KR101190157B1 - Ｒａｂ５를 이용한 세포내 단백질 상호 작용 시각화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엔도좀에 결합하는 Rab5 단백질을 이용하여, 살아있는 세포 내 엔도좀에서 단백질 간 상호 작용을 관찰할 수 있는 단백질 상호 결합 모니터링 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 칼슘 신호 의존적인 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제인 CaMKIIα(calcium/calmodulin-dependent protein kinase IIα)와 CaMKK1(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 1)의 상호 작용을 본 발명의 ECLIPSE(Emerging CircLe of Interactive Proteins at Specific Endosomes) 방법으로 관찰하여, 칼모듈린과 CaMKIIα의 가역적인 상호 작용을 밝혀냈으며, 칼모듈린 키나아제인 CaMKK1과 CaMKIIα의 칼슘 신호에 대한 민감도 차이로 인하여 칼모듈린과 결합하는데 차이를 갖는 것을 확인함으로써, 본 발명의 ECLIPSE 방법이 단백질 간 상호 작용을 모니터링하는데 유용한 방법임을 확인하였다.

Description

Ｒａｂ５를 이용한 세포내 단백질 상호 작용 시각화 방법{A visualizing method for monitoring intracellular protein-protein interaction using Rab５}

본 발명은 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링을 위한 시각화 방법에 관한 것이다.

단백질 간의 상호 작용은 다양한 세포 내 기능에 있어서 매우 중요한 역할을 담당한다. 예를 들어, 세포 외부의 신호가 세포 내부로 전달되기 위해서는 신호를 전달하는 분자가 단백질-단백질 상호 작용에 의해서 신호가 전달되어야 한다. 이러한 과정을 신호 전달(signal tranduction)이라고 알려져 있으며, 다수의 생물학적 과정 및 질병에서 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다.

단백질은 단백질 복합체를 형성할 수 있으며, 다른 단백질에 의해서 세포질에서 핵 또는 그 반대로 핵공의 importin을 통해서 이동되거나, 단백질 카나아제가 표적 단백질에 인(phosphate)을 첨가하는 것과 같이, 다른 단백질과 결합하여, 결합한 단백질을 변형시킬 수 있다. 이러한 단백질의 변형은 그 자체가 단백질-단백질간의 상호결합에 영향을 끼친다. 결론적으로 살아있는 세포 내의 실제 모든 과정에서 중심적인 역할을 하는 단백질-단백질 상호 결합에 대한 이해는 질병 및 이에 대한 치료학적 접근의 기본을 제공해 줄 수 있으므로, 세포 내 단백질 간 상호 작용을 밝히기 위한 방법은 매우 중요하다.

단백질 간의 상호 작용을 알아보기 위한 다양한 방법들이 있다. 대표적으로 시험관 내(in vitro)에서 단백질 간의 상호 작용을 파악하기 위한 면역침전(Co-immunoprecipitation) 이 있다. 특정 항체를 이용하여, 이와 상호 작용하는 단백질을 분리하여, 웨스턴 블랏 방법을 통해서 확인할 수 있다. 면역침전으로 모니터링된 단백질 간 상호 작용은 실제로 일어나는 반응으로 인정되지만, 이러한 방법은 결합이 추정되는 단백질을 항체로 분석하기 때문에, 스크리닝용으로 이용되기 어렵다. 또한, 면역침전으로 인해서 밝힌 단백질의 상호 작용이 직접적인지 또는 간접적인지의 여부를 판단하기 어려운 문제가 존재한다.

또한, 살아있는 세포 내에서 단백질 간의 상호 작용을 밝히기 위해서, 효모 2 하이브리드(yeast two-hybrid), 단백질 단편 상보 분석(protein-fragment complementation assay), 단백질 상호 작용 플랫폼(protein interaction platform, PIP) 분석 방법, 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 시스템 및 BiFC(bimolecular fluorescence complementation) 등이 사용되어 왔다.

단백질 간의 상호 작용을 모니터링하기 위하여 사용된 효모 2 하이브리드 방법은, 효모의 핵 안에서 인공적으로 합성한 단백질 간의 상호 작용을 확인할 수 있는 방법이다. 단세포 생물로서 효모가 지닌 소량의 유전 정보와, 약 90분 정도의 짧은 한 세대라는 장점을 이용하여 2 하이브리드 시스템이 개발되었으나(Sambrook J. and Russell D.W. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.), 결합 인자(associating factors), 단백질 인산화 또는 단백질 폴딩(folding) 등의 이유로 단백질들간의 상호 작용을 모두 효모에서 확인하기에는 한계가 있었다(Shioda T., Andriole S., Yahata T., and Isselbacher, K.J. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 97: 5220-5224). 그 예로, GAL4DB(DNA bindingdomain)-융합 SMAD4(bait)와 MSG1(prey)는 포유류 세포에서는 상호 작용을 하는 것으로 알려져 있으나, 효모에서는 성장인자 β의 부재로 이러한 상호 작용이 형성되지 않는다. 이로 인해서, 효모 시스템에서 검정하기 어려운 단백질 간의 상호 작용을 확인할 수 있는 포유 세포 투-하이브리드 스크리닝 시스템들이 개발되고 있다(Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., and Zhu, L. 1997. BioTechniques 22: 350-352; Fearon, E.R., Finkel, T., Gillison, M.L., Kennedy, S.P., Casella, J.F., Tomaselli, G.F., Morrow, J.S. and Dang, C.V. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 89: 7958-7962; Shioda et al. 2000).

이에, 본 발명자들은 모니터링하고자 하는 단백질 간의 상호 작용을 세포 내에서 관찰할 수 있는 방법을 개발하고자, 칼슘 신호 의존적으로 결합하는 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제 단백질 간의 상호 결합을 엔도좀과 결합하는 Rab5 단백질을 이용하여, 엔도좀에 특이적으로 위치하는 패턴을 분석함으로써 칼모듈린 키나아제 단백질인 CaMKIIα, CaMKK1, CaMKⅣ과 칼모듈린 간의 결합을 효과적으로 모니터링 할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 세포 내 단백질 상호 작용 촉진제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 세포 내 단백질 상호 작용 저해제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법을 제공한다.

1) 프레이(prey) 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터, 및 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트(bait) 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 발현벡터들을 숙주세포에 함께 형질전환시키는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 숙주세포에서 형광 단백질을 이용해 형광분석하는 단계.

아울러, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포 내 단백질 상호 작용 촉진제 또는 저해제 스크리닝 방법을 제공한다.

1) 프레이 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터, 및 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 발현벡터들을 숙주세포에 함께 형질전환시키는 단계;

3) 상기 단계 2)의 숙주세포에 피검물질을 처리하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 숙주세포를 형광 단백질을 이용해 형광 분석하는 단계; 및

5) 단백질 상호 작용을 촉진 또는 억제하는 피검물질을 선별하는 단계.

