CN115947866A - 一种基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针及其重组质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针及其重组质粒，所述探针包含FRET荧光蛋白对ECFP与Ypet、可折叠蛋白序列接头、Paxillin蛋白的主要功能结构域序列以及Paxillin蛋白的底物蛋白Src关键结合序列(Src homology 2domains，SH2)五个部分。探针转染细胞后能够在活细胞内自行表达，通过两种荧光蛋白的FRET效率的变化定量地反映活细胞内Paxillin蛋白活性程度的变化。该生物探针具有对细胞毒性作用微小、使用简便、实时动态检测、检测结果直观、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针。
背景技术
Paxillin是一种定位于细胞局部黏着斑(focal adhesion,FAs)的多结构域适配蛋白，其序列含有大量的磷酸化活性位点，Paxillin的活性和表达水平与FAs的组装、拆卸以及FAs中的蛋白募集密切相关。Paxillin蛋白调节细胞质激酶信号传导和FAs内的应力传递，参与机械应力引起的生理进程和调控细胞的粘附与迁移，并且在胰腺癌、直肠癌及多种实体瘤细胞中有高水平表达。Paxillin蛋白的功能发挥与其活性状态和表达水平息息相关。目前还没有一种可以实现对活细胞内Paxillin蛋白的活性状态进行动态检测的有效方法，传统的蛋白活性检测手段存在操作繁琐、无法实现无损伤检测以及高成本等缺点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针，其基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术和常规生物工程亚克隆技术设计制备探针工具，将探针转染细胞，使用激光共聚焦显微镜等荧光显微镜实时观测活细胞内Paxillin蛋白的活性水平。该生物探针蛋白在活细胞内自行表达，基于蛋白构象与活性的关系以及FRET效率对距离的敏感性，通过FRET效率的变化定量地反映活细胞内Paxillin蛋白活性程度的变化。
本发明通过构建生物探针转染细胞，基于蛋白构象与活性的关系以及FRET效应对距离的敏感性，实现活细胞内Paxillin蛋白活性可视化。Paxillin蛋白活性可视化FRET探针工具包含FRET荧光蛋白对ECFP与Ypet、可折叠蛋白接头序列(Linker)、Paxillin蛋白的主要功能结构域序列以及Paxillin蛋白的底物蛋白Src关键结合序列(Src homology2domains，SH2)五个部分，运用亚克隆技术，即聚合酶链式反应技术(polymerase chainreaction,PCR)、核酸特异性酶切和连接实验技术，对这五个部分的DNA序列进行复制、剪切和拼接重构，并与pcDNA3.1(+)形成重组质粒。其中探针设计截取的Src蛋白SH2序列仅为其与Paxillin蛋白结合的必需部分，其与探针表达的活性Paxillin蛋白结合，既可以排除Src蛋白SH2功能变化对探针工作的干扰，又可以降低外源Paxillin蛋白水平升高对细胞的影响。
本发明的技术方案为：
一种基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针，包括连接在可折叠蛋白接头两端的Paxillin蛋白功能结构域和SH2结合区，且Paxillin蛋白功能结构域和SH2结合区分别连接FRET荧光蛋白对的两个蛋白；
其中，可折叠蛋白接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸如SEQ ID NO.8所示；
Paxillin蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ IDNO.6所示。
SH2结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述的FRET荧光蛋白对选自蓝色荧光蛋白(bluefluorescentprotein,BFP)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)，GFP及其变体(EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)及其变体(mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby)，青色荧光蛋白(cyan fluorescentprotein,CFP)及其变体(mTurquoise2,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和ECFP)和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,YFP)及其变体(EYFP,mVenus,mCitrine,sEYFP和YPet)。
在一个优选的实施方案中，所述的FRET荧光蛋白对为增强型绿色荧光蛋白(enhanced cyan fluorescent protein,ECFP)和能量转移黄色荧光蛋白(yellowfluorescent protein for energy transfer,Ypet)。
