CN112661859A - 一种基于fret的活细胞内pim蛋白活性检测生物探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其包含FRET荧光蛋白对ECFP与Ypet、可折叠蛋白序列接头、PIM蛋白的主要功能结构域序列以及PIM蛋白的底物蛋白Hsp90α的关键结合序列五个部分。探针转染细胞后能够在活细胞内自行表达，通过荧光信号的变化定量地反映活细胞内PIM蛋白活性程度和表达水平的变化。该生物探针具有对细胞毒副作用微小、实时动态检测、使用简便、成本低等优点。

Description

一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针

技术领域

本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针。

背景技术

莫罗尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点(proviral integration of MMLV,PIM)蛋白激酶的活性和表达水平与干细胞分化和多种癌症的发生发展密切相关。PIM蛋白参与调控细胞周期，参与干细胞分化和胚胎发育，并且在淋巴癌、卵巢癌及多种实体瘤细胞中有高水平表达。PIM蛋白的功能发挥与其活性状态和表达水平息息相关。目前还没有可以一种可以实现对活细胞内PIM蛋白的活性状态进行动态检测的有效方法。鉴于此，本发明提出一种基于FRET技术、以分子生物学技术构建探针工具以实时观测活细胞内PIM蛋白水平的检测方法，它的优点是对细胞毒性作用微小、使用方便、实时动态检测、成本低等。

发明内容

本发明提供一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术和常规生物工程亚克隆技术设计制备探针工具，将探针转染细胞，使用荧光显微镜实时观测FRET比率变化继而反映细胞内PIM蛋白的活性水平。该生物探针蛋白在活细胞内自行表达，基于蛋白构象与活性的关系以及FRET效应对距离的敏感性，通过荧光信号的变化定量地反映活细胞内PIM蛋白活性程度和表达水平的变化。

本发明通过构建生物探针转染细胞，基于蛋白构象与活性的关系以及FRET效应对距离的敏感性，实现活细胞内PIM蛋白活性可视化。PIM蛋白活性可视化FRET探针工具包含FRET荧光蛋白对ECFP与Ype、可折叠蛋白接头序列(Linker)、PIM蛋白的主要功能结构域序列以及PIM蛋白的底物蛋白Hsp90α的关键结合序列五个部分，运用亚克隆技术，即聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction,PCR)、核酸特异性酶切和连接实验技术，对这五个部分的DNA序列进行剪切和拼接重构，并与pcDNA3.1(+)形成重组质粒。其中探针设计截取的热休克蛋白90α(heat shock protein90α,Hsp90α)序列仅为其与PIM蛋白结合的必需部分，其与探针表达的PIM蛋白结合，既可以排除热休克蛋白Hsp90α功能变化对探针工作的干扰，又可以减低外源PIM蛋白水平升高对细胞的影响。

本发明的技术方案为：

一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其包括连接在可折叠蛋白接头两端的PIM蛋白功能结构域和Hsp90α结合区，PIM蛋白功能结构域和Hsp90α结合区分别连接FRET荧光蛋白对的两个蛋白；

其中，可折叠蛋白接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸如SEQ ID NO.8所示；

PIM蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ ID NO.6所示。

Hsp90α结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述的FRET荧光蛋白对选自蓝色荧光蛋白(bluefluorescentprotein,BFP)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，GFP及其变体(EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)及其变体(mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby)，青色荧光蛋白(cyan fluorescentprotein,CFP)及其变体(mTurquoise2,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和ECFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)及其变体(EYFP,mVenus,mCitrine,sEYFP和YPet)。

在一个优选的实施方案中，所述的FRET荧光蛋白对为增强型绿色荧光蛋白(enhanced cyan fluorescent protein,ECFP)和能量转移黄色荧光蛋白(yellowfluorescent protein for energy transfer,Ypet)。

在一个优选的实施方案中，基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，各部分具体氨基酸及核苷酸序列如下所示：基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针完整氨基酸序列为(SEQ ID NO.1)：

MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHRFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKAHFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAMYQVGPLLGSGGFGSVYSGIRVSDNLPVAIKHVEKDRISDWGELPNGTRVPMEVVLLKKVSSGFSGVIRLLDWFERPDSFVLILERPEPVQDLFDFITERGALQEELARSFFWQVLEAVRHCHNCGVLHRDIKDENILIDLNRGELKLIDFGSGALLKDTVYTGGSGGTELPEDEEEKKKQEEKKTKFENLCKIMKDIMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLLCTTGKLPVPWPTLVTTLGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALFKDPNEKRDHMVLLEFLTAAGITEGMNELYK

