CN101906401A

CN101906401A - 一种在非接触条件下培养诱导成体骨髓间充质干细胞转变为汗腺细胞的方法

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Publication number: CN101906401A
Application number: CN2009101460872A
Authority: CN
Inventors: 付小兵; 孙同柱; 蔡飒; 张翠萍
Original assignee: First Affiliated Hospital Chinese PLA General Hospital
Current assignee: First Affiliated Hospital Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2009-06-08
Filing date: 2009-06-08
Publication date: 2010-12-08

Abstract

本发明涉及人体汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种在体外培养条件下，通过热休克汗腺的条件培养基，在成体骨髓间充质干细胞与汗腺细胞非接触的培养条件下，诱导成体骨髓间充质干细胞转分化为汗腺细胞的方法。

Description

一种在非接触条件下培养诱导成体骨髓间充质干细胞转变为汗腺细胞的方法

技术领域

本发明涉及人体汗腺再生研究领域。具体说来，本发明涉及一种在非接触条件下，利用经过热休克汗腺的条件培养基诱导成体骨髓间充质干细胞转分化为汗腺细胞的方法。

背景技术

皮肤被覆于身体表面，是人体最大的器官。排汗功能是其众多功能之一，可排出机体25％的热量以保持体温的相对恒定。轻度烧伤时汗腺细胞可以其深部未受创的部分为模板而完全修复，但全层大面积烧伤患者因汗腺被毁或被瘢痕组织堵隔而丧失了分泌汗液的功能，这不仅给患者的生理与心理带来严重障碍，而且对其后期的生活与工作质量将产生严重影响。因此，研究皮肤损伤后汗腺组织的修复与再生，不仅是创(烧、战)伤治疗本身的需要，而且也是重塑人体生理与心理的需要，值得人们关注。

近年来，随着干细胞生物学与再生医学研究的深入，利用成体干细胞及其可塑性为皮肤附属器的再生带来了新的希望。就采用成体干细胞再生皮肤汗腺的策略而言，有以下几个方面可以考虑：一是利用自身皮肤表皮干细胞直接诱导分化为汗腺细胞来再生汗腺。但问题的关键是在大面积严重创伤烧伤时由于皮肤的损毁，自体表皮干细胞的来源缺乏，因而从诱导残存的表皮干细胞来直接再生汗腺的技术和方法将来在临床应用会受到很大的限制。二是脂肪干细胞在一定条件下经诱导也具有分化为表皮细胞，进而再经诱导分化形成汗腺细胞的潜能。但由于这一条技术路线难度比较大，影响因素众多，加之在大面积严重创伤烧伤时脂肪组织和皮肤组织一样会受到严重的破坏，因而利用脂肪干细胞来重建汗腺也是一条艰难的途径。为此，利用骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来再生汗腺便成为一条重要的选择。这条路线的主要优点包括：一是MSCs本身具有低免疫源性和多向分化潜能；二是MSCs存在于骨髓基质，在大面积创伤、烧伤时受到外界的直接破坏作用比较小；三是储存量比较大，在严重创伤和烧伤条件下能够发生动员，容易获取。基于以上原因，深入开展MSCs的分化调控研究对皮肤汗腺再生策略具有重要的理论意义和应用价值。

我们和他人大量的前期研究已经初步证明MSCs直接参与了皮肤损伤修复与再生的全过程，其中包括：皮肤组织损伤后，造血干细胞和间充质干细胞从骨髓动员到循环细胞池，并迁移到损伤部位。在早期炎症阶段，这些细胞调节上皮细胞和真皮间充质细胞的增殖和迁移，促进炎症细胞趋化，参与创伤修复过程；炎症消退后，骨髓来源的细胞可以分化为表皮细胞、皮脂腺细胞、毛囊上皮细胞、树突状细胞以及内皮祖细胞等，并且可以整合到愈合的皮肤，分化为CD45+的抗原呈递纤维母细胞亚群；上皮化完成后，造血干细胞和MSCs都能长期重构愈合的真皮，产生I和III型胶原。在此基础上，我们实验室又进一步开展了MSCs向汗腺细胞诱导分化的研究，并在以下几方面获得了突破：1)通过MSCs与热休克汗腺直接共培养技术，已成功将MSCs诱导成为汗腺细胞或汗腺细胞样细胞，即经直接共培养诱导来的汗腺细胞具有正常汗腺细胞的形态、表型和功能特性；2)初步阐明在MSCs转分化为汗腺细胞的过程中涉及的信号通路主要有NF-κB和ERK的激活；3)将上述诱导来的汗腺细胞样细胞移植于裸鼠创面后，能显著促进受损汗腺的修复与再生，即创面愈合后能正常发汗，组织形态学观察证实创伤处有汗腺组织的再生；4)进一步的人体种植试验表明，在切除瘢痕的创面种植经诱导后具有汗腺细胞表型的自体MSCs，不仅可以使这些移植的细胞存活，而且这些细胞还能转变为汗腺组织并发挥排汗功能。形态学观察显示创部真皮浅层有大量CEA阳性细胞，结构类似正常汗腺组织。同时功能学检测也表明再生的汗腺组织所分泌的汗液具有与正常汗液类似的pH值、渗透压和化学组分。上述初步的实验结果证明：1)通过建立适当的MSCs体外诱导方法，可以成功实现将MSCs诱导转变为汗腺样细胞；2)从临床应用角度来讲，通过非接触的方法共培养诱导MSCs转变为汗腺样细胞可能会更安全、更实用。

