CN105264068A - Charcot-Marie-Tooth病的治疗剂的筛选方法以及为此所使用的自分化运动神经元 - Google Patents
Charcot-Marie-Tooth病的治疗剂的筛选方法以及为此所使用的自分化运动神经元 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及诱导多能干细胞和通过使用由所述诱导多能干细胞分化而来的运动神经元筛选用于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)的治疗剂的方法。具体而言,本发明使得如下方面成为可能:从源自CMT患者的人成纤维细胞制备诱导多能干细胞;通过使用由所述诱导多能干细胞分化而来的运动神经元,经由筛选CMT治疗剂候选物质来确定药物的有效性;以及,经由用于制备所述诱导多能干细胞的方法来制备自体运动神经元,从而用于筛选患者个性化治疗药物和患者个性化治疗。
Description
技术领域
本发明涉及制备诱导多能干细胞的方法以及使用由所述诱导多能干细胞分化而来的自体细胞筛选Charcot-Marie-Tooth病的治疗剂的方法。
背景技术
Charcot-Marie-Tooth病(CMT)或遗传性运动感觉神经病变(hereditarymotorandsensoryneuropathy)是由特定基因突变引起的运动神经元和感觉神经元的缺陷或损坏。遗传性周围神经病变可分为三组,即,遗传性运动感觉神经病变(HMSN)、遗传性运动神经病变(HMN)和遗传性感觉神经病变(HSN)。因此,遗传性运动感觉神经病变是其中之一。由于该病是在1886年由Charcot、Marie和Tooth首次发现的,所以将该病用他们的名字命名(即,Charcot-Marie-Tooth病),或者用他们名字的首字母简单地称为CMT。在20世纪后期,Dyck等将CMT叫做另一个名字,“遗传性运动感觉神经病变(HMSN)”,此后该病如今被叫做CMT或HMSN。根据遗传模式,Charcot-Marie-Tooth病被分为许多组,即常染色体显性遗传的I型和II型、常染色体隐性遗传的IV型和X染色体连锁遗传的CMTX型。根据基因突变的报道顺序,将I型成员命名为1A、1B、1C等。
Charcot-Marie-Tooth病的发病率是1/2500,这在罕见遗传性疾病中相当高。Charcot-Marie-Tooth病患者表现出此类症状:他们手/脚的肌肉变得越来越无力,而且他们的手和脚经常是变形的。症状的程度根据基因突变的类型而改变。一些患者表现为几乎接近正常人的轻度症状,一些患者显示出严重症状,以致于他们需要行走方面的帮助或者要坐轮椅。
CMT的传统治疗方法限于康复、辅助技术设备和疼痛控制。但是,CMT相关基因的鉴定使得遗传咨询和家庭计划成为可能,在此基础上,以科学为基础的临床护理正在推进中。尚未建立可改变遗传性运动感觉神经病变的进展过程的实际治疗或帮助,但最近的动物测试确证了这一可能性。同时,仍在进行关于如下的研究:基因疗法、细胞替代疗法、轴突运输相关疗法、线粒体功能矫正、基于免疫系统的疗法和整合素疗法。
随着过去几十年在罕见疾病研究中的惊人进步,在该疾病的治疗(从诊断到治疗,包括实践指南)方面取得了量和质的变化。特别是,分子生物学的进步使得诊断方法发生变化,并因此建立了由个体化代表的靶向疗法或考虑到罕见疾病的不同分子生物学起源的定制疗法(tailoredtherapy)。另外,遗传药理学的发展提供了如下构想:考虑患者自身的遗传特征,可区别对待甚至具有相同疾病或服用相同药物的患者。因此,我们可将现在称为“分子遗传学的时代”。特别是,就各种治疗选择和预后(包括旨在用药物疗法和额外治疗减轻症状的症状性治疗,以及旨在减轻和控制副作用与并发症的支持性疗法)而言,在罕见疾病中CMT是公开最多的。CMT由基因功能障碍引起,所以症状是持续的并且不能完全治愈。因此,CMT的常规治疗在于减轻症状和延迟进展,以提高生活质量。已通过遗传和分子生物学研究不断地尝试生物学治疗,并报道了一些有前途的结果。然而,该疾病的特征导致发病罕见,并且推进该研究的兴趣也低,因此合适的治疗方法尚未建立,并且,能够诊断并设计用于此类罕见疾病的治疗的医生和研究人员仍短缺(ActaPaediatri,2012)。
根据以前的报道,在给予孕酮受体拮抗剂“奥那司酮(onapristone)”(已知的一种CMT治疗药物)的转基因小鼠中,Pmp22mRNA的过表达被抑制,遗传性运动感觉神经病变的表型得到改善,也没有副作用。抗坏血酸(对外周神经的髓鞘形成(myelination)而言至关重要的物质)在髓鞘再生(remyelination)中起作用,并改善了CMT1A转基因小鼠中遗传性运动感觉神经病变的表型。还报道了神经营养蛋白-3(NT-3)使有髓神经纤维增加,由此使感觉相关的症状得到改善。然而,上述治疗物质限于1型CMT治疗。CMT由几十种不同的基因突变引起。因此,为了治疗具有多样性的此类CMT,迫切需要建立各基因缺陷的定制治疗方法以及评估新建立的治疗方法的方法。在CMT患者中,对药物的应答大大不同,因此药物选择由于CMT患者的症状均不同而受到限制。
获得自患者皮肤组织的干细胞具有该患者的基因突变的特征。因此,当所述干细胞分化为神经元时,可获得具有该患者所有疾病特征的神经元,预计这对药物选择或患者特异性治疗有用。
Charcot-Marie-Tooth病(CMT)(代表性遗传性周围神经病变)是单基因紊乱。可通过源自患者皮肤细胞的诱导多能干细胞的分化来构建CMT疾病模型。可通过使用能够重现该疾病特征的此类疾病模型来制备新的治疗剂。将源自患有脊髓性肌萎缩、家族性自主神经机能异常(dysautonomia)或LEOPARD综合征的患者的诱导多能干细胞用于在体外重现这些患者的异常和症状。当用测试药物处理培养的细胞时,症状得到改善(EbertAD.等,Nature,2009,457:277-280;LeeG.等,Nature,2009,461:402-406;Cavajal-VergaraX.等,Nature,2010,465:808-812;HannaJ.等,Science,2007,318:1920-1923)。因此,诱导多能干细胞和由该诱导多能干细胞分化而来的自体细胞可用于该途径,以给患有没有合适的治愈手段(cure)的这些疾病的患者开发出患者特异性的新药物,这表明它们可对患有不可治愈的罕见疾病的患者有帮助。
