射线，制作肝血管缺损模型小鼠。
(2)实验方法
使用从C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠的肝脏中回收的级分A(CD157阳性CD200阳性)、级分B(CD157阴性CD200阳性)及级分C(CD157阴性CD200阴性)的细胞。将2×104个各级分的细胞分别从肝血管缺损模型小鼠的脾静脉移植到肝脏。在移植后的第4周，在麻醉下将小鼠开腹，用体视荧光显微镜(Leica Camera AG制造)观察肝脏。进一步，摘取肝脏，用上述1-1的(1)中记载的方法制备细胞悬浮液，用抗CD31抗体、抗CD157抗体及抗CD200抗体进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析。
(3)结果
将结果示于图3。左侧为肝脏的体视荧光显微镜观察图像。可知在移植了级分A的CD157阳性CD200阳性细胞的肝脏(上侧)中，GFP阳性区域非常广，GFP阳性的移植细胞构建了无数的血管区域。移植了级分B的CD157阴性CD200阳性细胞的肝脏(中间)的GFP阳性区域小于移植了级分A的细胞时的GFP阳性区域。即，可知级分B的细胞虽然维持了构建血管区域的能力，但其能力比级分A的细胞差。在移植了级分C的CD157阴性CD200阴性细胞的肝脏(下侧)中，仅观察到移植的细胞作为GFP阳性细胞而存活，可知级分C的细胞没有构建新的血管区域的能力。
从移植了各级分的细胞的肝脏中回收GFP阳性CD31阳性细胞(源自移植的细胞的细胞)(中央)，在右侧示出了回收的细胞中的CD157表达量(X轴)与CD200表达量(Y轴)的散点图。可知在移植了级分A的CD157阳性CD200阳性细胞的肝脏(上侧)中，正在进行由CD157阳性CD200阳性细胞向CD157阴性CD200阳性细胞、进一步向CD157阴性CD200阴性细胞的分化。可知在移植了级分B的CD157阴性CD200阳性细胞的肝脏(中段)中，正在进行向CD157阴性CD200阴性细胞的分化。可知在移植了级分C的CD157阴性CD200阴性细胞的肝脏(下侧)中，移植的细胞作为GFP阳性细胞而存活。
1-4小结
由以上的分析结果可知，若根据CD157与CD200划分血管内皮细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)，则CD157阳性CD200阳性的血管内皮细胞为可作为干细胞对血管形成做出较大贡献的细胞。认为该CD157阳性CD200阳性的血管内皮干细胞分化而成的CD157阴性CD200阳性的细胞虽然比不上干细胞，但为仍保留了增殖能力的细胞(保留了一部分干细胞功能的、所谓的血管内皮祖细胞)，该CD157阳性CD200阳性的血管内皮干细胞分化而成的CD157阴性CD200阴性的细胞为增殖活性极度减弱的终末分化的血管内皮细胞。根据该研究成果，本申请的发明人在世界上首次发现了，血管内皮细胞中存在等级结构性(Hierarchy)，血管系统具有从血管内皮干细胞分化至血管内皮祖细胞、进一步分化至终末分化的血管内皮细胞的分化图谱。
另外，虽然未示出数据，但本申请的发明人确认到，通过移植的CD157阳性CD200阳性细胞而形成的血管即使在移植1年后的小鼠中也有残留且并未减少。
[实施例2：基于CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞移植的血友病的治疗]
由于干细胞可边维持未分化性，边持续生成终末分化的体细胞，因此若移植被认为是血管内皮干细胞的CD157阳性CD200阳性细胞，则能够期待其长期作为血管内皮细胞而持续做出贡献。因此，认为若将该细胞移植给血管内皮细胞的功能障碍所引起的疾病的患者，则具有能够治愈该疾病的可能。因此，研究了将正常的CD157阳性CD200阳性细胞移植至血友病A模型小鼠的肝脏中，是否能够抑制血友病A模型小鼠的出血倾向。
(1)实验方法
从美国杰克逊实验室购买血友病A模型小鼠(凝血因子Ⅷ基因缺失小鼠)。按照实施例1的1-1中记载的方法，由C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠的肝脏制作CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞及CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞。将C57BL/6-Tg小鼠的CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞及CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞分别从脾静脉移植至血友病A模型小鼠的肝脏中，6周后采血并回收血浆。除此以外，也对野生型小鼠、凝血因子Ⅷ基因杂合缺失小鼠、未移植细胞的凝血因子Ⅷ基因缺失小鼠进行采血，回收血浆。血浆中的凝血因子Ⅷ的测定中使用了Thrombocheck FVIII kit(Sysmex Corporation制造)。