发明内容

因此，本发明提供了一种在非接触培养条件下，利用经过热休克的汗腺培养基，诱导MSCs转分化为汗腺细胞的方法，包括以下步骤：

a)分离并培养MSCs，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CD29、CD44和CD105；

b)分离并培养汗腺细胞，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19；

c)将上述培养的汗腺细胞进行热休克处理，之后去除汗腺细胞，使之形成热休克汗腺的条件培养基；

d)使用上述热休克汗腺的条件培养基诱导MSCs向汗腺细胞的转分化；

优选地，进行热休克处理的汗腺细胞的密度为0.2-1×10⁶/ml，更优选0.4×10⁶/ml。所述的热休克处理温度为40-50℃，更优选47℃。所述的热休克处理时间为0.2-5小时，更优选0.5小时。

优选地，热休克处理后继续孵育时间为2-7天，更优选3-5天。

优选地，用于诱导MSCs的热休克汗腺条件培养基的掺入比例为20-50％，更优选30％。诱导时间为5-15天，更优选8-10天。

附图说明

图1描述了免疫细胞化学法检测MSCs表面标志性蛋白CD29、CD44和CD105的表达。其中(A)为：空白对照；(B)为：CD29；(C)为CD105；(D)为：CD44。

图2描述了免疫细胞化学法检测汗腺细胞表面标志性蛋白CEA、CK7、CK8和CK19的表达。其中(A)为：CEA；(B)为：CK7；(C)为CK8；(D)为CK19。

图3描述了MSCs转分化诱导后细胞形态的改变。其中(A)为：MSCs诱导前的形态；(B)为：MSCs诱导后5天的形态；(C)为：MSCs诱导后10天的形态；(D)为：正常汗腺细胞的形态。

图4描述了MSCs转分化诱导10天后细胞表型的改变。其中(A)为：诱导前CEA；(B)为：诱导后CEA：(C)为：诱导前CK7；(D)为：诱导后CK7；(E)为：诱导前CK8；(F)为：诱导后CK8；(G)为：诱导前CK19；(H)为：诱导后CK19。

具体实施方式

以下本发明以具体实施例的方式具体阐述发明。本领域技术人员可以理解的是，以下的实施例是为了阐述发明，而非限定发明的范围。

实施例

实施例1MSCs的分离培养及鉴定

无菌条件下取正常志愿者的髂骨骨髓约2ml，采用直接贴壁法，以含10％胎牛血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM为培养液，在37℃、5％CO2孵育箱内培养，24h后更换培养基，弃掉未贴壁细胞，以后每2～3d换液1次。待细胞达80％融合时，用0.125％的胰蛋白酶消化，给予传代培养和组化检测。取细胞爬片，用预冷的甲醛丙酮混合液(体积比1∶1))固定30min，按二步法免疫组化检测试剂盒说明分别进行CD29、CD105和CD44的免疫细胞化学染色，以PBS代替一抗作为空白对照。

免疫细胞化学检测结果表明：上述从人骨髓分离培养的细胞，均表达CD29(图1B)和CD105(图1C)，高表达CD44(图1D)，而空白对照组无阳性细胞出现。说明此细胞为骨髓间充质干细胞，而且纯度较高。

