KR20090018585A - 물질의 상호작용 검출 방법 - Google Patents

물질의 상호작용 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성물질을 비롯한 다양한 물질들의 상호작용(interaction)을 역동적으로 탐색하고 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 나노고단위복합체(nano-assembly matrix)를 형성할 수 있는 물질, 베이트(bait) 및 프레이(prey)를 반응시켜, 인 비트로(in vitro ) 또는 인 비보(in vivo )에서 베이트와 프레이의 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성(nano-assembly matrix formation)되는지를 분석하거나; 나노고단위복합체를 형성할 수 있는 물질, 베이트 및 나노고단위복합체 형성을 유도할 수 있는 매개(조절)물질을 반응시켜, 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo )에서 매개(조절)물질에 의해 나노고단위복합체의 형성을 유도한 후, 상기 베이트와 상호작용하는 프레이가 상기 나노고단위복합체상에 베이트와 같이 위치(co-localization on nano-assembly matrix)하는지를 분석하여, 베이트와 프레이의 상호작용을 역동적인 형태로 탐색하는 방법 및 상기 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질을 용이하게 검출하는 방법에 관한 것이다.
나노고단위복합체, 베이트, 프레이, 매개(조절)물질, 상호작용

Description

물질의 상호작용 검출 방법{The Methods for Detecting Molecular Interactions}
본 발명은 세포 안에서 일어나는 다양한 생리활성물질들 사이의 역동적인 상호작용(interaction)을 탐색하는 방법 및 이들의 상호작용과 기능을 조절하는 물질의 검출방법에 관한 것이다.
일반적으로 다양한 생리활성물질간의 역동적인 상호작용에 의해서 여러 가지 생리적인 기능이 조절된다. 이러한 상호작용이 적절히 일어나지 못하면 문제가 생겨 질환이 발생한다. 가령, 생체내의 단백질은 다른 단백질과 상호작용함에 의해 그 기능을 나타낸다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 상호작용한다. 일반적으로 두 개의 단백질들 사이의 상호작용은 이들 단백질이 기능적으로 관련되어 있음을 강하게 암시하며, 단백질의 특정부위에 특이적으로 상호작용하는 생리활성화합물은 그 단백질의 활성을 조절함에 의해 예컨대, 질환 관련 단백질의 경우 질환 을 진단, 예방, 치료 또는 경감시킬 수 있는 치료제로서의 개발가능성을 제시한다.
따라서 신약개발 분야에서는 이미 그 기능 및 특성이 밝혀진 물질인 "베이트"와 탐색 및 검출 대상이 되는 상호작용파트너인 "프레이"의 상호작용을 확인함으로써 신규 표적단백질을 검출하거나 신약후보물질로서 생리활성물질을 스크리닝하는 다양한 방법이 연구되고 있다. 이와 같이, 상호작용 분석을 통한 새로운 표적단백질의 동정 및 분리는 약물의 활성, 효과 및 부작용 등에 대한 유용한 정보를 수득하기 위한 매우 중요한 연구개발과제로 간주된다. 또한, 표적단백질은 생물학적 경로 및 전달체계에 대한 이해를 증진시키고 기초 세포조절 및 질환 메커니즘(mechanism)에 대한 정보를 제공하며, 이러한 정보는 표적단백질과 상호작용하는 생리활성 화합물에 대한 탐색 및 검출을 통하여 신약 개발 및 종래 약물의 개량 및 신규 약제학적 용도의 발견 등에 매우 놀랍고도 강력한 수단이 된다.
의약계는 인간의 다양한 질환에 대한 보다 안전하고 효과적인 치료법을 개발하기 위한 도전에 직면해 있지만, 현재 사용되고 있는 많은 약물들은 그들의 표적단백질 및 분자적 타겟(molecular target) 없이 질환 모델에서의 생물학적 효능에 의해 규정되어지고 있는 실정이다(L. Burdine et al., Chem. Biol. 11: 593, 2004; J. Clardy et at., Nature 432:829, 2004). 게다가, 생물적 활성을 지닌 천연물이 약물 개발에 중요한 원천이 되고 있으나, 그들 활성의 양상은 대부분 알려져 있지 않고 있다(J. Clardy et at., Nature 432:829, 2004). 그들의 생리적 대상 및 분자적 타겟에 대한 규명은 치료적 효과 및 역효과에 대한 이해에 필수적일 뿐만 아니라, 이에 의해, 보다 개선된 2세대 치료학의 발전을 가능하게 할 것이다. 또한, 임 상적으로 증명된 화합물의 새로운 타겟을 발견하는 일은 치료상의 새로운 응용에 기여하게 될 것이다(T. T. Ashburn et al., Drug Discov. 3:673, 2004).
고효율로 대사하는 세포 기반의 스크리닝 방법을 다루는, 화합물과 결부된 생물학 분야에서 '타겟 스크리닝'은 거대한 화합물 라이브러리로부터 바람직한 표현형에 따라 저분자화합물들을 규명하는데 사용된다(R. L. Strausberg at al., Science 300:294, 2003; B. R. Stockwell, Nature 432:846, 2004). 상기 스크리닝의 큰 이점에도 불구하고, 이러한 접근은 발견된 저분자화합물을 규명하기에는 쉽지 않은 방법이다. 그러나, 단백질(또는 저분자화합물)-단백질 상호작용과 같은 다양한 세포내 분자 상호작용의 효과적인 검출은 동적인 생물학적 프로세스 및 조절 네트워크의 이해에 필수적이기 때문에, 이러한 타겟 동정 기술의 발달은 유전학, 단백질학 및 시스템 생물학을 포함한 다양한 생명과학 분야에 있어서 매우 중요하다.
타겟 스크리닝 분야에서, 친화성 크로마토그래피(Phizicky, E.M. et al., Microbiol. Rev., 59:94, 1995; Mendelsohn A.R. et al., Science, 284:1948, 1999); 단백질/저분자화합물 마이크로어레이, 파지 디스플레이(Sche, P.P. et al., Chem. Biol., 6:707, 1999); 효모 2종-/3종-하이브리드 어세이(Licitra, E.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:12817, 1996); 발현 프로파일링; 및 효모균주 이종결실(heterologous deletions)이 일어난 효모균주의 평행분석(Zheng et al., Chem. Biol., 11: 609, 2004) 등과 같은 몇몇의 기술들이 생리활성 분자들간 상호작용의 분석을 위해 활용되어 왔다.
그러나, 이러한 모든 기술들은 하이-백그라운드(high background), 가양성(false positives), 낮은 민감도(low sensitivity), 단백질 발현 후의 부적절한 폴딩(inappropriate folding), 간접성(indirectness), 단백질 발현 후의 변형 부족, 또는 세포적 적합성이 포함된 제한된 타겟 접근성 등과 같은 다양한 문제들로 어려움을 겪고 있다. 또한, in vitro 결합조건 또는 비-포유동물 세포와 같은 인위적인 환경의 사용은 때때로 실험 결과에 오류를 초래한다.
그러므로, 생리학적으로나 약학적으로 높은 민감도 및 선택도가 고려된 정황에서 생리활성 분자들의 상호작용을 직접적으로 조사하는 것이 가장 바람직하다. 살아있는 포유동물 세포 내에서 분자간 상호작용을 탐색하기 위한, fluorescence resonance energy transfer (FRET)(Moshinsky, D.J. et al., Screen., 8(4): 447, 2003) 또는 protein-fragment complementation assay (PCA)와 같은 기술이 사용가능한데, 이들은 상호작용 파트너들 사이에서 특정 공간 위치(specific spatial orientation)나 거리 등의 요건에 의해서 다소 제한을 받는다.