본 발명은 엔도좀 결합 Rab5 단백질을 이용하여, 살아있는 세포 내, 엔도좀에서 단백질 간 상호 작용을 관찰할 수 있는 단백질 상호 결합 모니터링 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 칼슘 신호 의존적인 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제인 CaMKⅡα와 CaMKK1의 상호 작용이 가역적이며, 칼모듈린 키나아제 간의 칼슘 신호 민감도 차이를 밝힘으로써, 본 발명의 엔도좀 결합 Rab5를 단백질 상호 작용 모니터링 방법 및 단백질 상호 작용 저해제 스크리닝 방법으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 ECLIPSE의 개념을 나타낸 그림이다:
도 1의 A는 2개 단백질 간의 상호 작용을 모니터링하는 ECLIPSE의 도식을 나타낸 그림이다;
도 1의 B는 라파마이신 처리 후, FKBP가 엔도좀으로 이동하여 FRB와 결합하는 것을 관찰한 그림이다;
도 1의 C는 엔도좀으로 FKBP와 FRB가 동시에 자리 잡는 비율을 정량적으로 분석한 그래프이다;
도 1의 D는 항시 결합하고 있는 2개의 단백질의 상호작용을 확인하기 위한 ECLISPE의 도식을 나타내는 그림이다;
도 1의 E는 구조적으로 활성을 갖는 Cdc42와, 활성을 갖지 못한 Cdc42를 사용하여, 단백질 간 상호 작용을 관찰한 그림이다; 및
도 1의 F는 WASP 단백질의 CRIB 도메인과 구조적으로 활성을 갖는 Cdc42와, 활성을 갖지 못한 Cdc42의 상호 작용을 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 2는 ECLIPSE를 이용하여, 칼슘 신호 전달 의존적인 2개 단백질(칼모둘린과 칼모듈린 키나아제) 간의 상호 작용을 라파마이신을 이용한 ECLIPSE 실험을 통하여 관찰한 그림이다:
도 2의 A는 FRB-mCherry Rab5, FKBP-T-CaM, 및 EYFP-CaMKⅡα의 상호 작용을 관찰한 그림이다; 및
도 2의 B는 상호 작용을 유도하는 이오노마이신과 엔도좀으로의 이동을 유도하는 라파마이신을 단독 및 동시에 처리하였을 때, FKBP-CaM과 CaMKⅡα가 엔도좀으로 이동되는 것을 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 3은 ECLIPSE를 이용하여, 칼슘 신호 전달 의존적인 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제 CaMKⅡα의 상호 작용을 관찰한 그림이다:
도 3의 A는 CaM-mCherry-Rab5, YFR-CaMKⅡα의 상호 작용을 이오노마이신 처리 후, 관찰한 그림이다;
도 3의 B는 3개의 타임 포인트에서 칼모듈린과 CaMKⅡα의 가역적인 상호 작용을 라인 프로파일링(line profiling)을 통하여 확인한 그래프이다; 및
도 3의 C는 칼모듈린과 CaMKⅡα의 엔도좀으로 이동하는 것을 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 4는 칼모듈린과 CaMKⅡα의 역동적인 상호작용을 ECLIPSE를 이용하여 관찰한 그림이다:
도 4의 A는 이오노마이신 처리 후, 칼모듈린과 CaMKⅡα의 변동적인 관계를 30분간 관찰한 그림이다; 및
도 4의 B는 칼모듈린과 CaMKⅡα의 변동적인 관계를 관찰한 이미지를 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 5는 칼모듈린 키나아제 CaMKⅡα와 CaMKK1의 결합 친화도를 비교한 그림이다:
도 5의 A는 이오노마이신 처리 후, 칼모듈린과 CaMKⅡα와 CaMKK1의 결합 친화도를 결합하는 시점을 비교하여 관찰한 그림이다;
도 5의 B는 칼모듈린과 CaMKⅡα와 CaMKK1의 엔도좀에서의 결합을 정량적으로 분석한 그래프이다; 및
도 5의 C는 이오노마이신 처리 농도에 따라서, 칼모듈린과 CaMKⅡα와 CaMKK1의 엔도좀에서의 결합을 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 6은 칼모듈린 키나아제 CaMKK1, CaMKⅣ와 칼모듈린과 상호 작용을 ECLIPSE를 이용하여 관찰한 그림이다.
도 7은 칼모듈린 키나아제 CaMKⅡα와 CaMKK1의 칼모듈린과 결합하는 시간 차이의 원인이 키나아제가 가지고 있는 부피가 아니라는 것을 확인하는 그림이다:
도 7의 A는 CaMKⅡα와 CaMKK1이 가지고 있는 부피차이에 의해서 결합 시간 차이가 생성되는 것인지를 확인하기 위한 분석방법을 나타낸 그림이다;
도 7의 B는 라파마이신 처리 후, 엔도좀에서 CaMKⅡα와 CaMKK1을 관찰한 이미지를 정량적으로 분석한 그래프이다; 및
도 7의 C는 라파마이신 처리 후, 엔도좀에서 CaMKⅡα와 CaMKK1을 관찰한 그림이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법은 하기 단계를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 프레이(prey) 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터, 및 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트(bait) 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 발현벡터들을 숙주세포에 함께 형질전환시키는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 숙주세포에서 형광 단백질을 이용해 형광분석하는 단계.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법에 있어서, 상기 형광 단백질은 적색 형광 단백질(Red Fluorescent Protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(Enhanced red Fluorescent Protein, ERFP), 청색 형광 단백질(Cyan Fluorescent Protein, CFP), 증강된 청색 형광 단백질(Enhanced cyan Fluorescent Protein, ECFP), 황색 형광 단백질(Yellow Fluorescent Protein, YFP), 증강된 황색 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein, EYFP), mTFP(monomeric teal Fluorescent Protein), 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), 및 변형된 녹색 형광 단백질(modified green Fluorescent Protein, EGFP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 적색 형광을 나타내는 mCherry 및 청색 형광을 나타내는 mTFP를 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법에 있어서, 프레이 단백질은 칼모듈린 키나아제(Calmodulin Kinase)인 것이 바람직하며, CaMKIIα, CaMKK1, CaMKⅣ인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 베이트 단백질은 칼모듈린(calmodulin)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 프레이 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터는 형광 단백질이 융합된 발현벡터인 것이 바람직하며, pECFP-N1, EGFP(EGFP-C1), EYFP(pEYFP-N1) 및 TFP인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트(bait) 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터는 형광 단백질이 융합된 발현벡터인 것이 바람직하며, pmCherry-C1인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 발현벡터에 의해서 형질전환된 숙주세포는 Hela 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 Rab5 단백질을 이용한 세포 내 단백질 간 상호 작용 모니터링 방법은, 베이트(bait) 단백질, 형광 단백질 및 세포 내 엔도좀 위치에 결합하는 Rab5 단백질의 융합 단백질과 형광 단백질과 융합된 프레이(prey) 단백질 간의 상호 작용을 모니터링하는 방법이다. 베이트 단백질이 Rab5 단백질에 의해서 엔도좀에 위치하게 되며, 형광 단백질에 의해서 이를 확인할 수 있다. 형광 단백질과 융합된 프레이 단백질은 베이트 단백질과 상호작용을 검출하고자하는 단백질로써, 하나 이상의 프레이 단백질을 사용할 수 있다. 베이트 단백질과 프레이 단백질이 결합하는 경우, 프레이 단백질의 형광이 엔도좀으로 이동하는 것을 실시간으로 관찰함으로써, 그 상호작용을 관찰할 수 있으며, 상호작용이 중지되고, 분리되는 과정까지의 전체적인 상호작용을 실시간으로 관찰할 수 있는 것이 특징이다. 이러한 기술은 기존의 효모 2 하이브리드 시스템(two hybrid system)과 구성이 유사하다.

