CN113430171A

CN113430171A - 一种转染miRNA的细胞膜片及其应用

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Publication number: CN113430171A
Application number: CN202110697618.8A
Authority: CN
Inventors: 杨德琴; 于洋; 陈萌
Original assignee: Stomatological Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Stomatological Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113430171B

Abstract

本发明涉及细胞修复技术领域，具体涉及一种转染miRNA的细胞膜片及其应用。一种转染miRNA的细胞膜片，所述细胞膜片由骨髓间充质干细胞组成；所述细胞膜片中MicroRNA let‑7a成熟体的含量上调；所述MicroRNA let‑7a成熟体的序列为5’‑UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU‑3’。本方案在对细胞膜片的微环境的生物信号及分化机制进行更深入的研究的基础上，首次发现MicroRNA let‑7a对骨髓间充质干细胞成骨性能的正向诱导作用。本方案能够解决使用骨髓间充质干细胞修复颌骨缺损的效果不佳的技术问题，可以作为颌骨缺损修复材料应用于医疗实践中，进一步提升骨组织工程应用范围和认可度。

Description

一种转染miRNA的细胞膜片及其应用

技术领域

本发明涉及细胞修复技术领域，具体涉及一种转染miRNA的细胞膜片及其应用。

背景技术

传统的基于细胞的骨组织工程是利用大量的种子细胞种植在支架材料上，通过活性因子等诱导细胞分化成骨。其中，骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stemcells，BMMSCs) 具有自我更新、多向分化、免疫调节的能力，而且比其他干细胞来源更加广泛、获取更加方便，被认为是优良的诱导骨组织再生的种子细胞。但是，直接将骨髓间充质干细胞等种子细胞种植在支架材料上，存在细胞利用率低、附着效率差和细胞在支架材料上分布不均等缺陷。为解决上述问题，细胞膜片技术应运而生。采用细胞膜片技术，细胞分泌的细胞外基质给细胞提供了组织微环境，可以克服上述单纯细胞种植所带来的缺陷，并且利用细胞膜片技术，骨缺损修复效能明显优于多个单细胞修复。

虽然将细胞膜片技术应用与骨组织再生中,已经取得了一定的进展，基于细胞膜片的组织再生工程应用已经得到了广泛的认可，但是，仅仅利用细胞膜片技术，对提升种子细胞的骨修复能力的提升效果仍然有限，尚不能满足现阶段的应用需求，已成为限制骨组织工程技术应用于临床的瓶颈。骨组织工程的研究一直致力于维持种子细胞的成骨稳定性、提升支架材料与种子细胞的生物相容性和加强由种子细胞分化成骨的生物机械性能等。需要对细胞膜片微环境的生物信号及分化机制进行更深入的研究，进而充分了解和掌握相关诱导因素的传递和保持的关键技术点，从而提升细胞膜片技术在骨组织再生中的应用价值。

发明内容

本发明意在提供一种转染miRNA的细胞膜片，以解决使用骨髓间充质干细胞修复颌骨缺损的效果不佳的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种转染miRNA的细胞膜片，其由骨髓间充质干细胞形成；其细胞中的MicroRNAlet-7a的含量上调。

采用上述技术方案的原理以及有益效果：

MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21～23bp的非编码RNA,可通过结合相应靶基因的3'UTR 来调控其转录水平,具有高度的种间保守性,在细胞凋亡、自噬、增殖等生物学进程中起着重要功能。MicroRNA let-7a(mmu-let-7a，MIMAT0000521)是最先被鉴定的miRNA之一，是let-7家族的一员,且在由药物、感染和应激等因素引起的细胞凋亡中具有重要的抗凋亡作用，但在促进细胞成骨方面尚未报导。发明人首次将MicroRNA let-7a转染到由骨髓间充质干细胞形成的细胞膜片中，使得细胞膜片中的MicroRNA let-7a表达量上调。利用转染后的细胞膜片与组织工程材料形成复合骨修复材料，实验证明，MicroRNA let-7a可促进骨髓间充质干细胞成骨，可显著加快模型动物的下颌骨修复进程。

发明人通过建立大鼠颌骨缺损模型，以BMMSCs的多向分化功能、细胞膜片修复技术和miRNA 靶向调控基因为基础，研究let-7a能否调控BMMSCs细胞膜片的成骨能力，以及转染let-7a后促进BMMSCs细胞膜片修复颌骨缺损的效果。通过骨髓贴壁培养法得到纯化的BMMSCs，并通过细胞表面抗原标志物鉴定、增殖能力鉴定以及多项分化能力鉴定其干细胞特性。通过诱导使BMMSCs 形成细胞膜片，并随机分组进行转染等后续实验，转染分为三组：let-7a mimic(mi组)、inhibitor (in组)、negative control(nc组)。联合实时定量PCR和Western Blot技术检测转染有效率；利用实时定量PCR、Western Blot技术、ALP染色以及ALP活性检测、茜素红S染色、HE染色检测BMMSCs细胞膜片转染后体外成骨能力以及对细胞膜片细胞外基质的改变；最后通过将各分组进行体内成骨实验，包括裸鼠皮下异位成骨以及大鼠颌骨缺损原位修复，术后进行HE染色和Micro-CT分析兴趣区域。通过上述实验，主要发现了：Let-7a处理BMMSCs膜片，发现mi组较nc组和in组体外成骨以及成细胞外基质相关基因的表达更高，且向成骨细胞分化佳且矿化结节产生增多，其中in组成骨效果最差；Let-7a处理BMMSCs膜片，转染后各组细胞膜片组织学改变不大，但mi组较nc组和in组体外成细胞外基质相关基因的表达更高，其中in组效果最差； Let-7a处理BMMSCs膜片后植入裸鼠皮下，发现mi组较nc组和in组骨细胞及骨陷窝增多，新生类骨质产生增多，其中in组效果最差；Let-7a处理BMMSCs膜片后修复大鼠颌骨缺损，发现 mi组较nc组较in组较control组修复效果更佳，nc组其次，in组仅优于未植入移植物的control 组。

综上所述，通过大量实验研究可知：let-7a可以通过促进BMMSCs细胞膜片成骨分化从而改善颌骨缺损修复效果，对探索和建立更好的颌骨缺损修复方式开辟了新的途径。将BMMSCs细胞膜片中MicroRNA let-7a的含量上调，可有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化，本方案的由骨髓间充质干细胞形成的细胞膜片可以促进下颌骨修复进程。

进一步，其转染有let-7a mimic，let-7a mimic的正义链的序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的序列如SEQ ID NO.3所示。通过转染let-7a mimic可以提高细胞中MicroRNAlet-7a的含量，从而加快细胞膜片的成骨分化的进程。