在建立用于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者的患者特异性治疗方法的研究过程中,本发明人首次从源自CMT患者的人成纤维细胞制备出诱导多能干细胞。然后,本发明人进一步确认了,使用由所述诱导多能干细胞分化而来的运动神经元进行的CMT治疗剂候选物的筛选方法可对该候选物的药学效果的确认有用;并且,本发明人进一步通过本发明的方法构建出自体运动神经元,该自体运动神经元可用于患者特异性药物的筛选,并因此可用于患者特异性治疗,从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供用于从体细胞制备运动神经元的方法,所述体细胞来源于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者。
本发明的另一目的是提供CMT治疗剂候选物的筛选方法。
本发明的再一目的是提供由通过本发明的方法制备得到的诱导多能干细胞分化而来的CMT患者自体运动神经元。
本发明的又一目的是提供使用通过本发明的方法制备得到的CMT患者自体运动神经元进行的患者特异性CMT类型依赖性治疗剂(CMTtypedependenttherapeuticagent)的筛选方法。
技术方案
为了实现上述目的,本发明提供了用于从体细胞制备运动神经元的方法,所述体细胞来源于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者。
本发明还提供了CMT治疗剂候选物的筛选方法。
本发明进一步提供了由通过本发明的方法制备得到的诱导多能干细胞分化而来的CMT患者自体运动神经元。
另外,本发明提供了使用通过本发明的方法制备得到的CMT患者自体运动神经元进行的患者特异性CMT类型依赖性治疗剂的筛选方法。
有益效果
本发明提供了用于从人成纤维细胞制备诱导多能干细胞的方法,所述人成纤维细胞来源于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者;通过使用由所述诱导多能干细胞分化而来的运动神经元进行的CMT治疗剂候选物的筛选方法,该方法可有效确认这些候选物的药学效果;以及通过用于制备诱导多能干细胞的方法制备的CMT患者自体运动神经元。可将所述自体运动神经元有效用于患者特异性药物的筛选以及患者特异性治疗。
附图说明
参考附图来更好地理解本发明的优选实施方式的应用,其中:
图1为说明本发明中使用的人成纤维细胞的形状的图。
图2为说明从源自CMT的诱导多能干细胞(iPSC)分化出运动神经元的方法的图。
图3为说明源自CMT的诱导多能干细胞(CMT2F-iPSC)中HSP27(致CMT基因)的基因突变的图。
图4为说明CMT2F-iPSC集落的形状的图。从培养开始起20天拍摄这张照片,细胞密集聚集在诱导多能干细胞集落中。
图5为说明CMT2F-iPSC内源多能性基因的表达的图。
图6为说明CMT2F-iPSC干性(stemness)标志物蛋白的表达的图。
图7为说明由CMT2F-iPSC诱导而来的胚状体(EB)的体外分化潜能的图,其中,确认了外胚层标志物巢蛋白、中胚层标志物平滑肌肌动蛋白(SMA)和内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)的表达。
图8为说明通过观测体内CMT2F-iPSC畸胎瘤形成所确证的分化潜能的图。
图9为说明由CMT2F患者分化而来的CMT2F-MN的标志物蛋白的表达以及神经肌肉接头(neuromuscularjunction)形成的一组图;
图9a为说明CMT2F-MN标志物蛋白(HB9、ISL1、SMI32、Tuj1、MAP2突触蛋白和ChAT)的表达的图;
图9b为说明CMT2F-MN中SMI32和MPA2阳性蛋白的比例的图;以及
图9c为说明CMT2F-MN的轴突长度的图。
图10为说明CMT2F-MN的神经肌肉接头形成的图。
图11为说明作为CMT指标(index)的乙酰α-微管蛋白的表达的一组图,以在CMT2F-MN中调查tubastatinA处理后的轴突运输效率;
图11a为说明CMT2F-MN中α-微管蛋白的乙酰化的图;
图11b为说明蛋白质印迹结果的图,进行所述蛋白质印迹以确认tubastatinA处理后的CMT2F-MN中α-微管蛋白的乙酰化;以及
图11c为说明tubastatinA处理后的CMT2F-MN中α-微管蛋白乙酰化的量化的图。
图12为说明作为CMT指标的移动线粒体(movingmitochondria)的一组图,以在CMT2F-MN中调查tubastatinA处理后的轴突运输效率;
图12a为说明通过CMT2F-MN中引入的mito-RED2观测到的运动神经元中的轴突线粒体的图;
图12b为说明tubastatinA处理后的CMT2F-MN中的线粒体移动速度的比较的图;以及
图12c为说明tubastatinA处理后的CMT2F-MN中的线粒体迁移(以%示出)的图。
图13为说明用于调查CMT2F-MN的运动神经元中的轴突运输效率的微流体培养(microfluidicculture)的图。
具体实施方式
在下文中,对本发明进行详细说明。
本发明提供了用于从体细胞制备运动神经元的方法,所述体细胞来源于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者,所述方法包括以下步骤:
