KR101356787B1 - 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트 - Google Patents

나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질간의 상호작용의 효율적인 분석을 위해, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1폴리뉴클레오티드, 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝부위를 포함하는 제1발현벡터; 및 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2폴리뉴클레오티드, 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝부위를 포함하는 제2발현벡터를 포함하는 단백질간 상호작용 분석용 키트를 제공한다.

Description

나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트{Method and kit for analyzing interactions between proteins using nanocluster formation}
본 발명은 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트에 관한 것으로서, 더 상세하게는 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트에 관한 것이다.
일반적으로 다양한 생리활성 물질간의 역동적인 상호작용에 의해서 여러 가지 생리적인 기능이 조절되고, 이러한 상호작용이 적절히 일어나지 못하거나, 상호작용이 일어나지 않아야 할 분자 사이에 상호작용 발생하는 비정상적인 상황에서 질병이 초래되기도 한다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성 화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 상호작용하는데, 이들 생리활성 화합물은 대상 단백질의 기능을 조절함으로써, 당해 단백질과 관련된 질환의 진단 또는 예방, 치료 및 경감시킬 수 있는 치료제 후보물질이 될 수 있다.
이러한 단백질간의 상호작용 및 단백질과 소분자 화합물 간의 상호작용을 분석함으로써, 질병 표적 또는 치료제를 스크리닝하고자 하는 연구가 지속되어 왔다. 그 예로, 파지디스플레이(Sche et al., Chem. Biol., 6: 707, 1999), 효모 2종-/3종-하이브리드 분석(Licitra et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 93: 12817, 1996), 이종결손(heterologous deletions)이 일어난 효모균주의 평행분석(Zheng et al., Chem. Biol., 11: 609, 2004) 등과 같은 기술을 들 수 있다. 그러나, 이들 기술들은 높은 배경(high background), 위양성(false positive), 낮은 민감도(low sensitivity) 등과 같은 문제점을 가지고 있고, 시험관내 조건에서의 반응 또는 비포유동물 세포를 사용한 반응의 경우, 실험결과를 100% 신뢰하기 어려운 단점을 가지고 있다.
대한민국 공개특허 제2009-0018585호는 상기와 같은 문제점을 극복하기 위해 안출된 것으로서, 자기조립을 하는 페리틴 단백질에 형광단백질 및 미끼(bait) 단백질을 연결한 제1융합단백질과 페리틴 단백질에 동일 형광단백질 및 표적(pray) 단백질을 연결한 제2융합단백질을 하나의 세포주에서 동시에 발현시킨 후, 상기 미끼 단백질과 표적 단백질의 상호작용 여부를 자기조립된 형광 나노입자의 클러스터 형성에 따른 발광패턴의 차이로 확인하는 방법에 관한 것이다.
그러나 상기 대한민국 공개특허 제2009-0018585호에 개시된 기술은 하나의 나노입자 내에 미끼 단백질과 표적 단백질이 모두 존재하기 때문에, 단일 나노입자내에서 미끼 단백질과 표적 단백질이 상호작용함으로써 나노입자간의 상호작용이 저해되는 위음성(false-negative)이 나타날 수 있고(도 1a), 반대로 다른 나노입자에 존재하는 미끼 단백질 또는 표적 단백질 사이의 동형이량체 형성(homodimerization)에 따른 위양성(false-positive)이 나타날 수 있다(도 1b).
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 나노클러스 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 미끼 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 및 표적 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형관단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1융합단백질 내의 미끼단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질의 순서는 어느 것이라도 무방하다. 예를 들어 상기 제1융합단백질은 미끼단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질의 순으로 구성될 수도 있고, 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 미끼단백질의 순으로 구성될 수도 있다. 마찬가지로, 상기 제2융합단백질 내의 표적단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질의 순서 역시 어느 것이라도 무방하다. 예를 들어 상기 제2융합단백질은 표적단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질의 순으로 구성될 수도 있고, 제2자기조립단백질, 제2형광단백질 및 표적단백질의 순으로 구성될 수도 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1폴리뉴클레오티드, 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝부위를 포함하는 제1발현벡터; 및 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2폴리뉴클레오티드, 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝부위를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미끼 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 표적 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 세포에 형질도입하는 단계; 및 형질도입된 세포를 배양하여 세포내 형광의 분포 및 강도를 형광현미경으로 관찰하는 단계를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는, 단백질간 상호작용의 분석방법이 제공된다.
