CN113234719B - 检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用，该荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，最为优选的PINK1基因截短片段为SEQ IDNO.1所示的野生型PINK1基因序列的1‑390bp。本发明所提供的荧光探针具有制备方法简单，易储存，生物毒性低等优点；基于可遗传的特点，该线粒体膜电势探针应用面广泛，结合现代成像技术，可以快速灵敏的对目标细胞、组织、器官甚至是生命体的线粒体膜电势进行准确测量。

Description

检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用

技术领域

本发明属于细胞生物学领域,具体涉及一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用。

背景技术

线粒体通过氧化呼吸链来合成ATP。在氧化呼吸链中，电子由NADH，FADH2递氢体传递到呼吸链复合物，同时将质子主动运输到内膜外。内膜内外质子浓度梯度和跨膜电位差所储存的电化学势能即为线粒体膜电势，发挥着促使质子返回线粒体内膜，推动ATP合成酶合成ATP的作用。

线粒体膜电势的维持是健康线粒体发挥正常功能从而维护细胞稳态的必要条件。膜电势的异常不仅会阻碍氧化磷酸化的正常进行，还可以激活线粒体自噬通路来消除功能异常的线粒体。在多种疾病和病理情况下均检测到细胞中线粒体膜电势的异常，因此对线粒体膜电势变化的检测有助于我们加深对于疾病发展的进一步理解，有着重要的科学意义和现实意义。

对于线粒体膜电势的检测主要有电化学方法和荧光成像等方法。电化学方法主要是利用微电极准确测量线粒体内膜内外的电势差，具有很好的准确性。但由于线粒体体积小，难以精准的嵌入微电极，限制了电化学方法进行。荧光成像方法的主要原理是在细胞中线粒体膜电势发生改变后，其荧光染料在细胞中的荧光性质会发生一定的改变，从而根据荧光信号的改变来间接反映线粒体的膜电势。荧光染料对于线粒体膜电势的测量具有简单、方便、对细胞损伤较小等优点，因而被广泛应用于科学研究当中。目前，JC-1是常用于检测线粒体膜电势的荧光探针。正常线粒体膜电势情况下，JC-1在线粒体中呈现聚集态，发出橘红色的荧光，而在低线粒体膜电势的情况下，JC-1在线粒体中呈现单体态，发出绿色荧光，因此JC-1可通过荧光颜色的变化反映线粒体膜电势的变化。然而，作为可跨越线粒体膜的染料，外源添加JC-1等荧光染料对于线粒体具有潜在的影响。同时，目前的检测线粒体膜电势荧光成像方法不具有可遗传性，难以对疾病的全程，整体进行观测。因此，开发一种可遗传检测线粒体膜电势荧光探针是非常必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针；本发明的目的之二在于提供含有所述荧光探针的重组质粒；本发明的目的之三在于提供含有所述重组质粒的转化体；本发明的目的之四在于提供所述荧光探针检测线粒体膜电势的方法；本发明的目的之五在于提供所述荧光探针在检测线粒体膜电势降低中的应用；本发明的目的之六在于提供所述荧光探针在标记线粒体在活细胞中的分布中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针，所述荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，所述PINK1基因截短片段为SEQ ID NO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp或1-240bp。

本发明中优选的，所述PINK1基因截短片段为SEQ ID NO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp。

本发明中优选的，所述荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因。

本发明中更为优选的，所述红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2、含有所述荧光探针的重组质粒。

本发明中优选的，所述重组质粒为将所述的荧光探针的核苷酸序列插入到pCMV载体或pcDNA载体的多克隆位点处。

3、含有所述重组质粒的转化体。

4、所述的荧光探针检测线粒体膜电势变化的方法，其特征在于：用含有所述荧光探针的重组质粒转染动物细胞或动物体，根据线粒体外膜上的荧光强度变化判断线粒体膜电势的变化。