进一步，所述骨髓间充质干细胞为P3-P5代骨髓间充质干细胞。P3-P5代骨髓间充质干细胞具有较高的生长活性和成骨潜力，故本方案使用这些细胞进行细胞膜片的制备。

进一步，一种转染miRNA的细胞膜片由如下方法制备：接种并使用完全培养基培养骨髓间充质干细胞，待细胞密度达到70-80％之后，将完全培养基更换为膜片诱导液培养7天，获得细胞膜片；然后将膜片诱导液更换为含有10％FBS的α-MEM培养基；再培养一天后，使用let-7a mimic 转染骨髓间充质干细胞；完成转染后，对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，获得转染miRNA的细胞膜片。

采用上述技术方案，先将骨髓间充质干细胞诱导成膜，然后使用let-7a mimic转染骨髓间充质干细胞，并对转染后的细胞进程成骨诱导，获得可以用于体内移植的细胞膜片。细胞膜片诱导需要在细胞密度为70-80％的时候进行。在本方案中细胞膜片诱导之后还要经历转染和成骨诱导的复杂过程，上述过程耗时较长，这就会影响细胞膜片的生长状态，很容易使得膜片形成之后 (特别是在完成成骨诱导之后)与培养孔板脱离，且细胞膜片漂浮并蜷缩成团。出现上述情况则不利于将细胞膜片取出的过程，以及后续使用细胞膜片包裹HA-TCP的过程，出现上述情况后，细胞膜片状态差，其颌骨修复效果变差。

进一步，使用let-7a mimic转染骨髓间充质干细胞的方法为：在含有10％FBS的α-MEM培养基中加入let-7a mimic和Lipofectamine 2000，let-7a mimic的终浓度为50nM，转染时长为4-6h；完成转染后，将培养基再次更换为含有10％FBS的α-MEM培养基。

采用上述技术方案，Lipofectamine 2000可有效携带let-7a mimic，实现let-7amimic的高效转染，转染时长为4-6h可保证实现let-7a mimic的成功转染，转染结束后，将培养基再次更换为含有10％FBS的α-MEM培养基，避免let-7a mimic与细胞共存对细胞状态造成影响。

进一步，所述骨髓间充质干细胞的接种量3×10⁵个/孔。上述接种密度保证了骨髓间充质干细胞可有效形成细胞聚合体(即细胞膜片)。

进一步，所述完全培养基为用α-MEM配制的含10％的FBS、1％的青链霉素双抗的培养基，所述膜片诱导液为含50μg/mL维生素C的完全培养基。在维生素C的处理下，细胞基质表达增加，从而更容易形成细胞膜片。

进一步，所述成骨诱导的时机为完成转染后24h。

在制备转染let-7a mimic的BMMSCs细胞膜片的过程中，转染时间的选择非常重要，本方案选择在转染完成后24h进行成骨诱导，是因为经试验验证转染后24h这个时间点，let-7a mimic 对Fas蛋白的表达量的抑制效果最为显著，说明let-7a mimic在这个时间点的作用最强，具有最佳的协同增强成骨诱导效果的作用，更有利于对细胞膜片的成骨诱导进程，可加强基于细胞膜片的体内骨修复进程。

进一步，一种转染miRNA的细胞膜片在制备颌骨缺损修复材料中的应用。

经实验研究发现，转染miRNA的细胞膜片具有良好的颌骨缺损修复能力，可作为颌骨缺损修复材料应用于相应的组织工程修复实践操作中。

进一步，使用三层转染miRNA的细胞膜片包裹羟基磷灰石-磷酸三钙，获得移植物。

发明人将体外诱导的转染有let-7a mimic的BMMSCs细胞膜片与支架材料相复合并植入颌骨缺损模型处用以评价BMMSCs膜片参与骨组织再生的能力。体内实验表明，转染let-7a mimic BMMSCs细胞膜片与HA-TCP复合物(移植物)在大鼠颌骨缺损处植入后较转染let-7a inhibitor 或NC后可形成更多的骨组织。Micro-CT扫描结果显示，术后4周Micro-CT扫描结果显示，let-7a mimic BMMSCs细胞膜片与HA-TCP复合物(移植物)的实验组中，骨修复已基本完成，而在其他组中，硬组织有部分形成，未完成修复过程。说明使用本方案制备的细胞膜片包裹羟基磷灰石- 磷酸三钙，可促进颌骨缺损的修复，是一种具有实际应用价值的组织工程材料。

附图说明

图1为本发明实施例1的BMMSCs的形态学观察结果(10×，A为原代细胞，B为传代后细胞)。

图2为本发明实施例1的BMMSCs表面标志物的流式检测结果图。

图3为本发明实施例1的BMMSCs克隆形成能力及增殖形成能力鉴定结果。

图4为本发明实施例1的BMMSCs的茜素红S和油红O染色

图5为本发明实施例2的BMMSCs细胞膜片形态学观察结果。

图6为本发明实施例3的let-7a转染的有效性分析结果。

图7为本发明实施例3的转染let-7a对BMMSCs细胞膜片体外成骨能力影响的研究结果。

图8为本发明实施例3的转染let-7a对BMMSCs细胞膜片细胞外基质的影响的研究结果

图9为本发明实施例4的裸鼠皮下移植照片。

图10为本发明实施例4的转染let-7a对BMMSCs细胞膜片裸鼠皮下异位成骨效果。

图11为本发明实施例5的大鼠颌骨缺损移植模型建立过程。

图12为本发明实施例5的颌骨缺损修复大体观。

图13为本发明实施例5的Micro-CT结果。

图14为本发明实施例5的大鼠颌骨缺损修复的HE染色结果(4周)。

图15为本发明实施例5的大鼠颌骨缺损修复的HE染色结果(6周)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：骨髓间充质干细胞(BMMSCs)的分离和鉴定

从4周龄雌性Sprague Dawley大鼠(SCXK(渝)2018-0003)中分离BMMSCs。其中，使用的主要试剂为FBS(Gibco，美国)、α-MEM培养基(Hyclone，美国)、青链霉素双抗(Hyclone，美国)、成骨诱导培养基套装(赛业，中国)、成脂诱导培养基套装(赛业，中国)、CCK-8 试剂盒(同仁，日本)和维生素C(Sigma,美国)等。使用的主要实验仪器包括倒置相差显微镜照相系统(Nikon，日本)、体视显微镜(Olympas，日本)、分选型流式细胞仪(BD influx，美国)、酶标仪(Thermo Fisher Scientific，美国)和石蜡包埋机(科建化工)等。

