CN109164158A - 电生理试验中记录微小电流的方法 - Google Patents

电生理试验中记录微小电流的方法 Download PDF

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CN109164158A CN201810783375.8A CN201810783375A CN109164158A CN 109164158 A CN109164158 A CN 109164158A CN 201810783375 A CN201810783375 A CN 201810783375A CN 109164158 A CN109164158 A CN 109164158A
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苏彦华
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杨顺瑛
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Abstract

本发明公开一种电生理试验中记录微小电流的方法，其具体步骤如下：外源转运蛋白在细胞中表达后，将细胞钳制于‑70 mV，每隔70 S施加时长1.5 S、电压区间从‑160 mV到+20 mV变化的ramp程序以获取转运蛋白在不同条件下的电流响应特征，通过监控两次无铵条件下的电流重现性（基线波动控制在<5 nA）以及加铵下的电流重现性（电流波动控制在<10 nA或<5%，达到仪器的最低检测限），获得稳定可靠的铵转运蛋白底物诱导的微小电流，进而可检出<20 nA的微小电流变化；与传统的Gap‑free以及Step记录模式相比，本申请提供的记录方法极大的提高了数据获取的可靠性及便利性，可为利用电生理技术研究包括铵转运蛋白在内的各类转运体蛋白的功能提供有力技术支撑。

Description

电生理试验中记录微小电流的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。本发明涉及电生理试验中稳定记录转运体蛋白所产生的微小电流的方法。
背景技术
植物对NH4 +-N吸收是由铵转运蛋白(ammonium transporter,AMT)负责完成的(Ludewig,U.,B.,and Dynowski,M.(2007).Molecular mechanisms of ammoniumtransport and accumulation inplants.FEBSLetters 581,2301-2308.)。双电极电压钳电生理技术在解析AMT底物吸收机制以及调控机制方面具有独特优势，且在AMT功能研究中已经有广泛的应用。值得注意的是，电生理记录得到的AMT底物诱导的电流(吸收信号)一般在200-300nA以下，这种吸收信号的幅度远小于离子通道产生的吸收信号幅度(至少&gt;3000nA)。因此应用该技术研究AMT功能的难点在于如何建立一种稳定快捷的记录体系，以保证获得可靠的微小吸收信号，进而表征AMT的功能及其调控特征。
目前AMT电生理试验中常用的记录模式为“Gap-free”和“Step”两种模式(Ludewig,U.,von Wirén,N.,and Frommer,W.B.(2002).Uniport ofNH4 +by the root hairplasma membrane ammonium transporter LeAMT1；1.Journal of Biological Chemistry277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,and Udvardi,M.K.(2006).Mechanisms of ammonium transport,accumulation,and retention in ooyctesand yeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBS Letters 580,3931-3936.R.,Alsterfjord,M.,MacAulay,N.,and Zeuthen,T.(2009).Ammonium iontransport by the AMT/Rh homolog TaAMT1；1is stimulated by acidic pH.PflügersArchiv-European Journal of Physiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highly selective ammoniumtransporter that functions as H+/NH4 +symporter.Journal of Biological Chemistry286,31113-31122.)。