종합적으로 볼 때, 상기와 같은 기반기술을 발전시키는 것이 종래 기술과 비교하여 여러가지 이점을 제공하는데 매우 중요하다고 할 수 있다.
첫째, 생리학적으로나 약학적으로 관련된 생리활성물질 및 분자간 상호작용을 탐색하는 것은 인위적인 실험적 환경에 따른 결과물이 이끌어내는 오류를 크게 감소시킬 수 있고, 둘째, 전체 발현 프로파일 또는 복잡한 생물학적 표현형에 의존하는 여타 간접적 해독 방법과 달리, 생리활성물질 및 분자 상호작용을 명확한 해독 시그널로 직접적으로 해석할 수 있게 한다. 따라서, 생리활성물질 및 분자의 타겟에 대하여 내재된 가(false) 양성/음성 또는 오류를 일으키기 쉬운 추론 등이 미연에 방지될 수 있다. 셋째, 생리활성물질 및 분자간 상호작용에 있어서 동적인 단일세포 분석이 가능하다. 개개의 살아있는 세포들의 동적 분석(dynamic analysis)은 생리학적 및 약학적으로 광범위한 범위에 걸쳐, 이종간 비동시적으로 일어나는 세포내 프로세스를 탐색할 수 있는 효과적인 방법을 제공한다.
결국, 상기 기반기술은 다른 조직들 및 질환 상태의 넒은 범위에 걸쳐, 살아있는 세포 내에서 생리활성물질 및 분자간의 상호작용(예를 들어, 생리활성 저분자화합물와 단백질간의 상호작용 등)의 다양성 검출 및 단백질 변형(예를 들어, 인산화)을 검출하는데 사용될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 상기 기반 기술의 요구에 부응하여, 종래 기술이 가지고 있던 문제점을 해결하면서, in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서 생리활성물질들의 상호작용을 역동적으로 탐색하기 위한 방법을 연구한 결과, 다양한 생리활성물질들 사이의 상호작용에 따른 나노고단위복합체를 형성하는지(nano-assembly matrix formation) 여부 또는 나노고단위복합체상에서 같이 위치하는지(co-localization on nano-assembly matrix) 여부를 분석함으로 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색, 검증할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 특정 생리활성물질인 "베이트"와 탐색 및 검출 대상의 생리활성물질인 "프레이" 사이의 상호작용을 직접적으로 탐색하는 방법 및, 상기 "베이트"와 상호작용하는 "프레이"의 검출 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 "베이트"와 "프레이"의 상호작용을 억제 (blocking), 저해(inhibiting), 촉진(activating) 또는 유도(inducing)하는 표적물질을 탐색하고, 목적하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 제1태양으로
(i) 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질, 베이트(bait) 물질 및 프레이(prey) 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; (ii) 상기 베이트 물질 및 프레이 물질의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; 및 (iii) 상기 나노고단위복합체의 형성여부를 측정하여 상기 상호작용을 판별하는 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법을 제공한다. 이 때, 상기 물질 상호작용들은 각각 프레이 물질이 베이트 물질과 상호작용하여 나노고단위복합체를 형성하는지 여부를 통해 탐색한다.
또한, 제2태양으로,
(i) 매개(조절)물질 및 베이트 물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano- assembly matrix) 형성 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; (ii) 상기 매개물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및 (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 존재하는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법을 제공한다. 이 때, 상기 물질 상호작용들은 나노고단위복합체상에서 같이 위치하는지 여부를 통해 판별한다.
또한, 제3태양으로,
(i) 제1매개(조절)물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질 및 제2매개(조절)물질을 결합시킨 베이트 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개물질간의 작용에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상에 베이트물질을 결합시키는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및 (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 결합되어 있는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법을 제공한다. 이 때, 상기 물질 상호작용들은 나노고단위복합체상에서 같이 위치하는지 여부를 통해 판별한다.
나아가 본 발명은 상기 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 동일계 또는 동일장의 in vivo에서 다양한 생리활성물질들 사이의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성여부 또는 나노고단위복합체상의 동일 위치여부를 분석함으로 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색할 수 있다. 이를 위해, 본 발명은 in vitro 및 in vivo 에서 "베이트"와 "프레이"의 상호작용을 탐색하기 위한 키트(kit) 또는 칩(chip)에 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색 및 검출하고자 하는 표적물질의 크기에 제한 없이 세포를 파괴하지 않고 in vitro 및 in vivo 에서 효과적으로 수행할 수 있으므로, 신약개발을 위한 표적단백질 및 신약후보물질의 탐색 및 검출뿐만 아니라 기존의 약물을 개량하거나 새로운 약제학적 용도를 발견하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.
이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용하는 용어의 정의는 이하와 같다.
본 발명에서 "생리활성화합물"이란 생체 내에서 단백질, 핵산, 당 또는 지질 등을 포함한 생체물질과 결합하여 이들의 기능 또는 활성을 조절하는 화합물을 의미한다. 이러한 생리활성화합물은 유기체로부터 추출하거나 화학적 합성에 의해 수득된다. 예를 들어, 장기 이식 시 발생하는 면역거부반응을 경감시키기 위해 사용되는 "사이클로스포린 A"(Novartis AG) 및 "FK506"(Fujisawa)을 비롯하여 많은 항생물질들(antibiotics)이 미생물, 식물 또는 해양 생물로부터 분리되었다. 이와 같은 천연 또는 합성 생리활성화합물은 이것의 약리활성을 테스트하고, 동물모델 및 사람모델을 사용한 임상시험을 거쳐 하나의 신약으로 개발된다.
본 발명에서 "생리활성물질"이란, 생물이 생을 영위함에 있어서 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 등의 조절 역할을 하는 물질이라 정의할 수 있다. 이러한 생리활성의 물질은 동식물과 같은 천연물로부터 얻거나 미생물 및 동식물 세포주의 대사산물로부터 추출 정제 할수도 있고 화학합성에 의해서도 얻을수 있다. 생리활성물질은 예를 들어, 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 또는 화합물(chemical compound) 등일 수 있다.
본 발명에서 "베이트(bait) 물질"이란, 다른 생리활성물질과의 상호작용을 탐색하는데 이용되는 생리활성물질을 의미한다.
본 발명에서 "프레이(prey) 물질"이란, 상기 "베이트"의 상호작용 파트너로서 탐색(분석) 또는 검출하고자 하는 대상이 되는 생리활성물질을 의미한다.
본 발명에서 "표적물질"이란 검출하고자하는 대상이 되는 물질을 총칭하여 일컫는 용어로서, 목적하는 바에 따라 "베이트"와 상호작용하는 파트너인 프레이물질을 표적 물질로 할 수도 있고, 상기 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 촉 진(activating) 또는 유도(inducing)하거나 억제(blocking) 또는 저해(inhibiting)하는 물질을 표적물질로 할 수도 있다. 즉, 규명하고자 하는 대상이 되는 모든 물질을 포함한다. 그 중에서 베이트와 프레이 물질 간의 상호작용을 억제 또는 저해하는 물질을 '저해물질'이라고 정의하고, 촉진 또는 유도하는 물질을 '촉진물질'라고 정의한다.
본 발명에서 "나노고단위복합체(nano-assembly matrix)"란 물질의 반복적인 조립(assembly) 또는 상호작용(interaction)에 의해 쉽게 관찰할 수 있는 거대한 복합체를 의미한다. 상기 조립은 자기 조립을 포함하는 개념이다. "나노고단위복합체 형성 물질"이란 상기 나노고단위복합체를 형성할 수 있는 성질 및 기능을 가지고 있는 모든 물질을 의미한다.