对于移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠及移植了CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠，在移植6周后在麻醉下进行开腹，摘取肝脏。按照常规方法将摘取的肝脏制成冰冻切片，用抗EGFP抗体及抗CD31抗体进行染色，用荧光显微镜观察EGFP阳性CD31阳性细胞的存在。进一步，切断移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠与未移植细胞的血友病A模型小鼠的尾巴，每1分钟都用滤纸吸附渗出的血液，记录到止血为止的时间。
(2)结果
用抗EGFP抗体及抗CD31抗体对移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠的肝脏的冰冻切片进行染色，用荧光显微镜观察，并将结果示于图4。可知利用移植的EGFP阳性的血管内皮细胞构建了血管，窦状血管网被EGFP阳性的血管取代。
将血浆中的凝血因子Ⅷ的测定结果示于图5(N＝4，学生t检验)。将标准血浆的凝血因子Ⅷ的测定值设为100％，并以相对值的形式表示各测定值。在血友病A模型小鼠的血浆中未检测到凝血因子Ⅷ，但移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠中检测到了为野生型小鼠的约70％水平的凝血因子Ⅷ。该水平高于凝血因子Ⅷ基因杂合缺失小鼠的凝血因子Ⅷ水平。另一方面，在移植了CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠中，凝血因子Ⅷ的表达几乎没有恢复。
测定移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠与未移植细胞的血友病A模型小鼠的出血时间，并将结果示于图6。(A)为未移植细胞的血友病A模型小鼠的结果，(B)为移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠的结果。未移植细胞的血友病A模型小鼠在经过60分钟后仍未止血，与之相比，移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的血友病A模型小鼠不到5分钟就已止血。
根据这些结果可知，CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞(血管内皮干细胞)的移植对治疗血管内皮细胞的功能障碍所引起的疾病是有效的。
[实施例3：基于CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞移植的肝再生]
近年来，有报告指出由血管内皮细胞分泌的分子在维持组织的稳态或组织重塑中发挥重要功能，针对肝脏，也已经阐明了肝窦血管的血管内皮细胞所引导的肝细胞的维持机制。由于已知CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞对形成肝窦血管做出较大贡献，因此研究了能否通过CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的移植而促进肝脏的再生。
3-1肝再生实验1
(1)实验方法
按照常规方法对C57BL/6小鼠进行70％肝部分切除术。按照实施例1的1-1中记载的方法，由C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠的肝脏制作CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞及CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞。将CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞及CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞分别经由脾静脉移植至进行了70％肝部分切除的小鼠的肝脏中，8天后在麻醉下从小鼠中取出肝脏，测定重量。
(2)结果
虽然未示出数据，但与移植了CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞的小鼠相比，移植了CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的小鼠的肝脏再生得到了促进。因此，认为CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞(血管内皮干细胞)的移植对治疗例如肝纤维化、肝硬化等疾病是有效的。
