CN113413489B

CN113413489B - 一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统

Info

Publication number: CN113413489B
Application number: CN202110697597.XA
Authority: CN
Inventors: 杨德琴; 于洋; 杨诗瑶
Original assignee: Stomatological Hospital of Chongqing Medical University
Current assignee: Stomatological Hospital of Chongqing Medical University
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113413489A

Abstract

本发明涉及骨缺损修复技术领域，具体涉及一种含有Let‑7a的牙周缺损修复系统。包括第三细胞聚合体和包裹在第三细胞聚合体中的羟基磷灰石‑β磷酸三钙；第三细胞聚合体中转染有let‑7a mimic；let‑7a mimic为双链RNA，let‑7a mimic的正义链的序列如SEQ ID NO.2所示。本方案可以解决使用牙周膜干细胞修复骨缺损的效果不佳的技术问题。本方案使用Let‑7a调控牙周膜干细胞的成骨分化能力，结合并牙周膜干细胞聚合体形成本方案的牙周缺损修复系统，对牙周缺损的快速有效的修复提供了一条可行的途径。

Description

一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统

技术领域

本发明涉及骨缺损修复技术领域，具体涉及一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统。

背景技术

牙周炎是一种影响牙齿支持组织的常见的炎症性疾病。现在临床上主要采用的治疗方法有菌斑控制(包括龈上洁治和龈下刮治)和牙周翻瓣术，可以阻止牙周支持组织的进一步丧失，却不能使缺失的组织获得良好的再生；而再生性手术的兴起，为牙周治疗带来了新的希望，包括引导组织再生术，牙周植骨术，直接向牙根表面输送生物活性多肽生长因子，包括血小板衍生生长因子(PDGF)和胰岛素样生长因子-i(IGF-I)，骨形态发生蛋白(BMPs)等，但这些再生性手术适应范围狭窄、疗效不稳定且可预见性差。

干细胞具有自我更新与分化能力，还有免疫调节能力，且已有研究认为干细胞是再生医学的关键因素，在牙周治疗的背景下，一种潜在的牙周再生组织工程方法是将干细胞植入预制的三维结构支架中，然后将其植入缺损部位，其中最关键的因素就是支架的选择和最佳的种子细胞群。而从牙周膜分离的牙周膜干细胞(PDLSCs)，不仅具有干细胞特征(包括自我更新，多能性和免疫调节特性)，而且它们还具有制造三维(3D)牙周膜组织的独特潜力，使其成为牙周再生组织工程细胞的首选。但是，直接将牙周膜干细胞作为种子细胞植入支架上，细胞移植的植活率较低，不利于缺损骨组织或者牙周膜组织的组织修复进程。亟需研发一种能够提升牙周膜干细胞与支架间生物相容性的、并能提高牙周膜干细胞的活性以及成骨能力的方法，以提升周膜干细胞的骨缺损修复效果。

发明内容

本发明意在提供一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，以解决基于牙周膜干细胞的牙周缺损修复系统的修复效果有限的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，包括第三细胞聚合体和包裹在第三细胞聚合体中的羟基磷灰石-β磷酸三钙；所述第三细胞聚合体由如下方法制备：

S1：诱导牙周膜干细胞形成第一细胞聚合体；

S2：使用let-7a mimic转染第一细胞聚合体，获得第二细胞聚合体；所述所述let-7a mimic为双链RNA，let-7a mimic的正义链的序列如SEQ ID NO.2所示；

S3：对第二细胞聚合体进行成骨诱导，获得第三细胞聚合体。

采用上述技术方案的原理以及有益效果：在本方案中，将牙周膜干细胞诱导形成细胞聚合体，并在细胞聚合体中转染let-7a mimic并诱导牙周膜干细胞成骨分化，再将获得的第三细胞聚合体与支架材料羟基磷灰石-β磷酸三钙整合包裹。羟基磷灰石-β磷酸三钙对细胞聚合体形成支撑，细胞聚合体中的牙周膜干细胞可以有效进行成骨分化，进而实现对骨缺损的修复。