(一)大鼠骨髓间充质的分离、培养与传代

1)超净台内用α-MEM配置含10％的FBS、1％的双抗(青链霉素双抗)的完全培养基。

2)将4周的SD大鼠采用实验室专用二氧化碳安乐死箱处死，然后立即放入75％乙醇浸泡约 5min。

3)快速剔除肌肉、筋膜等组织(生物安全柜中，冰袋上)，取股骨和胫骨，浸泡于含有少量双抗的无菌PBS的玻璃皿中。

4)使用灭菌骨剪剪去胫骨及股骨干骺端，用完全培养基反复冲洗骨髓腔，直至肉眼观察股骨和胫骨变白。

5)收集含有骨髓悬液的完全培养基放入直径为10cm的培养皿内，并培养箱中常规培养。

6)5天后换液，细胞爬出，标记为P0，即原代细胞。

7)当P0细胞融合至80％左右时可以开始传代：弃培养基，用无菌PBS轻柔润洗两次，加入 1mL 0.25％胰酶，放入孵箱中孵育1-2min，加入3mL完全培养基终止胰酶消化；吹打混匀细胞悬液，转移至15mL无菌离心管中，离心(1000rpm/min,5min)；离心后小心弃上清液，用培养基重悬，以1：2的比例进行传代，加入10mL完全培养基常规培养，标记为P1，即第一代细胞。

(二)BMMSCs的表面标志物鉴定

1)选用P3-P5 BMMSCs,常规消化、中和、离心。

2)用含3％胎牛血清的PBS重悬细胞,加入1.5mL EP中，吹打混匀，离心(4℃，5min，转速400g)。

3)弃上清，室温避光条件下加入一抗(偶联二抗，抗大鼠CD90-FITC、CD29-PE、CD31-PE，和CD45-PE)各2μL)100uL/10⁶个细胞(一抗：3％胎牛血清PBS＝1：100)，室温避光孵育20-30min。

4)加入1mL含3％FBS的PBS溶液/EP管，混匀，4℃离心，5min，转速400g。

5)弃上清，加入1mL含3％FBS的PBS溶液/EP管，混匀，4℃离心，5min，转速400g。

6)弃上清，加入500uL含3％FBS的PBS溶液/EP管，混匀，4℃离心，5min，转速400g。

7)过滤至流式管中，使用流式细胞仪进行检测。

(三)BMMSCs自我更新能力的鉴定

①克隆形成

1)将P3-P5 BMMSCs按前述方法消化、重悬并计数。

2)将800个单细胞接种于直径为10cm的无菌培养皿中，一共接种3个培养皿。

3)培养14d后，弃培养基，用无菌PBS洗两次，然后用4％多聚甲醛固定细胞30min，弃去固定液，用PBS清洗2次、晾干。

4)用1％结晶紫染液染色20min后弃染色液，用PBS冲洗干净。

5)体式显微镜下观察并拍照，克隆形成为超过50个细胞的集落。

②CCK-8检测生长曲线

(四)成脂、成骨诱导分化

①成骨诱导分化：

1)参考SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基(赛业)说明书配制成骨诱导培养基。存于4℃备用。

2)将P3-P5 BMMSCs常规消化、重悬并计数。

3)参考诱导分化培养液说明书接种细胞于六孔板中；将细胞置于培养箱中常规培养。

4)细胞融合度达到60％-70％时，小心吸走完全培养基，每孔加入2mL配置好的成骨诱导分化培养基(提前水浴加热至37℃，每3天更换)。

5)诱导21天后，吸走培养基，用1×PBS冲洗2次。

6)每孔加入1mL细胞固定液，固定30min。

7)PBS洗2次后，加1mL茜素红S染液染3-5min。

8)吸走茜素红S染液，用1×PBS冲洗2-3次。

9)倒置显微镜下观察并拍照。

②成脂诱导分化：

按照现有技术，SD大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导培养基(赛业)说明书进行。

上述实验重复至少三次。利用GraphPad Prism 8软件进行统计分析。实验结果用“均数±标准差”表示。单因素方差分析(one-way ANOVA)比较多组之间差异，多样本两组间比较采用 Turkey检验，p＜0.05表示有统计学差异。

(五)实验结果

BMMSCs原代培养5-7天，倒置显微镜下可观察到少量细胞散在分布呈圆形、多角形或不规则形(图1，A)，传代培养后，细胞增殖迅速，呈长梭形，形态均一(图1，B)。

流式细胞实验检测结果表明：目的细胞阳性表达CD90、CD29。阴性表达CD31，CD45(图2)；符合间充质来源干细胞特征。图2中，A为BMMSCs表面标志物阴性对照；B为细胞表面标志物 CD29(PE)；C为细胞表面标志物CD90(FITC)；D为细胞表面标志物CD31(PE)；E为细胞表面标志物CD45(PE)。

利用结晶紫对培养14天的BMMSCs进行染色，体式显微镜下观察可见该细胞可形成克隆集落，说明BMMSCs有增殖能力(图3，A为大体观BMMSCs的克隆集落形成；B为4×体式显微镜下单个克隆集落)。CCK-8增殖曲线显示，分离培养的BMMSCs在培养后1天进入对数生长期，从5天增长速度逐渐变缓(图3，C为BMMSCs的增殖曲线图)。

BMMSCs多向分化能力检测结果详见图4，其中，A为BMMSCs的茜素红S染色(大体)；B为镜下BMMSCs的茜素红S染色(4×)；C为镜下BMMSCs的茜素红S染色(10×)；D为镜下BMMSCs的油红O染色(4×)；E为镜下BMMSCs的油红O染色(10×)；F为镜下BMMSCs的油红O染色 (40×)。P3-P5 BMMSCs在成骨诱导培养基诱导21天后茜素红S染色，倒置显微镜下可见红色矿化结节(图4，A-C)；P3-P5 BMMSCs在成脂诱导培养基诱导28日天后油红O染色，倒置显微镜下可见圆形红色脂滴(图4，D-F)。

实施例2：BMMSCs细胞膜片的制备

1)取P3-P5代骨髓间充质干细胞常规消化、中和、计数，以3×10⁵个接种于六孔板中。

2)待细胞生长融合至80％左右加入诱导液(即含50μg/mL维生素C的完全培养基)，每组三个复孔。

3)每3天换液，待诱导7天后，孔板底壁可见膜状物质形成并且边缘呈卷缩状，使用镊子沿细胞膜片(细胞聚合体)边缘可将其与板底分离并获得成熟的细胞膜片。

4)在体式显微镜下观测成熟细胞膜片。

5)将细胞膜片常规固定后HE染色：用1×PBS清洗2次，每孔加入2mL 4％多聚甲醛固定过夜。第二天常规脱水、石蜡包埋、切片和HE染色后封片并于组织显微镜下观察并记录细胞膜片的组织学结构。

