CN103773734A - 具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法，该方法首先分离骨髓间充质干细胞，然后进行骨髓间充质干细胞传代扩增培养，最后实现间充质干细胞片的培养，得到具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片；本发明通过采用细胞片层技术分离培养BMSCs，收获的BMSCs是含有细胞外基质的完整片状结构，并具有骨向分化和血管发生潜能。由于移植到体内的只有由纯细胞构成的组织，避免了支架等载体的使用以及其所带来的不良反应。且BMSCs细胞片层保留了重要的细胞表面蛋白，如离子通道、连接蛋白等，细胞间可以更好地进行信号传递，保持功能的协调一致。大大提高了细胞的利用率和转移细胞的活性。

Description

具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法

技术领域

本发明属于移植领域，尤其涉及一种用于组织修复再生的细胞片的制备方法。

背景技术

目前，组织工程最主要使用的方法是利用可降解生物材料制成与所需组织形状相仿的三维支架，并在其上培育特定细胞，细胞在支架上生长成所需组织后，将组织与支架一起移植入母体内以替换病变或受损组织。如今，科学家们已经通过此类方法获得了许多种类的组织并为再生医学做出了巨大贡献，例如软骨，骨骼和血管等的修复。然而，组织工程的发展也遇到了一些问题。首先，支架的生物相容性需要验证，某些生物支架会造成植入部位附近组织出现炎性增生，生物可降解支架的降解也会引起炎症反应。其次，支架降解会留下一定空间，而这些空间通常会被增殖的细胞以及大量的胞外基质填满，但是过多的胞外基质以及支架降解残留物又会造成组织纤维化，从而产生病变。

骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs）易于分离提取和体外培养扩增，无免疫排斥反应，诱导后可以向多种细胞组织分化，已成为组织工程中理想的种子细胞。传统的组织工程学在收获和转移细胞方面仍存在诸多不足，限制了组织工程学的发展。胰蛋白酶在消化细胞的过程中难以控制细胞的消化程度，造成细胞外基质破坏、细胞活性降低和细胞染色体突变机会的增加。单细胞悬液移植BMSCs的方法，细胞上架率和细胞密度低，难以形成致密的目标组织。因此，组织工程学要构建出具有致密组织且血供丰富的大块组织，必须解决种子细胞收获和转移方面存在的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法。本发明通过细胞层片技术，制备BMSCs细胞片，使植入体内的BMSCs更好地与周围组织结合，共同参与修复损伤组织，并减少因植入外物的损伤，提高细胞的利用率和转移细胞的活性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法，包括以下步骤：

（1）骨髓间充质干细胞的分离：健康成年大鼠，麻醉后处死，用体积浓度为75%的酒精浸泡约10min，无菌条件下取四肢长骨，除去骨表面附着的软组织，用PBS缓冲液清洗干净；将两端干骺端切除，显露骨髓腔；用体积浓度为10%的FBS的低糖DMEM培养液彻底冲洗骨髓腔，然后依次用7号针头和5号针头的注射器反复冲打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散，制成单细胞悬液，再接种于培养瓶内，在37℃、体积浓度为5% CO2培养箱中培养12h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，之后每2-3天换液1次；贴壁细胞融合80%以上后，结束原代培养；

（2）骨髓间充质干细胞传代扩增培养：将步骤1原代培养后的细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化约2min，待细胞形态开始皱缩，用含体积浓度为10%的胎牛血清的DMEM培养液3ml终止消化，移入离心管，1500rpm离心约5min，弃上清，加入含体积浓度为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，按1:3比例传代培养，得到第一代骨髓间充质干细胞，继续传代培养至得到第三代骨髓间充质干细胞；

（3）间充质干细胞片的培养：将步骤2得到的第三代骨髓间充质干细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化2min后接种在培养瓶中，接种密度为1×10⁴ cells/cm²，在α-MEM培养液，37℃恒温、体积浓度为5％C02饱和湿度培养箱内培养7天后，细胞在底部形成了层状结构，将融合的细胞从培养瓶上分离下来得到即得到具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片。

