CN104666347A

CN104666347A - 脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用

Info

Publication number: CN104666347A
Application number: CN201510091984.3A
Authority: CN
Inventors: 刘明; 徐军
Original assignee: Shenzhen Beike Bio Technology Co ltd; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: Shenzhen Beike Bio Technology Co ltd; First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2015-02-28
Filing date: 2015-02-28
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-02-28
Also published as: CN104666347B

Abstract

本发明公开了IFN-γ预处理的脐带间充质干细胞在肺间质纤维化治疗中的应用，采用IFN-γ预处理的间充质干细胞治疗小鼠肺间质纤维化，可明显提高小鼠成活率，减轻BLM诱导的肺纤维化肺部病变，明显降低小鼠肺组织病理学评分，在制备治疗肺间质纤维化的药品中将有广阔的应用前景。

Description

脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用

技术领域

本发明涉及间充质干细胞的用途，具体是脐带间充质干细胞的培养上清在肺间质纤维化治疗中的应用。

背景技术

肺间质纤维化(Pulmonary Fibrosis，PF)是弥漫性肺间质纤维化的简称，是由于多种原因引起肺泡壁炎症，继之肺间质形成大量纤维结缔组织和肺结构紊乱的一组异型疾病。患者病情重，病死率高，严重危害人类健康。迄今为止，其病因、发病机制尚不明确，临床尚缺乏任何有效的治疗手段。激素虽然对以炎症为主的非特异性间质性肺炎有一定效果，但不能减缓肺纤维化和肺功能下降的进程，因而对特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)的治疗效果差。肺移植是其中一项可选择的治疗策略，但受限于供体的来源及巨额的医疗费用，对于许多患者，通常仅仅接受一些经验型的治疗和对症支持治疗。因此，开发新的有效治疗策略显得尤为迫切。

近年，以干细胞为基础的细胞治疗引起了人们的极大兴趣。其中，间充质干细胞(MSCs)作为一群能够分化成许多不同的细胞系和发挥抗增殖、免疫调节、抗炎作用的多能干细胞，由于其多能性、迁移能力、低免疫原性等特点引起了人们对其治疗潜能的极大关注。研究发现，间充质干细胞可到达损伤局部，抑制炎症反应，并有助于上皮组织的修复，已被建议作为IPF治疗的一个潜在方法。事实上，骨髓间充质干细胞有望应用于多种疾病的治疗，包括严重的移植物抗宿主病，糖尿病胰岛和肾小球修复，脓毒症，急性肝功能衰竭，缺血性急性肾功能衰竭，急性肺损伤，改善缺血损伤后心功能。同时，间充质干细胞可分化为许多类型的细胞，因此可用于脊髓损伤，中风后和结缔组织损伤等的组织再生。研究表明，间充质干细胞可促进弹性蛋白酶诱导肺气肿的组织再生，定位到石棉引起的肺损伤部位，帮助肺动脉高压大鼠模型的组织重构，减轻卵清蛋白介导的小鼠哮喘模型气道慢性炎症，恢复内毒素诱导的急性肺损伤后肺泡和肺液的平衡，调节放射性肺损伤相关的纤维化反应。

一些临床前数据表明，间充质干细胞减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。Lee等发现静脉给予MSCs能够降低博莱霉素诱导的肺水肿，中性粒细胞浸润，胶原沉积和总死亡率。同样，Ortiz等报告，在小鼠博莱霉素处理后，MSCs募集到肺损伤的部位，导致减少炎症，降低纤维化和细胞外基质的胶原沉积，促进组织的修复。透明质酸酶的鼻腔给药则通过招募间充质干细胞到损伤肺从而减轻博莱霉素的损伤效果。同样，胎盘来源的干细胞，也可定位于肺组织，降低博莱霉素导致的相关组织损伤。脐带干细胞也可聚集到博莱霉素所致的肺损伤部位，抑制促炎性细胞因子的产生，并减少肺损伤和胶原沉积。虽然确切的作用机制尚未完全阐明，但用博莱霉素(BLM)模型的观察表明，肺损伤通过可溶性因子如G-CSF和GM-CSF的产生而募集骨髓间充质干细胞，并通过SDF-1/CXCR4轴介导其增殖和迁移。同样，IPF患者MSC高表达CXCR4，IPF患者肺组织中CXCR4和SDF-1也比对照组患者的肺组织更高。尽管如此，也有一些采用博莱霉素肺损伤模型的研究并没有取得阳性结果。Aguilar等利用造血干细胞(HSCs)和间充质干细胞作为载体，将角质细胞生长因子(KGF)带入BLM小鼠的肺脏，结果仅有转导的造血干细胞能减轻肺组织损伤，而MSC并没有改变博莱霉素损伤的组织病理学变化，尽管减少了胶原1α1mRNA的表达。这项研究还表明，KGF转基因HSCs减轻了BLM诱导的肺损伤，同时导致肺泡II型上皮细胞增殖。因此，深入理解MSC的生物学特性，认识疾病特定的免疫微环境对MSC疗效的影响，进而有效提高MSC的治疗效果是治疗PF的关键。