发明人首次将let-7a mimic转染到由牙周膜干细胞形成的细胞膜聚合体中，使得细胞聚合体中的MicroRNA let-7a表达量上调。利用转染后的细胞聚合体与组织工程材料形成复合骨修复材料(缺损修复材料)，实验证明，MicroRNA let-7a可促进牙周膜干细胞成骨，可显著加快模型动物的下颌骨修复进程。羟基磷灰石-β磷酸三钙为常用的支架材料，与种子细胞的生物相容性较好，且具有优良的机械性能。将种子细胞种植在支架材料上，有助于细胞增殖和分化成骨。

其中，MicroRNA(miRNA)是一类长度约为21～23bp的非编码RNA,可通过结合相应靶基因的3'UTR来调控其转录水平,具有高度的种间保守性,在细胞凋亡、自噬、增殖等生物学进程中起着重要功能。MicroRNA let-7a(mmu-let-7a，MIMAT0000521)是最先被鉴定的miRNA之一，是let-7家族的一员,且在由药物、感染和应激等因素引起的细胞凋亡中具有重要的抗凋亡作用，但在促进细胞成骨方面尚未报导。牙周膜干细胞(periodontal ligamentstem cells，PDLSCs)是存在于牙齿牙周组织中的一类可自我更新、增殖能力强及具有多向分化能力的成纤维细胞样干细胞。牙周膜干细胞具有多向分化的潜能，体外可分化为成脂细胞、成骨细胞样细胞、成牙骨质样细胞和神经前体细胞等，体内可分化为成牙骨质样和牙周膜样组织。

进一步，所述牙周膜干细胞由如下方法获取：含有5％双抗的PBS溶液清洗前磨牙；从前磨牙中取牙周膜，然后使用胶原酶消化所述牙周膜；取消化后的牙周膜组织接种于培养瓶中，使用含20％FBS和1％青链霉素双抗的α-MEM培养基培养消化后的牙周膜组织，获得原代的牙周膜干细胞。牙周膜干细胞从组织中的分离培养过程，需要克服很多困难。口腔组织环境复杂，组织之间除了牙冠的包被以外没有明显界限。故而在从组织提取PDLSCs时，需要避免组织之间的污染，才能得到牙周膜组织。另外，由于口腔组织中可以分离得到多种干细胞，他们在免疫表型，增殖和分化能力又大都相似。采用本方法可以提取获得纯度和表型符合要求的牙周膜干细胞。

进一步，所述第三细胞聚合体的层数为三层。多层第三细胞聚合体包裹羟基磷灰石-β磷酸三钙，以保证有足够量的具有成骨功能的细胞。

进一步，在S1中，接种并使用第一培养基培养牙周膜干细胞；待细胞密度达到70-80％时，将第一培养基更换为第二培养基，培养七天后获得第一细胞聚合体；所述第一培养基为含FBS和青链霉素双抗的α-MEM培养基；所述第二培养基为含FBS、青链霉素双抗和50μg/mL维生素C的α-MEM培养基。在维生素C的处理下，细胞基质表达增加，从而更容易形成细胞膜聚合体。发明人研究发现第二培养基的加入时机，对于后续转染成功以及细胞聚合体的质量的影响较大，只有在细胞生长融合至细胞密度为70-80％时加入第二培养基，形成的转染后的细胞聚合体才不会出现其与培养孔板脱离的情况，细胞聚合体不会漂浮并蜷缩成团。