基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针完整核苷酸序列为(SEQ IDNO.2)：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAGGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGTACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCCACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCATGTACCAGGTGGGCCCGCTACTGGGCAGCGGCGGCTTCGGCTCGGTCTACTCAGGCATCCGCGTCTCCGACAACTTGCCGGTGGCCATCAAACACGTGGAGAAGGACCGGATTTCCGACTGGGGAGAGCTGCCTAATGGCACTCGAGTGCCCATGGAAGTGGTCCTGCTGAAGAAGGTGAGCTCGGGTTTCTCCGGCGTCATTAGGCTCCTGGACTGGTTCGAGAGGCCCGACAGTTTCGTCCTGATCCTGGAGAGGCCCGAGCCGGTGCAAGATCTCTTCGACTTCATCACGGAAAGGGGAGCCCTGCAAGAGGAGCTGGCCCGCAGCTTCTTCTGGCAGGTGCTGGAGGCCGTGCGGCACTGCCACAACTGCGGGGTGCTCCACCGCGACATCAAGGACGAAAACATCCTTATCGACCTCAATCGCGGCGAGCTCAAGCTCATCGACTTCGGGTCGGGGGCGCTGCTCAAGGACACCGTCTACACGGGTGGCTCTGGCGGTACTGAACTTCCAGAGGATGAAGAAGAGAAAAAGAAGCAGGAAGAGAAAAAAACAAAGTTTGAGAACCTCTGCAAAATCATGAAAGACATAATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTCACTGGTGTTGTCCCAATTTTGGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGTCACAAATTTTCTGTCTCCGGTGAAGGTGAAGGTGATGCTACGTACGGTAAATTGACCTTAAAATTACTCTGTACTACTGGTAAATTGCCAGTTCCATGGCCAACCTTAGTCACTACTTTAGGTTATGGTGTTCAATGTTTTGCTAGATACCCAGATCATATGAAACAACATGACTTTTTCAAGTCTGCCATGCCAGAAGGTTATGTTCAAGAAAGAACTATTTTTTTCAAAGATGACGGTAACTACAAGACCAGAGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCTTAGTTAATAGAATCGAATTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGTAACATTTTAGGTCACAAATTGGAATACAACTATAACTCTCACAATGTTTACATCACTGCTGACAAACAAAAGAATGGTATCAAAGCTAACTTCAAAATTAGACACAACATTGAAGATGGTGGTGTTCAATTAGCTGACCATTATCAACAAAATACTCCAATTGGTGATGGTCCAGTCTTGTTACCAGACAACCATTACTTATCCTATCAATCTGCCTTATTCAAAGATCCAAACGAAAAGAGAGACCACATGGTCTTGTTAGAATTTTTGACTGCTGCTGGTATTACCGAGGGTATGAATGAATTGTACAAATAG

Hsp90α氨基酸序列为(SEQ ID NO.3)：

ELPEDEEEKKKQEEKKTKFENLCKIMKDI

其对应的DNA序列为(SEQ ID NO.4)：

GAACTTCCAGAGGATGAAGAAGAGAAAAAGAAGCAGGAAGAGAAAAAAACAAAGTTTGAGAACCTCTGCAAAATCATGAAAGACATA

PIM蛋白氨基酸序列为(SEQ ID NO.5)：

MYQVGPLLGSGGFGSVYSGIRVSDNLPVAIKHVEKDRISDWGELPNGTRVPMEVVLLKKVSSGFSGVIRLLDWFERPDSFVLILERPEPVQDLFDFITERGALQEELARSFFWQVLEAVRHCHNCGVLHRDIKDENILIDLNRGELKLIDFGSGALLKDTVYT

对应的DNA序列为(SEQ ID NO.6)：

ATGTACCAGGTGGGCCCGCTACTGGGCAGCGGCGGCTTCGGCTCGGTCTACTCAGGCATCCGCGTCTCCGACAACTTGCCGGTGGCCATCAAACACGTGGAGAAGGACCGGATTTCCGACTGGGGAGAGCTGCCTAATGGCACTCGAGTGCCCATGGAAGTGGTCCTGCTGAAGAAGGTGAGCTCGGGTTTCTCCGGCGTCATTAGGCTCCTGGACTGGTTCGAGAGGCCCGACAGTTTCGTCCTGATCCTGGAGAGGCCCGAGCCGGTGCAAGATCTCTTCGACTTCATCACGGAAAGGGGAGCCCTGCAAGAGGAGCTGGCCCGCAGCTTCTTCTGGCAGGTGCTGGAGGCCGTGCGGCACTGCCACAACTGCGGGGTGCTCCACCGCGACATCAAGGACGAAAACATCCTTATCGACCTCAATCGCGGCGAGCTCAAGCTCATCGACTTCGGGTCGGGGGCGCTGCTCAAGGACACCGTCTACACG