图5展示了细胞膜片的制备结果，其中，A为诱导7天后，肉眼观；B为经成膜诱导后的细胞膜片HE染色，镜下观(4×)；C为经成膜诱导后的细胞膜片HE染色，镜下观(20×)；D为普通培养后HE染色(未经成膜诱导后的)，镜下观(4×)；C为普通培养后HE染色(未经成膜诱导后的)，镜下观(20×)。经连续成膜片诱导7天后，可在六孔板底观察到乳白色的成熟细胞膜片(图5，A)。HE染色显示骨髓间充质干细胞细胞膜片中细胞均呈规律排列，单层膜片内有5-10层细胞(蓝色箭头指示区域)，且膜片内含有细胞外基质显著增多(图5，B和C)。在未经成膜诱导的间充质干细胞HE染色显示单层仅有2-3层细胞(蓝色箭头指示区域)，且细胞外基质较少(图5，D和E)。

研究表明单纯的干细胞组织修复效果有限，而细胞聚合体(细胞膜片)内富含丰富的细胞外基质，可以将内部细胞紧密相连，而且巩固了细胞分泌的生长因子，为细胞的生存提供了更合适的内环境。细胞膜片的这种特性更有利于在缺损部位的生存。本方案首先培养了BMMSCs细胞膜片，经HE染色后在光镜下可见单层细胞膜片较普通培养的骨髓间充质干细胞的细胞层数含量更多，且细胞之间的细胞外基质含量也更多，证明已经成功制备出细胞膜片。

实施例3：Let-7a转染BMMSCs细胞膜片以及体外成骨调控作用研究

本实施例使用到的试剂和设备包括：抗大鼠Fibronectin单克隆抗体、抗大鼠Laminin单克隆抗体、抗大鼠Collagen I单克隆抗体、抗大鼠RUNX2单克隆抗体、抗大鼠OSX单克隆抗体 (Abcam，美国)、荧光二抗(博奥森，中国)、mmu-let-7a mimics(Riobio，中国)、mmu-let-7a inhibitor(Riobio，中国)、mmu-let-7a negative control(Riobio，中国)、Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)、碱性磷酸酶活性(ALP)试剂盒(碧云天，中国)、ALP活性检测试剂盒(南京建成，中国)、合成引物(上海生工，中国)、PrimeScript^TMRT-PCR试剂盒(TaKaRa，日本)、荧光定量PCR仪(新加坡BIO RAD)。

(一)let-7a mimic及let-7a inhibitor及有效性分析

通过mirbase数据库获得mmu-let-7a(MIMAT0000521)成熟序列，let-7a mimics、inhibitor、negative control根据let-7a成熟序列由RiboBio公司设计，如表1所示：

表1：mmu-let-7a成熟序列、let-7a mimics、inhibitor和negative control的序列信息

使用上述RNA进行转染前，将let-7a mimic，inhibior及nc冻干粉瞬时离心后加入250uL RNase-free水，配置成20μM储存液，分装保存，放入-20℃储存(冻融不超过5次)。将let-7a mimic，inhibitor及nc以50nM的浓度(终浓度)，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen) 转染。转染前一天将细胞膜片培养基更换为2.5mL的不含抗生素的培养基。第二天用250μLα-MEM稀释7.5μL mimic、inhibitor和NC，轻轻混匀(冰上操作)，使用前轻轻混匀Lipo 2000，然后取5μL Lipo 2000在250μLα-MEM中稀释，室温孵育5min(25min内进行下一步操作)。将前两步稀释的miRNA和Lipo 2000混合(使总体积为500μL)，轻轻混匀，室温静置20min。每孔加入500μL转染液，孔板放入培养箱常规培养。4-6h后更换培养基，24-96个h后可检测相关转录表达。

接下来对转染有效性进行分析，具体过程如下：

提取转染miRNA的BMMSCs细胞膜片的总RNA后，采用Real Time RT-PCR(RT-PCR)检测其 let-7a miRNA的表达以及Fas mRNA的表达。其中，RNA提取采用酚-氯仿提取法，对提取获得的 RNA进行纯度和浓度的测定，以及RT-PCR检测，并同时使用WB检测Fas蛋白的表达量。使用到的引物包括：

Let-7a的上游引物：5’-GTGTATCATACAGTATAATGAAACTAC-3’(SEQ ID NO.6)；

Let-7a的下游引物：5’-AACAGTGCAGTTAGTTCT-3’(SEQ ID NO.7)；

Fas的上游引物：5’-TTCCCATCCTCCTGACCAC-3’(SEQ ID NO.8)；

Fas的下游引物：5’-CTCGTAAACCGCTTCCCTC-3’(SEQ ID NO.9)。

图6为let-7a转染的有效性分析，A为转染后各组各时间段BMMSCs细胞膜片内FasmRNA 的表达量；B和C为转染后各组各时间段BMMSCs细胞膜片内Fas蛋白的表达量；D为转染后各组BMMSCs细胞膜片内let-7a含量(***p<0.001)。Let-7a可特异与Fas基因结合，干扰其表达。转染let-7a后24h、48h、72h检测骨髓间充质干细胞细胞膜片的Fas mRNA表达量，对比48h的 mi(转染let-7a mimics)、in(转染let-7a inhibitor)、lipo(只使用Lipo 2000)和空白组(未使用miRNA和Lipo 2000)，发现mi可有效降低Fas mRNA的表达量，而in组最高；对比24h、48h、72h的mi组，发现24h组的抑制效果最明显，是发挥let-7a最佳效果的时间(图6，A)。检测骨髓间充质干细胞细胞膜片的Fas蛋白质表达量，对比48h的mi、in、lipo，发现mi可有效降低Fas蛋白质的表达量；对比24h、48h、72h的mi组，发现24h组的抑制效果最明显，是发挥let-7a最佳效果的时间(图6，B和C)。相对定量检测let-7a转染率，发现mi 组可有效增加BMMSCs细胞内的let-7a含量(图6，D)。

(二)Let-7a转染对BMMSCs细胞膜片的成骨相关及成细胞外基质相关基因表达的检测

将成功转染的细胞膜片培养基更换为常规成骨诱导液，提取经成骨诱导7天的骨髓间充质干细胞膜片的总RNA后，采用Real Time RT-PCR(RT-qPCR)检测其成骨相关基因(OCN、OPG、 Runx2、)和细胞外基质相关基因(Fibronect，Laminin，Col-I)的表达。

将转染后的BMMSCs细胞膜片成骨诱导7天，提取蛋白质后进行成骨相关蛋白(RUNX2、OSX) 和成细胞外基质相关蛋白(Integrinβ1，Col-1)的表达量检测。采用碧云天ALP染色试剂盒对骨髓间充质干细胞的细胞膜片染色。将转染后的BMMSCs细胞膜片成骨诱导21天，然后进行茜素红染色以及定量分析。