1)从Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者获得人的体细胞;
2)用引入有OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC转基因的载体转染步骤1)的来源于CMT患者的所述人的体细胞,随后进行培养以诱导出诱导多能干细胞(iPSC);以及
3)通过在视黄酸和音猬因子(sonichedgehog)的存在下将步骤2)中制备的所述诱导多能干细胞进行培养,诱导出运动神经元。
在步骤1)中,Charcot-Marie-Tooth病(CMT)可为I型CMT、II型CMT、IV型CMT或CMTX,本文中优选CMT2F。CMT2F的特征为如下突变:其中,热休克蛋白(HSP)27第404位和第545位的胞嘧啶被置换成胸腺嘧啶。本文中的突变蛋白的特征为:野生型HSP27第135位的氨基酸“丝氨酸”被置换为苯丙氨酸,或第182位的氨基酸“脯氨酸”被置换为亮氨酸。
在步骤1)中,人的体细胞优选为成纤维细胞,但不总限于此。
步骤2)中的载体可为使用仙台病毒、逆转录病毒和慢病毒的病毒载体,或可为非病毒载体,本文中特别优选使用仙台病毒。
为了在转染后获得诱导多能干细胞,用于人的体细胞培养的培养基可为用于培养的任何常规培养基。例如,Eagle’sMEM(Eagle最小必需培养基,Eagle,H.Science130:432(1959))、α-MEM(Stanner,C.P.等,Nat.NewBiol.,230:52(1971))、Iscove’sMEM(Iscove,N.等,J.Exp.Med.,147:923(1978))、199培养基(Morgan等,Proc.Soc.Exp.Bio.Med.,73:1(1950))、CMRL1066、RPMI1640(Moore等,J.Amer.Med.Assoc.,199:519(1967))、F12(Ham,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,53:288(1965))、F10(Ham,R.G.,Exp.CellRes.,29:515(1963))、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基,Dulbecco,R.等,Virology8:396(1959))、DMEM/F12混合物(Barnes,D.等,Anal.Biochem.102:255(1980))、Way-mouth’sMB752/1(Waymouth,C.J.,Natl.CancerInst.22:1003(1959))、McCoy’s5A(McCoy,T.A.等,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.100:115(1959))以及MCDB系列(Ham,R.G.等,InVitro14:11(1978)),但不总限于此。
本发明中的诱导多能干细胞(iPSC)为由已分化的细胞的人工去分化获得的具有多能性的细胞,也被称为“去分化的干细胞”或“诱导多能干细胞”。所述诱导多能干细胞具有与胚胎干细胞的特征几乎相同的特征。具体而言,细胞形状类似,基因和蛋白的表达模式相似。对于在体外确认多能性标志物蛋白的表达以及在体内显示畸胎瘤形成,具有多能性的所述iPSC也是适合的。特别是,通过将iPSC引入到小鼠囊胚中,能够产生嵌合体小鼠,并且能够实现种系传递(germlinetransmission)。本发明的iPSC包括所有的人、猴、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠和兔来源的iPSC,但本文中优选人来源的iPSC,最优选CMT患者来源的iPSC。
本发明中的转基因表示通过自然迁移或遗传工程技术从一个有机体转移到另一有机体中的基因或遗传物质。具体而言,一个实例为包含分离自一个有机体,然后被引入到另一有机体中的基因序列的DNA片段。将用于转基因的基因序列引入到载体中,所述基因序列例举OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC。该转基因是使已分化的细胞去分化成诱导多能干细胞所需的。本发明中的术语“去分化”表示能够使已分化的细胞逆转回未分化状态,从而诱导细胞分化成另一组织的表观遗传退化过程(epigeneticretrogressionprocess),也称为重编程过程(reprogrammingprocess)。这个过程是基于基因组的表观遗传变化的可逆性。根据本发明的目的,所述去分化包括所有能够将表现出0%-100%分化潜能的分化细胞逆转回未分化状态的过程。例如,可包括能够将完全分化的细胞(显示出0%分化潜能)逆转回分化的、但仍具有1%分化潜能的细胞的过程。
在步骤3)之后,可优选包括将上述所制备的诱导多能干细胞分化成运动神经元的步骤,该步骤包括下面的子步骤(3-1)和子步骤(3-2),但不总限于此:
(3-1)将上述所制备的诱导多能干细胞进行培养以获得胚状体(EB),然后使所获得的EB分化成神经球;以及
(3-2)使上述所制备的神经球分化成运动神经元。
步骤4)的神经营养蛋白优选选自于由如下神经营养蛋白所组成的组:神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF),但不总限于此。