Linker氨基酸序列为：

GGSGGT(SEQ ID NO.7)

对应的DNA序列为：

GGTGGCTCTGGCGGTACT(SEQ ID NO.8)

另一方面，本发明提供了一种重组质粒，其包含上述的SEQ ID NO.2所示的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针完整核苷酸序列。

进一步地，所述的重组质粒的载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNA^TM 3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4表达载体。

在一个优选的实施方案中，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1(+)载体。

在一个优选的实施方案中，基于常规亚克隆技术构建包含探针序列的重组质粒，基于蛋白激酶活性与构象关系和FRET原理检测活细胞内PIM蛋白活性。将构建的探针转染入活细胞，细胞自行翻译表达出重构融合探针蛋白结构，荧光蛋白对的FRET荧光效应随着PIM蛋白活性变化引起的蛋白构象变化而变化，使用FRET荧光显微镜动态检测分析活细胞内能量转移的动态效率变化，从而检测活细胞内PIM蛋白活性水平和表达水平的变化。

本发明的有益效果：

本发明提供一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性可视化检测的生物探针，该探针将PIM蛋白活性变化时产生的蛋白构象变化通过FRET现象反映出来，从而实现活细胞内PIM蛋白活性可视化检测。将构建的探针工具转染入活细胞，自行表达出荧光蛋白重构融合探针结构，使用FRET荧光显微镜动态检测分析活细胞内能量转移的动态效率变化，从而检测活细胞内PIM蛋白活性的变化。该探针实现了在活体细胞内对PIM蛋白活性水平的动态检测，具有操作简便、成本低、对细胞毒副作用微小、可动态检测等特点，为PIM蛋白功能研究和相关疾病研究提供了一种可视化工具。

附图说明

图1是本发明基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针的制备流程图。

图2(a)是基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针结构图。

图2(b)是基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针的工作原理图。

图3(a)是基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针转入不同真核细胞的荧光图像。

图3(b)是基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针验证的细胞比率分析图像。

图3(c)是基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针验证数据的统计图(实验组数n＝7；errorbar选择SEM)。

图中：2-1 ECFP；2-2 PIM；2-3 Linker蛋白；2-4 Hsp90α；2-5 Ypet

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例

本发明主要通过对DNA片段进行PCR扩增、限制性核酸内切酶消化和DNA片段粘性末端连接获得重组质粒，然后将重组质粒转化入DH5α进行筛选和扩增等实验获取目的探针；探针制备具体实验流程如图1所示。

测试例1：

使用脂质体转染法将本实施例中制备的探针转染到活细胞体内后，细胞能够表达出重构的融合荧光蛋白，其中Linker蛋白2-3折叠，PIM蛋白2-1与Hsp90α2-4结合。本探针具有稳定性特征，可以在多种活细胞体内工作，在人宫颈癌细胞HeLa和人骨肉瘤细胞U-2 OS内都能正常表达并产生荧光，如图3(a)所示。

测试例2：

对转染实施例中制备的探针的细胞施加PIM特异性抑制剂AZD1208(1μM)后，PIM蛋白活性降低，整个探针蛋白构象随之变化，引起荧光蛋白对ECFP2-1和Ypet2-5间距变大，从而使FRET效率降低。给予转染后的细胞436nm波长的激发光，利用FRET显微镜同时采集474nm和530nm波长上的荧光图像，然后通过474nm/530nm荧光强度比例分析能量转移的动态效率变化，荧光比率变化与蛋白活性变化一致；亚细胞荧光强度比例图如图3(b)所示，加入药物刺激的细胞荧光比率归一化数据时间曲线图如图3(c)所示。

综上，本探针转染细胞后可以在活细胞内稳定表达探针蛋白，给予转染后的细胞436nm波长的激发光，利用FRET显微镜同时采集474nm和530nm波长上的荧光图像，然后通过474nm/530nm荧光强度比例分析能量转移的动态效率变化，FRET效率的高低变化即可反映PIM蛋白活性水平的升降。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针