본 발명에서 "매개(조절)물질"이란 나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질을 의미하며, 이는 상기 나노고단위복합체 형성물질과 직접 또는 간접적인 결합, 상호작용 및 융합을 통해서 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있는 모든 경우를 포함한다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 매개(조절)물질이라고 할 수 있다. 상기 매개(조절)물질은 나노고단위복합체 형성을 유도하는 특정 화합물이나 단백질 등의 구체적인 물질인 경우뿐만 아니라, 특정 돌연변이(mutation) 등의 현상과 특정 생리적인 신호 등을 아우르는 개념이다. 예를 들어, 생리적인 신호에 따른 단백질간의 상호작용, RNA와 단백질의 상호작용이나, 특정 단백질의 특정 돌연변이(mutation), 또는 구체적인 화합물에만 반응하는 단백질의 사용 등을 통해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있고, 이 들을 본 명세서에서 '매개(조절)물질'로 나타내고 있다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, in vitro 또는 in vivo 에서 특정 물질(예를 들어, 특정 생리활성물질) "베이트"와 탐색 및 검출 대상 물질(예를 들어, 다른 생리활성물질) "프레이" 사이의 상호작용을 탐색하는 방법에 관한 것이다.
물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제1 태양으로서, (i) 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트 물질 및 프레이 물질을 동일한 장 또는 계에 제공하는 단계; (ii) 상기 베이트 물질 및 프레이 물질의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; 및 (iii) 상기 나노고단위복합체의 형성여부를 측정하여 상기 상호작용을 판별하는 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법을 제공한다. 상기 베이트 및 프레이 물질은 바람직하게는 각각 표지물질과 결합되어 제공될 수 있다. 이 때, (i)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질의 상호작용을 매개하거나 조절할 수 있는 매개(조절)물질을 추가로 더 제공할 수 있다. 상기 매개(조절)물질 역시 표지물질과 결합되어 제공될 수 있다.
나노고단위복합체를 형성할 수 있는 물질(이하, '나노고단위복합체 형성 물질'이라 한다)에 임의의 탐색물질 베이트를 직접 또는 간접적으로 결합시키는 한편, 나노고단위복합체 형성 물질과 분석하고자 하는 다른 탐색물질 프레이를 결합하여 제공할 수 있다. 또한, 나노고단위복합체 형성 물질과 매개(조절)물질을 결합하여 제공하는 한편, 베이트 물질과 프레이 물질에 각각 매개(조절)물질을 결합하 여 제공할 수 있다.
물질간 상호작용을 탐색하는데 있어서 상기 제1방법을 사용하는 경우에, 나노고단위복합체가 형성되면 베이트-프레이 물질 또는 베이트-프레이 물질-매개물질 간에 서로 상호작용을 하는 것으로 판별할 수 있고, 나노고단위복합체가 형성되지 않는 경우에 상기 물질들간에는 서로 상호작용하지 않는 것으로 판별할 수 있게 되는것이다.
상기 제1방법에 따른 개략도를 도 1에 나타내었다. 상기 방법에서는 탐색물질인 베이트-프레이 물질간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성되는지 여부 자체를 측정한다. 상기 방법은 예를 들어, 프레이 물질, 베이트 물질 및 매개(조절)물질의 서로간의 상호작용 여부를 알지 못하고 있는 경우, 상기 물질들간의 상호작용 유무를 탐색할 수 있는 방법으로 사용될 수 있다.
이 때, 상기 베이트-프레이 물질간의 상호작용은 양 물질간의 직접적인 상호작용에 의할 수도 있고, 이들의 상호작용을 매개(조절)하는 물질에 의한 간접적인 상호작용에 의할 수도 있다. 또한, 후자의 경우, 매개(조절)하는 물질은 2개 이상의 조합이여도 무방하다.
일 실시예로, 도 4에서, FKBP(도 1에서 X에 해당)와 FRB(도 1에서 Y에 해당)의 탐색물질과 매개(조절)물질인 Rapamycin(도 1에서 A에 해당)에 의해 서로 상호작용함에 따라 페리틴 융합 단백질에 의한 나노고단위복합체가 형성되는 개략을 보여주고 있다.
본 발명의 제1태양에 대한 일 예들의 개략도를 도 15에 나타내었다. 즉, 도 15에서는 탐색물질 IkBα와 RelA이 서로 다양한 형식(A, B, C)으로 상호작용함에 따라 페리틴 융합 단백질에 의한 나노고단위복합체가 형성되는 실험적인 개략을 보여주고 있다.
먼저, 도 15에서 A는 페리틴에 각각 융합되어 있는 프레이, 베이트 물질인 IkBα와 RelA의 직접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성되는 경우를 나타낸다. 그리고 B는 페리틴에 베이트 물질인 IkBα 및 매개(조절)물질인 FRB 단백질을 융합하고, 프레이 물질인 RelA 단백질에 매개(조절)물질 FKBP를 융합한 후, 매개(조절)물질인 FRB-FKBP 상호작용 및 프레이-베이트 물질인 IkBα와 RelA의 상호작용에 의해 거대한 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되는 경우를 나타낸다. 마지막으로 C는 페리틴에 매개(조절)물질인 FRB만을 융합하고, 프레이-베이트인 IkBα와 RelA에 각각 매개(조절)물질 FKBP을 융합하여 매개(조절)물질인 FRB-FKBP 상호작용을 통해 페리틴의 FRB에 연결되어 보다 거대한 나노고단위복합체가 형성되는 경우를 나타낸다.
상기 B와 C경우는 결국 IkBα와 RelA의 간접적인 상호작용을 이용한 경우로서, 그 수단으로는 매개(조절)물질인 FRB-FKBP의 상호작용을 이용한 경우에 해당한다. 즉, 매개(조절)물질인 FRB-FKBP, 프레이-베이트 물질인 IkBα-RelA이 서로 상호작용하여 거대한 나노고단위복합체가 형성되는 것이다. 이 때, 매개(조절)물질 FRB-FKBP의 작용을 매개(조절)하는 또 다른 물질인 Rapamycin이 더 사용될 수 있다.
특히, 상기 C의 경우는 페리틴 단백질에 매개(조절)물질 FRB만을 부착시킴으로써 물질의 다중 상호작용(multiple interactions)에 의해 보다 거대한 나노고단위복합체를 형성할 수 있는 경우를 보여준다.
이와 같이, 탐색물질간의 직접 또는 간접적인 상호작용에 의한 나노고단위복합체의 형성자체를 판별하여 물질간 상호작용을 탐색하는 방법 이 외에도, 본 발명은 이하와 같은 다른 탐색 방법도 함께 제공한다. 이하의 두 방법은 우선, 매개(조절)물질에 의해 나노고단위복합체의 형성한 후, 형성된 나노고단위복합체 상에 존재하는 베이트 물질과 상호작용할 수 있는 프레이 물질을 탐색할 수 있는 방법이다.
우선, 본 발명의 제2태양으로서, (i) 매개(조절)물질 및 베이트 물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; (ii) 상기 매개물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및 (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 존재하는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법을 제공한다(도 2의 위).
그리고, 본 발명의 제3태양으로서, (i) 제1매개(조절)물질을 결합시킨 나노 고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질 및 제2매개(조절)물질을 결합시킨 베이트 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개물질간의 작용에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상에 베이트물질을 결합시키는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및 (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 결합되어 있는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법을 제공한다(도 2의 아래).
그리고, 상기 두 태양의 각 (ii)단계에서는 상기 매개(조절)물질과 작용해서 나노고단위복합체 형성을 유도하는 또 다른 매개(조절)물질을 추가로 더 제공할 수 있고, (iv)단계에서 베이트 물질 및 프레이 물질 간의 상호작용을 매개 또는 조절하는 물질을 추가로 더 제공할 수도 있다. 이 때, 상기 베이트 물질, 프레이 물질 및 매개(조절)물질은 바람직하게는 각각 표지 물질과 결합되어 제공될 수 있다.