본 발명은 단백질 간 상호 작용을 관찰하는 효모 2 하이브리드 방법과 구성면에서 유사하나, 효모 2 하이브리드 방법의 경우, 단백질 간의 상호작용을 핵 내에서 관찰되며, 리포터를 사용하여 간접적으로 확인한다는 면에서, 그리고 리포터를 발현시키기 위하여, 기질이 필요하다는 점이 본 발명의 단백질 간 상호작용과 상이하다. 또한, 효모 2 하이브리드의 경우, 단백질 간의 상호 작용의 유무만을 관찰할 수 있는 반면, 본 발명의 세포 내 단백질 간 상호 작용을 관찰하는 방법은 베이트 단백질을 Rab5 단백질에 융합시킴으로써, 상호작용을 엔도좀에서 모니터링 할 수 있으며, 이러한 고정된 위치로 인하여 단백질 간 상호 작용을 시작부터, 결합의 유지 및 분리의 전 과정을 실시간으로 관찰할 수 있다. 또한, Rab 단백질과 융합되어 있는 베이트 단백질과 프레이 단백질이 상호 작용을 하는 경우, 엔도좀에서 형광 단백질이 원 모양을 관찰할 수 있으며, 이러한 베이트 및 프레이 단백질 간의 결합에서 프레이 단백질을 2개 이상의 단백질을 이용할 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 실시 양태에서, 프레이 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질과 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트 단백질 간의 상호 작용이 제대로 일어나는지 확인하기 위하여, FKBP와 FRB를 프레이 및 베이트 단백질로 이용한 결과, 라파마이신 처리 후, 엔도좀에서 두 단백질 간의 결합을 확인할 수 있었다. 또한, FRB-mCherry-Rab5, FKBP-EGFP-CRIB_WASP, Cdc42를 이용하여, 3개 단백질 간의 결합이 엔도좀에서 관찰할 수 있었으며, 단백질 간 상호 작용이 일어날 경우, 엔도좀에 뚜렷한 원 모양이 관찰되는 것에 기인하여, 이러한 모니터링 방법을 ELIPSE(Emerging CircLe of Interactive Proteins at Specific Endosomes)라고 명명하였다(도 1 참조).

또한, 본 발명의 실시양태에서, ELIPSE를 이용하여, 칼슘 신호 의존적으로 결합이 이루어지는 FRB-mCherry-Rab5, 칼모듈린(FKBP-T-CaM)과 칼모듈린 키나아제인 CaMKIIα(EYFP-CaMKIIα)간의 결합을 관찰한 결과, FRB와 FKBP의 결합을 유도하는 라파마이신 및 세포 내 칼슘 농도를 증가시키는 이오노마이신(Ionomycin)이 동시에 처리되었을 때, 엔도좀에서 원 모양이 관찰되면서 단백질 간 결합이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다(도 2 참조).

또한, 본 발명의 실시양태에서, 상기 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제의 칼슘 신호 의존적인 상호 결합을 관찰하기 위하여, CaM-mCherry-Rab5, YFP-CaMKIIα를 이용하여 관찰한 결과, 칼모듈린과 CaMKIIα 사이의 상호 결합이 유동적이며, 관찰한 10분 동안, 결합이 3번 관찰되었다(도 3 참조).

또한, 본 발명의 실시양태에서, CaM-mCherry-Rab5, YFP-CaMKIIα간의 상호 작용을 좀 더 긴 시간 동안 관찰한 결과, CaM-mCherry-Rab5, YFP-CaMKIIα 사이의 상호 작용이 변동적(oscillatroy)이라는 것을 관찰할 수 있었다(도 4 참조).

또한, 본 발명의 실시양태에서, 동일한 칼슘 신호에 의해서 칼모듈린과 결합하여, c-fos 유전자의 발현을 억제 및 촉진한다고 알려진 CaMKIIα와 CaMKK1 칼모듈린 키나아제 간의 결합력 비교를 통하여, 칼슘 신호에 의해서 발생되는 세포 내 변화가 일어나는 과정을 구체적으로 관찰하고자 ECLIPSE 방법을 사용하였다. 그 결과, 이오노마이신을 처리하여, 세포 내 칼슘 농도를 증가시킨 후 칼모듈린과 CaMKIIα와 CaMKK1 사이의 결합하는 시간에 차이가 존재함을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 이러한 차이의 원인을 규명하기 위하여, 본 발명자들은 칼모듈린 키나아제의 결합 친화성 차이(도 6 참조), 칼모듈린 키나아제 분자의 부피 차이(도 7 참조) 및 칼슘 신호 민감도 차이를 원인으로 분석한 결과, CaMKK1이 CaMKIIα 보다 칼슘 신호에 더욱 민감하다는 것을 밝힘으로써, 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제 간의 상호 작용을 구체적으로 규명할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 엔도좀 결합 단백질 Rab5를 이용한 ECLIPSE 방법은 하나의 살아있는 세포에서 단백질 간 상호 작용을 모니터링하여 비교분석하는 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 세포 내 단백질 상호 작용 촉진제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 촉진제 스크리닝 방법은 하기의 방법을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 프레이 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터, 및 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 발현벡터들을 숙주세포에 함께 형질전환시키는 단계;

3) 상기 단계 2)의 숙주세포에 피검물질을 처리하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 숙주세포를 형광 단백질을 이용해 형광 분석하는 단계; 및

5) 단백질 상호 작용을 촉진하는 피검물질을 선별하는 단계.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 촉진제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 형광 단백질은 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(CFP), 증강된 청색 형광 단백질(ECFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 단백질(EYFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(EGFP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 저해제 스크리닝 방법에 있어서, 프레이 단백질은 칼모듈린 키나아제(Calmodulin Kinase)인 것이 바람직하며, CaMKIIα, CaMKK1, CaMKⅣ인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 베이트 단백질은 칼모듈린(calmodulin)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 프레이 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터는 형광 단백질이 융합된 발현벡터인 것이 바람직하며, pECFP-N1, EGFP(EGFP-C1), EYFP(pEYFP-N1) 및 TFP인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트(bait) 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터는 형광 단백질이 융합된 발현벡터인 것이 바람직하며, pmCherry-C1인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 발현벡터에 의해서 형질전환된 숙주세포는 Hela 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 촉진제 스크리닝 방법에 있어서, 형광분석은 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 이용하여 분석하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 실시양태에서, 엔도좀 결합 단백질 Rab5를 이용하여 단백질 간 상호 작용을 모니터링 할 수 있는 방법을 검증하였다. 상호 결합이 이미 알려진 FKBP와 FRB를 이용하여, 엔도좀 결합 단백질 Rab5과 FRB를 융합한 후, 형광 단백질이 융합된 FKBP와의 상호 결합을 엔도좀에서 모니터링하였으며, 동일한 원리를 이용하여, 3가지 단백질 간의 상호 결합을 마찬가지 엔도좀에서 관찰할 수 있었다. 엔도좀 결합 단백질 Rab5를 이용한 모니터링 방법을 엔도좀에서 관찰되는 원모양을 본 따 ECLIPSE라 명한 뒤, ECLIPSE를 이용하여 칼슘 신호 의존적인 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제 간의 상호 작용을 관찰하였다. 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제인 CaMKK1 및 CaMKIIα의 상호 작용을 ECLIPSE를 이용하여 관찰한 결과, 칼모듈린과 CaMKK1 및 CaMKIIα는 엔도좀에서 상호 결합을 하며, 이러한 결합이 생성되는 시간의 차이가 존재하였다. 이에 본 발명자들은 이오노마이신을 다양한 농도로 처리하여, 칼슘 신호의 세기 변화 후, 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제의 결합을 관찰하였을 때, CaMKK1 및 CaMKIIα이 칼슘 신호에 대하여 상이한 민감도가 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 ECLIPSE는 단백질 간의 상호 작용을 모니터링 할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 활용하여 피검물질을 처리하여, 세포 내 단백질 간 상호 작용 저해제 스크리닝 방법으로도 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.