进一步，所述第二培养基中的维生素C的含量为50μg/mL。上述浓度的维生素C可以有效促进细胞基质分泌，形成符合要求的细胞聚合体。

进一步，在S2中，将第二培养基更换为第三培养基；一天后，在第三培养基中加入let-7a mimic和Lipofectamine 2000，获得转染体系，经4-6h完成转染，获得第二细胞聚合体；所述第三培养基为含有FBS的α-MEM培养基。采用上述转染方法，可实现let-7a mimic的成功转染，提高细胞聚合体中的let-7a的含量，从而促进成骨以及在动物模型中的骨修复过程。

进一步，let-7a mimic在转染体系中的浓度为50nM。采用上述浓度，可以实现let-7a mimic的成功转染，使得细胞聚合体中let-7a的含量上升，发挥促进成骨的作用。

进一步，在S3中，将转染体系更换为第三培养基，培养24h后将第三培养基更换为成骨诱导培养基，成骨诱导七天，获得第三细胞聚合体。在转染let-7a mimic之后，对细胞聚合体进行成骨诱导，促进细胞的成骨分化，为后续动物模型中体内成骨创造条件。

进一步，所述牙周膜干细胞为P3代牙周膜干细胞。P3代牙周膜干细胞具有较好的增殖活性和分化能力，比较适合于将其诱导形成细胞聚合体，实现骨缺损修复。

进一步，在S1中，所述牙周膜干细胞的接种量为3×10⁵个/培养孔。采用上述的接种量，可以保证后续诱导形成形态、活性等符合要求的细胞聚合体。

附图说明

图1为本发明实施例1的PDLSCs表面标志物的流式检测结果图。

图2为本发明实施例1的PDLSCs克隆形成能力及增殖形成能力鉴定结果。

图3为本发明实施例1的PDLSCs成脂成骨分化结果。

图4为本发明实施例2的PDLSCs细胞聚合体形态学观察结果。

图5为本发明实施例2的转染后let-7a含量水平统计图。

图6为本发明实施例2的转染后成骨相关基因表达水平统计图。

图7为本发明实施例2的转染后成骨相关蛋白水平统计图。

图8为本发明实施例2的转染后ALP染色以及活性检测结果。

图9为本发明实施例3的缺损修复材料裸鼠皮下异位成骨效果。

图10为本发明实施例3的大鼠颌骨缺损修复的Micro-CT结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：牙周膜干细胞(PDLSCs)的分离和鉴定

PDLSCs的分离、培养与传代的过程如下：

收集因正畸需要而拔除的前磨牙，样本收集的纳入标准和排除标准如下：

纳入标准：12-18岁之间；身体健康无全身疾病；健康无龋；牙根发育完成。

排除标准：有严重全身疾病；存在龋坏或牙髓根尖周病变；已行根管治疗；牙根严重吸收者。

将牙齿泡到含2％双抗的PBS溶液中，冰盒低温保存，保存时间不超过2小时，需进行下一步操作。将离体牙转移至超净台，将离体牙齿加入新的含有5％双抗的PBS溶液，拧紧离心管盖，手动上下晃动100次左右，更换新的5％双抗的PBS溶液，重复清洗。重复清洗三次后，将离心管中的牙齿倒入装有5％双抗的PBS中，用镊子夹起牙冠，并用装有5％双抗的PBS的注射器冲洗牙根部，冲洗至牙根上无明显血迹，重复操作三次。

准备200μl(使用200-300μl均可获得理想效果)的3mg/ml胶原酶于1.5ml EP管中，镊子夹取牙齿，左手固定牙齿牙冠，右手用手术刀刀片刮取牙根中1/3牙周膜转移至装有胶原酶1.5ml EP管中，观察牙齿牙周膜情况，2-3颗牙的牙周膜放于一个离心管中，EP管用封口胶封好后，将EP管放到37℃水浴锅中，每隔5min振荡一次,最后牙周膜消化成絮状。加入400μlα-MEM培养基(使用400-600μl均可获得理想效果)，1200rpm离心5min。离心好后，去除上清，巴氏管吸出组织，转移到培养瓶的瓶底，用巴氏管将组织分散开。将培养瓶翻转后正面加入培养基，加入3ml含20％胎牛血清(FBS)，1％双抗(青链霉素双抗)的α-MEM培养基，放入培养箱，6-8h后观察贴壁情况后，将培养瓶翻转，使得培养基充分覆盖培养瓶底部。5天后观察细胞是否爬出，获得原代(P0代)的牙周膜干细胞(periodontal ligament stemcells，PDLSCs)。按照现有技术的常规方法对原代的PDLSCs进行传代培养，取P3代PDLSCs进行后续的细胞聚合体培养。