5、所述荧光探针在检测线粒体膜电势降低中的应用。

6、所述荧光探针在标记线粒体在活细胞中的分布中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种检测线粒体膜电势可遗传荧光探针及其应用，该荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，最为优选的PINK1基因截短片段为SEQ ID NO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp。本发明所提供的荧光探针可通过质粒转染等方式编入宿主基因组中从而具有可遗传性，而且该荧光探针在线粒体氧化磷酸化解偶联试剂处理两小时后即有明显的效应，在利用模式动物研究线粒体膜电势作用及应用领域具有极大的潜力；并且该荧光探针具有制备方法简单，易储存，生物毒性低等优点；基于可遗传的特点，该线粒体膜电势探针应用面广泛，结合现代成像技术，可以快速灵敏的对目标细胞、组织、器官甚至是生命体的线粒体膜电势进行准确测量。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为重组载体pcDNA3.1(+)-PINK1-mRFP和pcDNA3.1(+)-TOM20-GFP共同转染Hela细胞后共定位图；

图2为重组载体pcDNA3.1(+)-gMPOR的基因序列图谱和质粒图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生化试剂原料，使用的实验仪器均为实验室常规仪器。除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1、野生型PINK1基因及重组质粒的获得

在NCBI上公布的人磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)诱导的激酶1(PTEN-inducedkinase1，PINK1)基因的序列，如SEQ ID NO.1所示(Gene ID:65018)，利用NCBI工具primerBLAST选择到特异性引物，具体引物序列如下：

PINK1-F：gaattcatggcggtgcgacaggcgctgg(SEQ ID NO.2)；

PINK1-R：gcggccgctcacagggctgccctccatgag(SEQ ID NO.3)

在前向引物ATG前增加GAATTC(EcoR I酶切位点)，在其反向引物终止密码子TGA后增加gcggccgc(Not I酶切位点)，引物由北京华大基因科技有限公司合成所得。随后，利用PCR从HEK293T细胞的cDNA进行扩增获得野生型PINK1基因，之后用限制性内切酶EcoRI和Not I对野生型PINK1基因进行双酶切，同时，使用限制性内切酶EcoR I和Not I对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4连接酶将两个产物连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定确定载体构建成功，命名为pcDNA3.1(+)-wtPINK1。

实施例2、红色荧光蛋白基因及重组质粒的获得

从实验室保存的质粒pcDNA3.1(+)-RFP中获取到如SEQ ID NO.4所示的红色荧光蛋白序列，在起始密码子ATG前增加gcggccgcggccacc(Not I酶切位点和Kozak序列)，在终止密码子后增加TCTAGA(XbaI酶切位点)，设计相应引物后，引物由北京华大基因科技有限公司合成所得，具体引物序列如下：

mRFP-F：gcggccgcGGCCACCatggcctcctccgaggacgt(SEQ ID NO.5)；

mRFP-R：tctagattaggcgccggtggagtggc(SEQ ID NO.6)；

随后，利用PCR从质粒pcDNA3.1(+)-RFP扩增获得红色荧光蛋白基因，之后用限制性内切酶Not I和Xba I对红色荧光蛋白基因进行双酶切，同时，使用限制性内切酶Not I和Xba I对pcDNA3.1(+)载体进行双酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4连接酶将两个产物连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，酶切鉴定，测序鉴定确定载体构建成功，命名为pcDNA3.1(+)-mRFP。

实施例3、检测线粒体膜电势可遗传荧光探针基因及重组质粒的获得

为了保留PINK1基因对于膜电势变化的灵敏度，同时去除PINK1对于线粒体自噬的介导能力，本发明通过去除PINK1基因(SEQ ID NO.1)480bp之后的核苷酸序列，即PINK1酶活性区域和C末端区域，从剩下的1-480bp核苷酸序列中，筛选出能够响应线粒体膜电势变化的最优PINK1 N端核苷酸序列。通过在起始密码子ATG前增加GAATTC(EcoR I酶切位点)，在不同长度的PINK1 N端序列基因后增加gcggccgc(Not I酶切位点)，引物由北京华大基因科技有限公司合成所得。随后，利用PCR从野生型PINK1基因处获得带有酶切位点的不同长度的PINK1 N端序列基因，之后用限制性内切酶EcoR I和Not I对不同长度PINK1 N端序列基因进行双酶切，同时，使用限制性内切酶EcoR I和Not I对pcDNA3.1(+)-mRFP载体进行双酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4连接酶将两个产物连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，酶切鉴定，送测序鉴定确定载体构建成功，载体命名为pcDNA3.1(+)-PINK1-mRFP。

pcDNA3.1(+)-TOM20-GFP重组质粒构建过程如下：从HEK293T细胞cDNA中扩增1-126bp TOM20序列(SEQ ID NO.7)，该序列包含TOM20的线粒体引导序列，能够引导融合蛋白靶向线粒体，具体引物为：