아울러, 본 발명은 세포 내 단백질 상호 작용 저해제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 저해제 스크리닝 방법은 하기의 방법을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

1) 프레이 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터, 및 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 발현벡터들을 숙주세포에 함께 형질전환시키는 단계;

3) 상기 단계 2)의 숙주세포에 피검물질을 처리하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 숙주세포를 형광 단백질을 이용해 형광 분석하는 단계; 및

5) 단백질 상호 작용을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 저해제 스크리닝 방법에 있어서, 상기 형광 단백질은 적색 형광 단백질(Red Fluorescent Protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(Enhanced red Fluorescent Protein, ERFP), 청색 형광 단백질(Cyan Fluorescent Protein, CFP), 증강된 청색 형광 단백질(Enhanced cyan Fluorescent Protein, ECFP), 황색 형광 단백질(Yellow Fluorescent Protein, YFP), 증강된 황색 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein, EYFP), mTFP(monomeric teal Fluorescent Protein), 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), 및 변형된 녹색 형광 단백질(modified green Fluorescent Protein, EGFP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 적색 형광을 나타내는 mCherry 및 청색 형광을 나타내는 mTFP를 사용하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 세포 내 단백질 상호 작용 저해제 스크리닝 방법에 있어서, 프레이 단백질은 칼모듈린 키나아제(Calmodulin Kinase)인 것이 바람직하며, CaMKIIα, CaMKK1, CaMKⅣ인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 베이트 단백질은 칼모듈린(calmodulin)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 프레이 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터는 형광 단백질이 융합된 발현벡터인 것이 바람직하며, pECFP-N1, EGFP(EGFP-C1), EYFP(pEYFP-N1) 및 TFP인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트(bait) 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터는 형광 단백질이 융합된 발현벡터인 것이 바람직하며, pmCherry-C1인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 발현벡터에 의해서 형질전환된 숙주세포는 Hela 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 실시양태에서, 엔도좀 결합 단백질 Rab5를 이용하여 단백질 간 상호 작용을 모니터링 할 수 있는 방법을 검증하였다. 상호 결합이 알려진 단백질 FKBP 및 FRB를 이용하여, 엔도좀 결합 단백질 Rab5과 FRB를 융합한 후, 형광 단백질이 융합된 FKBP와의 상호 결합을 엔도좀에서 모니터링 할 수 있었다. 이러한 상호작용은 세포 내 엔도좀에 고정된 FRB 단백질로 FKBP가 이동하는 변화양상을 결합의 시작부터, 유지 및 분리되는 모습을 모두 관찰할 수 있었으며, 동일한 원리를 이용하여, 3가지 단백질 간의 상호 결합을 엔도좀에서 모니터링함으로써, 세포 내 단백질 간 상호 작용을 더욱 상세하게 관찰할 수 있었다. 이러한 ECLIPSE 방법을 이용하여, 본 발명자들을 칼슘 신호 의존적인 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제 간의 상호 작용을 관찰한 결과, 칼모듈린 키나아제 CaMKK1 및 CaMKIIα이 칼슘 신호에 대하여 상이한 민감도가 있음을 확인함으로써, 동일한 칼슘 신호로 자극된 칼슘 키나아제로 유도될 수 있는 세포 내 반응에 대한 이해도를 높일 수 있었다. 따라서, 본 발명의 ECLIPSE는 단백질 간의 상호 작용을 모니터링 할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 활용하여 피검물질을 처리하여, 단백질 간 상호 작용 저해제 스크리닝 방법으로도 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 발현벡터의 제조

<1-1> FRB 발현벡터의 제조

pFRB-mCherry 발현벡터를 제조하기 위하여, FRB 정방향 프라이머(서열번호 2: 5′-GACTGCTAGCCCACCATGGCCTCCTACCC-3), FRB 역방향 프라이머(서열번호 3: 5′-GACTACCGGTAGGGCGCCGGCGCCGGCGCCCTTTGAGATTCGTCGGAAC-3')을 이용하여, PCR로 증폭한 뒤, pmCherry-C1 벡터에 넣은 뒤, pFRB-mCherry 발현벡터를 제조하였다. PCR 과정은 인간세포에서 추출한 cDNA를 주형으로 하여 94℃, 3분 후 25 사이클 - 94℃/30초, 53℃/30초, 72℃/50초 - 후 72℃, 3분으로 진행하였다. 증폭된 서열은 제한효소인 NheI, AgeI으로 절단한 뒤, 동효소로 절단한 pmCherry-C1 벡터에 삽입하였다.

FRB-mCherry를 암호화하는 서열을 제한 효소 NheI 및 BsrGI을 이용하여, 절단한 뒤, small GTPase 라이브러리(자체 제작, cDNA를 클로닝함)를 이용하여 획득한 CFP-Rab5Q^79L을 암호화하는 DNA에 도입하여, pFRB-mCherry-Rab5를 제조하였다.

Rab5는 인간세포에서 추출한 cDNA을 template로 하여 Rab5 정방향 프라이머(서열번호 4: 5'-CGGAATTCCATGACTAGCAGAAGCACAGCT-3'), Rab5 영방향 프라이머 (서열번호 5: 5'-CGGGATCCTCAGTTGCTACAACACTGGCT-3')를 이용하여 PCR (94℃, 3분 후 25 사이클 - 94℃, 30초,52℃, 30초, 72℃, 1분- 후 72℃, 3분)한 후 제한효소인 EcoRI, BamHI으로 절단한 후 동효소로 절단한 pECFP-C1 (Clontech)에 삽입하였다. 이와 같이 만들어진 Rab5 발현 벡터를 위치 특이적 돌연변이 생성(site-specific mutagenesis)하여 CFP-Rab5^Q79L를 제작하여 small GTPase 라이브러리에 추가하였다. 돌연변이생성(mutagenesis)은 정방향 프라이머(서열번호 6: 5'-GGACACAGCTGGGC-T-GGAGCGATATCAC-3')와 역방향 프라이머(서열번호 7: 5'-GTGATATCGCTCC-A-GCCCAGCTGTGTCC-3')를 이용하여, 236번 아데닌(Adenine)을 티아민(Thymine)으로 치환하여 수행하였다.

<1-2> FKBP 발현벡터의 제조

FKBP-EGFP는 cDNA 라이브러리 (BJ cell에서 추출)에서 FKBP12를 PCR을 이용하여 cloning 하여 pEGFP-N1 (Clontech Inc.)에 삽입하여 제작하였다. FKBP 정방향 프라이머(서열번호 8: 5'-ATGCTCGCTAGCCCACCATGGGAGTGCAGGTGG-3'), FKBP 역방향 프라이머(서열번호 9: 5'-ATGCTCACCGGTGCTTCCAGTTTTAGAAGCTCCAC AT-3')를 이용하여, 94℃, 3분 후 25 사이클 - 94℃/30초, 53℃/30초, 72℃/50초 - 후 72℃, 3분으로 진행하였다. 증폭된 서열은 제한효소인 NheI, AgeI으로 절단한 뒤, 동효소로 절단한 pEGFP-N1 벡터에 삽입하였다.

pFKBPx2-CFP 발현벡터를 제조하기 위해서는 두가지 단계를 거쳐야한다. 첫 번째는 FKBP tendem repeat (FKBP-FKBP)를 제작하는 단계, 두 번째는 제작된 tendem repeat를 pECFP-N1에 삽입하는 단계이다.

첫 번째 단계는 pFKBP-EGFP를 주형으로 하여 FKBP12를 PCR로 증폭한 뒤 널리 사용되는 cloning vector인 pBluescriptII(Stratagene)에 NheI, BamHI site를 이용하여 삽입하였다(삽입형태, NheI-BglII-FKBP12-BamHI). 이를 BglII와 BamHI site를 이용하여 temdem repeat을 제작하여 최종적으로 pBS-FKBP-FKBP을 제작하였다. 이를 주형으로 사용하여 FKBP-FKBP(FKBPx2)를 PCR로 증폭하여 NheI, AgeI 효소 위치를 이용하여 pECFP-N1 벡터에 삽입하였다.