转染let-7a对BMMSCs细胞膜片体外成骨能力影响的研究结果参见图7，其中，A为转染后各组BMMSCs膜片细胞内OCN、OPG、RUNX2 mRNA的表达量；B-C为转染后各组各时间段BMMSCs 细胞膜片RUNX2、OSX蛋白的表达量；D为转染后各组BMMSCs细胞膜片ALP染色；E为转染后各组BMMSCs细胞膜片及ALP活性；F-G为转染后各组BMMSCs细胞膜片茜素红S染色及定量 (**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001)。骨髓间充质干细胞的细胞膜片转染后经成骨诱导培养7d后，行Real Time RT-PCR检测、western blot检测、ALP染色、ALP活性检测；成骨诱导 21天后，对膜片行茜素红S染色及定量分析。Real Time RT-PCR检测结果表明，组间对比，转染let-7a mimic的BMMSCs细胞膜片OCN、OPG、RUNX2基因表达量更高(图7,A)，westernblot 检测结果表明转染let-7a mimic的BMMSCs细胞膜片表达RUNX2、OSX蛋白质表达更高(图7，B 和C)此外，ALP染色以及活性检测(图7，D和E)、茜素红S染色及定量结果显示mimic组处理后成骨潜力更强，与上述结果基本一致。但是值得注意的是在部分PCR和WB实验中inhibitor 组对于成骨的抑制作用并不明显(图7，A和C)，如OCN和RUNX2基因mRNA表达，以及RUNX2 的蛋白表达在inhibitor甚至高于nc组。

转染let-7a对BMMSCs细胞膜片细胞外基质的影响的研究结果参见图8，其中，A为转染后各组BMMSCs细胞膜片内Col-1、Fibronectin、Laminin mRNA的表达量；B和C为转染后各组各时间段BMMSCs细胞膜片内Col-1、Integrinβ1蛋白的表达量；D为转染后各组BMMSCs细胞膜片HE染色(4×)；E为转染后各组BMMSCs细胞膜片HE染色(20×)(**p<0.01,***p<0.001, ****p<0.0001)。Real Time RT-PCR检测结果表明，转染let-7a mimic的骨髓间充质干细胞细胞膜片表达成细胞外基质相关基因mRNA更多(图8，A)，wstern blot检测结果表明转染let-7a mimic的骨髓间充质干细胞的细胞膜片表达成细胞外基质相关基因蛋白质更多(图8，B和C)， HE染色检测结果(图8，D和E)显示转染后组织学层面上细胞膜片内的细胞层数及细胞外基质的分泌没有组间的统计学差异。另外，值得注意的是在WB实验中integrinβ1基因的蛋白表达mimic与NC组无明显差异，Col-1基因的蛋白表达在inhibitor与nc组差异无明显差异，但两组的的mimic相对inhibitor表达明显上调(图8，B和C)。

综上所述，骨缺损主要以骨组织的丧失为主要病理表现。因此，修复骨缺损的关键在于重生缺失的骨组织，有效使骨髓间充质干细胞成骨。miRNA可以调控干细胞成骨，但let-7a尚未有相关研究，在本方案中，转染let-7a后24h、48h、72h检测骨髓间充质干细胞的细胞膜片的Fas mRNA表达量，对比48h的mi、in、lipo和空白组，发现mi可有效降低Fas mRNA的表达量，而 in组最高；对比mi、in和空白组的Fas蛋白表达量，也发现同样的趋势，证明转染let-7a mimic 后成功与Fas靶向结合，而in由于竞争结合了let-7a，使得Fas表达量增加。对比24h、48h、 72h的mi组，发现24h组的抑制效果最明显，是发挥let-7a最佳效果的时间，因此取转染24h 后的细胞膜片进行后续实验。在验证let-7a调控体内成骨方面，本实验将骨髓间充质干细胞细胞膜片转染后经成骨诱导培养7d后，行Real Time RT-PCR检测、western blot检测、ALP染色、碱性磷酸酶活性检测；成骨诱导21天后行茜素红S染色及定量分析。Real Time RT-PCR检测结果表明，转染let-7a mimic的骨髓间充质干细胞细胞膜片表达成骨相关基因mRNA更多，western blot检测结果表明转染let-7a mimic的骨髓间充质干细胞细胞膜片表达成骨相关基因蛋白质更多。此外，ALP染色以及活性检测、茜素红S染色及定量结果显示mimic组处理后成骨潜力更强，与上述结果基本一致。碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞成熟的标志，矿化结节的形成也意味着成骨细胞形成产生矿化。这些结果证明在转染后短期内可见实验组成骨潜力无论在分子水平或者组织水平均明显增强。但是值得注意的是在部分Real Time RT-PCR和western blot实验中 inhibitor组对于成骨的抑制作用并不明显，如OCN和RUNX2基因mRNA表达，以及RUNX2的蛋白表达在inhibitor甚至高于nc组。骨钙素(OCN)是骨形成过程中的矿化时产生的非胶原蛋白，由成熟的成骨细胞在骨形成的后期形成和分泌,RUNX2是成骨细胞分化的重要调控基因，但是其本身并不能决定因素，该过程还受多种其他因素调控如激素和细胞因子等,综合以上结果可知 let-7a mimic对于骨髓间充质干细胞膜片的成骨向分化总体而言呈促进，而部分基因的表达中 inhibitor抑制效果并不明显，可能是由于该基因在此阶段的原始表达量并不高有关。

细胞膜片要发挥良好的修复功能作用需要具备一定的厚度、完整的形态外，还需要含有丰富的细胞外基质，细胞外基质中的某些蛋白对其生物学行为如细胞的形状、分化和迁移起着积极的调控作用，因此我们也探究了let-7a对于细胞膜片细胞外基质形成的影响。其中，胶原蛋白 (Collagen)作为细胞骨架可在细胞表面形成网状纤维复合物，并且通过纤连蛋白(Fibronectin) 层粘连蛋白或其他细胞外基质蛋白与细胞表面的受体相连接/附着，而膜整合蛋白(Integrin家族)构成了大部分细胞表面受体。综上所述，细胞、胞外基质和细胞表面受体通过胶原蛋白、纤连蛋白、膜整合蛋白这三种蛋白相连，从而使三者成为一个整体，有利于细胞内外信号的转导和细胞命运的有效调控。比较转染后细胞外基质相关基因和蛋白质的表达以及转染后对细胞膜片形态进行HE染色后观察，对比其他两组，发现转染let-7a mimic可以明显增加Col-1、Fibronectin、 Lamin基因mRNA的表达，以及Col-1蛋白质的表达，轻微增加Integrinβ1蛋白的表达，Real Time RT-PCR检测结果表明，转染let-7a mimic的骨髓间充质干细胞细胞膜片表达成细胞外基质相关基因mRNA更多，western blot检测结果表明转染let-7a mimic的骨髓间充质干细胞细胞膜片表达成细胞外基质相关基因蛋白质更多，但integrinβ1基因的蛋白表达mimic与NC 组无明显差异，Col-1基因的蛋白表达在inhibitor与nc组差异无明显差异，这可能是由于在转染短期内let-7a对于胞外基质蛋白表达促进作用不明显，HE染色检测结果显示转染后组织学层面上细胞膜片内的细胞层数及细胞外基质的分泌没有组间的统计学差异。证明在let-7a mimic对于细胞膜片细胞外基质的形成无负面影响，而且可使细胞外基质相关基因mRNA以及蛋白质的表达上升，但是短期内在组织学层面促进作用不明显。