现有报道中已经利用“Gap-free”记录模式对番茄LeAMT1；1、拟南芥AtAMT1；1、小麦TaAMT1；1以及菜豆PvAMT1；1的功能进行了研究。这种记录模式的优点是：实时监控不同条件下的电流响应，并获得稳定可靠的微小吸收信号数据。但该方法只能得到一个膜电位下的电流数据，无法获取不同膜电位下的电流-电压关系曲线这一电生理中重要指标(Ludewig,U.,von Wirén,N.,and Frommer,W.B.(2002).Uniport of NH4 +by theroot hair plasma membrane ammonium transporter LeAMT1；1.Journal of BiologicalChemistry 277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,andUdvardi,M.K.(2006).Mechanisms of ammonium transport,accumulation,andretention in ooyctes and yeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBSLetters 580,3931-3936.R.,Alsterfjord,M.,MacAulay,N.,and Zeuthen,T.(2009).Ammonium ion transport by the AMT/Rh homolog TaAMT1；1is stimulated byacidic pH.Pflügers Archiv-European Journal ofPhysiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highlyselective ammonium transporter that functions asH+/NH4 +symporter.Journal ofBiological Chemistry 286,31113-31122.)。Step模式则可以获得不同膜电位下的电流-电压关系曲线。但是这种记录模式是非连续的，只能获得完全无铵、完全有铵、恢复完全无铵后等瞬时状态下的电流-电压关系曲线，不能实时监控记录得到的数据是否稳定可靠(Ludewig,U.,von Wirén,N.,and Frommer,W.B.(2002).Uniport of NH4 +by the roothair plasma membrane ammonium transporter LeAMT1；1.Journal of BiologicalChemistry 277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,andUdvardi,M.K.(2006).Mechanisms of ammonium transport,accumulation,andretention in ooyctes and yeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBSLetters 580,3931-3936.R.,Alsterfjord,M.,MacAulay,N.,and Zeuthen,T.(2009).Ammonium ion transport by the AMT/Rh homolog TaAMT1；1is stimulated byacidic pH.Pflügers Archiv-European Journal of Physiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highlyselective ammonium transporter that functions asH+/NH4 +symporter.Journal ofBiological Chemistry286,31113-31122.)。因此，在实际操作中，Step模式获取的数据重现性较差，两次重复间波动很大，对于微小电流的AMT功能研究非常不利。事实上，由于各种因素(如物理性震动)可能引起电流信号的波动，单独利用Step模式进行记录往往会得到“假电流”(即记录得到的所谓铵诱导电流不是AMT引起的，而是一些机械震动导致的)，对初学者极易造成误导。