또한, pFKBPx2-ECFP-WASP(CRIB) 발현벡터를 제조하기 위하여, WASP의 CRIB 도메인을 암호화하는 DNA를 인간 cDNA 라이브러리(BJ cell에서 추출)에서 WASP(CRIB) 정방향 프라이머(서열번호 10: 5'-GACTCTCGAGCCACCATGAAGAAGAAGATCAGCAAAGC-3'), WASP(CRIB) 역방향 프라이머(서열번호 11: 5'-GACTGGATCCTTGGCGCCGGCGCCGGCGCCAGAGGTCTCGGCGTCGG-3')을 이용하여, PCR로 증폭한 뒤, 제한 효소 XhoI 및 BamHI을 이용하여 절단하였다. PCR 과정은 인간세포에서 추출한 cDNA을 template로 하여 94℃, 3분 후 25 사이클 - 94℃/30초, 52℃/30초, 72℃/50초 - 후 72℃, 3분으로 진행하였다. 절단된 단편은 FKBPx2-ECFP의 C 말단 부위를 암호화하는 DNA의 상응하는 부위에 라이게이션되어, pFKBPx2-ECFP-WASP(CRIB)을 생성하였다.

또한, 상기 pFKBPx2-CFP 벡터에서 ECFP를 암호화하는 DNA를 mTFP를 암호화하는 DNA로 치환하여 pFKBPx2-mTFP 발현벡터를 생성하였다. pNCS-mTFP1(Allele Biotechnology)가 mTFP를 암호화하는 DNA의 PCR 증폭 주형으로 사용하였다.

<1-3> Cdc42 발현벡터의 제조

YFP를 발현하는 플라스미드(pEYFP-C1, Clontech)를 활성 형태의 Cdc42^Q61L 또는 도미넌트 너게티브(dominant negative) Cdc42^T17N을 small GTPase 라이브러리로부터 획득하였다(Heo WD, et al., Science, 2006).

<1-4> CaM 발현벡터의 제조

칼모듈린을 발현하는 FKBP-TFP-CaM 및 CaM-mCherry-Rab5, EYFP-CaM kinase IIα 벡터는 인간 cDNA 라이브러리(구입처를 기재하여 주시기 바랍니다.)에서 CaM 정방향 프라이머(서열번호 12: 5'-GACTCTCGAG CTTCCGCCAT GGCTGAC-3'), CaM 역방향 프라이머(서열번호 13: 5'-GACTGGATCCTTGGCGCCGGCGCCGGCGCCCTTTGCAGTCATCATCTGTAC-3')를 이용하여, PCR 증폭으로 합성하였다. PCR 과정은 인간세포에서 추출한 cDNA을 template로 하여 94℃, 3분 후 25 사이클 - 94℃/30초, 52℃/30초, 72℃/50초 - 후 72℃, 3분으로 진행하였다. 증폭된 clon은 FKBPx2-mTFP, mCherry-Rab5에 삽입하였다. 모든 플라스미드는 DNA-Spin plasmid purification 키트(iNtRON Biotechnology)를 이용하여 정제하였으며, CaM kinase IIα, CaM kinase IV, and CaM kinase kinase 1를 포함하는 CaM 키나아제는 Alliance For Cellular Signaling (AFCS)에서 구매하였으며, 각각의 ID 번호는 A000456, A000461 및 A000462이다.

< 실시예 2> 세포 배양 및 형질 감염

Hela 세포(CCL-2, ATCC)는 10% FBS(#10437-028, Invitrogen Life Science Inc)를 포함한 DMEM(#11955-065, Invitrogen Life Science Inc)배지에 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양되었다. 세포는 100mm-culture dish에서 배양되었으며, ATCC에서 권장하는 바에 따라 10% FBS (fatal bovine serum, invitrogen)이 포함된 DMEM (Invtirogen)에서 배양되었으며, 3일에 한번씩 subculture하였다. 형질감염은 도입할 조합의 수당 2x10e5 개의 세포를 사용하였으며, 형질 도입후 24시간 이내에 관찰하였다.

형질감염(Electroporation)은 Microporator^TM(MP-100; Digital Bio Technology을 제조업자가 제공한 방법에 따라 수행하였다. Hela 세포의 형질감염의 최적화된 조건은 35 밀리초 동안, 1080 V의 2 펄스(pulse)이다. 형질감염 후, 이를 확인하기 위하여, 형질감염된 세포는 96 웰의 유리바닥으로 된 검정색 플레이트(Metrical Inc.)에 나누어 심었으며, 24시간 후, 세포는 하기 실시예의 분석에 이용하였다.

< 실험예 1> ECLIPSE 를 이용한 단백질 간의 상호결합 측정

본 발명자들은 단백질 간의 상호 결합을 가시화하기 위한 새로운 방법으로써, 단백질 간의 상호 결합을 세포 내 특정 위치인 엔도좀(endosome)에서 관찰하기 위하여, 엔도좀에 위치하는 베이트(bait) 단백질과 세포질 내의 프레이(prey) 단백질을 이용하여 상호결합을 관찰하였다.

베이트 단백질을 엔도좀에 자리잡게 하기 위하여, 엔도좀과 결합하는 구조적으로 활성을 띤 Rab5 단백질을 엔도좀에 대한 앵커(anchor)로서 이용하여, 베이트와 융합하였다. 또한, 본 발명자들은 엔도좀 앵커 단백질인 Rab5 단백질을 이용하여, 단백질의 상호 작용을 실제로 관찰할 수 있는지 확인하기 위하여, 이미 결합이 알려진 두 단백질을 베이트와 프레이로 사용하여 실험을 수행하였다.

라파마이신(rapamycin, 최종 농도, 500nM) 처리 후, 헤테로다이머(heterodimer)를 형성한다고 알려진, FKBP와 FRB 단백질을 베이트와 프레이로서 사용하였다. 실시예에서 사용된 발현 벡터는 각각 300ng씩 사용되었으며, 동시에 형질감염 되었다. 헤테로다이머(heterodimer)를 형성한다고 알려진, FKBP와 FRB 단백질을 베이트와 프레이로서 사용하였다. 이러한 상호 작용을 가시화하기 위하여, FKBP와 FRB 단백질에 형광물질이 융합된, 상기 실시예에서 구축한 FRB-mCherry-Rab5 발현벡터(bait)와 FKBP-EGFP(prey)를 Hela 세포에 형질감염시켰다(도 1의 A).

Hela 세포에 FRB-mCherry-Rab5 및 FKBP-EGFP를 형질감염한 20~24시간 후, 라파마이신 처리 전, 후의 세포 이미지를 공초점 광학 현미경(A1R, Nikon)의 CFI Plan Apochromat VC objective 렌즈(60×/1.40 오일)를 통해서 디지털 주밍(digital zooming)에서 512×512의 해상도로 이미지를 획득하였다.

그 결과, 도 1의 B에 나타난 바와 같이, 라파마이신의 유도가 없는 경우에, FRB-mCherry-Rab5는 엔도좀 내에 넓은 부위에 퍼져서 존재한 반면, FKBP-EGFP는 세포질 전체에 퍼져있음을 관찰할 수 있었다. 그러나 라파마이신을 처리한 경우, 엔도좀의 표면으로 FKBP-EGFP의 즉각적인 이동이 유도되었으며, 엔도좀 표면 위치한 FRB-mCherry-Rab5와의 결합으로 인하여, 이클립스(eclipse)와 같은 "원" 모양을 형성하는 것을 관찰할 수 있었다(도 1의 B). 이에 따라, 본 발명자들은 엔도좀 앵커 단백질 Rab5를 이용항 단백질 간 상호 작용을 모니터링하는 방법을 ECLIPSE(Emerging CircLe of Interactive Proteins at Specific Endosomes)로 명명하였다.