本方案有效转染了let-7a mimic、inhibitor以及negative congtrol，发现BMMSCs转染 let-7a mimic后可以有效靶向结合Fas基因，干扰其mRNA以及蛋白质的表达，let-7a mimic转染对于细胞膜片的胞外基质的形成无抑制作用，并且在mRNA水平和部分蛋白质水平可以有效促进胞外基质相关基因的表达，不过在组织水平层面促进作用不明显；在促进成骨方面，转染后短期内可见实验组成骨潜力无论在分子水平或者组织水平均明显增强。以上结果提示后骨髓间充质干细胞拥有更佳的体外成骨修复潜能，对骨缺损修复有借鉴意义。

实施例4：Let-7a调控BMMSCs细胞膜片异位成骨

本实施例进一步在体内验证Let-7a调节BMMSCs细胞膜片内分化情况。本部分实验将转染 let-7a mimic、inhbitor或negative control的BMMSCs细胞膜片成骨诱导7天后分别混合羟基磷灰石-磷酸三钙(Hydroxyapatite-tricalcium phosphate，HA-TCP，四川大学生物材料工程研究中心)支架材料，植入裸鼠(SCXK(渝)2018-0003)背部皮下，观察它们体内的分化情况。

转染let-7a mimic的BMMSCs细胞膜片的制备具体过程如下：

细胞膜片诱导：取P3代骨髓间充质干细胞(可选择P3-P5代骨髓间充质干细胞，均具有良好的增殖活性和成膜能力)常规消化、中和、计数，以3×10⁵个接种于六孔板中。使用完全培养基培养细胞，待细胞生长融合至细胞密度为80％左右加入膜片诱导液(可在细胞密度在70-80％的时候，加入诱导液进行成细胞膜片诱导)，膜片诱导液即含50μg/mL维生素C的完全培养基，完全培养基为用α-MEM配置含10％的FBS、1％的双抗(青链霉素双抗)的培养基，每3天更换膜片诱导液。使用膜片诱导液诱导培养细胞7天(培养箱中37℃常规培养)，完成膜片诱导，获得细胞膜片。

转染：使用双链的let-7a mimic转染BMMSCs细胞膜片，具体过程如下：

使用膜片诱导液进行细胞膜片诱导完成后(即转染前一天)，将诱导液更换成为2.5mL(每孔)的不含抗生素的培养基(用α-MEM配置含10％的FBS的培养基)。使用不含抗生素的培养基孵育细胞1天后(培养箱中37℃常规培养)，在2.5mL的不含抗生素的培养基中加入let-7a mimic 和Lipofectamine 2000(Invitrogen)，具体加入方式为：用250μLα-MEM稀释7.5μL let-7a mimic(储液浓度20μM)，获得let-7a mimic溶液，使用前轻轻混匀Lipofectamine 2000，5μ L Lipo 2000在250μLα-MEM中稀释，室温孵育5min(25min内进行下一步操作)，获得lipo 溶液。将全部let-7a mimic溶液和全部lipo溶液混合(使总体积为500μL)，轻轻混匀，室温静置20min，获得混合液。然后在每孔中加入500μL混合液，获得转染体系，在该转染体系中let-7a mimic的浓度为50nM。4h后更换培养基(转染过程可以持续4-6h，均可实现成功转染，转染过程将细胞置于培养箱中37℃常规培养)，将含有let-7amimic的转染体系更换为不含抗生素的培养基(用α-MEM配置含10％的FBS的培养基，培养箱中37℃常规培养)。

成骨诱导：转染后24h进行成骨诱导，将不含抗生素的培养基更换为成骨诱导培养基，每孔加入2ml成骨诱导培养基(为现有技术中常规培养基，OriCell^TMSD人鼠骨髓间质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒，赛业)。成骨诱导7天(其间每3天换液，培养箱中37℃常规培养)，获得转染有let-7a mimic的BMMSCs细胞膜片。

转染有let-7a inhibitor的BMMSCs细胞膜片也按照上述过程制备。

另外，细胞膜片诱导需要在细胞密度为70-80％的时候进行。在本方案中细胞膜片诱导之后还要经历转染和成骨诱导的复杂过程，上述过程耗时较长，这就会影响细胞膜片的生长状态，很容易使得膜片形成之后(特别是在完成成骨诱导之后)与培养孔板脱离，且细胞膜片漂浮并蜷缩成团。出现上述情况则不利于将细胞膜片取出的过程，以及后续使用细胞膜片包裹HA-TCP的过程，出现上述情况后，细胞膜片状态差，其颌骨修复效果变差。发明人分别尝试了在细胞密度为 60-90％的时候进行细胞膜片诱导(即研究了加入诱导液的时机)，发现只有细胞密度为70-80％的时候进行细胞膜片诱导，获得的细胞膜片与培养孔板贴合良好，未发生脱离培养孔板、漂浮于培养基中以及整个细胞膜片蜷缩成团的现象。并且在刮取细胞膜片的时候，细胞膜片易与培养孔板剥离，且刮取过程中，细胞膜片受损伤较小。当细胞密度小于70％(具体测试点为细胞密度60％) 或者大于80％(具体测试点为细胞密度90％)的时候进行细胞膜片诱导，均会出现细胞膜片与培养孔板脱离且细胞膜片漂浮并蜷缩成团的现象，细胞膜片中的细胞生长状态欠佳。发明人在进行单纯的细胞膜片培养的时候(实施例2，未进行转染和成骨诱导，只进行了成膜片诱导)，也尝试了在不同的细胞密度的情况下加入诱导液，实验显示，在60-100％的细胞密度时加入诱导液，诱导7天后，细胞膜片与培养孔板贴合良好，未发生脱离培养孔板、漂浮于培养基中以及整个细胞膜片蜷缩成团的现象。对比本段前述情况，这说明了后续的转染和成骨诱导会对细胞膜片的状态产生较大的影响，而通过调整诱导液的加入时机，可以提升细胞膜片的质量。

本实验共分为以下3组：

(1)mimic组：BMMSCs细胞膜片转染let-7a mimic，移植前与HA-TCP混合(转染有let-7a mimic的BMMSCs细胞膜片+HA-TCP)；

(2)inhibitor组：BMMSCs细胞膜片转染let-7a inhibitor，移植前与HA-TCP混合转染有let-7a inhibitor的BMMSCs细胞膜片+HA-TCP)；

