JP7113430B2 - 生体組織損傷の修復剤および当該修復剤の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤の製造方法(以下、「本実施形態の製造方法」ともいう。)は、無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する工程を有する方法である。
本実施形態の製造方法においては、間葉系幹細胞を、FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか1つをさらに含有する無血清培地において間葉系幹細胞を培養する(以下、第1工程と称する)。なお、無血清培地は、TGF-β、および/または、HGFを含有していないものであってもよい。
本実施形態の製造方法は、上記第1工程の後に、FGF、PDGF、TGF-β、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び少なくとも1つの脂肪酸を含有する無血清培地、より好ましくは、デキサメタゾン、インスリンおよび血清アルブミンの少なくとも何れか1つをさらに含有する無血清培地において、間葉系幹細胞を培養する第2工程をさらに有していてもよい。なお、無血清培地は、HGFを含有していないものであってもよい。
本実施形態の製造方法は、第1工程および/または第2工程の後に、間葉系幹細胞から、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングするスクリーニング工程をさらに包含していてもよい。
本発明の一実施形態にかかる生体組織損傷の修復剤(以下「本実施形態の修復剤」という。)は、無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有していることを特徴としている。
本実施形態の修復剤は、TNF-stimulated gene 6 protein(TSG-6)を有効成分として含有していることを特徴としている。
無血清培地で培養した間葉系幹細胞の移植による腎臓線維化の抑制効果に係る検討を行った。
無血清培地で培養した間葉系幹細胞移植による炎症細胞浸潤の抑制効果を調べた。細胞培養条件、及び手法等は、実施例1に記載した通りに行った。Tリンパ球の指標であるCD3およびマクロファージの指標であるCD68を用いて、尿管を結紮したラットの腎臓における炎症細胞浸潤の評価を行った。
無血清培地で培養した骨髄由来間葉系幹細胞による、マクロファージの活性制御能を評価した。
10%MSCsおよびSF-hMSCsを、Transwell systemを用いてTHP-1と共培養した。共培養72時間後にTHP-1を回収し、Immune-regulatory phenotype(M2)マクロファージのマーカーであるCD163およびCD206の発現をFACS法にて定量した。
無血清培地で培養した脂肪由来間葉系幹細胞による、マクロファージの活性制御能を評価した。
10%hAMSCsおよびSF-hAMSCsを、Transwell systemを用いてTHP-1と共培養した。共培養72時間後にTHP-1を回収し、Immune-regulatory phenotype(M2)マクロファージのマーカーであるCD163およびCD206の発現をFACS法にて定量した。
無血清培地で培養した骨髄由来間葉系幹細胞の炎症抑制効果を評価した。線維化の指標であるHGF、腎障害の指標であるPGE2、炎症の指標であるIL-6、および炎症効果抑制作用の指標であるTSG-6を用いて、細胞の炎症抑制効果を確認した。
Sprague Dawleyラット(6~7週齢)の大腿骨または脛骨の骨髄から採取したMSCsを、無血清培地(STK1またはSTK2)にて単離し、培養して増殖させ、無血清培地培養MSCs(以降SF-MSCsとも称する)を得た。該MCSsに、Negative Control siRNA、またはTSG-6 siRNA(各20nM)をトランスフェクションした。トランスフェクション後の細胞を、作製4日後のラット一側性尿細管結紮モデルの尾静脈へ投与した。ここで、上記Negative Control siRNAをトランスフェクションしたSF-MSCsを投与した群、TSG-6 siRNAをトランスフェクションしたSF-MSCsを投与した群、またはPBSのみを投与した群、尿細管の結紮を行わなかったコントロールの群を各5群ずつ用意した。一側性尿細管結紮術から10日後に各群のラットを屠殺し、腎臓を摘出し、TSG-6の抗炎症効果について確認した。
肝臓の線維化が進むにつれて、肝組織中にはコラーゲンを主成分とする細胞外マトリックスが過剰に沈着し、その終末像として肝臓の繊維化(例えば、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎)に至る。本実施例においては、無血清培地で培養した間葉系幹細胞の移植による肝臓の線維化(例えば、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪肝炎)の抑制効果に係る検討を行った。
本試験において、Sprague Dawleyラット(7週齢、オス)の大腿骨または脛骨から、実施例1の記載と同様の方法で、間葉系幹細胞を採取し、当該間葉系幹細胞を培養および継代した。
肝臓の線維化のモデルとして、一般的な、四塩化炭素を用いたモデルラットを作製した。
前記の疾患モデルである「疾患誘導群」に対し、疾患誘導剤の最終投与を行った日(Day31)の翌日(Day32)に、部分採血を行った。
薬剤の投与後、2週間の観察期間を経た後のDay47に、全群に対して、イソフルラン麻酔下で屠殺(放血安楽死)及び採材を行った。採材においては、組織学的評価に供する肝臓の内側葉および外側左葉に加え、生化学的検査に供する血液検体を採取(全採血)した。採取した肝臓の内側葉および外側左葉を、ホルマリンによって固定した後、パラフィンブロックに包埋した。その後、パラフィンブロックを薄切し、シリウスレッド染色標本を作製した。