目前研究者们常将“Gap-free”和“Step”两种记录模式配套使用(Ludewig,U.,vonWirén,N.,and Frommer,W.B.(2002).Uniport ofNH4 +by the root hair plasma membraneammonium transporter LeAMT1；1.Journal of Biological Chemistry 277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,and Udvardi,M.K.(2006).Mechanisms of ammonium transport,accumulation,and retention in ooyctes andyeast cells expressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBS Letters 580,3931-3936.R.,Alsterfjord,M.,MacAulay,N.,and Zeuthen,T.(2009).Ammonium ion transport bythe AMT/Rh homolog TaAMT1；1is stimulated by acidic pH.Pflügers Archiv-European Journal of Physiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highly selective ammonium transporter thatfunctions as H+/NH4 +symporter.Journal of Biological Chemistry 286,31113-31122.)，这种方法在一定程度上能够获取较为可靠的电流-电压关系曲线。然而此种配套操作需要两种记录模式单独分开使用(即需要两次记录)，缺陷是获取数据速度较慢，且数据稳定性差。因此，对于电生理试验中AMT介导的微小电流研究迫切需要一种整合常规的“Gap-free”和“Step”优点，而避免其各自缺点的记录方式。即一种既能实时监控AMT对不同条件的电流响应(可以通过比较不同时段相同条件下的电流以确保记录的稳定性)，又能稳定获取不同膜电位下的电流-电压关系曲线的记录模式。
同样，通过电生理手段研究其他各类转运蛋白如硝酸根转运体(Zhou,J.J.,Fernández,E.,Galván,A.,and Miller,A.J.(2000).A high affinity nitrate transportsystem from Chlamydomonas requires two gene products.Febs Letters 466,225-227.)、氨基酸转运体(Hammes,U.Z.,Nielsen,E.,Honaas,L.A.,Taylor,C.G.,andSchachtman,D.P.(2006).AtCAT6,a sink‐tissue‐localized transporter foressential amino acids in Arabidopsis.The Plant Journal 48,414-426.)等功能时也遭遇与AMT同样的问题—产生的电流幅度非常小(&lt;300nA)。因此，建立一种稳定又方便的记录转运体蛋白产生的小电流的新方法，进而精准表征其功能特征是电生理试验中研究各类转运蛋白功能的迫切要求。
发明内容
本发明的目的在于：针对电生理试验(特别是双电极电压钳试验)中转运蛋白诱导电流吸收信号较弱小，需要快速稳定记录体系的实际问题，提供一种稳定便捷获取转运蛋白微小电流的记录方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种电生理试验中记录微小电流的方法，其具体步骤为：电生理试验中，外源转运蛋白在细胞中表达后，将细胞钳制于-70mV，每隔70S施加时长1.5S、电压区间从-160mV到+20mV变化的ramp电压，该ramp电压变化频率为0.12mV/mS，以连续稳定获得转运蛋白在不同电压下的电流响应特征；上述电生理试验优选双电极电压钳试验。
本申请中，外源转运蛋白在细胞中表达的技术为本领域常规技术，如文献：Yang,G.,Sentenac,H.,Véry,A.A.,and Su,Y.(2015).Complex interactions among residueswithin pore region determine the K+dependence ofa KAT1‐type potassium channelAmKAT1.The Plant Journal 83,401-412；文献：Wang,L.,Yang,S.Y.,Guo,M.Y.,Huang,Y.N.,Sentenac,H.,Véry,A.A.,and Su,Y.H.(2016).The S1–S2 linker determines thedistinct pH sensitivity between ZmK2.1and KAT1.The Plant Journal 85,675-685.)等公开的方法。所述外源转运蛋白包括但不限于铵转运蛋白、硝酸根转运蛋白、氨基酸转运蛋白等。
进一步，本发明所述电生理试验中记录微小电流的方法中，外源转运蛋白为铵转运蛋白，细胞为蛙卵细胞，其检测具体步骤如下：从非洲爪蟾中取出健康蛙卵，将以常规技术构建好的AMT-pCI载体浓缩后按照59.8ng/蛙卵的量微注射入健康蛙卵，19℃培养3d，外源铵转运蛋白在蛙卵中表达后，将蛙卵钳制于-70mV，每隔70S施加时长1.5S、电压区间从-160mV到+20mV的ramp程序中检测，以稳定记录铵转运蛋白在不同条件下的电流响应特征。