3-2肝再生实验2
(1)实验方法
按照实施例1的1-1的(1)中记载的方法，由C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠的肝脏制作细胞悬浮液。对得到的细胞进行hoechst染色与免疫荧光染色，并进行流式细胞分析。向1×106个细胞/mL的细胞悬浮液中添加hoechst染色液(含有2％FBS(Sigma-Aldrich)、1mMHEPES(Gibco)、5μg/mL Hoechst33342(Sigma-Aldrich)的DMEM(Sigma-Aldrich))，于37℃进行90分钟的hoechst染色。免疫荧光染色中使用与实施例1中使用的抗CD31抗体及抗CD45抗体相同的单克隆抗体。在染色的细胞中加入PI(2μg/mL，Sigma-Aldrich Co.LLC制造)，进行死细胞的去除。回收CD31阳性CD45阴性PI阴性细胞(去除了死细胞的血管内皮细胞)，用流式细胞仪进行hoechst分析。流式细胞分析中使用了FACS Aria II SORP(BD Bioscience公司制造)及FlowJo Software(Treestar Software公司制造)。回收CD31阳性CD45阴性且未被hoechst染色的细胞作为SP细胞群，回收CD31阳性CD45阴性且被hoechst染色的细胞作为MP细胞群。本申请的发明人确认到，SP细胞群的约70％为CD157阳性CD200阳性，MP细胞群中几乎不包含CD157阳性CD200阳性。
按照常规方法，对C57BL/6小鼠进行70％肝部分切除术。将2×104个SP细胞群及MP细胞群的细胞分别经由脾静脉移植至进行了70％肝部分切除的小鼠的肝脏中。7天后在麻醉下从小鼠中摘取肝脏，测定重量，并用荧光显微镜进行观察。
按照实施例1的1-1中记载的方法，由摘取的肝脏制作GFP阳性血管内皮细胞(GFP阳性CD31阳性CD45阴性细胞)。使用RNeasy kit(QIAGEN K.K.)分别由该移植后的GFP阳性血管内皮细胞与移植前的SP细胞群的细胞(各1×104个)制作总RNA，使用ExScript RTreagent Kit(Takara Bio Inc.)合成cDNA。将得到的移植前后的cDNA(前及后)作为试样，利用实时荧光定量PCR法分析Wnt2与HGF的mRNA的表达量。这是因为已知肝脏内的血管内皮细胞在肝脏中分泌Wnt2及HGF等细胞因子，参与肝细胞的长期维持或肝脏的再生。作为对照，测定了作为糖酵解酶的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的mRNA的表达量。实时荧光定量PCR中使用了Stratagene MX3000P(Stratagene公司制造)。实时荧光定量PCR中使用的引物如下所示。
Wnt2
5’-AAGGACAGCAAAGGCACCTT-3’(序列编号1)
5’-GAGCCACTCACACCATGACA-3’(序列编号2)
HGF
5’-ACCCTGGTGTTTCACAAGCA-3’(序列编号3)
5’-CAAGAACTTGTGCCGGTGTG-3’(序列编号4)
GAPDH
5’-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3’(序列编号5)
5’-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3’(序列编号6)
(2)结果
将利用荧光显微镜的观察结果示于图7。(A)为移植了SP细胞群的细胞的肝脏的结果，(B)为移植了MP细胞群的细胞的肝脏的结果。在移植了SP细胞群的细胞的肝脏中，观察到GFP阳性细胞形成血管，而在移植了MP细胞群的细胞的肝脏中，几乎没有观察到GFP阳性细胞。
将测定肝重量的结果示于图8(N＝6，学生t检验)。移植了SP细胞群的细胞的肝脏的重量比移植了MP细胞群的细胞的肝脏的重量重，明确了SP细胞群的细胞的移植促进肝脏的再生。
将移植前的SP细胞群的细胞及移植后的GFP阳性CD31阳性CD45阴性血管内皮细胞中的、Wnt2及HGF的mRNA表达量的结果示于图9(N＝3，学生t检验)。(A)为Wnt2的结果，(B)为HGF的结果。明确了与移植前(前)相比，Wnt2及HGF在移植后(后)的表达均上升。
根据这些结果认为，将血管内皮干细胞移植至肝脏对治疗例如肝纤维化、肝硬化等疾病是有效的。
[实施例4：除肝脏以外的脏器中的CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞]
已明确了在肝脏中，能够将CD31阳性CD45阴性CD157阳性CD200阳性细胞作为指标而分离脏器内的血管内皮干细胞。因此，研究了在除肝脏以外的脏器中是否也存在这样的血管内皮干细胞。