(3)NC组：BMMSCs细胞膜片无转染对照，移植前与HA-TCP混合。

将三层相同的细胞膜片相复合并与颗粒状的HA-TCP包裹后，于常规条件下孵育一小时备用。实验室吸入麻醉机麻醉裸鼠，固定，碘伏消毒背部皮肤。分于背部两侧脊柱旁1.5cm左右做一纵行切口，钝性分离出潜形袋装空隙。分别植入制备好的移植物，缝合，耳标标记。每个分组至少 3只。所有动物程序按照动物机构伦理委员会指定的指南进行。术后4周常规取材、固定、EDTA 常规脱钙3周后行HE染色。将骨髓间充质干细胞膜片按照分组转染并成骨诱导后，制成移植物，进行裸鼠皮下移植，术后伤口恢复良好，无感染，裸鼠生存状况良好，手术过程如图9所示。其中，A为将三层转染后各组细胞膜片与颗粒状HA-TCP包裹制备成移植物；B为裸鼠皮下移植术中； C为裸鼠皮下移植术后。

HE染色显示3组均可见HA-TCP材料，呈网状结构，中间空隙处可见细胞存在。其中部分空隙处可见新生类骨质，呈均匀粉色；以及骨细胞和骨陷窝，骨陷窝为骨细胞的胞体所占据的椭圆形小窝，mi组和nc组对比in组在HA-TCP之间形成空隙更多，放大观察可见其中容纳的新生类骨质和骨细胞等，低倍镜下随机选取不同个体的切片全景可见在mi组形成了骨质和骨细胞的空隙更多，即较其他两组的新生类骨质、骨细胞和骨陷窝都更加丰富和密集(图10，A为裸鼠皮下组织HE染色(4×)；B为裸鼠皮下组织HE染色(20×))。

以往大量研究都对骨髓间充质干细胞的体内分化进行了研究，使用的动物模型种类较多，结果均显示骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中有巨大潜力。支架也是组织工程中重要的一部分，有很多材料都和骨髓间充质干细胞复合应用于动物模型，比如磷酸钙骨水泥、水凝胶等等，还有很多新型材料正在进一步研发中，本实验中所用的HA-TCP支架材料为骨缺损移植中常用的支架材料之一，已被大量动物和临床实验证明具有良好的生物相容性和骨传导性、且无过敏等不良反应。但生物支架联合BMMSCs治疗目前亟待突破技术的是提供良好的血液循环，以使BMMSCs得到充足营养以及及时清理代谢废物，否则将导致感染等风险增大而移植失败。在支架中添加生长因子如、 BMP-2、VEGF等，可以促进血管生成以及成骨分化，是值得努力的方向，本实验前部分实验已经证明let-7a可以促进BMMSCs细胞膜片体外成骨分化以及成细胞外基质也有正向调节作用，本部分实验进一步在动物体内验证let-7a可以促进BMMSCs细胞膜片成骨分化。因此本实验采HA-TCP 与转染后的BMMSCs细胞膜片混合植入裸鼠背部皮下。采用免疫缺陷的裸鼠可以使BMMSCs细胞膜片不受动物体内免疫系统影响。4周后取材组织，H&E染色显示3组均可见HA-TCP材料，呈网状结构，中间空隙处可见细胞存在。其中部分空隙处可见新生类骨质，呈均匀粉色；以及骨细胞和骨陷窝，骨陷窝为骨细胞的胞体所占据的椭圆形小窝，但在in组未见新生类骨质形成。Mi组和较其他两组的新生类骨质、骨细胞和骨陷窝都更加丰富和密集。且由此可见骨髓间充质干细胞由在体内随着时间变化由表面逐渐生长至在HA-TCP中，并成团向成骨细胞方向分化，至第4周已可见部分新生的类骨质。体内实验显示let-7a增强BMMSCs细胞膜片成骨分化，比另外两组的新生类骨质、骨细胞和骨陷窝都更加丰富和密集，有利于骨缺损再生和修复。

实施例5：Let-7a调控BMMSCs细胞膜片颌骨缺损修复

let-7a可以促进BMMSCs细胞膜片体外成骨以及异位皮下成骨，但是颌骨缺损的生理环境与体外以及异位都有所区别，本实施例旨在大鼠体内模拟颌骨缺损环境，观察转染let-7a后的BMMSCs细胞膜片修复颌骨缺损的效果。本实施例的转染let-7a后的BMMSCs细胞膜片的制备方法参见实施例6。

本实验共分为以下4组：

(1)mimic组：BMMSCs细胞膜片转染let-7a mimic，移植前与HA-TCP混合；

(2)inhibitor组：BMMSCs细胞膜片转染let-7a inhibitor，移植前与HA-TCP混合；

(3)NC组：BMMSCs细胞膜片无转染对照，移植前与HA-TCP混合；

(4)control组：无材料植入，空白对照。

将48只SD大鼠(8周龄雌性Sprague Dawley大鼠，SCXK(渝)2018-0003)行1％戊巴比妥全麻后，于下颌角区域行备皮、消毒、皮肤切开及肌肉、韧带钝性分离后暴露大鼠下颌骨第三磨牙附近的颊侧骨板。使用慢速手机和倒锥车针在下颌第三磨牙下后方制备一个面积为2mm×2mm的缺损，其深度约为1mm。制备缺损的同时应注意用生理盐水降温，防止组织温度过高；同时注意吸除多余液体防止老鼠术中窒息。制备好牙周组织缺损后，将其随机分组并设计四组，每组6只大鼠，其中移植物的制备方法同实施例4。将移植物分别植入缺损处，分层缝合后于缺损部分涂抹抗生素，术后普食。分别于1周，4周及6周取材，每个时间点分别取材3只大鼠。并对分离的下颌骨样本分别行Micro-CT扫描、HE染色观察。

将骨髓间充质干细胞膜片按照分组转染并成骨诱导后，制成移植物，进行大鼠颌骨缺损移植，术后伤口恢复良好，无红肿炎症等，大鼠生存状况良好，手术过程如图11所示。

建立缺损修复模型后1周、4周、6周分别取材，得到每组每时间段有效模型如图12，其中除1周in、nc、control组仅有2个重复有效，其他均有3重复，缺损区域由红圈指示。