对获得的PDLSCs进行表面标志物鉴定，流式细胞仪检测结果参见图1，流式细胞实验检测了表面标志物CD31、CD45-、CD29和CD90+，说明了获得细胞符合PDLSCs细胞的特点。

将P3代PDLSCs按常规方法消化、重悬并计数；将800个单细胞接种于直径为10cm的无菌培养皿中，一共接种3个培养皿；培养14天后，弃培养基，用无菌PBS洗两次，然后用4％多聚甲醛固定细胞30min，弃去固定液，用PBS清洗2次、晾干；用1％结晶紫染液染色20min后弃染色液，用PBS冲洗干净；体式显微镜下观察并拍照，克隆形成为超过50个细胞的集落。然后进行CCK-8检测，获得生长曲线。利用结晶紫对PDLSCs进行染色，体式显微镜下观察可见该细胞可形成克隆集落，说明PDLSCs有增殖能力(参见图2，A为大体观PDLSCs的克隆集落形成；B为4×体式显微镜下单个克隆集落)。CCK-8增殖曲线显示(参见图2C)PDLSCs有增殖能力。

对PDLSCs细胞进行成脂和成骨分化实验，实验结果参见图3，成骨分化可见矿化结节出现，成脂分化可见胞质内脂滴出现。

实施例2：PDLSCs细胞聚合体的制备以及let-7a转染

取P3代PDLSCs细胞常规消化、中和、计数，以3×10⁵个接种于六孔板中。使用完全培养基培养细胞，待细胞生长融合至细胞密度为80％时加入诱导液，每3天更换诱导液。使用诱导液诱导培养细胞7天(培养箱中37℃常规培养)，获得PDLSCs细胞聚合体，获得的PDLSCs细胞聚合体详见图4。

通过mirbase数据库获得mmu-let-7a(MIMAT0000521)成熟序列，let-7a mimics、inhibitor、negative control根据let-7a成熟序列由RiboBio公司设计，序列情况如下：

mmu-let-7a成熟序列：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’(SEQ ID NO.1)

let-7a mimic正义链：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’(SEQ ID NO.2)

let-7a mimic反义链：5’-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’(SEQ ID NO.3)

let-7a inhibitor：5’-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’(SEQ ID NO.4)

negative control：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO.5)

选择了用Lipofectamine 2000(Invitrogen)分别转染let-7a mimic、let-7ainhibitor、let-7a Negative Control进入P3代PDLSCs，检测了转染效率。图5为转染后各组PDLSCs细胞聚合体内let-7a含量(***p<0.001)，可见转染let-7a mimic之后，细胞聚合体中let-7a含量显著上升。转染完成之后，针对转染let-7a mimic的细胞，检测各相关基因的表达情况，包括RUNX2、OSX、ALP、COL-1,、fibronection和integrinb1，以验证let-7amimic促进了PDLSCs的成骨分化作用。qPCR实验结果详见图6，可见转染let-7a mimic可以提高成骨相关基因的表达量。Western Blot结果详见图7，可见let-7a mimic可以提高成骨相关基因的蛋白表达量。ALP染色以及活性检测结果如图8所示，说明let-7a mimic处理后成骨潜力更强。