「疾患誘導群」においては、Day0からDay31までの疾患誘導剤の投与期間に渡って、疾患誘導剤投与直後には、毎回うずくまりが全個体に見られる等、本疾患誘導剤の投与に伴い想定されうる観察所見が見られた。「健常群」においては、そのような観察所見は認められなかった。「細胞投与群」においては、細胞投与後2週間に渡った評価期間において、細胞治療で考慮すべき如何なる異常所見(例えば、拒絶反応等)も認められなかった。
初回投与日(Day0)から、屠殺を行った日(Day47)に至るまでの、各群の体重の推移は、図23に示す通りである。なお、図23、および、後述する図24~図26において、(a)は「健常群」の試験結果であり、(b)は「偽薬群」の試験結果であり、(c)は「有血清群」の試験結果であり、(d)は「STK群」の試験結果である。
Day47の血液検体から、血清を分離した。以下において、「AST」はアスパラギン酸アミノ基転移酵を、「LDH」は乳酸脱水素酵素を、「γ-GTP」はγグルタミルトランスペプチダーゼを示す。
シリウスレッド染色標本において、各個体の各葉(内側葉および外側左葉の各々)について、中心静脈を中心として、3視野(各個体毎に6視野(=2葉×3視野))の顕微画像を撮像し(対物レンズ10倍)、画像解析装置にて線維化面積を算出した。
本実施例において、「STK群」では、細胞の投与後に、拒絶反応等の細胞治療で考慮すべき異常所見は認められなかった。それ故に、本発明の修復剤は、安全性が高いと考えられる。
Claims (16)
- 無血清培地中で培養された間葉系幹細胞を含有している、生体組織損傷の修復剤であって、
上記生体組織損傷は、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、または、非アルコール性脂肪肝炎に伴う組織損傷であり、
上記無血清培地は、(i)FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地、および、(ii)FGF、PDGF、EGF、TGF-β、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地であることを特徴とする修復剤。 - 生体組織の線維化を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の修復剤。
- 炎症細胞の浸潤を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の修復剤。
- マクロファージの活性を制御するためのものであることを特徴とする、請求項1に記載の修復剤。
- 上記間葉系幹細胞は、スクリーニングされた造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞であることを特徴とする、請求項1~4の何れか1項に記載の修復剤。
- 上記間葉系幹細胞は、少なくとも1回継代されたものであることを特徴とする、請求項1~5の何れか1項に記載の修復剤。
- 上記継代では、哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することを特徴とする、請求項6に記載の修復剤。
- 上記間葉系幹細胞は、当該間葉系幹細胞の培養に適した培養容器を用いて培養されたものであることを特徴とする、請求項1~7の何れか1項に記載の修復剤。
- 無血清培地中で間葉系幹細胞を培養する工程を有する、生体組織損傷の修復剤の製造方法であって、
上記生体組織損傷は、慢性腎不全、慢性腎臓病、肝硬変、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、または、非アルコール性脂肪肝炎に伴う組織損傷であり、
上記無血清培地は、(i)FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地、および、(ii)FGF、PDGF、EGF、TGF-β、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地であることを特徴とする修復剤の製造方法。 - 上記培養する工程の後に、造腫瘍性を有していない間葉系幹細胞をスクリーニングする工程を有することを特徴とする、請求項9に記載の製造方法。
- 上記培養する工程では、間葉系幹細胞を少なくとも1回継代することを特徴とする、請求項9または10に記載の製造方法。
- 上記継代では、哺乳類および微生物由来の成分を含有していない細胞剥離剤を用いて上記間葉系幹細胞を剥離することを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 上記培養する工程では、上記間葉系幹細胞の培養に適した培養容器を用いて当該間葉系幹細胞を培養することを特徴とする、請求項9~12の何れか1項に記載の製造方法。
- TSG-6を含有している、生体組織損傷の修復剤であって、
上記生体組織損傷は、慢性腎不全、または、慢性腎臓病に伴う組織損傷であり、
上記TSG-6は、(i)FGF、PDGF、EGF、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地、および、(ii)FGF、PDGF、EGF、TGF-β、少なくとも1つのリン脂質、及び、少なくとも1つの脂肪酸を含有している無血清培地中で培養された間葉系細胞由来であることを特徴とする修復剤。 - 生体組織の線維化を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項14に記載の修復剤。
- 炎症細胞の浸潤を抑制するためのものであることを特徴とする、請求項14に記載の修復剤。
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