在本发明的优选实施方式中,本发明人通过使用4种转录因子(Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc),从获得自CMT2F患者(在HSP27基因中含有S135F突变或P182L突变)皮肤活检(skinbiopsy)的成纤维细胞制备出诱导多能干细胞(iPSC)和胚状体(参见图4)。所述iPSC保留了在CMT2F患者中确认的S135F突变或P182L突变(参见图3),并且还能够表达多能性标志物基因和蛋白,这表明所制备的iPSC和EB可被用作CMT疾病的多能干细胞模型(参见图5和图6)。还确认了由源自CMT2F患者的iPSC(CMT2F-iPSC)分化而来的EB在体外分化出了内胚层、中胚层和外胚层(参见图7),并在体内形成了畸胎瘤(参见图8)。
为了将CMT2F-iPSC用作周围神经病变模型,本发明人根据已知方法(AmorosoMW等,JNeurosci2013;33:574-586),将CMT2F-iPSC诱导分化成运动神经元(参见图2),然后通过确认运动神经元标志物蛋白的表达和神经肌肉接头的形成,对分化效率进行了调查(参见图9和图10)。
本发明的CMT来源的iPSC模型不仅包含与在CMT患者中发现的突变相同的突变,还具有多能性并且能够有效地经由神经球分化成运动神经元,因此,制备所述iPSC模型的该方法可有效地用于CMT的研究。
本发明还提供了用于预防和治疗Charcot-Marie-Tooth病的组合物的筛选方法,所述方法包括以下步骤:
1)在体外用CMT治疗物质候选物对通过本发明的方法制备的运动神经元进行处理;
2)测量在步骤1)中用所述治疗物质候选物处理的细胞中的CMT指标;以及
3)通过与对照进行比较,选择表现出增加或减少步骤2)中获得的CMT指标的候选物。
本发明还提供了患者特异性CMT类型依赖性治疗剂的筛选方法。
通过上述步骤1)-步骤2)和步骤(3-1)-步骤(3-2),可构建由诱导多能干细胞(从CMT患者细胞制备得到)分化而来的细胞。
本发明的由CMT来源的iPSC分化而来的运动神经元可用于CMT药物候选物的筛选。所述药物候选物包括组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)抑制剂曲古抑菌素(Trichostatin)、Tubacin和tubastatinA,但不总限于此。
为了测量药物候选物的细胞毒性,将这些候选物以不同浓度处理正常对照和CMT来源的神经元,然后确定不损害细胞存活的浓度。实施MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)测试来评价细胞存活率。
在用CMT药物候选物处理上述所制备的细胞后,对CMT指标进行测量,以调查这些药物候选物是否具有作为药物的可用性。所述CMT指标优选为轴突运输指标,特别是选自于由以下指标所组成的组中的一种或多种指标:乙酰α-微管蛋白、移动线粒体和动作电位振幅(电生理学指标),更优选乙酰α-微管蛋白或/和移动线粒体之一或这两者,但不总限于此。
本发明人确认了,在用CMT药物候选物处理的细胞中,乙酰α-微管蛋白的浓度增加,这表明所选择的候选物在治疗CMT中有效。此时,当相比未经候选物处理的细胞而言,乙酰α-微管蛋白水平的增加高于至少20%、优选高于至少30%、更优选高于至少35%时,认为该候选物在治疗CMT中有效。
当用CMT药物候选物处理的细胞中的移动线粒体和动作电位振幅恢复到正常对照神经元的水平时,认为该候选物在治疗CMT中有效。
此时,可通过本领域技术人员公知的各种方法实施对蛋白表达的定量。例如,可使用ELISA、蛋白质印迹或免疫细胞化学(ICC)。可通过RT-PCR(Sambrook等,MolecularCloning.ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborPress(2001))、Northern印迹(PeterB.Kaufman等,MolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,102-108,CRC出版)和使用cDNA微阵列的杂交(Sambrook等,MolecularCloning.ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborPress(2001))实施对基因表达的测量。
在步骤1)中,Charcot-Marie-Tooth病可为I型CMT、II型CMT、IV型CMT或CMTX,优选为CMT2F。CMT2F的特征为如下突变:其中,热休克蛋白(HSP)27第404位和第545位的胞嘧啶被置换为胸腺嘧啶。本文中的突变蛋白的特征为:野生型HSP27第135位的氨基酸“丝氨酸”被置换为苯丙氨酸,或者第182位的氨基酸“脯氨酸”被置换为亮氨酸。
在本发明的另一优选实施方式中,本发明人使用由CMT患者来源的iPSC分化而来的神经元作为CMT药物功效评价模型,来确认轴突运输系统缺陷(这是CMT2F的主要症状)中所涉及的微管蛋白轨道(microtubulintrack)的功能。为做到这一点,本发明人通过测量α-微管蛋白乙酰化的水平和移动线粒体,来调查CMT2F-MN的运动神经元中的轴突运输效率。结果,CMT2F-MN中α-微管蛋白乙酰化的水平相比正常对照WA09_MN中的水平而言有所下降(参见图11)。CMT2F-MN中的移动线粒体相比正常对照中的移动线粒体而言也有所减少(参见图12)。然而,当用组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)抑制剂“tubastatinA”处理CMT2F-MN后,α-微管蛋白乙酰化和移动线粒体的水平显著增加,二者均恢复至正常对照的正常水平(参见图11b、图11c、图12b和图12c)。
本发明的CMT患者来源的iPSC含有与作为CMT病因的突变相同的突变,同时能够经由神经球分化成自体运动神经元,并且也有利于在不直接将CMT药物候选物给予患者的情况下对药物处理后显示出的CMT指标的减少或增加进行确认,因此,它们使得展现出优异效果的患者特异性药物选择成为可能,同时有利于选择具有最少细胞毒性的药物。
