CN110487877B - 一种筛选降尿酸小分子化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于膜片钳技术筛选促尿酸排泄的降尿酸小分子化合物的方法，包括以下步骤：构建表达GLUT9基因的重组质粒；将上述重组质粒瞬时转染至HEK293T细胞；18‑24h后，利用膜片钳技术记录表达GLUT9细胞转运尿酸时电流的变化；通过阳性药苯溴马隆和丙磺舒，与阴性药RDEA3170、别嘌呤醇验证模型可靠性。本发明的操作简单，简便快捷；结果稳定可靠，重现性好；相对于现有的利用爪蟾卵母细胞摄取同位素的检测方法用时更短、成本更低，可实现GLUT9抑制剂的高通量筛选。

Description

一种筛选降尿酸小分子化合物的方法
技术领域
本发明涉及药学领域，具体涉及一种筛选降尿酸小分子化合物的方法。
背景技术
尿酸为体内嘌呤类物质代谢的最终产物。高尿酸血症(Hyperuricemia，HUA)是指在正常嘌呤饮食状态下，测出非同日两次空腹的血尿酸水平，男性若高于420μmol/L，女性若高于360μmol/L，则诊断为高尿酸血症。高尿酸血症可引起痛风、高血压、心血管疾病、糖尿病及肾脏病变等。同时，高尿酸血症与尿酸生成过多或尿酸排泄不足也有关，80％以上的高尿酸血症患者发病原因均为尿酸排泄减少。
体内尿酸主要经过肾脏随尿液排出，该过程依赖于表达在肾小管上皮细胞中多种尿酸转运体的协同作用。尿酸的排泄主要分四个过程：肾小球滤过、肾小管重吸收、肾小管再分泌以及分泌后重吸收。经肾小球滤过的绝大部分尿酸(>90％)将被肾小管上皮细胞刷状缘膜上的尿酸盐阴离子转运体1(Urate anion transporter 1，URAT1)重吸收进入上皮细胞，继而被肾小管上皮细胞基侧膜上的葡萄糖转运体9(GLUT9)转运至肾间质而重新回到人体血液循环。一部分尿酸(肾小球滤过的50％)也会经过上皮细胞基侧膜上的阴离子转运体(OAT1和OAT3)而转运至上皮细胞内，然后通过管腔侧膜上的MRP4和ABCG2转运体排入小管内而分泌排出体外。
GLUT9曾经被认为是一种果糖转运蛋白，属于葡萄糖转运体家族成员之一。但近年研究发现GLUT9也是一种新型的高容量、低亲和力的尿酸转运体，其在近端小管基底外侧膜的主要尿酸排泄机制中发挥跨上皮尿酸盐重吸收作用，以维持体内血尿酸的平衡。全基因组学研究显示，痛风病人主要与GLUT9的病变相关，而不是URAT1。因此GLUT9成为治疗高尿酸血症的一个重要靶点。此外，GLUT9突变会使肾脏重吸收尿酸功能受损，继而使血尿酸水平降低，最终导致肾性低尿酸血症。
目前临床常用的降尿酸药物主要分为抑制尿酸生成与促进尿酸排泄两大类。前者包括黄嘌呤氧化酶抑制剂：别嘌呤醇与非布司他。后者主要包括作用于尿酸转运体的促尿酸排泄药物，如苯溴马隆、丙磺舒、Lesinurad，RDEA3170等。由于苯溴马隆易诱发爆发性肝炎，FDA一直没批准该药在美国上市，欧洲也曾经一度叫停。丙磺舒效率低，选择性低，易引起胃肠道反应及变态反应，对造血系统、肝肾有轻微不良反应而使其在临床中的应用受到限制。
Lesinurad与RDEA3170均为URAT1的特异性抑制剂，均可通过抑制URAT1重吸收尿酸而降低血尿酸，但是Lesinurad临床上必须与别嘌呤醇联合使用才能更好地发挥作用。RDEA3170目前正在进行II期临床试验，其体外抑制URAT1的活性明显强于Lesinurad。
但是目前尚未发现靶向GLUT9的降尿酸药物，而GLUT9在体内尿酸稳态中发挥十分重要的作用。因此，寻找新型、选择性GLUT9抑制剂将成为开发强效促尿酸排泄药物的又一个研发热点。
常规的GLUT9抑制剂筛选方法通常利用放射性元素14C标记尿酸的摄取，该方法通常需将GLUT9cRNA注射入爪蟾卵母细胞，使其表达GLUT9蛋白。但由于爪蟾卵母细胞体积大，需要空间大，通常需要15个以上细胞数据才能获得较为可靠的实验结果。因此该方法并不适用于高通量筛选。因此，开发一种新型的高通量筛选方法在筛选促尿酸排泄药物中意义重大。
发明内容
为了实现上述目的，本发明利用GLUT9转运尿酸时膜电位会发生变化的特性，使用膜片钳技术，来筛选促尿酸排泄的降尿酸小分子化合物。