상기 제2방법 및 제3방법은 공통적으로 우선, 서로간 상호작용을 하는 것으로 알려져있는 매개(조절)물질을 이용하여 그들간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성시킨 후, 형성된 나노고단위복합체 상에 존재하는 베이트 물질과 상호작용할 수 있는 파트너 물질인 프레이 물질을 탐색하는 방법에 관한 것이다.
다만, 본 발명의 제2방법 및 제3방법 수행에 있어서 가장 큰 차이점은, 매개(조절)물질의 작용에 의한 나노고단위복합체 형성 단계에 있어서, 베이트 물질을 처음부터 나노고단위복합체를 형성물질에 결합시켜 매개(조절)물질 작용에 의한 나노고단위복합체 형성에 참여시킬 것인지(제2방법), 또는 나노고단위복합체를 형성물질과 매개(조절)물질(제1매개(조절)물질)만으로 먼저 나노고단위복합체를 형성시킨 후, 또다른 매개(조절)물질(제2매개(조절)물질)을 이용하여 상기 결과물에 추가로 결합시켜 사용할 것인지(제3방법)이다. 이 때, 상기 매개(조절)물질(제1매개(조절)물질이나 제2매개(조절)물질 포함)의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 추가로 사용할 수 있다.
물질간 상호작용을 탐색하는데 있어서 상기 제2방법 또는 제3방법을 사용하는 경우에, 프레이 물질이 베이트 물질과 동일위치에 존재하는 것으로 확인되면 상기 베이트-프레이 물질은 서로 상호작용을 하는 것으로 판별할 수 있고, 동일위치에 존재하지 않는 것으로 확인되면 상기 베이트-프레이 물질은 서로 상호작용을 하지 않는 것으로 판별할 수 있게 되는것이다.
본 발명의 제2방법에 대한 개략도를 도 2의 위에 나타내었다.
도 2 위의 개략도를 중심으로 본 발명의 일 실시예를 살펴보면, 도 30에서, 나노고단위복합체 형성물질인 페리틴 단백질(도 2의 기호 N에 해당)에 베이트 물질 DHFR(도 2의 기호 X에 해당)을 결합시키고, 세포내에서 하나의 단백질(monomer)로 퍼져서 존재하는 FKBP 단백질(도 2의 기호 A,B에 해당)에 특정 돌연변이(mutation)(도 2의 기호 C에 해당)를 통해 자기들끼리 서로 결합해서 자발적으로 나노고단위복합체의 형성을 유도한 후, DHFR의 파트너 탐색물질인 MTX 화합물(도 2 의 기호 Y에 해당)과 상호작용해서 나노고단위복합체에 도킹(docking 또는 recruitment)되는 개략을 보여주고 있다.
제2방법의 또 다른 일 예로는, 도 34에서, 나노고단위복합체 형성물질인 페리틴 단백질(도 2의 기호 N에 해당)에 베이트 물질 FKBP(도 2의 기호 A,B면서 동시에 X에 해당)을 결합시키고, 매개(조절)물질인 AP1510(도 2의 기호 C에 해당)에 의해 나노고단위복합체를 형성 시킨후, 나노고단위복합체상에 존재하는 FKBP(베이트)가 FRB(프레이)(도 2의 기호 Y에 해당)와 상호작용함으로써 상기 FRB(프레이)가 나노고단위복합체상에 도킹(docking 또는 recruitment)하여, 결론적으로 상기 FKBP(베이트)-FRB(프레이)가 같이 위치하는 실험적인 개략을 보여주고 있다. 즉, 이 때의 FKBP는 AP1510 화합물과의 반응에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 매개(조절)물질 역할을 하면서, 동시에 FRB(프레이)와 상호작용하는 베이트 기능도 하는 것이다.
본 발명의 제3방법에 대한 개략도를 도 2 아래에 나타내었다.
도 2 아래의 개략도를 중심으로 일 예를 상정해 보면, 나노고단위복합체 형성물질인 페리틴 단백질(기호 N)에 제1매개(조절)물질인 FKBP(기호 A, B, D)를 결합시켜 AP1510 화합물(기호 C)과의 반응에 의해 나노고단위복합체를 형성한 후, 상기 결과물에 제2매개(조절)물질 FRB(기호 E)을 결합시킨 특정 베이트 물질(기호 X)을 반응시켜 제2매개(조절)물질의 작용을 조절하는 물질 Rapamycin(기호 F)에 의해 상기 베이트물질을 결합시킨다(FKBP-FRB 상호작용). 그리고, 상기 특정 베이트 물 질(기호 X)의 파트너 탐색물질인 프레이 물질(기호 Y)은 나노고단위복합체상에 존재하는 상기 베이트 물질과 상호작용해서 나노고단위복합체에 도킹(docking 또는 recruitment)하여, 결론적으로 상기 FKBP(베이트)-FRB(프레이)가 같이 위치할 수 있다.
이 때, 상기 제2매개(조절)물질의 작용은 물질의 성질에 따라 별도의 추가 매개(조절)물질 없이(즉, 기호 F의 물질 없이) 나노고단위복합체 형성물질에 결합되어 있는 제1매개(조절)물질과 직접상호작용하여 형성된 나노고단위복합체상으로 옮길 수도 있다.
본 발명의 상기 방법들에서, 나노고단위복합체를 형성하는 물질들, 즉 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트 물질, 프레이 물질, 나노고단위복합체 형성 유도 매개(조절)물질, 그리고 및 표지물질 등 본 발명에서 사용되는 물질들간의 결합은 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적인 직접 또는 간접 결합을 포함할 수 있다. 그 중에서도, 생물학적 결합이 이루어지는 경우, 항체(antibody), 단백질(protein), 단백질 도메인(domain), 단백질 모티프(motif), 펩타이드 등을 포함하는 탐침(probe)을 사용할 수 있다.
이하에서는 상기 방법들에서 사용되는 구체적인 구성 요소에 대해 설명한다.
"나노고단위복합체 형성 물질"은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용 부위(binding moeity)를 가진 물질로서, 서로 간의 상호작용 또는 자기조립(self- assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 자기조립에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질을 사용한다. 비제한적으로 이들 복합체는 나노크기의 입자로 구성되어 있는 것이 적합하다.
상기 자기조립에 의한 나노고단위복합체 형성 물질의 바람직한 예로서, 페리틴(ferritin), 페리틴 유사 단백질(ferritin-like protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질 또는 바이러스 구성단백질을 들 수 있다. 또한 화학적으로 합성한 다양한 나노입자도 나노고단위복합체 형성이 가능하다. 예를 들어, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자점(Q dot) 또는 자성나노입자(magnetic nanoparticle) 등을 포함한 여러 종류의 나노입자를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 자기조립(self-assembly)에 의해 나노크기의 단위복합체를 형성할 수 있는 물질 또는 단백질들 중에 페리틴(ferritin) 단백질을 이용하였다.
페리틴 단백질은 24개가 자기조립에 의해 구형 나노입자복합체을 형성하며 외경은 약 12 nm이며, 내경은 약 9 nm인 구조를 이루며, 2500개 이상의 철 원자를 함유한다(Chasteen, N.D. Struc. Biol. 126:182-194, 1999). 페리틴 단백질의 의해 형성되는 나노입자복합체의 표면상에서 일어나는 "베이트"와 "프레이" 사이 또는 "매개(조절)물질" 간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성되는 경우, "베이트", "프레이" 또는 "매개(조절)물질"에 결합시킨 형광, 발광, 자성, 방사성 물질 등의 표지물질(label)을 현미경 등의 분석기기를 이용하여 분석함으로써 역동적으로 탐색할 수 있다.