实施例3：PDLSCs细胞聚合体的体内修复颌骨缺损实验

转染let-7a mimic的PDLSCs细胞聚合体的制备具体过程如下：

使用到的培养基包括如下几种：

完全培养基(第一培养基)：用α-MEM配置含10％的FBS、1％的双抗(青链霉素双抗)的培养基；诱导液(第二培养基)：50μg/mL维生素C的完全培养基；不含抗生素的培养基(第三培养基)：用α-MEM配置含10％的FBS的培养基。

聚合体诱导(获得第一细胞聚合体)：取P3代PDLSCs细胞常规消化、中和、计数，以3×10⁵个接种于六孔板中。使用完全培养基(第一培养基)培养细胞，待细胞生长融合至细胞密度为80％时加入第二培养基(将第一培养基更换为第二培养基)，每3天更换第二培养基。使用第二培养基诱导培养细胞7天(培养箱中37℃常规培养)，获得PDLSCs细胞聚合体。

转染(获得第二细胞聚合体)：使用双链的let-7a mimic转染PDLSCs细胞聚合体，具体过程如下：

使用第二培养基进行细胞聚合体诱导完成后(即转染前一天)，将第二培养基更换成为2.5mL(每孔)的第三培养基。使用第三培养基孵育细胞1天后(培养箱中37℃常规培养)，在2.5mL的第三培养基中加入let-7a mimic和Lipofectamine 2000(Invitrogen)，具体加入方式为：用250μLα-MEM稀释7.5μL let-7a mimic(储液浓度20μM)，获得let-7amimic溶液，使用前轻轻混匀Lipofectamine 2000，5μL Lipofectamine 2000在250μLα-MEM中稀释，室温孵育5min(25min内进行下一步操作)，获得lipo溶液。将全部let-7a mimic溶液和全部lipo溶液混合(使总体积为500μL)，轻轻混匀，室温静置20min，获得混合液。然后在每孔中加入500μL混合液，获得转染体系，在该转染体系中let-7a mimic的浓度为50nM。4h-6h后更换培养基(转染过程将细胞置于培养箱中37℃常规培养)，将含有let-7a mimic的转染体系更换为第三培养基，培养箱中37℃常规培养。

成骨诱导(获得第三细胞聚合体)：转染后24h进行成骨诱导，将第三培养基更换为成骨诱导培养基，每孔加入2ml成骨诱导培养基(为现有技术中常规培养基，OriCell^TMSD人鼠骨髓间质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒，赛业)。成骨诱导7天(其间每3天换液，培养箱中37℃常规培养)，获得转染有let-7a mimic的成骨诱导后的PDLSCs细胞聚合体。

聚合体诱导时，诱导液的加入时机对于后续转染成功以及细胞聚合体的质量的影响较大，只有在细胞生长融合至细胞密度为70-80％时加入诱导液，形成的转染后的细胞聚合体才不会出现其与培养孔板脱离的情况，细胞聚合体不会漂浮并蜷缩成团。在本方案中细胞聚合体诱导之后还要经历转染和成骨诱导的复杂过程，上述过程耗时较长，这就会影响细胞聚合体的生长状态，容易出现细胞聚合体质量不佳，不容易收集和不利于后续的其与羟基磷灰石-β磷酸三钙结合的过程。发明人研究了加入诱导液的时机，分别尝试了在细胞密度为60-90％的时候进行细胞聚合体诱导、转染和成骨诱导，实验结果参见表1。由实验结果可知，在细胞密度为60-90％的时候加入诱导液对保证细胞聚合体的质量非常关键。

表1：诱导时细胞密度与转染和成骨诱导后的细胞聚合体的状态的关系研究结果

转染有let-7a inhibitor、let-7a Negative Control的PDLSCs细胞聚合体也按照上述过程制备。将转染后的各组PDLSCs细胞聚合体(let-7a mimic、let-7a inhibitor、let-7a Negative Control，即使用第三细胞聚合体)与羟基磷灰石-β磷酸三钙(HA-TCP，颗粒状)材料结合后的复合物(即缺损修复材料)分别移植入裸鼠(皮下移植)以及SD大鼠的颌骨缺损内。即使用各组的三层PDLSCs细胞聚合体包裹羟基磷灰石-β磷酸三钙(HA-TCP)形成缺损修复材料。