因此，本领域仍需要深入研究MSC的增殖、分化、调节等生物学特性，进而利用这些特性，更好的发挥其特定疾病中的治疗价值。

发明内容

本发明的目的是提供脐带间充质干细胞的新用途，即它在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用。

进一步地，所述脐带间充质干细胞的培养上清由以下方法制备：将脐带间充质干细胞种植于多孔板，加入无血清培养基培养48h，收集培养上清。

进一步地，所述脐带间充质干细胞经IFN-γ预处理。

进一步地，所述脐带间充质干细胞的培养上清由以下方法制备：将脐带间充质干细胞种植于多孔板，加入重组IFN-γ作用24小时，PBS清洗3次，加入无血清培养基培养48h，收集培养上清。

进一步地，所述药物制剂是气管内给药喷雾剂。

进一步地，所述脐带间充质干细胞由以下方法制备而得：从脐带中分离提取间充质干细胞，经过原代培养和传代培养后得到。

进一步地，所述脐带间充质干细胞由以下方法制备而得：取胎儿娩出后结扎的脐带，经冲洗、消毒，置于脐带保存液中，2～8℃恒温保存，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成1～4mm³的组织匀浆块，加入适量培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱培养，第14～18天，细胞克隆团的面积百分比到达70～80％时，消化收获，得到P0代细胞，之后进行消化、传代，将需冻存的细胞放置于程序性降温仪中，按照标准冻存程序降至-80℃以下。

进一步地，所述间充质干细胞的CD90、CD29、CD73、CD105、CD44、CD166表达均大于95％，CD45、CD14、HLA-DR表达均小于2％。

一种治疗肺间质纤维化的药物组合物，其包含前述的脐带间充质干细胞的培养上清。

本发明通过实验证明：用IFN-γ预处理脐带间充质干细胞表型能引起IP-10、PGE2的mRNA表达水平升高，用IFN-γ预处理脐带间充质干细胞能引起培养上清中IP-10、PGE2的表达水平明显升高。

本发明通过实验证明：MSC所高分泌的IP-10具有对抗肺纤维化过程中成纤维细胞的聚集作用，而PGE2可明显抑制IPF患者成纤维细胞的活化。

由于博来霉素(BLM)会伤害肺部造成肺纤维化或严重的间质性肺病，已经成为当今经典的动物肺纤维化模型的诱导剂。选用BLM作为诱导剂，经气管内给药诱导小鼠肺纤维化，分析小鼠成活率和肺组织病理学评分，动态观察小鼠肺组织形态学变化，实验结果表明，采用IFN-γ预处理的脐带间充质干细胞的培养上清治疗肺纤维化的小鼠，可明显提高小鼠成活率，减轻BLM诱导的肺纤维化肺部病变，明显降低小鼠肺组织病理学评分。

本发明的有益效果是：

1本发明通过一系列实验证明了IFN-γ预处理的脐带间充质干细胞的培养上清对IPF成纤维细胞具有更强的抑制作用，可有效减轻肺脏损伤，抑制胶原纤维的沉积，在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中将有广阔的应用前景。

2本发明制备的间充质干细胞具有低免疫反应风险、活性高、残留低等优点，并且制备成本低廉，间充质干细胞来自脐带，采集方便，为无创性操作，脐带来源丰富，可以进行规模化生产。

3本发明用IFN-γ预处理脐带间充质干细胞的方法简单、有效、无治疗副作用。

附图说明

图1是实施例2用IFN-γ处理脐带间充质干细胞引起的IP-10、PGE2的mRNA表达变化结果；

图2是实施例3用IFN-γ处理脐带间充质干细胞引起的IP-10、PGE2的表达变化结果；

图3是实施例4中成纤维细胞活化标志α-SMA、Collagen3的表达结果；

图4是实施例4中趋化细胞的计数结果；

图5为实施例5四组小鼠的体重变化结果；

图6为实施例5四组小鼠的生存曲线；

图7为实施例5四组小鼠的肺脏HE染色图；

图8为实施例5四组小鼠的病理积分；

图9为实施例5四组小鼠的羟脯氨酸含量；

图10为实施例5四组小鼠的肺脏α-SMA的免疫组化图。

具体实施方式

本发明中使用的仪器和试剂、材料均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。本发明所使用的方法，如HE染色、免疫组化等均为本领域公知的方法，可通过教科书或相关文献的描述进行，不再赘述，本发明说明书中有描述的，参照本发明中描述的方法进行。