도 3에서 본원발명에서 사용된 24개의 페리틴 단백질이 자기조립에 의해 내 부지름 8 nm의 나노복합체를 형성한 모습을 나타내고 있다. 상기 도면에서 녹색구슬은 본 발명의 실시예에서 분석하고자 하는 여러 가지 물질을 결합시킨 아미노 말단 부위를 나타낸다. 이러한 페리틴 나노복합체의 표면에 결합시킨 물질이 서로간에 상호작용이 일어나면 본 발명의 실시예에서 관찰된 것처럼 서로 그물(matrix)처럼 연결되어서 나노고단위복합체가 형성된다.
상기 마그네토좀 구성 단백질은 세포 내에 자석을 축적하는 자성 박테리아(magnetic bacteria)의 마그네토좀(magnetosome) 이라는 소기관내에 축적되어 있는 약 100나노미터의 자석입자들의 막내부에 존재하고 있는 단백질이다. 이러한 마그네토좀 구성 단백질도 서로간의 자성에 의하여 자기조립에 의해 나노입자 복합체를 형성할 수 있으므로 본원 발명에 사용할 수 있다.
탐색 물질에 해당하는 '베이트' 및 이의 파트너에 해당하는 '프레이' 물질은 서로 간에 상호작용이 일어나리라 예상되는 후보 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직하게는 생리활성물질이다.
생리활성물질은 생체 내에서 생리적인 활성을 나타내는 모든 물질로서, 인간의 생체 내의 다양한 생체물질과 상호작용하여 이들의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직한 예로서 핵산(nucleic acid), 뉴클레오타이드(mono-/oligo-/poly-nucleotide), 단백질(protein), 펩타이드(mono-/oligo-/poly-peptide), 아미노산(amino acid), 당(mono-/oligo-/poly-saccharide), 지질(lipid), 비타민, 화합물(chemical compound)을 들 수 있으나, 나아가 상기 물질들을 구성하는 더 작은 분자들도 포함한다.
베이트 및 프레이 물질 쌍의 상호작용에 대한 구체적인 예로서, Rapamycin 화합물의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FRB와 FKBP 단백질의 상호작용, FK506 화합물과 이것의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FKBP 단백질의 상호작용, AP1510 화합물과 결합하는 FKBP 단백질의 상호작용, IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 RelA 단백질의 상호작용, TNFa 생리적인 신호에 따라 조절되는 IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 bTrCP 또는 IKKb 단백질의 상호작용, miRNA와 mRNA의 세포내 상호작용(lin-28 mRNA에 결합하는 let-7b miRNA), Ago2 단백질과 miRNA의 상호작용, MS2 결합 mRNA 부위와 결합하는 MS2 단백질의 상호작용, DHFR 단백질과 MTX 화합물 세포내 상호작용 등을 들 수 있다.
상기 베이트-프레이 쌍의 결합을 조절하는 '베이트 및 프레이 상호작용 매개(조절) 물질'은 상기 베이트 및 프레이 사이의 상호작용을 촉진하여 양 물질간 결합을 매개(조절)하는 물질이고, 해당 기능을 발휘하는 물질이면 생리활성물질이든 화합물이든 제한이 없다. 그러나, 사용하는 베이트-프레이 쌍에 특이적으로 반응하는 물질이 바람직하다. 이러한 베이트-프레이 쌍의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하므로, 궁극적으로 상기 '베이트 및 프레이 상호작용 매개(조절) 물질'은 본 발명에서 정의하고 있는 '나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질'인 "매개(조절)물질"에 속한다고 할 수 있다.
상기 프레이-베이트간의 상호작용을 매개(조절)함에 있어서, 필요에 따라, 외부 신호에 따라 조절되는 단백질을 사용할 수도 있고, 자신의 표적인 mRNA와 특이적으로 결합하는 miRNA의 특성을 이용할 수도 있다. 일 예로, 도 22에서 RNA와 조절 단백질이 서로 상호작용함에 따라 페리틴 융합 단백질에 의한 거대한 나노고단위복합체가 형성되는 개략을 보여주고 있다. 특히, 외부 신호에 따라 조절되는 단백질을 이용하면, 생리적인 신호에 의해 세포내에서 일어나는 매우 민감한 탐색물질의 상호작용 등도 분석가능하게 된다.
본 발명의 일 실시예에서는 FKBP-FRB 쌍을 사용한 경우 Rapamycin을 매개(조절)물질로 사용하였고, IkBα-bTrCP 쌍 및 IkBα-IKKb 쌍을 사용한 경우 외부신호에 따라 조절되는 TNFa를 매개(조절)물질로 사용하였으며, PAZ-MS2CP 쌍을 사용한 경우 let-7b(miRNA)와 lin28-MS2bs(mRNA)의 결합을 매개(조절)물질로 사용하였다.
본 발명의 나노고단위복합체의 형성을 유도하는 '매개(조절)물질'은 상기 나노고단위복합체 형성 물질의 표면에서 서로 직접 또는 간접적으로 상호작용해서 나노고단위복합체를 형성시킬 수 있는 모든 요소를 포함하는 개념이다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 본 발명의 '매개(조절)물질'이라고 할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 베이트-프레이의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되는 경우(제1방법 발명)에, "베이트-프레이의 상호작용을 조절 또는 매개하는 물질" 역시 넓은 의미의 상기 "매개(조절)물질"에 포함된다.
이러한 '매개(조절)물질'은 나노고단위복합체를 형성을 유도한다는 해당 기 능을 발휘하는 요소라면 제한이 없다. 그러므로 서로 특이적으로 반응하는 물질간의 결합이나 돌연변이 등의 특정 현상에 의해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있으면, 해당 물질이든 특정 현상이든 모두 매개(조절)물질로 파악될 수 있다. 즉, 본 발명에서 매개(조절)물질이란, 특정 물질, 특정 현상 또는 특정 상호작용 자체 등을 모두 포함하는 용어이며, 이러한 매개(조절)물질은 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
만약 서로 상호작용하는 베이트-프레이 쌍의 성질을 이용하면서 프레이를 탐색하면서, 한편으로는 상기 베이트 물질의 자체 성질을 이용하여 나노고단위복합체의 형성하였다면, 상기 사용된 베이트 물질은 나노고단위복합체의 형성을 유도하는 매개(조절)물질이면서, 동시에 파트너인 프레이와의 상호작용을 탐색하는데 사용된 베이트 기능을 발휘하고 있는 것이다.
일 예로서, FKBP 단백질에 특정 돌연변이를 통해 자기들끼리 서로 결합해서 자발적으로 나노고단위복합체의 형성을 유도한 후, Rapamycin을 통해 FKBP의 파트너 탐색물질인 FRB 단백질이 FKBP 단백질과 상호작용해서 나노고단위복합체에 도킹(docking 또는 recruitment)되는 경우에(도 27), 상기 FKBP는 돌연변이에 의한 나노고단위복합체의 형성(매개(조절)물질의 기능) 및 FRB 단백질과의 상호작용(베이트 기능)을 동시에 발휘하고 있다. 또한, 상기 FRB-FKBP 상호작용을 매개(조절)하는 Rapamycin 역시 또다른 매개(조절)물질에 해당한다[실시예 6의 (1)].