缺损修复材料的皮下移植实验结果如图9所示，实验结果显示MI组(转染let-7amimic的PDLSCs细胞聚合体组)出现了较为大量的骨细胞以及新生骨组织；IN组(转染let-7a inhibitor的PDLSCs细胞聚合体组)几乎没有骨细胞以及新生骨组织出现；NC组(转染let-7a NegativeControl的PDLSCs细胞聚合体组)有少量的骨细胞以及新生骨组织出现。缺损修复材料体内修复颌骨缺损移植实验结果如图10所示，实验结果显示mimic组细胞聚合体形成骨量较多。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

SEQUENCE LISTING

<110>重庆医科大学口腔附属医院

<120>一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统

<130>2021-6-10

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>22

<212>RNA

<213>Mus musculus

<400>1

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210>2

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<400>2

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210>3

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<400>3

aacuauacaa ccuacuaccu ca 22

<210>4

<211>22

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

aacuauacaa ccuacuaccu ca 22

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆医科大学口腔附属医院

<120> 一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统

<130> 2021-6-10

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Mus musculus

<400> 1

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

aacuauacaa ccuacuaccu ca 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacuauacaa ccuacuaccu ca 22

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

caguacuuuu guguaguaca a 21

Claims

1.一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：包括第三细胞聚合体和包裹在第三细胞聚合体中的羟基磷灰石-β磷酸三钙；所述第三细胞聚合体由如下方法制备：

S1：诱导牙周膜干细胞形成第一细胞聚合体；

S2：使用let-7a mimic转染第一细胞聚合体，获得第二细胞聚合体；所述let-7a mimic为双链RNA，let-7a mimic的正义链的序列如SEQ ID NO.2所示；

S3：对第二细胞聚合体进行成骨诱导，获得第三细胞聚合体；

在S1中，接种并使用第一培养基培养牙周膜干细胞；待细胞密度达到70-80％时，将第一培养基更换为第二培养基，培养获得第一细胞聚合体。

2.根据权利要求1所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：所述第三细胞聚合体的层数为三层。

3.根据权利要求1所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：所述牙周膜干细胞由如下方法获取：含有5％双抗的PBS溶液清洗前磨牙；从前磨牙中取牙周膜，然后使用胶原酶消化所述牙周膜；取消化后的牙周膜组织接种于培养瓶中，使用含20％FBS和1％青链霉素双抗的α-MEM培养基培养消化后的牙周膜组织，获得原代的牙周膜干细胞。

4.根据权利要求1所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：在S1中，所述第一培养基为含FBS和青链霉素双抗的α-MEM培养基；所述第二培养基为含FBS、青链霉素双抗和维生素C的α-MEM培养基。

5.根据权利要求4所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：所述第二培养基中的维生素C的含量为50μg/mL。

6.根据权利要求5所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：在S2中，将第二培养基更换为第三培养基；一天后，在第三培养基中加入let-7a mimic和Lipofectamine 2000，获得转染体系，经4-6h完成转染，获得第二细胞聚合体；所述第三培养基为含有FBS的α-MEM培养基。

7.根据权利要求6所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：let-7amimic在转染体系中的浓度为50nM。

8.根据权利要求7所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：在S3中，将转染体系更换为第三培养基，培养24h后将第三培养基更换为成骨诱导培养基，成骨诱导七天，获得第三细胞聚合体。

9.根据权利要求8所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：所述牙周膜干细胞为P3代牙周膜干细胞。

10.根据权利要求9所述的一种含有Let-7a的牙周缺损修复系统，其特征在于：在S1中，所述牙周膜干细胞的接种量为3×10⁵个/培养孔。