아울러 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미끼 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 표적 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 세포에 형질도입하는 단계; 형질도입된 세포에 상기 미끼 단백질 및 상기 표적 단백질 사이의 상호작용에 대한 조절 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포내 형광의 분포 및 강도가 변화했는지 여부를 형광현미경으로 관찰하는 단계를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는, 단백질간 상호작용의 분석방법이 제공된다.
상기 단백질간 상호작용의 분석방법에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용의 분석방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용의 분석방법에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용의 분석방법에 있어서, 상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용의 분석방법에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
상기 형광의 분포 및 강도의 변화는 형광현미경을 통해 육안으로 관찰할 수 있는데, 나노클러스터가 형성되지 않은 경우에는 세포질 내 또는 발현된 단백질이 분포하는 세포내 소기관 내에 형광이 전반적으로 퍼져있는 양상으로 나타나는 반면, 나노입자 사이의 상호작용에 의해 나노클러스터가 형성되는 경우에는 상기 나노클러스터가 강한 형광을 나타내는 점의 형태로 시각화된다. 이러한 변화는 육안으로 관찰이 가능하며, 이미지분석 소프트웨어를 통해 형광 점의 수와 형광 강도를 정량화할 수도 있다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 효율적인 단백질간 상호작용 분석을 수행할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 종래 나노클러스터를 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 단점을 보여주는 개요도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질간 상호작용 분석방법의 장점을 보여주는 개요도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질간 상호작용 분석방법을 이용하여 FKBP와 FRB 사이의 상호작용을 관찰한 결과로서 도 3a는 나노클러스터 형성을 개략적으로 묘사한 개요도이고 도 3b는 형광현미경으로 세포를 촬영한 사진이다.
도 4는 Raf1의 Ras 결합 도메인(RBD)와 Ras 단백질 사이의 상호작용을 나노클러스터형성을 통해 분석하는 본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법의 작동모드를 개략적으로 보여주는 개요도이다.
도 5a는 Ras와 RBD 사이의 상호작용을 보여주는 양성대조군에 대한 형광현미경 촬영 사진이고, 도 5b는 Ras와 CRIBWASP이 상호작용하지 않음을 보여주는 음성대조군에 대한 형광현미경 촬영 사진이다.
도 6은 RBD와 다양한 Ras 유사체(analogue)사이의 상호작용 여부를 본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법을 통해 관찰한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법을 통해 칼슘 이온에 의해 단백질간 상호작용이 조절되는 예를 보여주는 개요도(도 7a) 및 실제 형광현미경 사진(도 7b)이다.
도 8은 종래의 나노클러스터를 이용한 분석방법에 사용되는 나노입자의 구조를 나타내는 개요도(도 8a), 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자의 구조를 나타내는 개요도(도 8b), 종래의 나노클러스터를 이용한 분석방법 사용시 동형 이량체 형성에 따라 나타난 위양성의 결과를 나타내는 형광현미경 사진(도 8c) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 분석방법 사용시 위양성 여부를 확인할 수 있음을 보여주는 형광현미경 사진(도 8d)이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 "미끼(bait) 단백질"이란, 다른 단백질과의 상호작용을 탐색하는데 이용되는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "표적(prey) 단백질"이란, 상기 "미끼 단백질"의 잠재적 상호작용 파트너로서 탐색(분석) 또는 검출하고자 하는 대상이 되는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "상호작용 조절 후보물질"이란 "미끼 단백질"과 "표적 단백질" 사이의 상호작용을 촉진, 유도, 억제 또는 저해할 것으로 예상되는 물질이다.
본 문서에서 사용되는 "자기조립단백질"은 매개물질의 도움 없이 단백질 발현과 동시에 자가조립(self-assembly)되는 단백질을 의미하며, 대표적인 자기조립단백질로는 페리틴(ferritin)을 들 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "나노클러스터(nanocluster)"는 자기조립단백질의 자가조립에 의해 형성된 나노입자가 나노입자간 상호작용에 의해 군집을 형성한 군집체를 의미한다.