为了达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种筛选促尿酸排泄的降尿酸小分子化合物的方法，包括如下步骤：
(1)将包括编码GLUT9基因的活性片段克隆到表达载体上，构建重组质粒；
(2)将所述重组质粒转染至哺乳动物细胞；
(3)对经转染的细胞进行膜片钳电生理实验，其中使用含尿酸的电极外液；
(4)将待检测的小分子化合物加到含尿酸的电极外液中，当与未加所述待检测的小分子化合物相比，电流明显降低时，则判断所述待检测小分子化合物为对GLUT9有抑制作用的降尿酸小分子化合物。
进一步的，步骤(1)所述重组质粒的构建方法是将克隆有所述GLUT9基因活性片段的表达载体转化进入大肠杆菌菌株，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑取单克隆筛选出含目的质粒的菌株进行培养。
进一步的，步骤(2)待哺乳动物细胞融合至80％时，将重组质粒和EGFP共转染到哺乳动物细胞。
进一步的，所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞、仓鼠卵巢细胞CHO、非洲绿猴肾成纤维细胞Cos7。
进一步的，步骤(3)所述膜片钳电生理实验是将玻片放在连有金属电极的细胞外液中，将玻璃微电极移到带荧光的细胞的上方，给予负压，待电极与细胞之间形成大于1GΩ的高阻封接，电容补偿后，将细胞钳制在-30mV，记录电流变化。
进一步的，步骤(3)转染细胞18～24小时后，将细胞传代进行膜片钳电生理实验。
进一步的，以2-3ml/min的速度灌流含有所述待检测的小分子化合物的电极尿酸外液。
进一步的，利用膜片钳技术，记录瞬转所述重组质粒的HEK293T细胞转运尿酸时细胞电流大小的变化。
本发明在国内外首次尝试使用膜片钳技术来筛选GLUT9抑制剂，从而可作为降尿酸药物来治疗高尿酸血症，加微弱负压，则电极尖端与细胞膜即可发生紧密接触，即高阻封接。通过放大器可以敏感地捕捉到相应的电流信号，并记录。膜片钳技术主要有四种基本记录模式：细胞吸附膜片、全细胞记录法、内面向外膜片、外面向外膜片。
Anzai等人(Plasma Urate Level Is Directly Regulated by a Voltage-driven Urate Efflux Transporter URATv1(SLC2A9)in Humans)的研究表明GLUT9转运尿酸时的产电特性。具体而言，GLUT9转运一个尿酸阴离子进入细胞，即有一个负电荷的移动从而产生电流。因此本发明将利用膜片钳技术中全细胞记录法记录GLUT9转运尿酸时细胞产生电流的变化，从而评价GLUT9潜在抑制剂对GLUT9的抑制活性。
本发明首先构建了表达GLUT9重组质粒pcDNA3.1(-)-GLUT9，将其与荧光基因片段EGFP共转染至融合度为70-80％的HEK293T细胞，转染后18-24h，将细胞消化并重新接种至多聚赖氨酸预处理盖玻片上，配制待细胞贴壁后可用于全细胞膜片钳记录。本发明先以不同浓度的尿酸作为底物检测GLUT9的活性。尿酸浓度为1mM时，能记录到明显的电流变化。然后在尿酸溶液中加入阳性药苯溴马隆(100μM)和丙磺舒(500μM)，以及阴性药RDEA3170(100μM)和别嘌呤醇(100μM)后，根据电流值的变化，验证平台的可靠性。
本发明在选取膜片钳细胞是比较困难，需要考虑到转染效率、细胞状态等因素，所以本发明通过调整了细胞的种类(选择了转染效率高的HEK-293T为主要实验对象)、转染的条件(包括转染的试剂种类和使用量、时间、温度、质粒的种类和使用量等)、传代到玻片上的条件(包括传代的细胞悬液中的细胞数、贴壁时间)、膜片钳的条件(尿酸外液的配制方法和尿酸外液浓度的选取、膜片钳的不同加药系统、不同型号的膜片钳和纪录电流的电压程序的设置)，使膜片钳细胞的转染效率大大提高，能成功产生电流的细胞数增加了80％以上，从而得到了很好的技术效果，实现了GLUT9抑制剂的筛选。
本发明的有益效果是：