如下列实施例中所示的,本发明的实用和目前优选的实施方式是说明性的。
然而,可以理解的是,在考虑本公开的基础上,本领域技术人员可在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例
实施例1:通过皮肤活检分离CMT患者来源的细胞
皮肤活检是用于皮肤损伤(skinlesion)病理诊断的安全的、低侵入的且经济的方法。在伦理审查委员会(institutionalreviewboard)的批准下,本发明人访问了在HSP27基因中展现出S135F或P182L突变的CMT2F患者以及正常志愿者(EwhaWomansUniversityMokdongHospital,韩国)。为了实施皮肤活检,对正常志愿者和CMT患者给予局部麻醉,并通过使用具有直径为4mm的圆刀(roundblade)的钻孔器(punch)来实施皮肤活检。将通过皮肤活检获得的皮肤组织加载于补充有以下物质的DMEM中:10mg/mlIV型胶原酶(Invitrogen,USA)、50U/ml分散酶(Roche)和0.05%胰蛋白酶/EDTA,接着在37℃下反应40分钟。通过尼龙细胞过滤器(可通过大小高达70μm的颗粒)将得到的细胞悬浮液进行过滤。将所得到的成纤维细胞培养在补充有20%FBS和100μg/ml青霉素/链霉素的DMEM中。如表1中所示,对每个样品进行分类。
【表1】
正常对照组和CMT2F患者组样品
结果,如图1中所示,确认了分离自正常组和CMT患者的成纤维细胞在形态上是相同的(图1)。
实施例2:制备CMT患者来源的诱导多能干细胞(iPSC)和胚状体
<2-1>诱导源自CMT患者的iPSC发育
为了从通过实施例1中的皮肤活检由CMT患者获得的成纤维细胞制备出iPSC以用于神经元的分化,用含有4种转录因子(Klf4、Oct3/4、Sox2和c-Myc)的仙台病毒系统(CellBiolabs,USA)转染正常对照组的成纤维细胞和CMT患者的成纤维细胞。所使用的仙台病毒并未插入宿主基因组,相反它在几个继代培养后消失,这表明可得到更稳定的iPSC。仙台病毒的剂量被确定为MOI(感染复数)3。用仙台病毒过夜感染细胞,然后将培养基替换为补充有10%FBS的DMEM,随后进一步培养6天以使细胞稳定。然后,将细胞转移到SNL饲养细胞(用丝裂霉素C(Invitrogen)处理的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF))(CellBiolabs,USA),并与补充有4ng/mlbFGF的ESC/iPSC培养基(KnockOutTM,USA)混合。在培养过程中每天都用新鲜的培养基对培养基进行替换。仙台病毒感染后30天,选择并分离iPSC样细胞集落。对分离出的iPSC进行核苷酸序列分析,以确认导致CMT的基因突变是否被保留。
结果,如表1、图3和图4中所示,CMT患者来源的iPSC(CMT2F-iPSC)展现出HSP27基因中的404C>T或545C>T突变,由此合成的HSP27蛋白展现出突变体形式的形成(该突变体中存在S135F或P182L突变)(表1和图3)。另外,确认了由分离自正常组和CMT患者的成纤维细胞分化而来的iPSC具有扁平卵石(flatpebble)的形态学或与普通的人多能干细胞的形态学相同的形态学(图4)。
<2-2>CMT2F-iPSC内源多能性基因的表达
为了调查CMT2F-iPSC是否显示出多能性,对内源基因KLF4、OCT4、SOX2和c-Myc的表达进行了确认。
具体而言,将实施例2中制备的CMT2F-iPSC或正常对照WA09_hESC培养经过10个细胞传代,随后悬浮于TRIzol(Gibco,USA)中。根据制造商的方案,从CMT2F-iPSC或WA09_hESC中提取总RNA。然后,将1μg所提取的RNA和AMV逆转录酶(Promega,USA)与oligo-dT及表2中列出的正向引物和反向引物混合,随后合成各KLF4、OCT4、SOX2和c-Myc基因的cDNA。对合成的各cDNA进行扩增,并通过电泳在mRNA水平上测量各基因的表达。
【表2】
用于确认多能性标志物基因表达的引物序列
结果,如图5中所示,确认了内源基因KLF4、OCT4、SOX2和c-Myc的表达(图5)。
<2-3>CMT2F-iPSC多能性标志物蛋白的表达
为了确认CMT来源的iPSC中的干细胞标志物,另外调查了干性标志物蛋白SSEA4和NANOG的表达。
具体而言,在明胶涂覆的腔室玻片(Lab-TekII)中将实施例2中制备的CMT2F-iPSC或正常对照WA09_hESC与SNL细胞混合,随后进行培养。一周后,将培养的细胞用4%多聚甲醛固定,随后使用10%正常山羊血清(NGS;Gibco,USA)和0.2%TritonX-100进行免疫染色。本文所用的一抗是抗SSEA4抗体(小鼠IgG3,1:100;MC-813-70,DSHB,USA)和抗NANOG抗体(小鼠IgG1,1:500;NNG-811,Abcam,USA)。使用缀合Cy3的山羊来源的抗小鼠IgG二抗和DAPI复染剂进行可视化。
结果,如图6中所示,确认了通常表达于细胞核中的NANOG蛋白和通常表达于质膜中的SSEA4在CMT2F-iPSC中均显著表达(图6)。
<2-4>从CMT2F-iPSC分化EB和组织
为了在体外确认CMT2F-iPSC的多能性,从CMT2F-iPSC诱导EB的分化,然后还从分化的EB诱导外胚层、中胚层和内胚层起源的组织的分化。
具体而言,将实施例2中制备的CMT2F-iPSC或正常对照WA09_hESC转移到具有细胞不容易附着的底板的未涂覆培养皿中,随后培养8天,每两天更换ESC/iPSC培养基(KnockOutTM,Gibco,USA)。获得成为胚状体(EB)的悬浮细胞。将所得到的EB转移到明胶涂覆的腔室玻片(Lab-Tek)中,随后在10%FBS/DMEM中培养8天,以诱导分化为外胚层、中胚层和内胚层起源的组织。