本申请中，技术术语“ramp电压”是指施加电压从-160mV开始，在1.5S内以斜率为0.12mV/mS的幅度持续增加到达+20mV的电压施加程序。术语“微小电流”是指小于200nA的电流。
与现有检测技术相比，本发明公开的记录体系整合了目前常用的“Gap-free”和“Step”记录模式优点，既能实时监控AMT对不同条件的电流响应(可以通过比较不同时段相同条件下的电流以确保记录的稳定性)，同时又能稳定获取不同膜电位下的电流-电压关系曲线。既保证了电生理试验中AMT诱导微小电流记录的可靠性，又提高了数据获取的速度，可为精准表征包括AMT在内的各类转运体蛋白的功能特征提供有力的技术支撑。
附图说明
图1为Gap-free记录模式、Step记录模式和本申请连续ramp记录方法的电压施加程序、获取的原始电流信号及电流(I)-电压(V)关系曲线示意图；
其中，A-C为电压施加程序示意图：A为Gap-free记录模式、B为Step记录模式、C为本申请连续ramp记录方法；
D-F为上述电压施加程序获得的原始电流信号：D为Gap-free记录模式、E为Step记录模式、F为本申请连续ramp记录方法；
G-I为电流(I)-电压(V)关系曲线示意图：G为Gap-free记录模式、H为Step记录模式。
图2为本专利创制的连续ramp记录方法与传统的step方法数据稳定性比较结果示意图。
具体实施方式
以下实施例所涉及的试剂/器材：
双电极电压钳设备购自Axon公司,放大器型号pClamp 900A，数模转换型号Digidata 1440.质粒注射仪器Nanoliter 2000。克隆载体PMD-19T购自Takara。
Ca2+-free溶液(mM)：82.5NaCl、2KCl、1MgCl2、5HEPES、pH 7.4；
ND96溶液(mM)：96NaCl、2KCl、1MgCl2、1.8CaCl2、5HEPES、pH 7.4。
以下实施例所涉及的引物序列：
SEQ ID NO.1:5’-GTCGAATTCATGTCAGGAGCAATAACATGC-3’；
SEQ ID NO.2:5’-GTCTCTAGATTAAACGCGAGGAGGAGTAGC-3’；
实施例1
1、前期准备工作
1.1AtAMT1；3-pCI卵母细胞表达载体构建
以拟南芥cDNA为模板，以SEQ IDNO.1和SEQ IDNO.2为引物，利用高保真酶扩增AtAMT1；3开放阅读框(1497bp)；将扩增片段连入克隆载体PMD-19T。待测序正确后，利用EcoR 1+Xba1双酶切位点连入蛙卵表达载体pCI获得AtAMT1；3-pCI载体。
该AtAMT1；3-pCI载体的构建方法参见文献：Yang,G.,Sentenac,H.,Véry,A.A.,and Su,Y.(2015).Complex interactions among residues within pore regiondetermine the K+dependence of a KAT1‐type potassium channel AmKAT1.The PlantJournal 83,401-412。
1.2卵母细胞的获取以及AtAMT1；3-pCI的注射
从成熟的雌性非洲爪蟾中取出卵母细胞，利用Ca2+-free溶液清洗2-3次后，将卵母细胞置于含1mg/mL CollengaseA的Ca2+-free溶液中，放在摇床上轻轻摇动，23℃消化1-1.5hr。
弃掉消化液，利用ND96溶液清洗6-8次。在显微镜下挑选健康的蛙卵备用。
将AtAMT1；3-pCI质粒浓缩至&gt;1μg/μL，利用Nanoliter 2000微注射59.8ng质粒入每个卵母细胞(蛙卵)。然后将蛙卵置于ND96溶液+2.5mM丙酮酸钠培养液中，19℃培养3d，外源转运蛋白AtAMT1；3即在蛙卵母细胞中表达。
上述将外源蛋白导入蛙卵的方法为本领域常规技术，如文献：Yang,G.,Sentenac,H.,Véry,A.A.,and Su,Y.(2015).Complex interactions among residues within poreregion determine the K+dependence of a KAT1‐type potassium channel AmKAT1.ThePlant Journal 83,401-412；文献：Wang,L.,Yang,S.Y.,Guo,M.Y.,Huang,Y.N.,Sentenac,H.,Véry,A.A.,and Su,Y.H.(2016).The S1–S2linker determines the distinct pHsensitivity between ZmK2.1and KAT1.The Plant Journal 85,675-685.)等。