TOM20-F：ccaagctggctagcgtttaaacttaagcttatggtgggtcggaacagcgc(SEQ IDNO.8)；

TOM20-R：agctcctcgcccttgctcacGCCTGATGATCCACCTCCtcttcgttctcgaagcctgt(SEQ ID NO.9)；

随后从实验室保存质粒pCDNA3.1(+)中扩增出GFP序列(SEQ ID NO.10)，具体引物为：

GFP-F：acaggcttcgagaacgaagaGGAGGTGGATCATCAGGCgtgagcaagggcgaggagct(SEQID NO.11)；

GFP-R：cgagcggccgcgaattcttacttgtacagctcgtccatgc(SEQ ID NO.12)；

随后将1-126bp TOM20和GFP使用重叠PCR进行连接，之后使用限制性内切酶HindIII(AAGCTT)和EcoR I(GAATTC)对TOM20-GFP序列进行双酶切，同时，使用限制性内切酶Hind III和EcoR I对pCDNA3.1(+)载体进行双酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4连接酶将两个产物连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，酶切鉴定，送测序鉴定确定载体构建成功，载体命名为pcDNA3.1(+)-TOM20-GFP。

实施例4、不同长度的线粒体膜电势可遗传荧光探针基因对于膜电势改变的响应能力

分别将含有1-240bp、1-480bp、1-390bp的PINK1 N端核苷酸序列的重组载体pcDNA3.1(+)-PINK1-mRFP和指示线粒体pcDNA3.1(+)-TOM20-GFP重组质粒共同转染Hela细胞，结果如图1所示，图1中CTL为对照组，CCCP为处理组。对照组加入溶剂DMSO，处理组加入线粒体氧化磷酸化解偶联剂CCCP，其中CCCP能够携带质子穿越线粒体内膜，发挥降低线粒体膜电势的功能。在CCCP处理2h后终止反应，固定，DAPI染色，加入抗荧光淬灭剂后，使用莱卡激光扫描共聚焦显微镜观察细胞线粒体。指示线粒体的绿色荧光蛋白可采用波长488nm激发，检测波段为绿光波段500-550nm；指示膜电势变化的红色荧光蛋白可采用波长510-550nm激发，检测波段为红光波段600-650nm；指示细胞核的DAPI可采用波长405nm激发，检测波段为410-450nm。以1-240bp和1-480bp PINK1 N端核苷酸序列为例，如图1所示，在对照组中，红色荧光分布在线粒体和细胞质中，和指示线粒体的绿色荧光有弱共定位；而在CCCP处理组中未出现明显的改变。而在1-390bp PINK1 N端序列中(gMPOR)，对照组红色荧光分布在线粒体和细胞质中，和指示线粒体的绿色荧光有弱共定位，而在CCCP处理组中，红色荧光聚集在线粒体上，和指示线粒体的绿色荧光有强共定位。因此最终筛选得到了390bpPINK1 N端序列对于线粒体膜电势变化的响应最为明显，将筛选到的最优重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-gMPOR，所述gMPOR的核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列为SEQ IDNO.14所示，基因序列图谱和质粒图谱如图2所示。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atggcggtgc gacaggcgct gggccgcggc ctgcagctgg gtcgagcgct gctgctgcgc 60