<130> 2020

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 664

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针氨基酸序列

<400> 1

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Arg Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Trp Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Ile Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Ala His Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Met Tyr Gln Val Gly Pro Leu Leu Gly Ser Gly Gly

225 230 235 240

Phe Gly Ser Val Tyr Ser Gly Ile Arg Val Ser Asp Asn Leu Pro Val

245 250 255

Ala Ile Lys His Val Glu Lys Asp Arg Ile Ser Asp Trp Gly Glu Leu

260 265 270

Pro Asn Gly Thr Arg Val Pro Met Glu Val Val Leu Leu Lys Lys Val

275 280 285

Ser Ser Gly Phe Ser Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg

290 295 300

Pro Asp Ser Phe Val Leu Ile Leu Glu Arg Pro Glu Pro Val Gln Asp

305 310 315 320

Leu Phe Asp Phe Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala

325 330 335

Arg Ser Phe Phe Trp Gln Val Leu Glu Ala Val Arg His Cys His Asn

340 345 350

Cys Gly Val Leu His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Ile Leu Ile Asp

355 360 365

Leu Asn Arg Gly Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Leu

370 375 380

Leu Lys Asp Thr Val Tyr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Thr Glu Leu Pro

385 390 395 400

Glu Asp Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln Glu Glu Lys Lys Thr Lys Phe

405 410 415

Glu Asn Leu Cys Lys Ile Met Lys Asp Ile Met Ser Lys Gly Glu Glu

420 425 430

Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val

435 440 445

Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr

450 455 460

Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Leu Leu Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro

465 470 475 480

Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Gly Tyr Gly Val Gln Cys

485 490 495

Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser

500 505 510

Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp

515 520 525

Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr

530 535 540

Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly

545 550 555 560

Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val

565 570 575

Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys

580 585 590

Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln Leu Ala Asp His Tyr

595 600 605

Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

610 615 620

His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu Phe Lys Asp Pro Asn Glu Lys

625 630 635 640

Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Leu Thr Ala Ala Gly Ile Thr

645 650 655

Glu Gly Met Asn Glu Leu Tyr Lys

660

<210> 2

<211> 1995

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针核苷酸序列

<400> 2

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacag gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg taccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacat cagccacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg cccacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccatgtac caggtgggcc cgctactggg cagcggcggc 720

ttcggctcgg tctactcagg catccgcgtc tccgacaact tgccggtggc catcaaacac 780

gtggagaagg accggatttc cgactgggga gagctgccta atggcactcg agtgcccatg 840

gaagtggtcc tgctgaagaa ggtgagctcg ggtttctccg gcgtcattag gctcctggac 900

tggttcgaga ggcccgacag tttcgtcctg atcctggaga ggcccgagcc ggtgcaagat 960

ctcttcgact tcatcacgga aaggggagcc ctgcaagagg agctggcccg cagcttcttc 1020

tggcaggtgc tggaggccgt gcggcactgc cacaactgcg gggtgctcca ccgcgacatc 1080

aaggacgaaa acatccttat cgacctcaat cgcggcgagc tcaagctcat cgacttcggg 1140

tcgggggcgc tgctcaagga caccgtctac acgggtggct ctggcggtac tgaacttcca 1200

gaggatgaag aagagaaaaa gaagcaggaa gagaaaaaaa caaagtttga gaacctctgc 1260

aaaatcatga aagacataat gtctaaaggt gaagaattat tcactggtgt tgtcccaatt 1320

ttggttgaat tagatggtga tgttaatggt cacaaatttt ctgtctccgg tgaaggtgaa 1380

ggtgatgcta cgtacggtaa attgacctta aaattactct gtactactgg taaattgcca 1440

gttccatggc caaccttagt cactacttta ggttatggtg ttcaatgttt tgctagatac 1500

ccagatcata tgaaacaaca tgactttttc aagtctgcca tgccagaagg ttatgttcaa 1560

gaaagaacta tttttttcaa agatgacggt aactacaaga ccagagctga agtcaagttt 1620

gaaggtgata ccttagttaa tagaatcgaa ttaaaaggta ttgattttaa agaagatggt 1680

aacattttag gtcacaaatt ggaatacaac tataactctc acaatgttta catcactgct 1740

gacaaacaaa agaatggtat caaagctaac ttcaaaatta gacacaacat tgaagatggt 1800

ggtgttcaat tagctgacca ttatcaacaa aatactccaa ttggtgatgg tccagtcttg 1860

ttaccagaca accattactt atcctatcaa tctgccttat tcaaagatcc aaacgaaaag 1920

agagaccaca tggtcttgtt agaatttttg actgctgctg gtattaccga gggtatgaat 1980

gaattgtaca aatag 1995

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Hsp90α氨基酸序列

<400> 3

Glu Leu Pro Glu Asp Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln Glu Glu Lys Lys