본 발명의 키트 및 방법은 종래의 나노클러스터를 이용한 단백질간 분석방법에서 하나의 나노입자 내에 존재하는 미끼 단백질과 표적 단백질간의 상호작용에 따른 위음성 즉, 나노입자간 클러스터의 미형성(도 1a)와 미끼 단백질 또는 표적 단백질 간의 동형 이량체 형성(homodimerization)에 의해 나타날 수 있는 위양성(도 1b)의 위험성을 미끼 단백질과 표적 단백질 각각에 서로 다른 자기조립단백질을 사용함으로써 제거할 수 있으며(도 2), 본 발명자들은 실제 상기 위험성을 제거할 수 있음을 실험적으로 입증하였다(도 8 참조).
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 벡터의 제작
1-1: FKBP-ECFP-FT 컨스트럭트의 제작
페리틴 유전자인 FTL(GenBank Acc. No. BC016346)은 미국의 Open BioSystems사에서 구입하였고, 페리틴 단백질의 N-말단에 개량청록색형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP)와 FKBP(FK506 binding protein 1A, GeneBank No. NM_054014.2)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pECFP-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 FKBP-ECFP-FT 컨스트럭트를 제작하였다(페리틴 단백질은 FT로 표기함).
1-2: FRB-YFP-CaMKIIα(AD) 컨스트럭트의 제작
자기조립단백질로 CaMKIIα 유전자(GenBank No.: NM_012920)의 자기조립에 관여하는 결합도메인(Association domain (AD), CaMKIIα의 315-478 아미노산 잔기)을 사용하였고, FRB(FKBP12??rapamycin binding) 도메인은 mTOR 유전자(GenBank No.: NM_004958.3, 2021-2113 아미노산 잔기)로부터 증폭하여 사용하였다. FRB, 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP) 및 CaMKIIα(AD)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pEYFP-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 FRB-YFP-CaMKIIα 컨스트럭트를 제작하였다.
1-3: FRB-ECFP-FT 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 1-1에서 제조한 FKBP-ECFP-FT 컨스트럭트에서 FKBP를 FRB로 치환한 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pECFP-C1 벡터에 삽입하여, FRB-ECFP-FT 컨스트럭트를 제작하였다.
1-4: FKBP-DsRed 컨스트럭트의 제작
상기 FKBP 유전자 뒤에 DsRed(DsRed-Express2, Strack et al., Nat. Methods, 5: 955, 2008)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-N1 벡터(Clonetch, USA)에 삽입하여 FKBP-DsRed 컨스트럭트를 제작하였다.
1-5: FRB-ECFP-CaMKIIα(AD) 컨스트럭트의 제작
실시예 1-1에서 제작한 FRB-ECFP-FT 컨스트럭트에서 FT 유전자를 CaMKIIα(AD)로 치환한 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pECFP-C1 벡터에 삽입하여, FKBP-ECFP-CaMKIIα 컨스트럭트를 제작하였다.
1-6: FRB-DsRed 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 1-4에서 제작한 FKBP-DsRed 컨스트럭트에서 FKBP 유전자를 FRB 유전자로 치환한 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pDsRed-Express-N1 벡터(Clonetch, USA)에 삽입하여, FRB-DsRed 컨스트럭트를 제작하였다.
1-7: DsRed-HRas 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 HRas 유전자(GenBank No.: NM_001130442.1, Q61L mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-HRas 컨스트럭트를 제작하였다.
1-8: DsRed-KRas4B 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 KRas4B 유전자(GenBank No.: NM_033360.2, Q61L mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-KRas4B 컨스트럭트를 제작하였다.
1-9: DsRed-NRas 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 NRas 유전자(GenBank No.: NM_002524.3, Q61L mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-NRas 컨스트럭트를 제작하였다.
1-10: DsRed-MRas 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 MRas 유전자(GenBank No.: NM_001085049.1, Q71L mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-MRas 컨스트럭트를 제작하였다.
1-11: DsRed-Rap2B 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 Rap2B 유전자(GenBank No.: NM_002886.2, G12V mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-Rap2B 컨스트럭트를 제작하였다.