< 실험예 2> ECLIPSE 를 이용한 단백질 간의 상호결합 정량화

상기 실시예 1의 단백질 상호 작용을 정량적으로 분석하기 위하여, Nikon imaging 소프트웨어(NIS-element AR 64-bit version 3.00, Laboratory Imaging) 및 MetaMorph offline version 7.6.0.0 MDS Analytical Technologies를 이용한 뒤, ROI(Region of Intensity)를 측정하기 위하여 NIS-element software의 "Time-measurement" 도구 또는 MetaMorph software의 "Total measurement"를 이용하여 수행하였다. ROI는 Rab5-키메라 단백질의 위치에 따라서 결정되었으며, 다른 구성요소의 위치 역시 상기 분석 프로그램을 이용하여 측정하였다. 상대적인 형광 단위(Relative Fluorescence Units, RFU)는 결합을 유도하는 물질을 처리하기 전 초기의 ROI를 기준으로 계산하였다.

FRB-mCherry-Rab5와 FKBP-EGFP간의 상호 결합을 200초 동안 관찰한 결과를 분석한 결과, 도 1의 C에 나타난 바와 같이 라파마이신을 처리한 후, 단백질 간의 상호 결합은 즉각적으로 발생하며, 100초 안에 완료가 되는 것을 관찰할 수 있었다(도 1의 C).

< 실험예 3> ELIPSE 를 이용한 3개 단백질 간 상호 결합 관찰

엔도좀 앵커 단백질 Rab5를 이용하여 두 단백질 간의 상호 결합을 충분히 관찰할 수 있음을 FKBP와 FRB 단백질을 이용하여 상기 실시예에서 확인하였으므로, 이러한 ECLIPSE 방법을 응용하여, 두 종류의 프레이와 베이트 사이의 상호 결합을 관찰에 활용할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.

라파마이신 처리에 의해서 결합하는 FKBP와 FRB 이외에, 이미 결합이 알려진 다른 한 쌍의 단백질인 비스코트-알드리히 증후군 단백질(Wiskott-Aldrich Syndrome Protein, WASP) 및 Cdc42를 이용하였다. 구체적으로 3-하이브리드 시스템에서 베이트는 엔도좀에 위치한 FRB-mCherry-Rab5를 사용하였으며, 프레이로는 Cdc42/Rac-Interactive Binding(CRIB) 도메인이 융합되어 있는 FKBP-ECFP-CRIB_WASP과 CAAX 모티프가 제거되어 세포질 내에 존재할 수 있는 Cdc42(EYFP-Cdc42)를 이용하였다(도 1의 D).

Hela 세포에 FRB-mCherry-Rab5, EYFP-Cdc42 및 FKBP-ECFP-CRIB_WASP를 형질감염한 후, 라파마이신 처리 전 후의 세포 이미지를 공초점 광학 현미경의 CFI Plan Apochromat VC objective 렌즈(60×/1.40 오일)를 통해서 디지털 주밍에서 512×512의 해상도로 이미지를 획득하였다.

상기 Rab5-FRB anchor, FKBP-ECFP-CRIB_WASP 및 Cdc42를 각각 300ng(총 900ng)씩 Hela 세포 내에 동시에 형질감염한 후, 라파마이신을 처리한 결과, EYFP-Cdc42가 라파마이신에 의해서 결합하는 FRB-mCherry-Rab5과 결합한 FKBP-ECFP-CRIB_WASP가 위치한 엔도좀으로 이동하여, Cdc42와 CRIB_WASP이 결합하여 또렷한 원 모양을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 1의 E)

< 실험예 4> ELIPSE 를 이용한 3개 단백질 간 상호 결합 검증

<실험예 3>에서 나타난 ECLIPSE를 이용한 단백질간 상호 작용이 3개 단백질 간의 상호 결합을 효과적으로 관찰할 수 있는 방법임을 확인하기 위하여, FKBP-ECFP-CRIB_WASP 과 결합하는 EYFP-Cdc42의 도미넌트 네거티브(dominant-negative) Cdc42를 사용하여, 상기와 동일하게 Hela 세포에 형질 감염시킨 뒤, 단백질 간의 상호결합을 관찰하였다.

그 결과, 라파마이신 처리 후, 도미넌트 네거티브 형태의 Cdc42의 낮은 결합 친화도로 인하여, FKBP-ECFP-CRIB_WASP와 결합력이 낮아져서, 활성이 있는 Cdc42에서 관찰되는 원 모양이 엔도좀에서 관찰되지 않았다(도 1의 F). 따라서, 상기 결과로부 ECLIPSE가 살아있는 포유류 세포에서 단백질 간의 상호결합을 관찰하는 효과적인 방법이라는 것을 알 수 있었다.

< 실험예 5> ELIPSE 를 이용한 신호전달 의존적인 단백질 간 상호 결합 관찰

ECLIPSE를 이용하여, 신호 의존적인 단백질 간의 상호 결합을 관찰하기 위하여, 본 발명자들은 칼슘 신호 의존적인 칼모듈린(calmodulin)과 CaMKIIα를 베이트와 프레이로써 사용하여, 칼슘 신호에 의한 상기 두 단백질 간의 상호 결합을 확인하였다.

상기 실시예에서 합성한 청록색 형광 단백질(teal fluorescence protein, mTFP)이 융합된 FKBP-TFP-CaM, YFP와 융합된 EYFP-CaMKIIα 및 pFRB-mCherry-Rab5를 Hela 세포에 형질감염시켰다. 그 뒤, 단백질 간의 상호 결합을 유도하기 위한 라파마이신(최종 농도 500nM) 및 이오노마이신(최종 농도 1μM)을 처리하였다.상기와 동일한 방법으로 세포의 이미지를 관찰하여 분석하였다.

그 결과, 도 2의 A에 나타난 바와 같이 라파마이신이 처리되지 않은 경우에, FRB는 엔도좀의 표면에 존재하는 반면, FKBP가 융합된 칼모듈린 및 CaMKIIα는 세포질 내에 흩어져서 존재하였다. 이노마이신 또는 라파마이신을 단독으로 처리하였을 때에는 엔도좀으로 CaMKIIα이 이동하지 않았지만, 라파마이신과 세포질 내 칼슘 이온의 농도를 높이는 이오노포어(ionophore)인 이오노마이신(ionomycin)을 처리하여 칼모듈린과 CaMKIIα의 결합을 유도하였을 때에만, 엔도좀에서 뚜렷한 원이 관찰되었다(도 2의 A).

< 실험예 6> ELIPSE 를 이용한 신호전달 의존적인 3개 단백질 간 상호 결합의 정량 분석

<실험예 5>에서 관찰된 칼슘 신호 의존적인 단백질 간 결합을 정량적으로 분석하기 위하여, 획득한 이미지를 NIS-element software 또는 MetaMorph software를 이용하여 분석하였다. Rab5-키메라 단백질의 위치에 따라서 ROI(region of intensity)를 결정하였으며, 칼모듈린 및 CaMKIIα의 위치 역시 상기 분석 프로그램을 이용하여 측정하였다. 상대적인 형광 단위(RFU)는 결합을 유도하는 물질을 처리하기 전 초기의 ROI를 기준으로 계산하였다.

단백질들의 결합을 엔도좀 위치를 기준으로 분석한 결과, 도 2의 B에 나타난 바와 같이, 이오노마이신을 처리하여 세포질 내의 칼슘 농도를 높일지라도, FKBP-CaM 및 CaMKIIα의 엔도좀 내에서 수준의 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 라파마이신을 단독으로 처리하였을 때에 FKBP-CaM만이 엔도좀 내에서 수준이 증가함을 관찰할 수 있었다. 그러나, 이오노마이신과 라파마이신을 동시에 처리하였을 때에는 FKBP-CaM 및 CaMKIIα 모두의 엔도좀 내에서의 수준이 증가함을 관찰할 수 있었다(도 2의 B). 결과적으로, 이러한 결과는 ECLIPSE가 단일 신호 의존적인 단백질 간의 상호 작용을 분석하는데 강력한 이미지 분석법이라는 것을 확인시켜주었다.