Micro-CT结果如图13所示，其中，A为术后第1周；B为术后第4周；C为术后第6周；D为缺损修复区域骨密度；E为缺损修复区域骨小梁厚度(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。本实验使用Micro-CT检测大鼠颌骨缺损修复情况。术后1周、4周及6周，Micro-CT扫描结果(图 13，A)显示术后1周四组均几乎无新骨质形成，缺损区域仍呈现较为完整的骨缺损形态。术后 4周Micro-CT扫描结果显示，mi组骨修复已基本完成，in和nc组硬组织有部分形成，但组间并无显着差异，而control组缺损修复形成最少，缺损边缘清晰可见(图13，B)；术后6w CT 所示mi修复效果最佳，缺损几乎完成，nc其次，表面还可见少量崎岖不平，in可见部分修复，但是缺损边缘仍清晰，control组形成骨质最少(图13，C)。术后6w的缺损区域骨密度(BMD) 和骨小梁厚度(Tb.Th)定量分析可见mi、nc、in和control组依次下降，与之前结果相符合(图 13，D和E)。

图14展示了各组大鼠颌骨缺损修复的HE染色结果(4周，A为4×，B为10×)，图15展示了各组大鼠颌骨缺损修复的HE染色结果(6周，A为4×，B为10×)。术后4周的HE染色组间结果(图14)对比显示mi组骨缺损区域有新骨形成最多，in与nc组也有少量新骨形成，但in组缺损面积较mi和nc组大，但新骨结构暂不均匀。而blank control组并无明显的再生骨组织。但mi较nc和in组所形成的骨组织结构更为均匀、与正常骨组织接近，骨量也更为丰富。而blank control组缺损区域几乎无新骨形成。术后6周的HE染色组间结果(图15)对比显示mi、in、nc组骨缺损区域有大量新骨形成而blank control组并无明显的再生骨组织。但 mi较nc和in组所形成的骨组织结构更为均匀、与正常骨组织接近，骨量也更为丰富。Blankcontrol组形成的骨组织较少。

由于机体内外环境不同，使得通过体内实验验证BMMSCs细胞膜片修复颌骨缺损成为必要。骨髓间充质干细胞属于具有低免疫原性即为免疫排斥反应小等特点的一类间充质干细胞，植入大鼠颌骨缺损处来修复组织缺损成为可能。BMMSCs细胞膜片不仅可以分泌丰富的细胞外基质还可为缺损部位提供大量细胞来源从而参与组织缺损修复，是目前体内干细胞移植最为常用的方式之一。由于支架材料是组织工程的关键要素之一，所以细胞膜片与支架材料是否有着良好的生物相容性是其能否成功应用于组织缺损修复的前提。本实验所采用的支架材HA-TCP已被大量动物和临床实验证明具有良好的生物相容性和骨传导性、且无过敏等不良反应。所以本实验将体外诱导的BMMSCs细胞膜片与支架材料相复合并植入颌骨缺损模型处用以评价BMMSCs膜片参与骨组织再生的能力。体内实验表明，转染let-7amimic BMMSCs细胞膜片与HA-TCP复合物在大鼠颌骨缺损处植入后较转染let-7ainhibitor或NC后可形成更多的骨组织。后1周、4周及6周，Micro-CT 扫描结果显示术后1周四组均几乎无新骨质形成，缺损区域仍呈现较为完整的骨缺损形态。这进行了移植物术后并未见移植物是由于在1周时移植物与术区并未形成紧密结合，而仅有纤维状物质粘连，在解剖过程中被去除；术后4周Micro-CT扫描结果显示，mi组骨修复已基本完成，in 和nc组硬组织有部分形成，但组间并无显着差异，而control组缺损修复形成最少，缺损边缘清晰可见。证明在术后4周已经有移植物已经开始形成修复，组间差异也证实let-7a对于BMMSCs的体内颌骨缺损修复具有正向调节作用；术后6w CT所示mi修复效果最佳，缺损几乎完成，nc 其次，表面还可见少量崎岖不平，in可见部分修复，但是缺损边缘仍清晰，control组形成骨质最少。术后6w的缺损区域骨密度(BMD)和骨小梁厚度(Tb.Th)定量分析可见mi、nc、in和 control组依次下降，与之前结果相符合。术后4周及6周的HE染色结果显示mi组骨缺损区域有较多新骨形成，in于nc组也有少量新骨形成，但mi较nc和in组所形成的骨组织结构更为均匀、与正常骨组织接近，骨量也更为丰富。control组形成的骨组织较少，与micro-CT的结果相一致。本实验系列结果为骨髓间充质干细胞细胞膜片的临床应用修复骨缺损的修复应用提供了一定的实验依据和理论基础。本部分实验的micro-ct和HE染色结果均表明转染let-7a mimic 后体内原位修复颌骨缺损效果优于其他组，术后4周已经有移植物已经开始形成修复，组间差异也证实let-7a对于BMMSCs的体内颌骨缺损修复具有正向调节作用，术后6周mimic组修复基本完成。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学口腔附属医院

<120> 一种转染miRNA的细胞膜片及其应用

<130> 2021/5/27

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

acuccaucau ccaacauauc aa 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacuauacaa ccuacuaccu ca 22

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

caguacuuuu guguaguaca a 21

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtgtatcata cagtataatg aaactac 27

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aacagtgcag ttagttct 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcccatcct cctgaccac 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcgtaaacc gcttccctc 19

Claims

1.一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：其由骨髓间充质干细胞形成；其细胞中的MicroRNA let-7a的含量上调。

2.根据权利要求1所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：其转染有let-7amimic，let-7a mimic的正义链的序列如SEQ ID NO.2所示，反义链的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求2所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞为P3-P5代骨髓间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：其由如下方法制备：接种并使用完全培养基培养骨髓间充质干细胞，待细胞密度达到70-80％之后，将完全培养基更换为膜片诱导液培养7天，获得细胞膜片；然后将膜片诱导液更换为含有10％FBS的α-MEM培养基；再培养一天后，使用let-7a mimic转染骨髓间充质干细胞；完成转染后，对骨髓间充质干细胞进行成骨诱导，获得转染miRNA的细胞膜片。

5.根据权利要求4所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：使用let-7a mimic转染骨髓间充质干细胞的方法为：在含有10％FBS的α-MEM培养基中加入let-7a mimic和Lipofectamine 2000，let-7a mimic的终浓度为50nM，转染时长为4-6h；完成转染后，将培养基再次更换为含有10％FBS的α-MEM培养基。

6.根据权利要求5所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：所述骨髓间充质干细胞的接种量3×10⁵个/孔。

7.根据权利要求6所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：所述完全培养基为用α-MEM配制的含10％的FBS、1％的青链霉素双抗的培养基，所述膜片诱导液为含50μg/mL维生素C的完全培养基。

8.根据权利要求7所述的一种转染miRNA的细胞膜片，其特征在于：所述成骨诱导的时机为完成转染后24h。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的一种转染miRNA的细胞膜片在制备颌骨缺损修复材料中的应用。

10.根据权利要求9所述的一种转染miRNA的细胞膜片在制备颌骨缺损修复材料中的应用，其特征在于：使用三层转染miRNA的细胞膜片包裹羟基磷灰石-磷酸三钙，获得移植物。