1-12: DsRed-DiRas3 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 DiRas3 유전자(GenBank No.: NM_004675.2, A46V mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-DiRas3 컨스트럭트를 제작하였다.
1-13: DsRed-RheB 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 RheB 유전자(GenBank No.: NM_005614.3, Q64L mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-RheB 컨스트럭트를 제작하였다.
1-14: DsRed-RalB 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 RalB 유전자(GenBank No.: NM_002881.2, Q72L mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-RalB 컨스트럭트를 제작하였다.
1-15: DsRed-Rap1A 컨스트럭트의 제작
상기 DsRed 유전자 뒤에 Rap1A 유전자(GenBank No.: NM_001010935.1, G12V mutant, CAAX-deleted)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 작동가능하게 연결한 유전자 컨스트럭트를 pDsRed-Express2-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 DsRed-Rap1A 컨스트럭트를 제작하였다.
1-16: RBD Raf1 -ECFP-FT 컨스트럭트의 제작
실시예 1-1에서 제작한 FKBP-ECFP-FT에서 FKBP 대신 Raf1 단백질(GenBank No.: NM_002880.3)의 Ras 결합 도메인(RBDRaf1)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 치환한 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, pECFP-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 RBDRaf1-ECFP-FT 컨스트럭트를 제작하였다.
1-17: CRIB WASP -ECFP-FT 컨스트럭트의 제작
실시예 1-1 제작한 FKBP-ECFP-FT에서 FKBP 대신 CRIBWASP 단백질(GenBank No.: NM_000377.2)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 치환한 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, pECFP-C1 벡터(Clonetch, USA)에 삽입하여 CRIBWASP-ECFP-FT 컨스트럭트를 제작하였다.
1-18: mCherry-CaMKII[296-315]-AD 컨스트럭트의 제작
형광현미경으로 적색을 나타내는 mCherry(Clontech)와 CaMKIIα 내에서 칼모듈린(CaM)과 상호작용하는 것으로 알려진 296-315 아미노산 잔기 그리고 CaMKIIα의 자기조립에 관여하는 결합 도메인(association domain, AD)의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pmCherry-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 mCherry-CaMKII[296-315]-AD 컨스트럭트를 제작하였다.
1-19: CaM-ECFP-FT 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 1-1에서 제작한 FKBP-ECFP-FT 컨스트럭트에서 FKBP 유전자를 칼모듈린(CaM) 유전자로 치환한 폴리뉴클레오티드를 제조한, 후 이를 pECFP-C1 벡터(Clonetch, USA)에 삽입하여 CaM-ECFP-FT 컨스트럭트를 제작하였다.
실시예 2: 형질도입
2-1: FKBP-ECFP-FT 및 FRB-YFP-CaMKIIα(AD)의 형질도입
미리 배양된 헬라 세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 실시예 1-1에서 제조한 FKBP-EGFP-FT 컨스트럭트 및 실시예 1-2에서 제조한 FRB-YFP-CaMKIIα(AD) 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 각각 또는 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-2: FKBP-ECFP-FT 및 FRB-DsRed의 형질도입
미리 배양된 헬라 세포에 실시예 1-1에서 제작한 FKBP-ECFP-FT 컨스트럭트 및 실시예 1-6에서 제작한 FRB-DsRed 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 각각 또는 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-3: FKBP-ECFP-CaMKIIα(AD) 및 FRB-DsRed의 형질도입
미리 배양된 헬라 세포에 실시예 1-4에서 제조한 FRB-GFGP-CaMKIIα(AD) 컨스트럭트 및 실시예 1-5에서 제조한 FKBP-DsRed 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 각각 또는 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-4: 다양한 DsRed-Ras 융합단백질과 RBD Raf1 -ECFP-FT 융합단백질의 공발현
실시예 1-7에서 제작한 DsRed-HRas 컨스트럭트와 실시예 1-16에서 제작한 RBDRaf1-ECFP-FT 컨스트럭트를 미리 배양된 헬라 세포에 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 각각 또는 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다. 한편, 음성대조군으로는 실시예 1-7에서 제작한 DsRed-HRas 컨스트럭트와 실시예 1-17에서 제작한 CRIBWASP-ECFP-FT 컨스트럭트를 상기와 동일한 방법으로 헬라 세포에 형질도입하였다.