< 실험예 7> ELIPSE 를 이용한 칼슘 신호 의존적인 칼모듈린과 CaMKII α사이의 상호 결합 관찰

칼모듈린과 CaMKIIα 단백질 간의 상호결합의 신호 의존적인 가역성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 CaMKIIα가 칼모듈린과 결합, 분리 및 확산을 모두 관찰할 수 있는 엔도좀 앵커 단백질 Rab5를 이용한 ECLIPSE를 적용하였다.

Hela 세포에 CaM-mCherry-Rab5와 YFP-CaMKIIα를 형질감염시킨 뒤, 이오노마이신을 처리한 후, 10분 동안 상호 결합을 관찰하였다. 그 결과, 도 3의 A에 나타난 바와 같이, 이오노마이신을 처리한 후, 칼모듈린과 CaMKIIα 사이의 가역적인 상호 작용을 관찰할 수 있었다. 또한, Rab5-칼모듈린 융합 단백질을 발현하는 세포에서, Rab5-칼모듈린 융합 단백질 엔도좀에 존재하였으며, 상기 엔도좀에서 높은 농도의 형광이 핵 주위에 응집되어 단백질 간의 상호 작용의 분석에 있어서 신뢰성 있는 판독을 할 수 있었다(도 3의 A).

< 실험예 8> ELIPSE 를 이용한 칼슘 신호 의존적인 칼모듈린과 CaMKII α사이의 상호 결합의 정량 분석

상기 실험예 7에서 관찰된 CaM-mCherry-Rab5와 YFP-CaMKIIα간의 상호 결합을 정량적으로 분석하기 위하여, 획득한 이미지를 NIS-element software 또는 MetaMorph software를 이용하여 분석하였다. CaM-mCherry-Rab5의 위치에 따라서 ROI(region of intensity)를 결정하였으며, 칼모듈린 및 CaMKIIα의 위치 역시 상기 분석 프로그램을 이용하여 측정하였다. 상대적인 형광 단위(RFU)는 결합을 유도하는 물질을 처리하기 전 초기의 ROI를 기준으로 계산하였다.

단백질들의 결합을 엔도좀 위치를 기준으로 분석한 결과, 도 3의 B 및 C에 나타난 바와 같이 엔도좀에 집중되어 있는 CaMKIIα 수준은 세포질 내의 증가된 칼슘 수준에 의해서 강화되었으나, 이러한 엔도좀 내의 집중은 5 분이 지난 후부터, 흩어지기 시작하였다. 이러한 자발적인 분산은 칼모듈린과 CaMKIIα 사이의 상호 결합이 가역적이라는 것을 의미하며, 가역적인 상호관계를 관찰할 수 있는 ECLIPSE의 유용성을 나타내주었다(도 3의 B 및 C).

< 실험예 9> ELIPSE 를 이용한 칼모듈린과 CaMKII α 사이의 변동적인 ( Oscillatory ) 상호 작용을 모니터링

<실험예 8>에서 관찰된 칼모듈린과 CaMKIIα 단백질 사이의 가역적인 상호 작용을 바탕으로, 두 단백질 사이의 변동적인(Oscillatory) 상호 작용을 관찰하기 위하여, 칼모듈린과 CaMKIIα 사이의 상호 작용을 좀 더 긴, 30분 이상의 시간 동안 관찰하였다.

Hela 세포에 CaM-mCherry-Rab5와 YFP-CaMKIIα를 형질감염시킨 뒤, 이오노마이신을 처리한 후, 30분 동안 상호 결합을 관찰하였다. 그 결과, 도 4의 A에 나타난 바와 같이, 이오노마이신을 첨가한 후, CaMKIIα가 엔도좀으로 이동되어 칼모듈린과의 결합이 관찰시간 동안 4번 관찰되었다(도 4의 A).

이러한 변화를 정량적으로 분석한 결과, 도 4의 B에 나타난 바와 같이, 이오노마이신 첨가 후, 칼슘 이온이 세포 내로 이동하자마자, 얼마 지나지 않아 이오노마이신을 첨가하지 않았을 때보다, 1.5배 증가한 첫 번째 피크가 관찰되었으며, 두 번째 피크는 2배, 세 번째 피크는 2.5배 증가한 것이 관찰되었으며, 네 번째 피크는 세 번째 피크와 유사한 정도가 관찰되었다(도 4의 B).

< 실험예 10> ELIPSE 를 이용한 칼모듈린과 칼모듈린 키나아제 간의 상호 작용 모니터링

본 발명자들은 ECLIPSE 방법을 이용하여 칼모듈린(bait)과 결합하는 CaMKIIα과 CaM 키나아제 키나아제 1(CaM kinase kinase 1, CaMKK1)을 프레이로 이용하여 단백질 간의 결합을 관찰하였다. CaMKK1은 CaMKIIα과 유사하게, 칼모듈린 결합 단백질로 잘 알려져 있다(Oldroyd GE et al, Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, Soderling TR, Trends Biochem Sci, 1999). 그러나, 칼슘 신호에 의존적으로 칼모듈린과 결합하여, CaMKK1은 CaMKＩ과 CaMKⅣ을 활성화시켜, CREB(cAMP Response Element Binding Protein)의 전사를 활성화하는 반면, CaMKIIα는 활성화시키지 않는다고 알려져 있다. 세포 내 동일한 칼슘 신호에 의해서 정반대의 기작이 일어나는 원인 및 과정을 살펴보기 위하여, 본 발명자들은 두 종류의 칼모듈린 키나아제를 Hela 세포에 형질감염시킨 뒤, ELIPSE를 이용하여 단백질 간 상호 작용을 관찰하였다.

Hela 세포에 CFP-CaMKK, YFP-CaMKIIα 및 CaM-mCherry-Rab5를 형질감염시킨 후, 이오노마이신을 처리하여, 세포 내 칼슘수준을 증가시켜 칼모듈린과 CaMKIIα과 CaMKK1의 결합을 유도하였다.

그 결과, 도 5의 A에서 나타난 바와 같이, 이오노마이신 처리 후, 칼모듈린, CaMKK1 및 CaMKIIα가 엔도좀에서 결합하는 것이 관찰되었다. 이러한 결과를 바탕으로, CaMKK1 및 CaMKIIα의 엔도좀으로의 이동을 분석한 결과, 상기 두 종류의 키나아제의 엔도좀으로 이동하는 속도에 차이가 관찰되었으며, CaMKK1이 CaMKIIα보다 더 빠른 속도로 칼모듈린과 결합하는 것을 관찰할 수 있었다(도 5의 A 및 B).

< 실험예 11> CaMKK1 및 CaMKII α의 칼모듈린에 대한 친화성 측정

상기 <실험예 10>에서 관찰된 칼모듈린과 CaMKK1과 CaMKIIα의 칼모듈린에 이동하여 결합하는 속도의 차이가 키나아제와 칼모듈린과의 결합 친화성에 의한 것임을 확인하기 위하여, CaMKVI를 CaMKIIα 대신 사용하여 실험을 수행한 결과, CaMKVI과 CAMKK1이 엔도좀으로 동시에 이동되어 칼모듈린과 결합하는 것을 관찰되었다(도 6).