在一个优选的实施方案中，基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，各部分具体氨基酸及核苷酸序列如下所示：基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针完整氨基酸序列为(SEQ ID NO.1)：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHRFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKAHFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAMDDLDALLADLESTTSHISKRPVFLSEETPYSYPTGNHTYQEIAVPPPVPPPPSSEALNGTILDPLDQWQPSSSRFIHQQPQSSSPVYGSSAKTSSVSNPQDSVGSPCSRVGEEEHVYSFPNKQKSAEPSPTVMSTSLGSNLSELDRLLLELGGSGGTSNYVAPSDSIQAEEWYFGKITRRESERLLLNAENPRGTFLVRESETTKGAYCLSVSDFDNAKGLNVKHYKIRKLDSGGFYITSRTQFNSLQQLVAYYSKHADGLCHRLTTVCMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKLLCTTGKLPVPWPTLVTTLGYGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALFKDPNEKRDHMVLLEFLTAAGITEGMNELYK
基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针完整核苷酸序列为(SEQ IDNO.2)：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAGGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGTACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACATCAGCCACAACGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCCACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCATGGACGACCTCGACGCCCTGCTGGCGGACTTGGAGTCTACCACCTCCCACATCTCCAAACGGCCTGTGTTCTTGTCGGAGGAGACCCCCTACTCATACCCAACTGGAAACCACACATACCAGGAGATTGCCGTGCCACCCCCCGTCCCCCCACCCCCGTCCAGCGAGGCCCTCAATGGCACAATCCTTGACCCCTTAGACCAGTGGCAGCCCAGCGGCTCCCGATTCATCCACCAGCAGCCTCAGTCCTCATCACCTGTGTACGGCTCCAGTGCCAAAACTTCCAGTGTCTCCAACCCTCAGGACAGTGTTGGCTCTCCGTGCTCCCGAGTGGGTGAGGAGGAGCACGTCTACAGCTTCCCCAACAAGCAGAAATCAGCTGAGCCTTCACCCACCGTAATGAGCACGTCCCTGGGCAGCAACCTTTCTGAACTCGACCGCCTGCTGCTGGAACTGGGTGGCTCTGGCGGTACTAGCAACTACGTGGCGCCCTCCGACTCCATCCAGGCTGAGGAGTGGTATTTTGGCAAGATCACCAGACGGGAGTCAGAGCGGTTACTGCTCAATGCAGAGAACCCGAGAGGGACCTTCCTCGTGCGAGAAAGTGAGACCACGAAAGGTGCCTACTGCCTCTCAGTGTCTGACTTCGACAACGCCAAGGGCCTCAACGTGAAGCACTACAAGATCCGCAAGCTGGACAGCGGCGGCTTCTACATCACCTCCCGCACCCAGTTCAACAGCCTGCAGCAGCTGGTGGCCTACTACTCCAAACACGCCGATGGCCTGTGCCACCGCCTCACCACCGTGTGCATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGATGGCGATGTGAACGGCCACAAGTTCAGCGTGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGACGCTACATACGGCAAGCTGACCCTGAAGCTGCTGTGCACAACAGGCAAGCTGCCCGTGCCTTGGCCCACACTGGTGACAACCCTGGGCTACGGCGTGCAGTGTTTCGCCAGATACCCCGATCACATGAAGCAGCACGATTTTTTTAAGTCCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAGAGAACAATCTTTTTCAAGGACGATGGCAACTACAAGACCAGGGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACACTGGTGAACAGGATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAGTACAATTACAATAGCCACAACGTGTACATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCAGGCACAACATCGAGGACGGCGGCGTGCAGCTGGCCGACCATTACCAGCAGAACACACCTATCGGCGACGGCCCTGTGCTGCTGCCCGATAACCACTACCTGAGCTACCAGAGCGCCCTGTTCAAGGACCCTAATGAGAAGAGGGACCACATGGTGCTGCTGGAGTTTCTGACCGCCGCCGGCATCACAGAGGGCATGAATGAGCTGTACAAGTGA