아울러, 실시예 1-8 내지 1-15에서 각각 제작한 DsRed-KRas4B, DsRed-NRas, DsRed-MRas, DsRed-Rap2B, DsRed-DiRas3, DsRed-RheB 또는 DsRed-RalB 컨스트럭트와 실시예 1-16에서 제작한 RBDRaf1-ECFP-FT 컨스트럭트를 미리 배양된 헬라 세포에 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 각각 또는 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
실험예 1: Rapamycin에 의한 FKBP 및 FRB의 상호작용 여부 관찰
실시예 2-1 내지 2-3에서 형질도입된 헬라 세포의 이미징을 위해 세포배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 500nM 농도(Stock 농도는 2 mM, DMSO에 녹아있음)의 Rapamycin(Calbiochem, USA)을 세포에 처리하고, 세포내의 형광의 분포 및 강도를 공초점 형광 현미경(Nikon, A1R)으로 확인하였다(도 3). 그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, rapamycin을 처리하지 않은 세포에서는 형광이 세포질 전반에 걸쳐서 퍼져 있는 것으로 나타난 반면, rapamycin을 처리한 후에는 그 크기가 불규칙한 점의 형태의 강한 형광이 곳곳에 관찰되었다. 이는 페리틴, CaMKII 또는 DsRed의 자기집합에 의해 형성된 나노입자가 rapamycin에 의해 매개되는 FKBP와 FRB의 상호작용에 의해 클러스터를 형성하여 당해 나노클러스터가 형광현미경에 의해 시각화되었음을 의미한다.
본 실험은 본 발명이 특정 신호에 의해 상호작용하는 단백질간의 상호작용을 조절하는 물질을 탐색할 때 사용 가능함을 보여준다.
실험예 2: RBD Raf1 과 상호작용하는 Ras 분자의 탐색
본 발명자들은 특정 상호작용 조절물질이 없는 경우에도 본 발명이 특정 미끼 분자와 상호작용을 하는 표적 분자를 탐색하는데 사용가능한지 확인하기 위하여, Ras 단백질과 상호작용하는 것으로 알려진 RBDRaf1 단백질 사이의 상호작용 여부를 확인하고자 하였다(도 4).
우선, HRas 단백질과 DsRed의 융합단백질을 암호화하는 DsRed-HRas 컨스트럭트와 양성대조군으로서 HRas와 상호작용하는 것으로 알려진 RBDRaf1-ECFP-FT 컨스트럭트 또는 음성대조군으로서 CRIBWASP-ECFP-FT 컨스트럭트를 공형질도입한 세포주에 대하여 세포내 형광의 분포 및 강도를 관찰하였다(도 5). 그 결과, DsRed-HRas 컨스트럭트와 RBDRaf1-ECFP-FT 컨스트럭트가 공형질도입된 세포의 경우 적색형광 및 청록색 형광이 다수의 강한 점의 형태로 그리고 동일한 위치에 나타나는 반면(도 5a), Ras-DsRed 컨스트럭트와 CRIBWASP-ECFP-FT 컨스트럭트가 공혈질도입된 세포의 경우 형광이 세포질에 전반적으로 퍼져있는 양상을 나타냈다(도 5b). 이는, HRas와 RBDRaf1이 상호작용하여 이들을 포함하는 나노입자 사이에 나노클러스터가 형성되었음을 나타내며, HRas와 CRIBWASP 단백질 사이에는 아무런 상호작용이 일어나지 않았음을 나타낸다.
이어, 본 발명자들은 본 발명의 시스템이 특정 미끼 단백질과 상호작용하는 다양한 표적 단백질의 스크리닝에 활용가능한지 여부를 확인하기 위해, 실시예 1-8 내지 1-15에서 제작한 다양한 Ras 단백질과 DsRed의 융합단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트와 실시예 1-16에서 제작한 RBDRaf1-ECFP-FT 컨스트럭트를 공형질도입한 세포의 형광의 분포 및 강도를 형광현미경으로 관찰하였다(도 6)
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, KRas, NRas, MRas 및 Rap2B는 적색 형광과 청록색 형광이 다수의 점의 형태로 동일 위치에 나타나는 반면, RheB, RalB 및 Rap1A의 경우 적색 형광 및 청록색 형광 모두 세포질 전반에 걸쳐서 나타나는 것을 알 수 있었다. DiRas3의 경우에는 적색형광은 일부 강한 점이 세포질에 나타나기는 했지만 RBDRaf1의 청록색 형광의 경우 DiRas3와 함께 점의 형태로 나타나지 않고 세포질 내에 분산된 형태를 나타내어, 서로 상호작용을 하지 않음을 시사하고 있다.