操作简单，简便快捷，易于实现高通量筛选：实验过程中无需培养爪蟾卵母细胞进行14C同位素摄取实验，且细胞转染后18h即可进行实验，用时更短；使用本发明膜片钳常规仪器设备即可完成；体系稳定，数据重现性好，成本低廉即可实现GLUT9抑制剂的筛选。
附图说明
图1为pcDNA3.1(-)-GLUT9质粒图谱。
图2示出对pcDNA3.1(-)-GLUT9重组质粒双酶切鉴定结果。
图3为瞬转GLUT9质粒的细胞与空白对照细胞GLUT9蛋白表达量分析。
图4A为转染未转染GLUT9的细胞加入尿酸刺激时记录的电流图，图4B为GLUT9转运尿酸时细胞产生的电流图。其中UA代表灌流尿酸溶液，Bath代表灌流空白外液。
图5示出GLUT9转运不同浓度尿酸时细胞电流变化结果。其中图5A、B为GLUT9转运不同浓度尿酸时细胞产生电流的变化与其Km值。其中UA代表灌流尿酸溶液，Bath代表灌流空白外液。
图6示出苯溴马隆对GLUT9转运尿酸时细胞电流的影响(N＝3)。其中苯溴马隆的浓度为100μM。其中UA代表灌流尿酸溶液，Bath代表灌流空白外液。
图7示出丙磺舒对GLUT9转运尿酸时细胞电流的影响(N＝3)。其中丙磺舒的浓度为500μM。其中UA代表灌流尿酸溶液，Bath代表灌流空白外液。
图8示出RDEA3170对GLUT9转运尿酸时细胞电流的影响(N＝3)。其中RDEA3170的浓度为100μM。其中UA代表灌流尿酸溶液，Bath代表灌流空白外液。
图9示出别嘌呤醇对GLUT9转运尿酸时细胞电流的影响(N＝3)。其中别嘌呤醇的浓度为100μM。
具体实施方式
试剂与方法：
卡那霉素的制备：溶解1g卡那霉素于足量的ddH2O中，最后定容至20mL，过滤除菌，分装成小份于-20℃贮存，使用时将其稀释1000倍。
感受态细胞制备：全式金Trans1-T1感受态(货号：CD501-02)，使用前冰上溶解后备用。
液体培养基的制备：分别称取5g蛋白胨、5g氯化钠、2.5g酵母提取物至500mL洗净的瓶子中，加入超纯水500mL搅拌均匀，121℃高温灭菌20min。灭菌后降温至37℃，加入500μL的卡那霉素(100μL/100mL)摇匀，4℃保存，备用。
固体培养基的制备：分别称取3g蛋白胨、3g氯化钠、1.5g酵母提取物、4.5g琼脂至500mL洗净的瓶子中，加入超纯水300mL，121℃高温灭菌20min。灭菌结束后将固体培养基放置于室温，在培养基未凝固时加入300μL卡那霉素(100μL/100mL)，摇匀，倒入无菌的培养皿里，凝固后4℃保存，备用。
实施例1GLUT9重组质粒的构建与鉴定
1)pcDNA3.1(-)-GLUT9重组质粒的构建
本发明选择pcDNA3.1(-)作为表达载体；目的基因序列活性片段为GLUT9全长(Gene ID：117591)。在T4链接酶的作用下，将目的基因片段克隆至pcDNA3.1(-)载体上，将质粒转化到大肠杆菌37℃培养16h后，挑取单克隆，放置于已经制备好的液体培养液中培养，摇菌16h。摇菌后提取质粒，之后进行双酶切鉴定，选取样品送去测序做最终的确认。
结果：图1～图3为pcDNA3.1(-)-GLUT9重组质粒的质粒图谱。已知pcDNA3.1(-)的长度约为5.4kb，而GLUT9约为1.6kb，采用限制性内切酶HindIII和XbaI进行双酶切。双酶切结果如图2。由此，筛选出插入有GLUT9的pcDNA3.1(-)-GLUT9重组质粒，并经测序验证，说明pcDNA3.1(-)-GLUT9表达载体构建成功。
2)GLUT9蛋白表达鉴定：
待HEK293T细胞生长融合至90％时，将HEK293T细胞接种到24孔板中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养18-24h后，细胞融合率约70-80％则进行DNA-脂质体复合物瞬时转染。
具体转染步骤如下：在两个1.5mL的EP管(1号管和2号管)中分别加入25μL Opti培养基，然后在1号管中加入步骤1)制备好的重组质粒(pcDNA3.1(-)-GLUT9)600ng以及1μL的P3000TM，或者仅1μL的P3000TM混合均匀；在2号管中加入0.75μL
Figure BDA0002126085510000051