또 다른 예로서, 페리틴에 FKBP 단백질을 붙이고 AP1510(FKBP 상호작용 매개(조절)화합물)을 처리하여 FKBP-FKBP간 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형 성을 유도한 후, Rapamycin을 통해 FKBP의 파트너 탐색물질인 FRB 단백질이 상호작용함에 따라 나노고단위복합체 표면에 결합 및 도킹(docking 또는 recruitment)되는 경우에도, 상기 FKBP는, AP1510에 의한 나노고단위복합체의 형성(매개(조절)물질 기능) 및 FRB 단백질과의 상호작용(베이트 기능)을 동시에 발휘하고 있다. 마찬가지로, 상기 FRB-FKBP 상호작용을 매개(조절)하는 Rapamycin 역시 또다른 매개(조절)물질에 해당한다[실시예 7].
한편, 본 발명의 방법들에서 상기 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 알아보기 위하여 표지물질을 사용하는 것이 바람직하다. 특히 상기 베이트 물질, 프레이 물질 및/또는 매개(조절)물질에 표지물질을 결합시켜 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 특정 물질들 사이의 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체상에서, 검출 대상 물질인 프레이가 베이트와 결합하여 같은 위치에 존재하고 있는지 여부를 표지물질로서 직접 측정함으로써 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 역동적으로 탐색할 수 있다.
본 발명의 표지물질로는 방사성 표지, 형광성 물질 또는 발광성 물질을 사용할 수 있다. 방사성 표지로서는, 예를 들어 32P, 35S, 3H 및 14C 등을 포함하여 일반적으로 사용 가능한 표지를 모두 사용할 수 있다. 그리고, 그 자체로서 형광을 나타내거나 물질들간의 상호작용에 의해 형광성을 나타내는 형광물질(fluorescent material)로서는, 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광 염료들; ECFP, TagCFP, mTFP1, GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질; 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif); 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다. 발광성 물질로서는, 그 자체로서 발광을 내거나 물질들간의 상호작용에 의해 발광을 나타내는 발광체(luminescent material) 예를 들어, 루시퍼레이즈(luciferase) 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 표지의 위치 또는 움직임 변화는 현미경을 포함한 광학적 방법, 스캐너(scanner), 방사성 표지 감지 수단, FP 리더(fluorescence polarization reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, 형광검출기, 발광검출기 등 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 제1 태양의 방법에서는 베이트 및 프레이 물질이 상호작용하여 나노고단위복합체를 형성함을 이용하여 물질간 상호작용을 탐색한다. 이 때, 나노고단위복합체 형성 물질과 결합되어 있는 베이트 및 프레이 물질 사이의 직접 결합을 통해 나노고단위복합체가 형성될 수도 있지만, 베이트 물질 및 프레이 물질과 각각 상호작용하는 또 다른 탐색물질을 매개(조절)로 하여 간접적으로 결합할 수도 있다(도 1). 즉, 제1방법에서는 베이트 및 프레이 물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체의 형성여부가 결정된다.
본 발명의 다른 태양인 상기 제2방법 및 제3방법에서는 나노고단위복합체 형 성 가능물질에 의한 나노고단위복합체 형성은 매개(조절)물질(나노고단위복합체 형성 유도 물질)에 의하여 이루어진다. 이 때, 상기 나노고단위복합체 형성 물질은 매개(조절)물질 및 베이트 물질과 결합하여 제공되거나(제2방법), 또는 매개(조절)물질하고만 결합하여 제공될 수 있다(제3방법). 후자의 경우, 베이트 물질은 나노고단위복합체 형성 물질과 결합시키지 않고 별도로 제공되나, 바람직하게는 형성된 나노고단위복합체상에 옮겨 갈 수 있게하는 매개(조절)물질과 융합하여 제공되는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 편의상 나노고단위복합체 형성에 직접 관여하는 매개(조절)물질을 제1매개(조절)물질로, 베이트 물질을 옮길 수 있게 하는 매개(조절)물질을 제2매개(조절)물질로 표시하였다.
본 발명의 상기 제2방법 및 제3방법에 의하면, 매개(조절)물질에 의해 나노고단위복합체가 형성되며, 베이트 물질은 직접적으로 나노고단위복합체 형성 물질과 결합되어 있거나 혹은 매개(조절)물질에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상의 일부 부위에 존재하게 된다.
따라서, 최종적으로, 형성된 나노고단위복합체 상에 존재하고 있는 베이트 물질이, 파트너 물질인 프레이 물질이 상호작용하면 양 물질은 같이 위치하게 되고, 상호작용하지 않으면 다르게 위치하게 된다. 바꾸어 말해, 본 발명의 제2 및 제3태양에서 프레이 물질은 나노고단위복합체의 형성에 직접적으로 관여하지 않고, 이미 형성된 나노고단위복합체상에 도킹(docking 또는 recruitment)함에 따른 위치판별이 물질상호작용 탐색의 기준이 된다고 할 수 있다. 상기 프레이 물질의 도킹(docking 또는 recruitment)은 형성된 나노고단위복합체상에 존재하는 베이트 물 질과의 상호작용에 의한 것이다.
프레이가 베이트와 결합하여 "나노고단위 복합체상 같은 위치에 존재함"이라는 의미는 나노고단위복합체 형성 가능 물질간의 결합, 즉 나노고단위복합체 형성을 위해 베이트와 프레이가 결합되어 양 물질이 혼합되어 있는 상태를 의미하는 것이 아니라, 나노고단위복합체를 형성하는 결합부위가 아닌 별도의 다른 부위에 위치하고 있는 베이트와 제2구성물로서 도입한 탐색물질 프레이가 상호작용하여 결합하여 동일한 나노고단위복합체에 함께 존재하고 있는 상태를 말한다.
따라서, 제2 및 제3방법에서는 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체의 형성이 일단 유도되고, 베이트 및 프레이간 상호작용은 상기 프레이가 나노고단위복합체의 베이트 위치와 동일하게 위치할지를 결정한다. 그러므로 베이트와의 상호작용이 없는 경우는 나노고단위복합체가 형성되는 동안 프레이는 균질상태 등 다른 위치로 유지하게 된다.
상기 본 발명의 제1방법, 제2방법 및 제3방법에서는 베이트 및 프레이물질의 결합반응 또는 매개(조절)물질의 작용이 완료된 후의 정적인 결과를 관찰할 수 있을 뿐만 아니라, 반응 완결 전에도 매개(조절)물질에 의한 나노고단위복합체 형성 과정을 동적으로 관찰할 수 있다. 특히, 제2 및 제3방법의 경우 동일위치(co-localization)에 대한 동적인 분석이 가능하다. 이러한 동적인 분석방법은 신호 대 결합비 (signal to ratio)를 높일 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 방법은 in vitro 또는 in vivo 어느 계에서도 수행가능하다. 그 중에서 본 발명을 in vivo에서 수행하는 경우, 진핵세포, 원핵세포, 포유동물의 생체내, 조직내 및 세포내, 식물의 생체내, 조직내 및 세포내에서 수행할 수 있다. 특히, 본 발명은 제프라 피쉬(Zebra fish), 선충(C. elegans), 효모(Yeast), 초파리(Fly) 또는 개구리(Frog)의 세포내, 조직내 또는 생체내에서도 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트 물질, 프레이 물질, 매개물질(나노고단위복합체 형성 유도 물질) 및 표지물질들은 일반적으로 널리 알려진 방법에 의해 용이하게 상기 세포내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 세포전달성 펩타이드 (transducible 또는 fusogenic peptide), 지질 유전자 전달체 (lipid 또는 liposome) 또는 이들의 결합체를 이용하거나, Opti-MEM 배지에서 세포와 배양하거나, 일렉트로포레이션(electroporation) 또는 마그네토펙션(magnetofection) 등을 이용할 수 있다. 그 중에서도 특히, 본 발명의 방법을 세포 내에서 수행하는 경우, 배양플레이트(culture plate/dish) 또는 마이크로어레이(microarray)된 살아있는 세포 내에서 수행할 수 있다.