상기 결과를 통해, RBDRaf1은 KRas, NRas, MRas, Rap2B와는 강력한 상호작용을 하고, DiRas3, RheB, RalB 및 Rap1A와는 상호작용을 하지 않는 것을 알 수 있었다.
실험예 3: CaMKIIα와 CaM 간의 상호작용의 실시간 관찰
본 발명자들은 본 발명의 시스템이 칼슘 의존적인 나노클러스터 형성을 통해 칼슘에 의해 조절되는 분자간 상호작용의 실시간 관찰이 가능한지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-18에서 제작된 mCherry-CaMKII[296-315]-AD 컨스트럭트와 상기 실시예 1-19에서 제작한 CaM-ECFP-FT 컨스트럭트를 헬라 세포에 상술한 방법으로 공형질도입한 후 칼슘이온의 통과를 촉진시키는 이오노포어(ionophore)로서 1 mM의 ionomycin을 처리한 후 형광의 분포 및 강도를 형광현미경으로 관찰하였다(도 7a 및 7b).
그 결과, 도 7b에서 나타나는 바와 같이, ionomycin 처리 전에는 형광이 세포질 내에 분산되어 있다가 ionomycin 처리 후 80초 경과 후에는 세포질 내에 나노클러스터 형성에 따른 강한 강도의 형광점이 나타났다가 시간이 지남에 따라 형광이 다시 분산되는 양상이 나타났다. 이는 칼슘의 유입(influx)에 따라 CaMKIIα와 칼모듈린 사이에 상호작용이 나타났다가, 칼슘이 제거됨에 따라 상호작용이 서서히 해제됨을 알 수 있다.
비교예: 동종 상호작용에 의한 위양성의 가능성
종래 나노클러스터 형성에 의한 단백질간 상호작용 분석방법은 상용되는 미끼 단백질 및/또는 표적 단백질의 특성에 따라서 미끼 단백질 사이의 동형 이량체 형성(homodimerization)에 따른 위양성이 나타날 수 있다(도 8a 및 8b). 따라서, 본 발명의 시스템이 이러한 위양성을 걸러낼 수 있는 지 확인하기 위해, 동형이량체를 형성하는 것으로 알려진 14-3-3 단백질(GenBank No.: NM_139323.2)과 FKBP(F36M) 단백질을 사용하였다.
구체적으로 14-3-3 단백질, ECFP 및 FT가 순차적으로 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pECFP-C1 벡터(Clonetch, USA)에 삽입하여 14-3-3-ECFP-FT 컨스트럭트를 제작하고, FKBP(F36M) 단백질과 mCherry와 FT가 순차적으로 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 FKBP(F36M) 단백질과 mCherry 및 AD(CaMKIIα의 결합 도메인)이 순차적으로 연결된 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 제조한 후, 이를 pmCherry-C1 벡터(Clonetch, USA)에 삽입하여 각각 FKBP(F36M)-mCherry-FT 컨스트럭트 및 FKBP(F36M)-mCherry-AD 컨스트럭트를 제작하였다.
그런 다음, 상기 14-3-3-ECFP-FT 컨스트럭트와 FKBP(F36M)-mCherry-FT 컨스트럭트를 헬라 세포에 공형질도입한 세포주와 14-3-3-ECFP-FT 컨스트럭트와 FKBP(F36M)-mCherry-AD 컨스트럭트를 헬라 세포에 공형질도입한 세포주를 제조하고, 상기 세포주의 형광 분포 및 강도를 분석하였다(도 8c 및 8d). 종래 시스템(14-3-3-ECFP-FT 컨스트럭트와 FKBP(F36M)-mCherry-FT 컨스트럭트 조합)에 의할 때는 청록색 형광 및 적색 형광이 동일한 위치에서 복수의 점의 형태로 나타나 일견 양 단백질 사이에 상호작용이 일어난 것으로 보인다(도 8c).