이에 따라 본 발명자들은 또 다른 요인으로 칼모듈린 키나아제의 부피를 비교하였다. CAMKK1은 모노머릭(monomeric)인 반면 CaMKIIα는 도데카믹(dodecamic)이며, 단백질의 부피는 이동성에 영향을 끼치기 때문에, 이를 확인하기 위하여, FKBP-결합된 CaM 키나아제를 사용하여 실험을 수행하였다. FKBP가 결합된 CaM 키나이제의 엔도좀으로의 이동은 calmodulin-CaM 키나아제의 상호 작용에 의해서 조절되는 것이 아니라, FRB-Rapamycin-FKBP 상호 작용에 의해서 조절될 수 있었다. 따라서, 모노머릭 CaMKK1 및 도데카믹 CaMKIIα는 엔도좀으로 향하는 동일한 힘을 받고 있으므로, 단백질의 부피에 의한 것인지를 비교할 수 있었다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, CaMKK1과 CaMKIIα는 엔도좀으로 동일한 시간에 자리 잡는 것을 관찰할 수 있었으며, 이에 따라 단백질의 부피 차이가 상기 두 가지 키나아제가 엔도좀으로 이동하는데 중요한 요소가 아님을 의미한다(도 7). 이는, 10Å에서 100Å 반경의 입자는 세포질 내에서 비슷한 확산 비율이 있다는 보고와 일치한다(Jacobson K, et al, P Natl Acad Sci-Biol, 1984).

< 실험예 12> 칼슘 신호 증가에 따른 칼모듈린 키나아제의 결합 친화성 변화 측정

CaMKIIα및 CaMKK1의 상이한 칼모듈린 결합 친화성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 이오노마이신 농도에서 칼모듈린과 상기 CaM 키나아제의 결합 패턴을 비교하였다.

Hela 세포는 혈청이 포함되어 있지 않고, 1 μM 플루오-4- AM 에스터(Fluo-4 AM ester)(Invitrogen Life Science Inc, USA) 또는 플루오-3- AM 에스터(Fluo-3 AM ester)(Invitrogen Life Science Inc, USA)를 포함한 DMEM에서 37℃에서 배양되었다. 세포는 1 시간 동안 반응한 후, PBS를 이용하여 세척된 후, 이미지를 찍기 전에, OPTI-MEM 배지로 현탁되었다. 세포질 내 칼슘 수준을 강화시키기 위하여, 이오노마이신을 0.125 ~ 2 μM로 처리하였다.

그 결과, 이오노마이신의 농도가 증가할수록, 칼슘 킬레이팅(chelating) 염료 Fluo-4를 통해서 측정에 따라, 세포질 내 칼슘 이온의 수준이 증가함을 확인할 수 있었다(도 8). 칼모듈린과 CaMKIIα 사이의 상호결합이 증가한 원인이 세포 내 칼슘 수준의 증가에 기인한 것으로 추정할 수 있었다.

이에, 본 발명자들은 ECLIPSE 방법을 이용하여, 세포 내 칼슘 수준의 변화가 단백질 간의 상호 결합에 미치는 영향을 관찰하였다. Hela 세포에 CaM-mCherry-Rab5, YFP-CaMKIIα, 및 CFP-CaMKK1를 형질감염시킨 뒤, 이오노마이신을 0.125 ~ 2 μM로 처리하였다.

그 결과, 이오노마이신 농도가 증가함에 따라서, 상호 결합의 정도 및 결합하는 시간이 증가함을 관찰할 수 있었다(도 5의 C). 추가적으로, CaMKK1의 엔도좀 내의 이동은 CaMKIIα의 이동에 필요한 세포질 내 칼슘 수준보다 더 낮아도, 관찰할 수 있었으며, 이는 칼모듈린과 CaMKK1 상호결합이 칼모듈린과 CaMKIIα보다 세포질 내 칼슘 수준에 대하여 더욱 민감함을 나타낸다. 종합해보면, 상기 결과는 CaMKK1은 세포질 내 증가된 칼슘 수준에 의한 칼모듈린의 형태 변화에 더욱 민감하기 때문에, CaMKIIα보다, 더욱 빠른 속도로 칼모듈린과 결합함을 확인할 수 있었다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 단백질 간 상호 작용을 모니터링 할 수 있는 ECLIPSE 방법은, 세포 내 엔도좀과 결합하는 Rab5 단백질을 이용하여, 신호 의존적 또는 단백질 간 상호 작용에 따른 단백질 결합을 모니터링 할 수 있는 효과적인 방법이므로, 단백질 간 상호 작용을 모니터링 할 수 있는 스크리닝 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

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Claims (10)

1) 세포질 내에 위치하는 프레이(prey) 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터, 및 엔도좀(endosome)에 위치하는 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트(bait) 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 발현벡터들을 숙주세포에 함께 형질전환시키는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 숙주세포에서 형광 단백질을 이용해 프레이 단백질이 엔도좀에 위치하는지 여부를 형광분석하는 단계;를 포함하는 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법.

제 1항에 있어서, 상기 형광 단백질은 적색 형광 단백질(Red Fluorescent Protein, RFP), 증강된 적색 형광 단백질(Enhanced red Fluorescent Protein, ERFP), 청색 형광 단백질(Cyan Fluorescent Protein, CFP), 증강된 청색 형광 단백질(Enhanced cyan Fluorescent Protein, ECFP), 황색 형광 단백질(Yellow Fluorescent Protein, YFP), 증강된 황색 단백질(Enhanced Yellow Fluorescent Protein, EYFP), mTFP(monomeric teal Fluorescent Protein), 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP), 및 변형된 녹색 형광 단백질(modified green Fluorescent Protein, EGFP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법.

제 1항에 있어서, 프레이 단백질은 칼모듈린 키나아제(Calmodulin Kinase)인 것을 특징으로 하는 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법.

제 1항에 있어서, 베이트 단백질은 칼모듈린(calmodulin)인 것을 특징으로 하는 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법.

제 1항에 있어서, 형광분석은 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 분석하는 것을 특징으로 하는 세포 내 단백질 상호 작용 모니터링 방법.

1) 세포질 내에 위치하는 프레이(prey) 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터, 및 엔도좀에 위치하는 서열번호 1로 기재되는 Rab5, 형광 단백질 및 베이트(bait) 단백질의 융합 단백질을 발현하는 발현벡터를 제작하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 발현벡터들을 숙주세포에 함께 형질전환시키는 단계;
3) 상기 단계 2)의 숙주세포에 피검물질을 처리하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 숙주세포를 형광 단백질을 이용해 형광 분석하는 단계; 및
5) 상기 형광 분석을 통해 프레이 단백질이 엔도좀에 위치하는지 여부를 확인함으로써 단백질 상호 작용을 촉진 또는 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 단백질 상호 작용 촉진제 또는 저해제 스크리닝 방법.

제 6항에 있어서, 상기 형광 단백질은 적색 형광 단백질(RFP), 증강된 적색 형광 단백질(ERFP), 청색 형광 단백질(CFP), 증강된 청색 형광 단백질(ECFP), 황색 형광 단백질(YFP), 증강된 황색 단백질(EYFP), 녹색 형광 단백질(GFP), 변형된 녹색 형광 단백질(EGFP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단백질 상호 작용 촉진제 또는 저해제 스크리닝 방법.

제 6항에 있어서, 프레이 단백질은 칼모듈린 키나아제(Calmodulin Kinase)인 것을 특징으로 하는 단백질 상호 작용 촉진제 또는 저해제 스크리닝 방법.

제 6항에 있어서, 베이트 단백질은 칼모듈린(calmodulin)인 것을 특징으로 하는 단백질 상호 작용 촉진제 또는 저해제 스크리닝 방법.

제 6항에 있어서, 형광분석은 형광 현미경 또는 공초점 현미경으로 분석하는 것을 특징으로 하는 세포 내 단백질 상호 작용 촉진제 또는 저해제 스크리닝 방법.

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