3000，将上述样品管涡旋10秒，静置5min；再将两管中液体混匀，涡旋10秒，静置20min，均匀滴入至加入500μL/孔新培养基的孔中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养18-24h，然后进行免疫印迹分析。
其中，Opti培养基：opti-MEM成分含有HEPES，2400mg/L碳酸氢钠，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，微量元素，生长因子，以及微量的酚红。
结果显示：图3为瞬转GLUT9细胞与空白对照细胞表达GLUT9对比情况，瞬转GLUT9质粒后的细胞中GLUT9蛋白表达水平明显强于空白对照细胞，表明本发明制备方法在HEK293T细胞成功表达出GLUT9蛋白。
3)GLUT9与EGFP进行细胞共转染
待HEK293T细胞生长融合至90％时，将HEK293T细胞接种到24孔板中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养18-24h后，细胞融合率约70-80％则进行DNA-脂质体复合物瞬时转染。
具体转染步骤如下：在两个1.5mL的EP管(1号管和2号管)中分别加入25μL Opti培养基，然后在1号管中加入两种质粒(mGLUT9:EGFP＝2:1)600ng：250ng以及1μL的P3000TM混合均匀；在2号管中加入0.75μL P3000TM，将上述样品管涡旋10秒，静置5min；再将两管中液体混匀，涡旋10秒，静置20min，均匀滴入至加入500μL/孔新培养基的孔中，置于37℃，含5％CO2培养箱中培养18-24h。
其中，Opti培养基：opti-MEM成分含有HEPES，2400mg/l碳酸氢钠，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，微量元素，生长因子，以及微量的酚红。
4)细胞玻片的准备
转染后18-24小时后，观察绿色荧光蛋白EGFP的表达，将转染后的细胞消化下来重新接种到经多聚赖氨酸预处理的12mm半径的圆型盖玻片上，5小时后待细胞贴壁即可用于全细胞膜片钳记录。
实施例2膜片钳记录电流
1.全细胞膜片钳记录
(1)制备细胞内外液。
外液配方为：140mM/L NaCl、5mM/L KCl、1mM/L MgCl2、2mM/L CaCl2、10mM/LHEPES、10mM/L D-glucose配制后，使用NaOH调其pH为7.4左右，使用0.22μm微孔滤膜过滤后放置4℃保存备用。
内液配方为：140mM/100mL KCl、1mM/100mL MgCl2、5mM/100mL EGTA、10mM/100mLHEPES配制后，使用KOH调pH为7.4左右，使用0.22μm微孔滤膜过滤后放置4℃保存备用。
(2)制备(含药)尿酸溶液：用0.1M的NaOH溶解8.4mg的尿酸粉末得到25mM的尿酸母液；在19.2mL外液中加入800μL尿酸母液后混合均匀，得到1mM的尿酸外液20mL。宜现配现用。含药尿酸即药物溶液与尿酸溶液混匀得到最终设定浓度。
(3)电极制备：使用硼硅酸盐毛细玻璃管，经拉制仪两步拉制后，尖端直径约为1～5μm，用注射器在微电级尾部冲灌加入内液(约为电极三分之一至二分之一)，并轻轻地弹除气泡。
(4)电极安装在膜片钳电极臂上，稍微给予正压，移入液面后进行液接电位补偿。在显微镜下将玻璃微电极移到所选细胞上方，接触到细胞时电阻大约增加0.2-0.4MΩ，去掉正压而后施加负压。
(5)待电极与HEK293T细胞膜之间会形成大于1GΩ的高阻封接，再进行快电容(fast capacitance)补偿和慢电容(slow capacitance)补偿。然后将细胞钳制在-30mV上，施加一个短而有力的负压，进行破膜。
(6)细胞稳定后，全细胞模式记录电流。采用灌流系统在细胞正上方小心加入用细胞外液配制好的样品，记录电流的变化情况。实验重复3次。
(7)更换不同的灌流液，分别记录细胞在加尿酸外液或加含药物的尿酸外液前后的电流变化，电流曲线使用Clampfit与AI处理作图。
(8)若在0.15s时出现的GLUT9产生的瞬时最大电流大小明显降低，说明该药物可能是符合实验条件的小分子化合物，判断此小分子化合物为对GLUT9有抑制作用的降尿酸小分子化合物。