2、利用连续ramp记录体系对AtAMT1；3诱导电流进行稳定收集
AtAMT1；3在蛙卵中表达后，针对上述细胞，以连续ramp记录模式进行双电极电压钳试验，同时分别以Gap-free记录模式、step记录模式作为对比试验。
试验器材：双电极电压钳设备(主要包括：放大器pClamp 900A，数模转换器Digidata 1440，数据采集软件Clampex 10.3)。
试验步骤：
1、Gap-free记录模式：具体试验方法参见Ludewig,U.,von Wirén,N.,andFrommer,W.B.(2002).Uniport of NH4 +by the root hair plasma membrane ammoniumtransporter LeAMT1；1.Journal of Biological Chemistry 277,13548-13555.Wood,C.C.,Porée,F.,Dreyer,I.,Koehler,G.J.,and Udvardi,M.K.(2006).Mechanisms ofammonium transport,accumulation,and retention in ooyctes and yeast cellsexpressing Arabidopsis AtAMT1；1.FEBS Letters 580,3931-3936.文献公开的方法，即将蛙卵一直钳制于一个固定的膜电位(-70mV)，该电压程序的完整过程为：-70mV(持续时间：一直)，利用该程序监控：表达AtAMT1；3蛙卵首先置于无铵溶液中→慢慢通过灌流改变为有铵溶液→再通过灌流改变为无铵溶液→再通过灌流恢复到无铵溶液的整个过程的电流信号。程序如图1A所示。
2、step记录模式：具体检测步骤参见Ammonium ion transport by the AMT/Rhhomolog TaAMT1；1is stimulated by acidic pH.Pflügers Archiv-European Journalof Physiology 458,733-743.Ortiz-Ramirez,C.,Mora,S.I.,Trejo,J.,and Pantoja,O.(2011).PvAMT1；1,a highly selective ammonium transporter that functions as H+/NH4 +symporter.Journal ofBiological Chemistry 286,31113-31122.文献公开的方法。即只在蛙卵处于完成的无铵或者有铵溶液状态时，施加一次该电压程序。该电压程序的一个完整过程为：-160mV(持续200mS)→200mS后增加20mV到-140mV(持续200mS)→200mS后再增加20mV到-120mV(持续200mS)→……直到200mS后再增加20mV达到+20mV(持续200mS)。该电压程序只在完全无铵溶液或者完全有铵溶液条件下施加，通过灌流改变溶液浓度的过程不施加该电压程序(程序如图1B所示)。因为是不连续的，该程序只能监控：表达AtAMT1；3蛙卵置于在第一次完全无铵溶液中的瞬时电流信号(0min)、第一次完全有铵溶液中的瞬时电流信号(2min)、第二次完全无铵溶液中的瞬时电流信号(4min)、第二次完全有铵溶液中的瞬时电流信号(6min)，无法获得改变溶液过程中的电流信号。
3、ramp记录模式：施加程序为将蛙卵细胞钳制于-70mV,与Gap-free模式不同的是，该程序在长时间-70mV的钳制中，会每隔70S运行一个-160mV到+20mV变化的持续时间为1.5S的ramp程序电压设置，该电压从-160mV到+20mV以0.12mV/mS的斜率增加。该连续电压程序的完整过程为：-70mV(持续时间70S)→电压施加从-160mV开始，以斜率为0.12mV/mS幅度增加直到+20mV(持续时间1.5S)→一直连续重复这个过程(程序如图1C所示)。利用该程序全程监控：表达AtAMT1；3蛙卵首先置于在无铵溶液中→慢慢通过灌流改变为有铵溶液→再通过灌流改变为无铵溶液→再通过灌流恢复到无铵溶液的整个过程的电流信号。
试验结果参见图1：图1A-图1C展示的是上述三种记录模式所采用的电压施加程序。图1D-图1F展示的是上述三种记录模式所对应获取的原始数据。图1G-图1I展示的是由几种记录模式获取的最终数据展示方式电流(I)-电压(V)关系曲线。
由图1可以直观的看出：传统的记录模式之一的Gap-free记录模式下两次无铵(0mMNH4Cl，0min和4min时电流信号)和两次有铵(1mMNH4Cl，2min和6min时电流信号)的数据重现性好，即数据很可靠(图1D)。这种记录的方式的缺点是只能获取一个确定的电压下(如本程序的-70mV)下的电流响应特征，而不能获取不同细胞膜电位下的吸收速率-膜电位关系曲线这一重要指标(图1G)。