(1)实验方法
从8周龄的C57BL/6小鼠中采集视网膜、脑、心脏、皮肤、肌肉、肺。按照实施例1的1-1的(1)中记载的方法分别制作细胞悬浮液。用抗CD31抗体、抗CD45抗体、抗CD157抗体及抗CD200抗体对各细胞悬浮液进行免疫荧光染色，回收CD31阳性CD45阴性CD157阳性CD200阳性细胞(CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞)及CD31阳性CD45阴性CD157阴性CD200阴性细胞(CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞)。使用这些细胞，并按照实施例1的1-2的(1)中记载的方法，进行集落形成实验。
(2)结果
将结果示于图10。(A)为视网膜的结果、(B)为脑的结果、(C)为心脏的结果、(D)为皮肤(真皮)的结果、(E)为肌肉组织的结果、(F)为肺的结果。能够从任意脏器中回收CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞，该细胞形成很多CD31阳性的大型的集落。另一方面，CD157阴性CD200阴性血管内皮细胞的集落形成能力匮乏。
血管在脏器中维持特征性的结构，支撑着该脏器的功能。因此，认为各脏器的血管内皮干细胞可诱导该脏器的再生。
[实施例5：导入了基因的血管内皮干细胞的移植]
通过移植导入了基因的血管内皮干细胞，研究移植的血管内皮干细胞及由此分化的血管内皮细胞是否继续且持续地表达所导入的基因的产物。
(1)实验方法
按照实施例1的1-1中记载的方法，由C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠的肝脏制作CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞。将200个该CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞混悬于添加了10ng/mL的VEGF的4000μL的含4％胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich)的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS，ThermoFisher)中。使用PIPETMAN(商品名称，GILSON)将20μL的细胞悬浮液分装到96孔板(ThermoFisher)中。使用显微镜(DM IL LED、Leica)肉眼筛选装有1个细胞的孔，进一步用荧光显微镜(DMi8，Leica)确认到GFP进行了表达。
使用C57BL/6小鼠(Japan SLC,Inc.)作为受体。使用带注射针的注射器将包含1个CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞的20μL的溶液经皮直接注入到受体小鼠的肝脏中。1个月后将受体小鼠在麻醉下开腹，使用体视荧光显微镜(MZ 16FA，Leica)进行肝脏的观察，然后使其安乐死并摘取肝脏。在显微镜下切除包含GFP阳性血管集落的部分，使用荧光免疫染色及流式细胞仪进行分析。关于荧光免疫染色，用4％多聚甲醛(Wako)进行固定后，用抗GFP抗体(MBL)及抗CD31抗体(克隆号30-F11，BD Biosciences公司制造)进行染色，并用SYTOXorange(ThermoFisher)进行核染色，用共聚焦显微镜(Leica)进行观察。按照与实施例1的1-1的(1)相同的方法进行细胞悬浮液的制作，按照与实施例1的1-1的(2)相同的方法进行流式细胞分析。
(2)结果
将受体小鼠的肝脏的体视荧光显微镜图像示于图11。观察维持GFP的表达的血管结构。
对受体小鼠的肝脏进行免疫荧光染色并用共聚焦显微镜进行观察，将结果示于图12。(A)为用抗GFP抗体进行染色的结果，(B)为用抗CD31抗体进行染色的结果，下侧为上侧的虚线框内(窦周间隙)的放大图像。观察到了表达GFP的CD31阳性细胞。
将流式细胞分析的结果示于图13。表明存在很多GFP阳性的血管内皮细胞(CD157阴性CD200阴性)。此外，表明GFP阳性的血管内皮干细胞(CD157阳性CD200阳性)也进行增殖。
这些结果证明了：即使为1个血管内干细胞，只要定殖，就能够长期作为血管内皮细胞及血管内皮干细胞而在生物体内得以维持；及通过在此时移植导入了编码靶分子的基因的血管内皮干细胞，以使移植的血管内皮干细胞分泌靶分子，可使对治疗疾病而言有用的靶分子在生物体内长期表达。
[实施例6：人肝脏中的血管内皮干细胞的确认]
研究了人体内是否也存在在小鼠的肝脏中确认到的血管内皮干细胞。
6-1人肝脏血管内皮细胞的表面标记物分析