ttcacgggca agcccggccg ggcctacggc ttggggcggc cgggcccggc ggcgggctgt 120

gtccgcgggg agcgtccagg ctgggccgca ggaccgggcg cggagcctcg cagggtcggg 180

ctcgggctcc ctaaccgtct ccgcttcttc cgccagtcgg tggccgggct ggcggcgcgg 240

ttgcagcggc agttcgtggt gcgggcctgg ggctgcgcgg gcccttgcgg ccgggcagtc 300

tttctggcct tcgggctagg gctgggcctc atcgaggaaa aacaggcgga gagccggcgg 360

gcggtctcgg cctgtcagga gatccaggca atttttaccc agaaaagcaa gccggggcct 420

gacccgttgg acacgagacg cttgcagggc tttcggctgg aggagtatct gatagggcag 480

tccattggta agggctgcag tgctgctgtg tatgaagcca ccatgcctac attgccccag 540

aacctggagg tgacaaagag caccgggttg cttccaggga gaggcccagg taccagtgca 600

ccaggagaag ggcaggagcg agctccgggg gcccctgcct tccccttggc catcaagatg 660

atgtggaaca tctcggcagg ttcctccagc gaagccatct tgaacacaat gagccaggag 720

ctggtcccag cgagccgagt ggccttggct ggggagtatg gagcagtcac ttacagaaaa 780

tccaagagag gtcccaagca actagcccct caccccaaca tcatccgggt tctccgcgcc 840

ttcacctctt ccgtgccgct gctgccaggg gccctggtcg actaccctga tgtgctgccc 900

tcacgcctcc accctgaagg cctgggccat ggccggacgc tgttcctcgt tatgaagaac 960

tatccctgta ccctgcgcca gtacctttgt gtgaacacac ccagcccccg cctcgccgcc 1020

atgatgctgc tgcagctgct ggaaggcgtg gaccatctgg ttcaacaggg catcgcgcac 1080

agagacctga aatccgacaa catccttgtg gagctggacc cagacggctg cccctggctg 1140

gtgatcgcag attttggctg ctgcctggct gatgagagca tcggcctgca gttgcccttc 1200

agcagctggt acgtggatcg gggcggaaac ggctgtctga tggccccaga ggtgtccacg 1260

gcccgtcctg gccccagggc agtgattgac tacagcaagg ctgatgcctg ggcagtggga 1320

gccatcgcct atgaaatctt cgggcttgtc aatcccttct acggccaggg caaggcccac 1380

cttgaaagcc gcagctacca agaggctcag ctacctgcac tgcccgagtc agtgcctcca 1440

gacgtgagac agttggtgag ggcactgctc cagcgagagg ccagcaagag accatctgcc 1500

cgagtagccg caaatgtgct tcatctaagc ctctggggtg aacatattct agccctgaag 1560

aatctgaagt tagacaagat ggttggctgg ctcctccaac aatcggccgc cactttgttg 1620

gccaacaggc tcacagagaa gtgttgtgtg gaaacaaaaa tgaagatgct ctttctggct 1680

aacctggagt gtgaaacgct ctgccaggca gccctcctcc tctgctcatg gagggcagcc 1740

ctgtga 1746

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaattcatgg cggtgcgaca ggcgctgg 28

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggccgctc acagggctgc cctccatgag 30

<210> 4

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggcctcct ccgaggacgt catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccctc agttccagta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac 360

aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag 480

atcaagatga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgccgaggt caagaccacc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca agaccgacat caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgagcgcgc cgagggccgc 660

cactccaccg gcgcctaa 678

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcggccgcgg ccaccatggc ctcctccgag gacgt 35

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctagattag gcgccggtgg agtggc 26

<210> 7

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggtgggtc ggaacagcgc catcgccgcc ggtgtatgcg gggccctttt cattgggtac 60

tgcatctact tcgaccgcaa aagacgaagt gaccccaact tcaagaacag gcttcgagaa 120

cgaaga 126

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaagctggc tagcgtttaa acttaagctt atggtgggtc ggaacagcgc 50

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acaggcttcg agaacgaaga ggaggtggat catcaggcgt gagcaagggc gaggagct 58

<210> 10

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaggtggat catcaggcgt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 60

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 120

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 180

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 240

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 300

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 360

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 420

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 480

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 540

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 600

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 660

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 720

gagctgtaca agtaa 735

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acaggcttcg agaacgaaga ggaggtggat catcaggcgt gagcaagggc gaggagct 58