通过与实施例<2-3>中所述的方式相同的方式来实施对分化的细胞的免疫染色。本文所用的一抗为抗甲胎蛋白抗体(抗AFPAb,小鼠IgG2b,1:100;2A9,Abcam,USA)、抗α-平滑肌肌动蛋白抗体(小鼠IgG2a,1:100;1A4,Abcam,USA)和抗巢蛋白抗体(小鼠IgG1,1:1000;10C2,Abcam,USA),用于反应的二抗为缀合FITC的山羊来源的抗小鼠IgG抗体。当反应完成后,将细胞放置在含有DAPI复染剂的溶液中,随后在共聚焦显微镜下进行分析。
结果,如图7中所示,获得了由CMT患者来源的iPSC分化而来的EB。确认了甲胎蛋白(AFP)(内胚层)、平滑肌肌动蛋白(SMA)(中胚层)以及巢蛋白(外胚层)均在EB中成功表达(图7)。
<2-5>在体内确认CMT2F-iPSC的分化潜能
为了在体内确认CMT2F-iPSC的分化潜能,在具有免疫损伤的小鼠中调查了CMT2F-iPSC的畸胎瘤形成。
具体而言,将通过与实施例2所述的方式相同的方式诱导出的CMT2F-iPSC(S135F和P182L)或正常对照WA09_hESC分成小细胞团块(cellclumps)。计数出1.0×106个细胞,将其与基质胶以1:1(v/v)的比例混合。在背部的下方,将混合的基质胶-细胞混合物皮下注射入5周龄的雌性免疫缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)。将该异种移植(xenografted)的小鼠饲养8周。将小鼠处死,并将产生的畸胎瘤移出,在10%的中性缓冲甲醛(10%NBF)中固定过夜。然后制备石蜡块。将石蜡块切成0.4μm厚的切片,随后进行苏木精和伊红(H&E)染色,以进行进一步观察。
结果,如图8中所示,注射进小鼠的CMT2F-iPSC特有地形成畸胎瘤,并且还分化成外胚层、中胚层和内胚层起源的组织,这表明CMT患者来源的iPSC具有体内多能性(图8)。
实施例3:诱导CMT患者来源的运动神经元的分化及其分化效率
<3-1>从CMT2F-iPSC分化运动神经元
为了将CMT2F-iPSC用作周围神经病变模型,通过与图2中描述的方式相同的方式诱导从CMT2F-iPSC到运动神经元的分化(AmorosoMW等,JNeurosci2013;33:574-586)(图2)。
具体而言,为了诱导胚状体形成,将通过与实施例2中描述的方式相同的方式诱导的CMT2F-iPSC(S135F和P182L)或正常对照WA09_hESC分为小团块,随后在补充有如下物质的ESC/iPSC培养基(基础培养基)中悬浮培养2天:10μMY27632(Rho相关激酶抑制剂,TocrisBioscience,英国)、20ng/mlbFGF(Invitrogen,USA)、10μMSB435142(Stemgent,USA)、0.2μMLDN193189(Stemgent,USA)和青霉素/链霉素。
在培养开始3天后,将基础培养基替换为神经干细胞培养基(Stemline;Sigma,USA),其中添加有2μg/ml肝素(Sigma,USA)和N2补充物(Gibco,USA)以诱导神经化(neuralization)。向其中加入1μM视黄酸(Sigma,USA)、0.4μg/ml抗坏血酸(Sigma,USA)和10ng/mlBDNF(R&D,USA),随后尾部化(caudalization)以获得神经球。
然后,在培养开始7天后,停止添加10μMSB435142和0.2μMLDN193189。作为替代,向其中加入音猬因子(shh)激动剂purmorphamine(Stemgent,USA),随后进行培养以使其腹部化(ventralization)。
在培养开始17天后,将基础培养基替换为神经基础(neurobasal)培养基(Invitrogen,USA)。同时,继续进行所有所述成分的添加,并另外向其中添加10ng/mlIGF-1、10ng/mlGDNF、10ng/mlCNTF(R&D,USA)和B27补充物(Gibco,USA),以将神经球分化成运动神经元。在培养过程中,将细胞维持为悬浮在培养流体中。在培养开始20天或30天后,将培养的细胞用Accutase(PAALaboratories)处理,使得细胞分散在聚L-赖氨酸/层粘连蛋白涂覆的培养容器或腔室玻片(NalgeneNunc,USA)中。结果,获得了由CMT2FiPSC或WA09_hESC分化而来的运动神经元(CMT-2F-MN或WA09_MN)。
<3-2>CMT2F-MN标志物蛋白的表达
为了确认从CMT2F-iPSC分化出运动神经元的分化效率,调查了运动神经元标志物蛋白的表达和神经肌肉接头的形成。
具体而言,为了确认运动神经元标志物蛋白的表达,以与实施例<2-3>中所述的方式相同的方式,对实施例<3-1>中获得的CMT2F-MN或WA09_MN进行免疫染色。本文所用的一抗为抗HB9抗体(小鼠IgG1,1:100;81.5C10,DSHB,USA)、抗Islet-1/2抗体(小鼠IgG2b,1:50;39.4DS,DSHB,USA)、抗SMI32抗体(抗H-非磷酸化神经丝,小鼠IgG1,1:500;Covance,USA)、抗神经元特异性βIII微管蛋白(Tuj1)抗体(兔IgG,1:1000;Abcam,USA)、抗微管相关蛋白2(抗MAP2)抗体(兔IgG,1:200;Millipore,USA)、抗突触蛋白抗体(兔IgG,1:100;Abcam,USA)和抗胆碱乙酰基转移酶(抗ChAT)抗体(兔IgG,1:1000;Abcam,USA)。本文所用的二抗为缀合FITC的鹅抗小鼠IgG抗体、缀合Cy3的山羊抗兔IgG抗体和缀合Cy3的山羊抗小鼠IgG抗体。将DAPI复染剂用于可视化。为了评价运动神经元的发育程度,对SMI32/DAPI或MAP2/DAPI的百分比进行了计算。也测量了轴突的长度来进行比较。