实施例2汗腺细胞的分离培养及鉴定

取约0.13cm×2.10cm的全层正常皮肤，置于含有青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的人平衡盐溶液中反复漂洗，去除皮下脂肪，在60mm²培养皿中将皮肤剪成1mm³左右的小块，加入含有II型胶原酶(2mg/ml)、胎牛血清(5％)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的DMEM液3ml，置37℃、5％CO2、95％O2、饱和湿度孵箱中过夜。次日在清洁的、紫外线消毒的50×倒置相差显微镜下挑取汗腺组织，置37℃、5％CO2、95％O2、饱和湿度条件下培养。汗腺培养液以DMEM作为基础培养液，补加胎牛血清(5％)、重组人表皮生长因子(10ng/ml)、三碘甲状腺原氨酸(2ng/ml)、半琥珀酰氢化可的松(0.14μg/ml)、胰岛素2转铁蛋白2亚硒酸钠(1ml/100ml)(以上试剂均购于Gibco)及青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)。待人汗腺细胞贴壁后，补加约2ml汗腺培养液继续培养，以后每2～3d换液一次。待细胞达80％融合时，用0.125％胰蛋白酶消化，给予爬片检测。按前述的细胞固定及免疫细胞化学法行CEA、CK7、CK8和CK19检测。

免疫细胞化学检测结果表明：上述从人皮肤分离培养的细胞，均表达CEA(图2A)、CK7(图2B)、CK8(图2C)和CK19(图2D)。说明此细胞为汗腺细胞，而且纯度较高。

实施例3将上述培养的汗腺细胞进行热休克处理获得热休克汗腺条件培养基

原代培养的汗腺细胞达70％～80％融合后，用0.125％的胰蛋白酶消化，并以0.4×10⁶/ml的密度接种于60mm²的培养皿中，24h后放入47℃环境中1h，造成汗腺细胞的体外热休克状态，然后置37℃继续培养3天后，收集细胞培养上清即获得热休克汗腺条件培养基，放-80℃保存备用。

实施例4热休克汗腺条件培养基诱导MSCs向汗腺细胞的转分化

将MSCs于诱导前一天以2×10⁵/ml的密度接种于60mm²的培养皿中，次日进行转分化诱导。对照组使用新鲜的汗腺细胞培养基，实验组使用混合培养基(热休克汗腺条件培养基的掺入比例为30％)诱导时间为5-10天。所有实验均重复至少3次。

1.MSCs转分化诱导后细胞形态的改变：MSCs诱导前体积较大，呈纤维状分散性分布(图3A)；诱导5天后细胞体积变小，呈多边形且比较扁平，部分细胞可相互连接成片(图3B)；诱导10天后细胞进一步连接成片，如“铺路石”样生长(图3C)，形态类似汗腺上皮细胞(图3D)。

2.MSCs转分化诱导后细胞表型的改变：MSCs经热休克汗腺条件培养基诱导10天后，按前述的细胞固定及免疫细胞化学法行CEA、CK7、CK8和CK19检测。结果显示：被诱导的细胞中有40-60％的细胞呈CEA(图4B)、CK7(图4D)、CK8(图4F)和CK19(图4H)染色阳性。而对照组没有检测到CEA(图4A)、CK7(图4C)、CK8(图4E)和CK19(图4G)染色阳性的细胞。

以上结果说明：经过建立适当的体外汗腺诱导培养体系，中胚层的MSCs可以通过跨胚层转分化途径转变为汗腺样细胞，并且从形态、表面标志等方面确证这些转分化来源的细胞为汗腺细胞。

Claims

1.一种在体外非接触培养条件下诱导成体骨髓间充质干细胞转分化为汗腺细胞的方法，包括以下步骤：

a)分离并培养骨髓间充质干细胞(MSCs)，用免疫细胞化学法鉴定其表面标志性蛋白CD29、CD44和CD105；

c)将上述培养的汗腺细胞进行热休克处理，之后去除汗腺细胞，使之形成热休克汗腺的条件培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的热休克汗腺细胞的密度为0.2-1×10⁶/ml。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述的热休克汗腺细胞的密度为0.4×10⁶/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的热休克处理温度为40-50℃。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的热休克处理温度为47℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述的热休克处理时间为0.2-5小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的热休克处理时间为0.5小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其中热休克处理后继续孵育时间为2-7天。

9.根据权利要求8所述的方法，其中热休克处理后继续孵育时间为3-5天。

10.根据权利要求1所述的方法，其中用于诱导MSCs的热休克汗腺条件培养基的掺入比例为20-50％。

11.根据权利要求10所述的方法，其中用于诱导MSCs的热休克汗腺条件培养基的掺入比例为30％。

12.根据权利要求1所述的方法，其中MSCs向汗腺细胞转分化的诱导时间为5-15天。

13.根据权利要求12所述的方法，其中MSCs向汗腺细胞转分化的诱导时间为8-10天。