实施例1

脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定

1脐带间充质干细胞的分离、培养

取胎儿娩出后结扎的脐带，经冲洗、消毒，置于脐带保存液中，6℃恒温保存。用无菌组织剪将华通氏胶体剪切成2mm³的组织匀浆块，加入适量培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱培养。第16天，细胞克隆团的面积百分比到达80％时，消化收获，得到P0代细胞。之后进行消化、传代，将需冻存的细胞放置于程序性降温仪中，按照标准冻存程序降至-80℃以下。

2脐带间充质干细胞表面抗原鉴定

将培养的脐带间质干细胞样品消化制成混悬细胞，将细胞浓度调整为4.0×10⁶个/ml；取100μl加入流式管中，再加入各组抗体及同型对照试剂(避光操作)；充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30分钟；然后每管加入1ml PBS，充分混匀，以500g离心5分钟，弃上清液，重复此洗涤过程1次，调整细胞悬液体积至200μl左右，上机检测。

结果显示：获得的脐带间质干细胞的CD90、CD29、CD73、CD105、CD44、CD166表达全部大于95％，同时，CD45、CD14、HLA-DR表达全部小于2％。完全符合国际细胞治疗协会(ISCT)关于间充质干细胞的表型要求。

实施例2

IFN-γ处理对脐带间充质干细胞表型及分泌细胞因子、趋化因子的影响

将P4代脐带间充质干细胞以每孔1×10⁵个种植于6孔板，24小时后换为无血清培养基饥饿细胞12小时，加入20ng/ml重组人IFN-γ作用24小时，收集上清，用实时荧光定量PCR检测具有抗纤维化作用的细胞因子、趋化因子(IP-10、PGE2)的mRNA表达变化，实验结果见图1，收集细胞，流式细胞术检测细胞表面免疫标记(CD90、CD29、CD73、CD105、CD45、CD34、CD19、CD14、HLA-DR)的变化，实验结果见表1。

表1 IFN-γ预处理前后脐带间充质干细胞免疫表型结果

细胞表面免疫标记	MSC	MSC-IFN-γ
			CD90	99.2％	99.1％
CD105	96.3％	97.8％

CD73	94.4％	97.2％
			CD29	99.6％	99.2％
CD166	99.3％	98.2％
			CD44	95.3％	96.3％
CD14	0.8％	1.1％
			CD45	1.0％	0.6％
HLA-DR	0.6％	1.8％

结果发现，IFN-γ处理24小时后，细胞表面标记CD90、CD29、CD73、CD105、CD45、CD34、CD19、CD14均无明显改变，HLA-DR稍有升高，IFN-γ处理对脐带间充质干细胞表型无明显影响。

如图1所示，IFN-γ处理24小时后，脐带间充质干细胞(MSCU)IP-10、PGE2的mRNA表达水平均明显升高(p<0.05)。

实施例3

IFN-γ预处理脐带间充质干细胞培养上清的制备及细胞因子、趋化因子IP-10、PGE2的表达

将20ng/ml重组人IFN-γ作用24小时后的间充质干细胞，PBS清洗3次，加入无血清培养基继续培养48小时，收集培养上清即为后续动物实验所需上清。ELISA法检测IP-10、PGE2的表达，实验结果见图2。

结果发现，如图2所示，IFN-γ预处理脐带间充质干细胞培养上清中，IP-10、PGE2的水平明显高于未处理组上清的水平。

实施例4

IP-10、PGE2对抗肺纤维化过程中成纤维细胞的聚集及活化的作用

实验一：分离培养特发性肺纤维化患者的肺成纤维细胞，分别加入不同浓度的PGE2，48小时后收集蛋白，检测成纤维细胞活化标志α-SMA(α-平滑肌动蛋白)、Collagen(胶原蛋白)3表达的变化，实验结果见图3A。

实验二：第一组为肺成纤维细胞对照；第二组在肺成纤维细胞中加入TGFβ1(TransformingGrowth Factor Beta1，转化生长因子β1)；第三组将肺成纤维细胞和脐带间充质干细胞用Transwell法共培养，并加入TGFβ1；第四组将肺成纤维细胞和脐带间充质干细胞用Transwell法共培养，并加入TGFβ1和PGE2的抑制剂(Celecoxib，塞来昔布)；48小时后收集蛋白，检测成纤维细胞活化标志α-SMA、Collagen3表达的变化，实验结果见图3B。