结果,如图9中所示,确认了由正常对照和CMT2F-iPSC分化而来的运动神经元显著表达了运动神经元标志物蛋白HB9、ISL1、SMI32、Tuj1、MAP2突触蛋白和ChAT(图9a)。分化的CMT2F-MN与正常对照没有太多不同,这表明在分化过程中不存在发育缺陷(图9b和图9c)。
<3-3>CMT2F-MN神经肌肉接头的形成
为了确认从CMT2F-iPSC分化出运动神经元的分化效率,调查了神经肌肉接头的形成。
具体而言,将C2C12小鼠成肌细胞(CRL-1772,ATCC)培养在补充有10%FBS、1mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的DMEM中。当细胞生长至70%汇合时,向培养基中加入1%胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)补充物(Sigma,USA),以诱导肌管的分化。将细胞培养2天后,向其中加入10μM胞嘧啶阿拉伯糖苷,以消除分裂的细胞,随后进一步培养2-4天。然后,通过使用胰蛋白酶获得分化的肌管,将所述分化的肌管以1.0×104个细胞/孔的低密度接种在基质胶涂覆的8孔腔室玻片中。1或2天后,将在实施例<3-1>中获得的CMT2F-MN或WA09_MN加入到接种的肌管中,随后以10:1的比例进行共培养。然后,向其中加入MN分化培养基。1周后,用缀合Alexa488的α-环蛇毒素(bungarotoxin)(α-BTX;Invitrogen,USA)对共培养的运动神经元和肌管进行染色,以观测新形成的神经肌肉接头。
结果,如图10中所示,确认了与肌管共培养的CMT-2F-MN正常地形成了神经肌肉接头(图10)。
实施例4:通过组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)抑制剂恢复CMT来源的运动神经元中的轴突运输
<4-1>CMT2F-MNα-微管蛋白的乙酰化
为了将由CMT患者来源的iPSC分化而来的神经元用作CMT药物功效测试模型,调查了根据tubastatinA(组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)抑制剂)处理的轴突运输的恢复。CMT2亚型在致CMT基因方面具有异质性(heterogeneity),但尽管如此,CMT2亚型在很多患者中引起轴突运输系统的功能障碍(GentilBJ和CooperL,BrainResBull2012;88:444-453)。因此,通过测量α-微管蛋白乙酰化的水平,对CMT2F-MN的轴突运输效率进行了调查,以前报道了α-微管蛋白乙酰化的水平与囊泡和马达蛋白之间的相互作用有关(WestermannS和WeberK.,NatRevMolCellBiol2003;4:938-947)。
具体而言,将通过与实施例<3-1>中描述的方式相同的方式分化而来的CMT-2F-MN或WA09_MN用5μMtubastatinA处理,随后培养12小时。然后,以与实施例<2-3>中所述的方式相同的方式,对细胞就α-微管蛋白和乙酰α-微管蛋白进行免疫染色。本文所用的一抗为抗α-微管蛋白抗体(兔IgG,1:500;Abcam,USA)和抗乙酰α-微管蛋白抗体(小鼠IgG,1:200;Abcam,USA)。本文所用的二抗为缀合Alexa488的山羊抗兔IgG抗体和缀合Cy3的山羊抗小鼠IgG抗体。
将用5μMtubastatinA处理的CMT-2F-MN或WA09_MN悬浮于含有如下物质的RIPA裂解缓冲液(pH8.0)中:150mMNaCl、1.0%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠和50mMTris。然后,获得含有细胞蛋白的上清液,并在12%SDS-PAGE凝胶上对蛋白进行分离。将蛋白转移至PVDF膜上。使用抗乙酰α-微管蛋白抗体(小鼠IgG2b,1:1000;6-11B-1,Abcam)和抗α-微管蛋白抗体(兔,小鼠IgG1,1:1000;DM1A,Sigma,USA)对膜进行免疫印迹。通过使用UN-SCAN-IT凝胶软件(SilkScientific,USA)对带密度进行分析,以测量α-微管蛋白乙酰化的水平。对于阴性对照,以与上述方式相同的方式对未经5μMtubastatinA处理的CMT-2F-MN或WA09_MN进行免疫染色,随后进行免疫印迹。
结果,如图11中所示,与正常对照WA09_MN相比,当未用tubastatinA处理CMT2F-MN时,α-微管蛋白乙酰化的水平下降。同时,当用5μMtubastatinA处理CMT-2F-MN时,α-微管蛋白乙酰化的水平增加/恢复至正常对照组的水平(图11a、图11b和图11c)。
<4-2>CMT2F-MNα-微管蛋白的移动线粒体
如图13中所示,为了将由CMT患者来源的iPSC分化而来的神经元用作CMT药物功效测试模型,通过微流体培养,调查了tubastatinA(组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)抑制剂)处理后的移动线粒体。并且,确认了运动神经元(CMT2F-MN)的轴突运输效率(图13)。
具体而言,通过使用Accutase,将实施例<3-1>中获得的CMT-2F-MN或WA09_MN分离成单细胞,然后将所述单细胞以1.0×105个细胞/板的密度接种于微通道板(由Dr.Mok,SeoulNationalUniversity,Korea提供;ParkJW等,NatProtoc2006;1:2128-2136)中,随后在神经基础培养基/B27中培养10天。在轴突完全生长通过微米尺寸的槽并伸展到相对隔室(compartment)后,通过使用lipofectamine2000(Invitrogen,USA),用mito-dsRED2转染经处理的运动神经元。从转染起2天内,用5-10μMtubastatinA处理培养基,随后培养6小时。通过使用荧光显微镜,以121快照(snaps)/2min的速度进行线粒体成像。通过使用ImageJ和Kymograph,对运动神经元的移动速度进行测量。