상기 방법을 이용하여 특정 베이트 물질과 상호작용을 하는 특정 프레이 물질을 탐색하기 위하여 프레이 물질들은 라이브러리(library)로 제공될 수 있다.
즉, 본 발명은 상기 제1방법을 이용하여 (i) 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트 물질및 프레이 물질의 라이브러리를 동일한 장 또는 계에 제공하는 단계; (ii) 상기 베이트 물질 및 프레이 물질 라이브러리의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; (iii) 상기 나노고단위복합체의 형성여부를 측정하여 베 이트와 프레이 물질간 상호작용을 판별하는 단계; 및 (iv) 상기 베이트와 상호작용하여 나노고단위복합체를 형성하는 프레이 물질을 표적물질로, 선택, 분리 및 동정하는 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질 프레이의 검출방법을 제공한다.
또한, 상기 제2방법을 이용하여, (i) 매개(조절)물질 및 베이트 물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; (ii) 상기 매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질 라이브러리를 제공하는 단계; (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 존재하는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계; 및 (v) 상기 베이트와 상호작용하여 나노고단위복합체상 같이 위치하는 프레이 물질을 표적물질로, 선택, 분리 및 동정하는 단계를 제공한다.
또한, 상기 제3방법을 이용하여, (i) 제1매개(조절)물질을 결합시킨 나노고단위복합체 형성 물질 및 제2매개(조절)물질을 결합시킨 베이트 물질을 동일한 장 또는 계에 제공하는 단계; (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개물질간의 작용에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상에 베이트물질을 결합시키는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질 라이브러리를 제공하는 단계; (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 결합되어 있는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하 여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계; 및 (v) 상기 베이트와 상호작용하여 나노고단위복합체상 같이 위치하는 프레이 물질을 표적물질로, 선택, 분리 및 동정하는 단계를 제공한다.
각각에 대한 구체적인 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 방법들을 이용하여 베이트와 상호작용하여 나노고단위복합체상 같이 위치하는 프레이 물질을 표적물질로, 선택, 분리 및 동정할 수 있다.
본 발명은 또한, 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 탐색하고, 이들의 상호작용에 영향을 끼치는 제3의 물질(표적물질)을 탐색, 검출하는 방법을 제공한다.
구체적으로 제1방법을 응용하여, (i) 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트 물질및 프레이 물질을 동일한 장 또는 계에 제공하는 단계; (ii) 표적 후보물질의 존재하에서, 베이트 물질과 프레이 물질의 상호작용에 따른 나노고단위복합체를 형성하는 단계; 및 (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 베이트와 프레이 물질간 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성정도에 비해, 표적 후보물질 존재하에 베이트와 프레이 물질간 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성이 저해(억제) 또는 촉진(유도)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 검출방법을 제공한다. 여기서도 (ii)단계에서 베이트 물질 및 프레이 물질 간의 상호작용을 매개 또는 조절하는 물질을 추가할 수 있다.
또한, 제2방법을 응용하여, (i) 매개(조절)물질 및 베이트 물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; (ii) 표적 후보물질의 존재하에서, 상기 매개(조절)물질의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및 (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도에 비해, 표적후보물질 존재하에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도가 저해(억제) 또는 촉진(유도)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 또 다른 검출 방법을 제공한다.
또한 제3방법을 응용하여, (i) 제1매개(조절)물질을 결합시킨 나노고단위복합체 형성 물질 및 제2매개(조절)물질을 결합시킨 베이트 물질을 동일한 장 또는 계에 제공하는 단계; (ii) 표적 후보물질의 존재하에서, 상기 제1매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개물질간의 작용에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상에 베이트물질을 결합시키는 단계; (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및 (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도에 비해, 표적후보물질 존재하에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도가 저해(억제) 또는 촉진(유도)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질 로 선정하는 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 또 다른 검출 방법을 제공한다.
각각에 대한 구체적인 설명은 앞서 설명한 바와 같다.
상기 방법들을 이용하여 베이트 물질 및 프레이 물질간의 상호작용에 영향을 미치는, 즉, 상기 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적 후보물질을 검출할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: 화합물(Rapamycin)과 단백질(FKBP 및 FRB)의 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성
페리틴 유전자인 FTH1(GenBank Acc. No. BC013724)와 FTL(GenBank Acc. No. BC016346)은 미국의 Open BioSystems사에서 구입하였다.
본 발명에서는 페리틴 단백질의 말단에 다양한 단백질을 부착해서 분석에 사 용했다. 페리틴 단백질(FT로 표기)의 아미노기 말단에 다양한 탐색 단백질(예, FKBP와 FRB)과 형광 단백질(예, mRFP, EGFP, ECFP, YFP)을 부착한 여러 가지 융합 단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다 .
미리 배양된 헬라 세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 재조합 유전자 FKBP-mRFP-FT, FRB-mRFP-FT를 일렉트로포레이션(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 각각 또는 같이 도입시킨 후, 세포를 16-well chamber slide(Nunc)에 깔고 37 로 고정된 5 % CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다. 이미징을 위해 세포배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 250nM 농도(Stock 농도는 1mM, DMSO에 녹아있음)의 Rapamycin(Calbiochem)을 세포에 처리하고, 세포내의 페리틴 융합 단백질의 분포를 형광 현미경(Olympus, IX51)으로 확인하였다(도 5).
도 4에서 FKBP와 FRB의 탐색물질과 각각 상호작용하는 매개(조절)물질인 Rapamycin에 의해 서로 간접적으로 상호작용함에 따라 나노고단위복합체가 형성하는 본 실시예의 개략을 나타보여주고 있고, 그 한가지 결과는 도 5에 나타내었다.
음성대조구는 재조합 유전자 FKBP-mRFP-FT과 FRB-mRFP-FT중 하나만을 발현시킨 세포로서, 이 세포에서는 Rapamycin을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우 모두 세포내에 나노고단위복합체가 형성되지 않았다. 반면 FKBP-mRFP-FT와 FRB-mRFP-FT의 단백질을 모두 한 세포에서 발현시킨 경우, Rapamycin을 처리하였을 때에만 나 노고단위복합체가 세포내에서 형성되는 것을 확인하였다.
즉, 페리틴 단백질과 결합된 탐색물질 FKBP와 FRB가, 이들과 상호작용하는 양친성 매개(조절)물질 Rapamycin에 의하여 가교화되어 세포내에서 나노고단위복합체를 형성하였다.
(1) 시간에 따른 나노고단위복합체 형성
FKBP, Rapamycin, FRB의 상호작용을 실시간으로 관찰하여 페리틴의 나노고단위복합체가 어떠한 양상으로 형성되는지 관찰하였다.
배양된 헬라세포에 재조합 유전자 FKBP-EGFP-FT와 FRB-mRFP-FT를 함께 도입시킨 후, 페리틴 융합 단백질을 발현시켰다. 그 다음 250nM 농도의 Rapamycin을 세포에 처리하고, 세포내의 페리틴 융합 단백질의 분포를 2분 간격으로 10분 동안 형광 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, FKBP-EGFP-FT와 FRB-mRFP-FT의 단백질을 함께 세포에서 발현시킨 경우, Rapamycin을 처리함에 따라 빠르게 상호작용해서 10분 내에 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되었다.
(2) 형광단백질과 무관한 나노고단위복합체 형성
페리틴의 나노고단위복합체가 Rapamycin의 처리에 의존하여 생성된다는 것을 더욱 뒷받침하기 위해 배양된 헬라세포에 도 6의 쌍으로부터 형광단백질을 맞바꾸어 제조한 재조합 유전자 FKBP-mRFP-FT, FRB-EGFP-FT를 함께 도입시킨 후, 페리틴 융합 단백질을 발현시켰다. 그 다음 250nM 농도의 Rapamycin을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 10분 동안 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, FKBP-mRFP-FT와 FRB-EGFP-FT의 단백질을 함께 세포에서 발현시킨 경우, Rapamycin을 처리하였을 때에만 빠르게 상호작용해서 나노고단위복합체가 세포내에서 형성됨을 확인할 수 있었다.