传统记录模式之二的Step记录模式获取的两次无铵(0mMNH4Cl，0min和4min)和两次有铵(1mMNH4Cl，2min和6min)的电流信号在图1E中。该记录模式可以获取不同细胞膜电位下的吸收速率-膜电位关系曲线，但是由于这种记录方法无法实时监控，因此两次重复间的重现性较差(图1H)。
而本申请创制的连续ramp记录方法吸收了两者的优势：蛙卵一直钳制于-70mV，每隔70S插入施加一个时间长度为1.5S的voltage ramp，从-160mV到+20mV捕捉电流-电压关系曲线(图1C)。连续记录可以保证实时监控信号，呈现出和Gap-free模式同样的效果。而每隔70S插入的ramp程序可以获得从-160mV到+20mV区间内的电流响应，即和step模式一样获取电流-电压关系曲线，弥补了Gap-free模式的缺陷。比较两次无铵条件下的基线电流发现其波动&lt;5nA；比较两次加铵条件下的稳态电流波动&lt;10nA(图1F)。这种波动达到了双电极电压钳设备的最低检出限(10nA)，理论上可以认为没有波动。将其中的ramp单独抽取出来发现，与step模式下相同条件重现性差相比，ramp模式获取的完全无铵条件下(0min和4min)，还是完全铵存在下(2min和6min)的的稳态电流-电压关系重现性变得更好(图1I)。
AtAMT1；3静的铵吸收信号＝完全有铵条件下的吸收信号－完全无铵条件下的吸收信号。通过比较不同记录模式下的AtAMT1；3静的铵吸收信号发现，本申请创制的连续ramp记录方法将两次重复间数据的波动性的从step记录模式下的30％降低到了&lt;5％(图2)，达到了该设备的精度极限。由此，本发明的连续ramp记录模式保证了电生理试验中AMT诱导微小电流记录的可靠性。同时，由于传统的电生理试验中需将“Gap-free”和“Step”配合起来使用，即需要两次记录才能获取较可靠数据，而本发明的连续ramp记录模式只需要一次即可获得。因此，该发明不但保证了电生理试验中AMT诱导微小电流记录的可靠性，还提高了数据获取的速度。可为利用电生理技术研究包括铵转运蛋白在内的各类转运蛋白的小电流提供有力技术支撑。
本技术领域技术人员可以理解的是，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
&lt;110&gt; 中国科学院南京土壤研究所
&lt;120&gt; 电生理试验中记录微小电流的方法
&lt;141&gt; 2018-07-17
&lt;160&gt; 2
&lt;170&gt; SIPOSequenceListing 1.0
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 30
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;400&gt; 1
gtcgaattca tgtcaggagc aataacatgc 30
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 30
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人工序列(Artificial Sequence)
&lt;400&gt; 2
gtctctagat taaacgcgag gaggagtagc 30

Claims (5)

1.一种电生理试验中记录微小电流的方法，其特征在于，具体步骤如下：外源转运蛋白在细胞中表达后，将细胞钳制于-70 mV，每隔70 S施加时长1.5S、电压区间从-160 mV到+20mV变化的ramp电压，电压变化频率为0.12 mV/mS，以获得转运蛋白在不同电压下的电流响应特征。
2.根据权利要求1所述电生理试验中记录微小电流的方法，其特征在于：所述转运蛋白包括：铵转运蛋白、硝酸根转运蛋白、氨基酸转运蛋白中的至少一种。
3.根据权利要求1所述电生理试验中记录微小电流的方法，其特征在于：所述细胞为卵母细胞或植物细胞。
4.根据权利要求1所述的电生理试验中记录微小电流的方法，其特征在于：所述转运蛋白为铵转运蛋白，所述细胞为蛙卵细胞。
5.根据权利要求4所述的电生理试验中记录微小电流的方法，其特征在于：具体步骤如下：将AMT-pCI载体以59.8 ng/蛙卵的量微注射入蛙卵细胞中，19℃培养3 d后，在双电极电压钳试验中，将蛙卵钳制于-70 mV，每隔70 S施加时长1.5 S、电压区间从-160 mV到+20 mV的ramp电压，记录铵转运蛋白的电流响应特征。
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CN1842709A (zh) * 2003-07-10 2006-10-04 塞诺米克斯公司 使用表达人的ENaC的卵母细胞的改进的电生理测定法和用于在使用膜电位报告染料的测定中提高ENaC增强子功效的PHENAMIL的用途

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