반면, 본 발명의 시스템에 의할 때에는 청록색 형광과 적색 형광 모두 특정 점의 형태로 나타났지만 두 형광은 서로 다른 위치에서 나타났기 때문에(도 5d), 이들 두 단백질 사이에 상호작용이 일어나지 않았다는 것을 알 수 있다.
이러한 결과는, 종래의 시스템의 경우 자기조립단백질을 페리틴 한 가지만 사용하기 때문에, 페리틴 자기조립에 따라 형성된 나노입자 내에 미끼 단백질과 표적 단백질이 같이 위치함에 따라, 이종 분자 간 상호작용의 결과와 동종 분자 간 상호작용의 결과를 구분할 수 없게 되는 반면, 본원 발명의 개선된 시스템은 미끼 단백질 및 표적 단백질 별로 서로 다른 자기조립단백질을 사용하게 됨에 따라, 이종 단백질 간의 상호작용과 동종 단백질 간의 상호작용을 구분할 수 있음을 보여준다.
따라서, 본 발명의 시스템은 위양성의 위험성을 현저하게 낮춘 매우 효과적인 시스템임을 알 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (18)

  1. 미끼 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 및
    표적 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며,
    다만, 상기 제1형광단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 어느 하나가 형광단백질로 DsRed를 포함하는 경우 상기 DsRed를 포함하는 융합단백질에서 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  2. 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1폴리뉴클레오티드, 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝부위를 포함하는 제1발현벡터; 및
    제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2폴리뉴클레오티드, 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝부위를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며,
    다만, 상기 제1형광단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 어느 하나가 형광단백질로 DsRed를 포함하는 경우 상기 DsRed를 포함하는 융합단백질에서 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 제1발현벡터 또는 제2발현벡터의 프로모터는 진핵 프로모터인,
    단백질간 상호작용 분석용 키트.
  10. 미끼 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 표적 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 세포에 형질도입하는 단계; 및
    형질도입된 세포를 배양하여 세포내 형광의 분포 및 강도를 형광현미경으로 관찰하는 단계를 포함하며,
    다만, 상기 제1형광단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 어느 하나가 형광단백질로 DsRed를 포함하는 경우 상기 DsRed를 포함하는 융합단백질에서 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  11. 미끼 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 표적 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 세포에 형질도입하는 단계;
    형질도입된 세포에 상기 미끼 단백질 및 상기 표적 단백질 사이의 상호작용조절 후보물질을 처리하는 단계; 및
    상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포내 형광의 분포 및 강도가 변화했는지 여부를 형광현미경으로 관찰하는 단계를 포함하며,
    다만, 상기 제1형광단백질과 제2형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 어느 하나가 형광단백질로 DsRed를 포함하는 경우 상기 DsRed를 포함하는 융합단백질에서 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한 것을 특징으로 하는,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  15. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  16. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
  18. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 제1발현벡터 또는 제2발현벡터의 프로모터는 진핵 프로모터인,
    단백질간 상호작용의 분석방법.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10865394B2 (en) 2015-07-27 2020-12-15 Washington University Toolkit for the production of post-translationally modified proteins

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1645881A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-12 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Screening process for the detection and characterization of protein-protein-interactions in vivo by fluorescence cross correlation spectroscopy
KR20090018585A (ko) * 2007-08-17 2009-02-20 한국과학기술원 물질의 상호작용 검출 방법
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6911311B2 (en) * 2001-01-04 2005-06-28 Myriad Genetics, Inc. Method of detecting protein-protein interactions
KR100886312B1 (ko) * 2006-01-20 2009-03-04 연세대학교 산학협력단 단백질-단백질의 상호작용을 분석하는 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1645881A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-12 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Screening process for the detection and characterization of protein-protein-interactions in vivo by fluorescence cross correlation spectroscopy
KR20090018585A (ko) * 2007-08-17 2009-02-20 한국과학기술원 물질의 상호작용 검출 방법
KR20110126356A (ko) * 2010-05-17 2011-11-23 한국과학기술원 Ｒａｂ５를 이용한 세포내 단백질 상호 작용 시각화 방법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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