本发明的有益效果是，本发明通过采用细胞片层技术分离培养BMSCs，收获的BMSCs是含有细胞外基质的完整片状结构，并具有骨向分化和血管发生潜能。由于移植到体内的只有由纯细胞构成的组织，避免了支架等载体的使用以及其所带来的不良反应。且BMSCs细胞片层保留了重要的细胞表面蛋白，如离子通道、连接蛋白等，细胞间可以更好地进行信号传递，保持功能的协调一致。大大提高了细胞的利用率和转移细胞的活性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

    本发明具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法，包括以下步骤：

1、骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离  

健康成年Sprague-Dawley大鼠，麻醉后处死，用体积浓度为75%的酒精浸泡10min，无菌条件下取四肢长骨，除去骨表面附着的软组织，用PBS缓冲液清洗干净。用咬骨钳将两端干骺端切除，显露骨髓腔。用体积浓度为10%的FBS的低糖DMEM培养液彻底冲洗骨髓腔，然后依次用7号针头和5号针头的注射器反复冲打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散，制成单细胞悬液。1 只大鼠股骨和胫骨骨髓细胞接种于1个T-25cm2 塑料培养瓶内，在37℃、体积浓度为5% CO2培养箱中培养12h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，之后每2-3天换液1 次。贴壁细胞融合80%以上后，结束原代培养。

2、骨髓间充质干细胞传代扩增培养　

将原代培养后的细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化2min，待细胞形态开始皱缩，用含体积浓度为10%的胎牛血清的DMEM培养液3ml终止消化，反复轻轻吹打，移入离心管，1500rpm离心5min，弃上清，加入含体积浓度为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，按1:3比例传代培养，得到第一代骨髓间充质干细胞，继续传代培养至第三代骨髓间充质干细胞，用于体外实验。

3、间充质干细胞片的培养

将第三代骨髓间充质干细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化2min后接种在培养瓶中，接种密度为1×10⁴ cells/cm²，在常规α-MEM培养液，37℃恒温、体积浓度为5％C02饱和湿度培养箱内培养7天后，细胞在底部形成了层状结构，即细胞片，可以使用细胞刮刀将融合的细胞从培养瓶上分离下来得到细胞片。

通过PCR方法检测MSC 细胞片与MSCs在基因表达上的差异，发现骨髓间充质干细胞细胞片高表达BMP-2与VEGF，说明MSC细胞片具有骨向分化和血管发生的潜能。

Claims (1)

1.一种具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）骨髓间充质干细胞的分离：健康成年大鼠，麻醉后处死，用体积浓度为75%的酒精浸泡约10min，无菌条件下取四肢长骨，除去骨表面附着的软组织，用PBS缓冲液清洗干净；将两端干骺端切除，显露骨髓腔；用体积浓度为10%的FBS的低糖DMEM培养液彻底冲洗骨髓腔，然后依次用7号针头和5号针头的注射器反复冲打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散，制成单细胞悬液，再接种于培养瓶内，在37℃、体积浓度为5% CO2培养箱中培养12h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，之后每2-3天换液1次；贴壁细胞融合80%以上后，结束原代培养；

（2）骨髓间充质干细胞传代扩增培养：将步骤1原代培养后的细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化约2min，待细胞形态开始皱缩，用含体积浓度为10%的胎牛血清的DMEM培养液3ml终止消化，移入离心管，1500rpm离心约5min，弃上清，加入含体积浓度为10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，按1:3比例传代培养，得到第一代骨髓间充质干细胞，继续传代培养至得到第三代骨髓间充质干细胞；

（3）间充质干细胞片的培养：将步骤2得到的第三代骨髓间充质干细胞用1ml质量体积比为0.25%胰蛋白酶消化2min后接种在培养瓶中，接种密度为1×10⁴ cells/cm²，在α-MEM培养液，37℃恒温、体积浓度为5％C02饱和湿度培养箱内培养7天后，细胞在底部形成了层状结构，将融合的细胞从培养瓶上分离下来得到即得到具有骨向分化和血管发生的组织工程细胞片。