SH2氨基酸序列为(SEQ ID NO.3)：
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其对应的DNA序列为(SEQ ID NO.4)：
AGCAACTACGTGGCGCCCTCCGACTCCATCCAGGCTGAGGAGTGGTATTTTGGCAAGATCACCAGACGGGAGTCAGAGCGGTTACTGCTCAATGCAGAGAACCCGAGAGGGACCTTCCTCGTGCGAGAAAGTGAGACCACGAAAGGTGCCTACTGCCTCTCAGTGTCTGACTTCGACAACGCCAAGGGCCTCAACGTGAAGCACTACAAGATCCGCAAGCTGGACAGCGGCGGCTTCTACATCACCTCCCGCACCCAGTTCAACAGCCTGCAGCAGCTGGTGGCCTACTACTCCAAACACGCCGATGGCCTGTGCCACCGCCTCACCACCGTGTGC
Paxillin蛋白氨基酸序列为(SEQ ID NO.5)：
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对应的DNA序列为(SEQ ID NO.6)：
ATGGACGACCTCGACGCCCTGCTGGCGGACTTGGAGTCTACCACCTCCCACATCTCCAAACGGCCTGTGTTCTTGTCGGAGGAGACCCCCTACTCATACCCAACTGGAAACCACACATACCAGGAGATTGCCGTGCCACCCCCCGTCCCCCCACCCCCGTCCAGCGAGGCCCTCAATGGCACAATCCTTGACCCCTTAGACCAGTGGCAGCCCAGCGGCTCCCGATTCATCCACCAGCAGCCTCAGTCCTCATCACCTGTGTACGGCTCCAGTGCCAAAACTTCCAGTGTCTCCAACCCTCAGGACAGTGTTGGCTCTCCGTGCTCCCGAGTGGGTGAGGAGGAGCACGTCTACAGCTTCCCCAACAAGCAGAAATCAGCTGAGCCTTCACCCACCGTAATGAGCACGTCCCTGGGCAGCAACCTTTCTGAACTCGACCGCCTGCTGCTGGAACTG
Linker氨基酸序列为：
GGSGGT(SEQ ID NO.7)
对应的DNA序列为：
GGTGGCTCTGGCGGTACT(SEQ ID NO.8)
另一方面，本发明提供了一种重组质粒，其包含上述的SEQ ID NO.2所示的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针完整核苷酸序列。
进一步地，所述的重组质粒的载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNATM3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4表达载体。
在一个优选的实施方案中，所述的重组质粒的载体为pcDNA3.1(+)载体。
在一个优选的实施方案中，基于常规亚克隆技术构建包含探针序列的重组质粒，基于蛋白激酶活性与构象关系和FRET原理检测活细胞内Paxillin蛋白活性。将构建的探针转染入活细胞，细胞自行翻译表达出重构融合探针蛋白结构，荧光蛋白对的FRET荧光效应随着Paxillin蛋白活性变化引起的蛋白构象变化而变化，使用激光共聚焦显微镜或FRET荧光显微镜动态检测分析活细胞内能量转移的动态效率变化，从而检测活细胞内Paxillin蛋白活性水平和表达水平的变化。
本发明的技术效果：
本发明提供一种基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性可视化检测的生物探针，该探针将Paxillin蛋白活性变化时产生的蛋白构象变化通过FRET现象反映出来，从而实现活细胞内Paxillin蛋白活性可视化检测。将构建的探针工具转染入活细胞，自行表达出荧光蛋白重构融合探针结构，使用激光共聚焦显微镜或FRET荧光显微镜动态检测分析活细胞内能量转移的动态效率变化，从而检测活细胞内Paxillin蛋白活性的变化。该探针实现了在活体细胞内对Paxillin蛋白活性水平的动态检测，具有操作简便、成本低、检测结果直观、对细胞毒副作用微小、可动态检测等特点，为Paxillin蛋白功能研究和相关疾病研究提供了一种可视化工具。
附图说明
图1是本发明基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针的制备流程图。
图2(a)是基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针结构图。