结果,如图12、表3和表4中所示,在mito-RED2转染的CMT-2F-MN或WA09_MN中观测到运动神经元的轴突线粒体。当未用tubastatinA处理时,线粒体的移动速度在具有S135F突变的CMT2F-MN轴突中显著下降。在具有P182L突变的CMT2F-MN中,移动线粒体的百分比下降(图12a、图12b和图12c)。另一方面,当用tubastatinA处理时,在分别具有S135F突变和P182L突变的CMT2F-MN中,线粒体的移动速度和运输频率均显著增加,几乎恢复到正常对照的水平(图12b和图12c)。
【表3】
tubastatinA处理后线粒体的移动速度
【表4】
tubastatinA处理后线粒体的迁移
a迁移以移动线粒体数量占线粒体总数量的百分比(%)表示。
Claims (15)
1.一种用于从体细胞制备运动神经元的方法,所述体细胞来源于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者,所述方法包括以下步骤:
1)从Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者获得人的体细胞;
2)用引入有OCT4转基因、SOX2转基因、KLF4转基因和c-MYC转基因的载体转染步骤1)的来源于CMT患者的所述人的体细胞,随后进行培养以诱导出诱导多能干细胞(iPSC);以及
3)通过在视黄酸和音猬因子的存在下将步骤2)中制备的所述诱导多能干细胞进行培养,诱导出运动神经元。
2.一种用于从体细胞制备运动神经元的方法,所述体细胞来源于Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者,所述方法包括以下步骤:
1)从Charcot-Marie-Tooth病(CMT)患者获得人的体细胞;
2)用引入有OCT4转基因、SOX2转基因、KLF4转基因和c-MYC转基因的载体转染步骤1)的来源于CMT患者的所述人的体细胞,随后进行培养以诱导出诱导多能干细胞(iPSC);
3)通过在视黄酸和音猬因子的存在下将步骤2)中制备的所述诱导多能干细胞进行培养,诱导出运动神经元;以及
4)在神经营养蛋白的存在下,延续步骤3)中制备的所述运动神经元的培养。
3.根据权利要求2中所述的制备运动神经元的方法,其中,步骤4)的所述神经营养蛋白选自于由如下神经营养蛋白所组成的组:神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)。
4.根据权利要求1或2中所述的制备运动神经元的方法,其中,所述Charcot-Marie-Tooth病为I型CMT、II型CMT、IV型CMT或CMTX。
5.根据权利要求1或2中所述的制备运动神经元的方法,其中,步骤1)的所述人的体细胞典型地为成纤维细胞。
6.根据权利要求1或2中所述的制备运动神经元的方法,其中,步骤2)的所述载体为仙台病毒、逆转录病毒或慢病毒。
7.根据权利要求4中所述的制备运动神经元的方法,其中,所述CMT2F在热休克蛋白(HSP)27中具有第135位氨基酸的突变或第182位氨基酸的突变。
8.根据权利要求1或2中所述的制备运动神经元的方法,其中,步骤3)由如下子步骤构成:
(3-1)将上述制备的所述诱导多能干细胞进行培养以获得胚状体(EB),然后使所获得的EB分化成神经球;以及
(3-2)使上述制备的所述神经球分化成运动神经元。
9.一种用于预防和治疗Charcot-Marie-Tooth病的组合物的筛选方法,所述筛选方法包括以下步骤:
1)在体外用CMT治疗物质候选物对通过权利要求1或2所述的方法制备的所述运动神经元进行处理;
2)测量在步骤1)中用所述治疗物质候选物处理的细胞中的CMT指标;以及
3)通过与对照进行比较,选择表现出增加或减少步骤2)中获得的所述CMT指标的候选物。
10.根据权利要求9中所述的用于预防和治疗Charcot-Marie-Tooth病的组合物的筛选方法,其中,所述Charcot-Marie-Tooth病为I型CMT、II型CMT、IV型CMT或CMTX。
11.根据权利要求10中所述的用于预防和治疗Charcot-Marie-Tooth病的组合物的筛选方法,其中,CMT2F在热休克蛋白(HSP)27中具有第135位氨基酸的突变或第182位氨基酸的突变。
12.根据权利要求9中所述的用于预防和治疗Charcot-Marie-Tooth病的组合物的筛选方法,其中,所述CMT指标为乙酰α-微管蛋白、轴突运输指标或移动线粒体。
13.根据权利要求9中所述的用于预防和治疗Charcot-Marie-Tooth病的组合物的筛选方法,其中,步骤3)的特征在于选择能够增加CMT指标的候选物,所述CMT指标例如为乙酰α-微管蛋白、轴突运输指标和移动线粒体。
14.根据权利要求9中所述的用于预防和治疗Charcot-Marie-Tooth病的组合物的筛选方法,其中,所述CMT指标的测量通过选自于由如下方法所组成的组中的方法之一实施:RT-PCR、ELISA、免疫组织化学(IHC)、蛋白质印迹、FACS和全细胞膜片钳。
15.一种CMT患者特异性治疗物质的筛选方法,所述筛选方法包括以下步骤:
1)在体外用CMT治疗药物对通过权利要求1或2所述的方法制备的所述运动神经元进行处理;
2)测量在步骤1)中用所述CMT治疗药物处理的细胞中的CMT指标水平;以及
3)通过与对照的水平进行比较,选择增加或减少步骤2)中的所述CMT指标水平的CMT治疗药物。
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