1 5 10 15

Thr Lys Phe Glu Asn Leu Cys Lys Ile Met Lys Asp Ile

20 25

<210> 4

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Hsp90αDNA序列

<400> 4

gaacttccag aggatgaaga agagaaaaag aagcaggaag agaaaaaaac aaagtttgag 60

aacctctgca aaatcatgaa agacata 87

<210> 5

<211> 163

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PIM蛋白氨基酸序列

<400> 5

Met Tyr Gln Val Gly Pro Leu Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Ser Val

1 5 10 15

Tyr Ser Gly Ile Arg Val Ser Asp Asn Leu Pro Val Ala Ile Lys His

20 25 30

Val Glu Lys Asp Arg Ile Ser Asp Trp Gly Glu Leu Pro Asn Gly Thr

35 40 45

Arg Val Pro Met Glu Val Val Leu Leu Lys Lys Val Ser Ser Gly Phe

50 55 60

Ser Gly Val Ile Arg Leu Leu Asp Trp Phe Glu Arg Pro Asp Ser Phe

65 70 75 80

Val Leu Ile Leu Glu Arg Pro Glu Pro Val Gln Asp Leu Phe Asp Phe

85 90 95

Ile Thr Glu Arg Gly Ala Leu Gln Glu Glu Leu Ala Arg Ser Phe Phe

100 105 110

Trp Gln Val Leu Glu Ala Val Arg His Cys His Asn Cys Gly Val Leu

115 120 125

His Arg Asp Ile Lys Asp Glu Asn Ile Leu Ile Asp Leu Asn Arg Gly

130 135 140

Glu Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Ser Gly Ala Leu Leu Lys Asp Thr

145 150 155 160

Val Tyr Thr

<210> 6

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PIM蛋白核苷酸序列

<400> 6

atgtaccagg tgggcccgct actgggcagc ggcggcttcg gctcggtcta ctcaggcatc 60

cgcgtctccg acaacttgcc ggtggccatc aaacacgtgg agaaggaccg gatttccgac 120

tggggagagc tgcctaatgg cactcgagtg cccatggaag tggtcctgct gaagaaggtg 180

agctcgggtt tctccggcgt cattaggctc ctggactggt tcgagaggcc cgacagtttc 240

gtcctgatcc tggagaggcc cgagccggtg caagatctct tcgacttcat cacggaaagg 300

ggagccctgc aagaggagct ggcccgcagc ttcttctggc aggtgctgga ggccgtgcgg 360

cactgccaca actgcggggt gctccaccgc gacatcaagg acgaaaacat ccttatcgac 420

ctcaatcgcg gcgagctcaa gctcatcgac ttcgggtcgg gggcgctgct caaggacacc 480

gtctacacg 489

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Linker氨基酸

<400> 7

Gly Gly Ser Gly Gly Thr

1 5

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Linker DNA序列

<400> 8

ggtggctctg gcggtact 18

Claims (7)

1.一种基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针包括连接在可折叠蛋白接头两端的PIM蛋白功能结构域和Hsp90α结合区，PIM蛋白功能结构域和Hsp90α结合区分别连接FRET荧光蛋白对的两个蛋白；

其中，可折叠蛋白接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸如SEQ ID NO.8所示；

PIM蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ ID NO.6所示；

Hsp90α结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的FRET荧光蛋白对选自BFP和GFP，GFP及其变体和RFP及其变体，CFP及其变体和YFP及其变体。

3.根据权利要求2所述的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其特征在于，GFP的变体选自EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus，RFP的变体选自mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby；CFP的变体选自ECFP,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和mTurquoise2，YFP的变体选自EYFP,mVenus,mCitrine,sEYFP和YPet。

4.根据权利要求3所述的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的FRET荧光蛋白对为ECFP和YPet。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒包含如权利要求1至5中任一项所述的基于FRET的活细胞内PIM蛋白活性检测生物探针的核苷酸序列，所述的重组质粒的载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNA^TM 3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4表达载体。

7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1(+)载体。

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