图2(b)是基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针的工作原理图。
图3(a)是基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针转入不同真核细胞的荧光图像。
图3(b)是基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针验证的细胞比率分析图像。
图3(c)是基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针验证数据的统计图(实验组数n＝7；errorbar选择SEM)。
图中：2-1ECFP；2-2Paxillin蛋白；2-3Linker蛋白；2-4SH2；2-5Ypet
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
本发明主要通过对DNA片段进行PCR扩增、限制性核酸内切酶消化和DNA片段粘性末端连接获得重组质粒，然后将重组质粒转化入DH5α进行筛选和扩增等实验获取目的探针；探针制备具体实验流程如图1所示，所制备探针的结构如图2(a)所示。
测试例1：
使用脂质体转染法将本实施例中制备的探针转染到活细胞体内后，细胞能够表达出重构的融合荧光蛋白，其中Linker蛋白2-3折叠，Paxillin蛋白2-1与SH2 2-4结合。本探针具有稳定性特征，可以在多种活细胞体内工作，在人宫颈癌细胞HeLa、人骨肉瘤细胞U-2OS和神经胶质瘤细胞SH-5Y内都能正常表达并产生荧光，如图3(a)所示。
测试例2：
对转染实施例中制备的探针的细胞施加Paxillin抑制剂PP1(10μM)后，Paxillin蛋白活性降低，整个探针蛋白构象随之变化，引起荧光蛋白对ECFP2-1和Ypet2-5间距变大，从而使FRET效率降低。给予转染后的细胞436nm波长的激发光，利用FRET显微镜同时采集474nm和530nm波长上的荧光图像，然后通过474nm/530nm荧光强度比例分析能量转移的动态效率变化，荧光比率变化与蛋白活性变化一致；亚细胞荧光强度比例图如图3(b)所示，加入药物刺激的细胞荧光比率归一化数据时间曲线图如图3(c)所示。
综上，本探针转染细胞后可以在活细胞内稳定表达探针蛋白，其检测原理如图2(b)所示：当Paxillin活性升高时，检测结构域SH2与Paxillin特异性结合，其结构域两端连接的ECFP与Ypet荧光蛋白的构象距离缩小，FRET效率升高；反之，当Paxillin活性降低时，底物结构域SH2与Paxillin解离，荧光蛋白距离变大，FRET效率变低，从而通过FRET效率变化实现检测Paxillin活性的目的。进一步地，给予转染后的细胞436nm波长的激发光，利用FRET显微镜同时采集474nm和530nm波长上的荧光图像，然后通过474nm/530nm荧光强度比例分析能量转移的动态效率变化，FRET效率的高低变化即可反映Paxillin蛋白活性水平的升降。
Claims (6)
1.一种基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针包括连接在可折叠蛋白接头两端的Paxillin蛋白功能结构域和SH2结合区，Paxillin蛋白功能结构域和SH2结合区分别连接FRET荧光蛋白对的两个蛋白；
其中，可折叠蛋白接头的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸如SEQ ID NO.8所示；
Paxillin蛋白功能结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸如SEQ ID NO.6所示；
SH2结合区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的FRET荧光蛋白对选自BFP和GFP，GFP及其变体和RFP及其变体，CFP及其变体和YFP及其变体。
3.根据权利要求2所述的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针，其特征在于，GFP的变体选自EGFP,mClover3,mNeonGreen,mCerulean和mVenus，RFP的变体选自mCherry,mRuby3,mRuby2和mRuby；CFP的变体选自ECFP,mCerulean3,mTFP1,Aquamarine和mTurquoise2，YFP的变体选自EYFP,mVenus,mCitrine,sEYFP和YPet。
4.根据权利要求3所述的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的FRET荧光蛋白对为ECFP和YPet。
5.根据权利要求1至4中任一所述的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针，其特征在于，所述的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒包含如权利要求1至5中任一所述的基于FRET的活细胞内Paxillin蛋白活性检测生物探针的核苷酸序列，所述的重组质粒的载体选自pcDNA3.1(+)载体、pcDNATM3.3载体、pCMVp-NEO-BAN载体和CMV4表达载体。
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