实验三：Transwell法观察IP-10对成纤维细胞趋化的影响，第一组为肺成纤维细胞对照组，第二组在上层加入肺成纤维细胞，下层加入细胞因子复合物(TGFβ1、IL-1β、IFN-γ)，第三组在上层加入肺成纤维细胞，下层加入细胞因子复合物和IP-10中和抗体，24小时后计数趋化细胞的数量，实验结果见图4。

结果发现，如图3A所示，PGE2可浓度依赖性地抑制IPF患者成纤维细胞α-SMA、Collagen3的表达；如图3B所示，MSC可明显抑制TGFβ1所诱导的IPF患者成纤维细胞α-SMA、Collagen3的表达，当加入PGE2抑制剂后这种抑制作用可被部分逆转；如图4所示，IP-10的中和抗体具有明显促进成纤维细胞趋化的作用。这些结果表明，MSC所高分泌的IP-10具有对抗肺纤维化过程中成纤维细胞的聚集作用，而PGE2可明显抑制IPF患者成纤维细胞的活化。

实施例5

以博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠模型，研究本发明的脐带间充质干细胞及IFN-γ预处理的脐带间充质干细胞对治疗肺纤维化模型的有效性。

取C57/B6雄性小鼠40只，随机分为4个组(PBS组，BLM组，BLM+MSC-CM组，BLM+MSC-IFN-γ-CM组)，每组10只，PBS组小鼠以3mg/kg体重给PBS，其他三组小鼠均以3mg/kg体重气管内直接给BLM，BLM+MSC-CM组小鼠气管内高压枪给予5×10⁶个脐带间充质干细胞的上清的冻干浓缩液100ul，BLM+MSC-IFN-γ-CM组小鼠气管内高压枪给予经IFN-γ预处理的5×10⁶个脐带间充质干细胞的上清的冻干浓缩液100ul，观察小鼠体重变化，计算存活率，并在21天处死小鼠，取一侧肺组织，HE染色观察组织学改变，免疫组化检测α-SMA表达的变化，另一侧肺组织匀浆，检测羟脯氨酸的变化。

结果如图5～10所显示，其中图5为四组小鼠的体重变化结果；图6为四组小鼠的生存曲线；图7为四组小鼠的肺脏HE染色图；图8为四组小鼠的病理积分；图9为四组小鼠的羟脯氨酸含量；图10为四组小鼠的肺脏α-SMA的免疫组化图。

结果显示，与BLM组相比，BLM+MSC-CM组、BLM+MSC-IFN-γ-CM组小鼠的体重减轻较少，存活率明显提高，组织学病变明显减轻，胶原沉积减少，α-SMA表达降低，病理积分减少，羟脯氨酸含量下降，更重要的是，在这些指标中，IFN-γ预处理的脐带间充质干细胞上清组(BLM+MSC-IFN-γ-CM组)比单纯的脐带间充质干细胞上清组(BLM+MSC-CM组)的变化更加明显，证明IFN-γ预处理的脐带间充质干细胞对肺纤维化有更好的治疗效果。

Claims

1.脐带间充质干细胞的培养上清在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的培养上清由以下方法制备：将脐带间充质干细胞种植于多孔板，加入无血清培养基培养48h，收集培养上清。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞经IFN-γ预处理。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞的培养上清由以下方法制备：将脐带间充质干细胞种植于多孔板，加入重组IFN-γ作用24小时，PBS清洗3次，加入无血清培养基培养48h，收集培养上清。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制剂是气管内给药喷雾剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞由以下方法制备而得：从脐带中分离提取间充质干细胞，经过原代培养和传代培养后得到。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脐带间充质干细胞由以下方法制备而得：取胎儿娩出后结扎的脐带，经冲洗、消毒，置于脐带保存液中，2～8℃恒温保存，将华通氏胶体剪切成1～4mm³的组织匀浆块，加入培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱培养，第14～18天，细胞克隆团的面积百分比到达70～80％时，消化收获，得到P0代细胞，之后进行消化、传代，将需冻存的细胞放置于程序性降温仪中，按照标准冻存程序降至-80℃以下。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞的CD90、CD29、CD73、CD105、CD44、CD166表达均大于95％，CD45、CD14、HLA-DR表达均小于2％。

9.一种治疗肺间质纤维化的药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含权利要求1～8任一项所述的脐带间充质干细胞的培养上清。