结果：图4～图5所示，图4A是转染未转染GLUT9的细胞加入尿酸刺激时记录到的电流图，图4B是GLUT9转运尿酸时细胞产生的电流图，图5A、B为GLUT9转运不同浓度尿酸时细胞产生电流的变化与其Km值。
如图4B，UA外液刺激后，能记录到明显电流；而图4A未转染GLUT9的细胞加入UA外液刺激后，并无明显电流产生。不同浓度尿酸灌流后，能记录到电流逐渐增加的趋势，其Km值为0.167±0.09mM(图5A和图5B)。
为了验证，分别使用苯溴马隆和丙磺舒作为阳性药物，使用RDEA3170和别嘌呤醇作为阴性药物，按照上述方法进行实验。
结果：图6是100μM苯溴马隆(BM)、图7是500μM丙磺舒(PB)对GLUT9转运尿酸时细胞电流的影响；从中可以看出BM与PB均能明显抑制尿酸灌流后所记录到的电流大小。图8与图9分别为100μM RDEA3170和100μM别嘌呤醇(AP)对GLUT9转运尿酸时细胞电流的影响，从中可知，REDA3170与别嘌呤醇对GLUT9电流大小并无明显影响。(图6～图9中的Bath代表的是未加药组)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种筛选促尿酸排泄的降尿酸小分子化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将包括编码GLUT9基因活性片段克隆到表达载体上，构建重组质粒；
(2)将所述重组质粒转染至哺乳动物细胞；
(3)对经转染的细胞进行膜片钳电生理实验，其中使用含尿酸的电极外液；
(4)将待检测的小分子化合物加到含尿酸的含尿酸的电极外液中，当与未加所述待检测的小分子化合物相比，电流明显降低时，则判断所述待检测的小分子化合物为对GLUT9有抑制作用的降尿酸小分子化合物；
所述哺乳动物细胞为HEK293T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述重组质粒的构建方法是将克隆有所述GLUT9基因活性片段的表达载体转化进入大肠杆菌菌株，将菌液均匀涂布到混有抗生素的固体培养基上，挑取单克隆筛选出含目的质粒的菌株进行培养。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)待哺乳动物细胞融合至80％时，将重组质粒和EGFP共转染到哺乳动物细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述膜片钳电生理实验是将玻片放在连有金属电极的细胞外液中，将玻璃微电极移到带荧光的细胞的上方，给予负压，待电极与细胞之间形成大于1GΩ的高阻封接，电容补偿后，将细胞钳制在-30mV，记录电流变化。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)转染细胞18～24小时后，将细胞传代进行膜片钳电生理实验。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以2-3ml/min的速度灌流含有所述待检测的小分子化合物的电极尿酸外液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用膜片钳技术，记录瞬转所述重组质粒的HEK293T细胞转运尿酸时细胞电流大小的变化。
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Uric Acid-Induced Enhancements of Kv1.5 Protein Expression and Channel Activity via the Akt-HSF1-Hsp70 Pathway in HL-1 Atrial Myocytes;Fikri Taufiq et al;《Circulation Journal》;20190220;第83卷;718-726 *

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