(1)实验方法
使用人肝脏组织，按照实施例1的1-1的(1)中记载的方法制作细胞悬浮液。接着，按照实施例1的1-1的(2)中记载的方法，对得到的细胞进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析。
(2)结果
将结果示于图14。回收(A)的散点图的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)作为肝脏的血管内皮细胞。接着，对回收的细胞中的CD157表达量(X轴)与CD200表达量(Y轴)进行分析，将结果示于(B)的散点图中。如图14的(B)所示，表明了根据CD200的表达量，可将人肝脏的血管内皮细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)分为CD200阴性与CD200阳性这两个级分。另一方面，确认到尽管数目非常少，但存在CD157阳性细胞。
6-2以CD200划分的血管内皮细胞的集落形成实验
(1)实验方法
分别回收图14的(B)的CD200阳性级分(本发明的第一细胞群：CD31阳性CD45阴性CD200阳性细胞)及CD200阴性级分(CD31阳性CD45阴性CD200阴性细胞)，按照实施例1的1-2的(1)中记载的方法进行集落形成实验。
(2)结果
将结果示于图15。(A)为CD200阳性级分的结果，(B)为CD200阴性级分的结果。表明(B)的CD200阴性级分中不存在形成CD31阳性的集落的细胞，但(A)的CD200阳性级分中包含形成CD31阳性的集落的细胞。即，人肝脏的CD31阳性CD45阴性CD200阳性细胞中包含具有血管内皮细胞集落形成能力的血管内皮干细胞。另外，由于本实施例中CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞(本发明的第二细胞群)的细胞数少，因此并未使用CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞进行集落形成实验，但认为人的情况与小鼠相同，CD157阳性CD200阳性血管内皮细胞群(本发明的第二细胞群)为以血管内皮细胞干细胞为主的细胞群。
根据以上结果，认为血管内皮干细胞普遍存在于哺乳动物中，对形成各种脏器的血管做出了较大贡献，在人的各种疾病中，基于该血管内皮干细胞的移植的治疗也是有效的。
[实施例7：人血管内皮细胞中的CD157阳性的确认]
可知在小鼠的任意脏器、器官、组织中，血管内皮干细胞均表达了CD157(实施例4)。虽在人的肝脏中确认到CD200阳性细胞中存在血管内皮干细胞，但尚不清楚是否存在CD157阳性细胞。因此，研究了在除肝脏以外的人组织中是否能确认到CD157阳性血管内皮细胞的存在。
(1)实验方法
按照实施例1的1-1的(1)中记载的方法，由人肾脏组织及人胎盘组织分别制作细胞悬浮液。使用抗CD31抗体(克隆号WM59，BioLegend,Inc.制造)、抗CD45抗体(克隆号HI30，BioLegend,Inc.制造)及抗CD157抗体(克隆号SY11B5，BD公司制造)对得到的细胞进行免疫荧光染色，并进行流式细胞分析。流式细胞分析中使用了FACS Aria II SORP(BDBioscience公司制造)及FlowJo Software(Treestar Software公司制造)。
(2)实验结果
将人肾脏组织的结果示于图16、将人胎盘组织的结果示于图17。图16及图17中，(A)均为用抗CD31抗体与抗CD45抗体进行染色并进行流式细胞分析的结果，(B)均为对(A)的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)中的CD157阳性细胞进行流式细胞分析的结果。用抗CD157抗体对(A)的框内的细胞(CD31阳性CD45阴性细胞)进行染色并进行流式细胞分析，结果在肾脏及胎盘中均观察到了CD157阳性血管内皮干细胞级分的存在。
[实施例8：人血管内皮细胞中的SP细胞群的确认]
本申请的发明人确认到，在小鼠血管内皮细胞中存在侧群细胞(SP细胞群)(非专利文献1)。然而，在人组织中，尚未确认到血管内皮细胞中存在SP细胞群。因此，研究了在人组织中，是否也能够在血管内皮细胞中确认到SP细胞群的存在。
(1)实验方法