<210> 12

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agcggccgcg aattcttact cggtcagtct tcttctcagc tcctcctcca gtctgctggg 60

cttgtacagc tcgtccatgc 80

<210> 13

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggcggtgc gacaggcgct gggccgcggc ctgcagctgg gtcgagcgct gctgctgcgc 60

ttcacgggca agcccggccg ggcctacggc ttggggcggc cgggcccggc ggcgggctgt 120

gtccgcgggg agcgtccagg ctgggccgca ggaccgggcg cggagcctcg cagggtcggg 180

ctcgggctcc ctaaccgtct ccgcttcttc cgccagtcgg tggccgggct ggcggcgcgg 240

ttgcagcggc agttcgtggt gcgggcctgg ggctgcgcgg gcccttgcgg ccgggcagtc 300

tttctggcct tcgggctagg gctgggcctc atcgaggaaa aacaggcgga gagccggcgg 360

gcggtctcgg cctgtcagga gatccaggca gcggccgcgg ccaccatggc ctcctccgag 420

gacgtcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcgcatgg agggctccgt gaacggccac 480

gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag 540

ctgaaggtga ccaagggcgg ccccctgccc ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc 600

cagtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg 660

tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg 720

accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc 780

ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc 840

tccaccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg gcgagatcaa gatgaggctg 900

aagctgaagg acggcggcca ctacgacgcc gaggtcaaga ccacctacat ggccaagaag 960

cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaagacc gacatcaagc tggacatcac ctcccacaac 1020

gaggactaca ccatcgtgga acagtacgag cgcgccgagg gccgccactc caccggcgcc 1080

taa 1083

<210> 14

<211> 360

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Ala Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Gln Leu Gly Arg Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Arg Phe Thr Gly Lys Pro Gly Arg Ala Tyr Gly Leu Gly

20 25 30

Arg Pro Gly Pro Ala Ala Gly Cys Val Arg Gly Glu Arg Pro Gly Trp

35 40 45

Ala Ala Gly Pro Gly Ala Glu Pro Arg Arg Val Gly Leu Gly Leu Pro

50 55 60

Asn Arg Leu Arg Phe Phe Arg Gln Ser Val Ala Gly Leu Ala Ala Arg

65 70 75 80

Leu Gln Arg Gln Phe Val Val Arg Ala Trp Gly Cys Ala Gly Pro Cys

85 90 95

Gly Arg Ala Val Phe Leu Ala Phe Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ile Glu

100 105 110

Glu Lys Gln Ala Glu Ser Arg Arg Ala Val Ser Ala Cys Gln Glu Ile

115 120 125

Gln Ala Ala Ala Ala Ala Thr Met Ala Ser Ser Glu Asp Val Ile Lys

130 135 140

Glu Phe Met Arg Phe Lys Val Arg Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His

145 150 155 160

Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr

165 170 175

Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala

180 185 190

Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val

195 200 205

Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu

210 215 220

Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val

225 230 235 240

Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys

245 250 255

Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln

260 265 270

Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Thr Glu Arg Met Tyr Pro Glu

275 280 285

Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Met Arg Leu Lys Leu Lys Asp

290 295 300

Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Met Ala Lys Lys

305 310 315 320

Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Lys Thr Asp Ile Lys Leu Asp Ile

325 330 335

Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala

340 345 350

Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Ala

355 360

Claims (9)

1.一种检测线粒体膜电势的可遗传荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是由PINK1基因截短片段和荧光蛋白基因融合所得，所述PINK1基因截短片段为SEQ ID NO.1所示的野生型PINK1基因序列的1-390bp。

2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于：所述荧光蛋白基因为红色荧光蛋白基因。

3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于：所述红色荧光蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.含有权利要求1~3任一项所述的荧光探针的重组质粒。

5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为将权利要求1~3任一项所述的荧光探针的核苷酸序列插入到pCMV载体或pcDNA载体的多克隆位点处。

6.含有权利要求4或5所述的重组质粒的转化体。

7.权利要求1~3任一项所述的荧光探针检测线粒体膜电势变化的方法，其特征在于：用含有权利要求1~3任一项所述的荧光探针的重组质粒转染动物细胞或动物体，根据线粒体外膜上的荧光强度变化判断线粒体膜电势的变化，所述方法用于非诊断目的。

8.权利要求1~3任一项所述的荧光探针在检测线粒体膜电势降低中的应用，所述应用为非诊断目的。

9.权利要求1~3任一项所述的荧光探针在标记线粒体在活细胞中的分布中的应用，所述应用为非诊断目的。

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