按照实施例1的1-1的(1)中记载的方法，由人皮肤组织制作细胞悬浮液。对得到的细胞进行hoechst染色与免疫荧光染色，并进行流式细胞分析。向1×106个细胞/mL的细胞悬浮液中添加hoechst染色液(含有2％FBS(Sigma-Aldrich)、1mM HEPES(Gibco)、5μg/mLHoechst33342(Sigma-Aldrich)的DMEM(Sigma-Aldrich))，于37℃进行90分钟的hoechst染色。免疫荧光染色中使用了抗CD31抗体(克隆号WM59，BioLegend,Inc.制造)及抗CD45抗体(克隆号HI30，BioLegend,Inc.制造)。在染色的细胞中加入PI(2μg/mL，Sigma-AldrichCo.LLC制造)并进行死细胞的去除。回收CD31阳性CD45阴性PI阴性细胞(去除了死细胞的血管内皮细胞)，用流式细胞仪进行hoechst分析。流式细胞分析中使用了FACS Aria II SORP(BD Bioscience公司制造)及FlowJo Software(Treestar Software公司制造)。
(2)实验结果
将结果示于图18。确认到人皮肤组织中存在SP细胞群级分(虚线框内)。
另外，本发明并不受上述各实施方案及实施例的限定，可在权利要求所示的范围内进行各种变更，适当组合分别公开于不同的实施方案中的技术手段而得到的实施方案也包含在本发明的技术范围内。此外，本说明书中记载的所有学术文献及专利文献均作为参考而引用于本说明书中。
序列表
<110>国立大学法人大阪大学
<120>由CD31阳性CD45阴性CD200阳性的哺乳动物细胞组成的细胞群及其应用
<130>KHP202110943.2
<150>JP 2017-221955
<151>2017-11-17
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
aaggacagca aaggcacctt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gagccactca caccatgaca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
accctggtgt ttcacaagca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
caagaacttg tgccggtgtg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
aactttggca ttgtggaagg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
ggatgcaggg atgatgttct 20

Claims (12)

1.一种细胞群，其由细胞表面标记物CD31及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成，所述哺乳动物为人或小鼠。
2.一种细胞群，其由细胞表面标记物CD31、CD157及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物细胞组成，所述哺乳动物为人或小鼠。
3.根据权利要求1或2所述的细胞群，其中，所述哺乳动物细胞包含表达导入的基因的血管内皮干细胞。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞群，其中，哺乳动物为人。
5.一种血管内皮干细胞，其为细胞表面标记物CD31呈阳性、CD157及CD200呈阳性、CD45呈阴性的哺乳动物的血管内皮干细胞，其中，所述哺乳动物为人或小鼠。
6.根据权利要求5所述的血管内皮干细胞，其表达导入的基因。
7.根据权利要求5或6所述的血管内皮干细胞，其中，哺乳动物为人。
8.权利要求1～4中任一项所述的细胞群或权利要求5～7中任一项所述的血管内皮干细胞在血管再生用药物的制备中的应用，其中，所述血管再生用药物治疗血友病A或促进肝脏再生。
9.权利要求1～4中任一项所述的细胞群或权利要求5～7中任一项所述的血管内皮干细胞在血管再生用药物的制备中的应用，其中，所述血管再生用药物改善缺血及低营养。
10.一种毒性评价方法，其为评价受试物质对血管的毒性的方法，所述毒性评价方法的特征在于，其包含：
(1)使用含有受试物质的培养基及不含有受试物质的培养基来培养权利要求1～4中任一项所述的细胞群的工序；
(2)测定培养后的细胞增殖水平的工序；及
(3)对使用含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平与使用不含有受试物质的培养基进行培养时的细胞增殖水平进行比较的工序。
11.一种血管内皮干细胞的制备方法，其特征在于，其包括：消化并分散已分离的脏器而制备细胞悬浮液的工序(I)；及回收CD31呈阳性、CD200呈阳性、CD45呈阴性的细胞的工序(II)。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在所述工序(II)中，回收CD31、CD157及CD200呈阳性、CD45呈阴性的细胞。
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