(3) 특이적 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성
페리틴 나노고단위복합체가 FKBP, Rapamycin, FRB간의 특이적인 상호작용에 의해 형성된다는 것을 보여주기 위해 FKBP-EGFP-FT와 FRB를 제거하여 제조한 mRFP-FT의 조합으로 페리틴 융합 단백질을 헬라세포내에 발현시켰다.
250nM의 Rapamycin을 처리해 준 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 도 6, 7과는 달리 FKBP 하나만 페리틴 융합 단백질로서 발현됨에 따라 Rapamycin에 의한 FKBP와 FRB의 특이적 상호작용이 일어나지 않아 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되지 않았다.
또한, 상기와 같은 방법으로 FKBP를 제거하여 제조한 EGFP-FT와 FRB-mRFP-FT의 조합으로 페리틴 융합 단백질을 헬라세포내에 발현시키고, Rapamycin을 처리해 준 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, FRB 중 하나만 페리틴 융합 단백질로서 발현됨에 따라 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되지 않았다.
이러한 결과들은 Rapamycin에 의한 FKBP, FRB의 특이적 상호작용에 의해 페 리틴 고단위복합체를 형성한다는 것을 보여준다.
(4) 줄기세포 내에서의 나노고단위복합체 형성
사람의 Bone Marrow 유래의 줄기세포(human mesenchymal stem cell)에 재조합 유전자 FKBP-mRFP-FT, FRB-EGFP-FT를 함께 도입시킨 후, 페리틴 융합 단백질을 발현시켰다. 그 다음 250nM 농도의 Rapamycin(Calbiochem)을 세포에 처리하고, 세포내의 페리틴 융합 단백질의 분포를 형광 현미경으로 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, FKBP-mRFP-FT와 FRB-EGFP-FT의 단백질을 함께 세포에서 발현시킨 경우, FKBP와 FRB가 서로 상호작용해서 나노고단위복합체가 줄기세포내에서 형성된다.
실험예 1-1: 나노고단위복합체 형성에 있어서 매개(조절)물질 의존성 여부
도 11에서 Rapamycin를 매개로 한 나노고단위복합체 형성의 특이성을 검증하기 위해, FKBP 단백질에만 특이적으로 결합하고 FRB 단백질에는 결합하지 않는 FK506을 Rapamycin의 경쟁화합물로 하여 세포에 먼저 처리해서 비교했다.
25μM의 FK506을 10분간 전처리 후, 250nM의 Rapamycin을 첨가해 주었을 때, Rapamycin과 FKBP의 결합을 FK506이 방해하기 때문에, 도 6, 7 결과와는 달리, Rapamycin에 의한 FKBP와 FRB 단백질의 상호작용에 의해 형성되는 나노고단위복합체를 관찰할 수 없었다.
실험예 1-2: 나노고단위복합체 형성에 있어서 형광물질 의존성 여부
FKBP-mRFP-FT와 FRB-mRFT-FT(도 5) 또는 FKBP-mRFP-FT와 FRB-EGFP-FT(도 6, 7)의 조합 이외에 FKBP-EGFP-FT와 FRB-ECFP-FT의 조합 및 FKBP-YFP-FT와 FRB-mRFP-FT의 조합에서도 250nM의 Rapamycin을 처리하였을 때 10분 내에 효율적으로 FKBP와 FRB 단백질이 특이하게 상호작용하여 나노고단위복합체가 형성되었다.
즉, Rapamycin에 의한 FKBP와 FRB 단백질의 상호작용에 의해 형성되는 나노고단위복합체는 페리틴 단백질에 여러 가지 다른 형광 단백질을 부착 시에도 영향을 받지 않음을 확인하였다(도 12 및 도 13).
실험예 1-3: 나노고단위복합체 형성에 있어서 장소 의존성 여부
페리틴은 기본적으로 세포질 내에 위치하는 단백질이므로 Rapamycin에 의한 FKBP와 FRB 단백질의 상호작용을 세포질 내에서 주로 관찰하였다.
세포 내의 여러 기관에서의 분자 간 상호작용을 페리틴 나노고단위복합체 형성을 통해 볼 수 있는지 알아보는 것의 일환으로 NLS(Nuclear Localization Signal)를 페리틴 단백질에 부착시킴으로써 페리틴 융합 단백질을 핵 내로 위치 변화시킬 수 있었다. 이 상태에서 250 nM의 Rapamycin을 처리함에 따라, FKBP와 FRB 단백질의 상호작용에 의해 세포질 내에 비해 효율은 낮지만, 핵 내에서 나노고단위복합체를 형성시킬 수 있음을 확인했다(도 14).
실시예 2: 단백질들간의 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성
도 15에서 나타낸 바와 같은, IkBα와 RelA의 탐색물질의 상호작용에 대하여 다양한 형식(A, B, C)으로 나노고단위복합체가 형성되는지를 확인하고자 하였다.
(1) 도 15의 A에 의한 경우
IkBα와 RelA를 직접 페리틴단백질에 융합시켰을 때, 이들이 발현됨에 따라 자발적으로 세포 내에 나노고단위복합체가 형성될 수 있는지 알아보는 실험을 하였다.
실시예 1에서 배양된 헬라세포에 재조합 유전자 IkBα-YFP-FT(pcDNA 3.1), RelA-mRFP-FT(pcDNA 3.1)를 함께 도입시킨 후, 페리틴 융합 단백질을 발현시켰다. 그 결과, 도 16에서 나타난 바와 같이, IkBα와 RelA 단백질이 서로 상호작용함에 따라 나노고단위복합체가 세포내에서 형성됨을 확인하였다.
(2) 도 15의 B에 의한 경우
IkBα와 FRB 단백질을 각각 페리틴에 직접 융합하고 RelA 단백질은 FKBP와 융합하여 250nM의Rapamycin을 처리하였다. 즉, 매개(조절)물질(FRB-FKBP)에 대하여, 상기 매개(조절)물질의 작용을 조절하는 또다른 매개(조절)물질로서 Rapamycin을 사용하였다.
헬라세포에 재조합 유전자 FRB-ECFP-FT, FKBP-mRFP-RelA, IkBα-YFP-FT를 함께 도입시킨 후, 페리틴 융합 단백질을 발현시켰다. 그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, Rapamycin을 처리함에 따라 매개(조절)물질인 FRB와 FKBP 단백질이 서로 상 호작용하고, 동시에 프레이와 베이트인 IkBα와 RelA 단백질이 서로 상호작용함에 따라 거대한 나노고단위복합체가 세포내에서 형성됨을 확인하였다.
(3) 도 15의 C에 의한 경우
IkBα와 RelA에 FKBP단백질을 융합하고, 페리틴에는 FRB만을 융합하여 Rapamycin을 통해 IkBα와 RelA에 있는 FKBP단백질이 페리틴의 FRB에 연결되어 나노고단위복합체를 형성할 수 있는지 관찰하였다.
헬라세포에 재조합 유전자 FRB-ECFP-FT, FKBP-mRFP-RelA, IkBα-YFP-FKBP를 함께 도입시킨 후, 각각의 융합 단백질을 발현시킨 결과, 도 18에서 나타난 바와 같이, Rapamycin을 처리함에 따라 매개(조절)물질 FRB와 FKBP 단백질이 서로 상호작용하고 동시에 IkBα와 RelA 단백질이 서로 상호작용함에 따라 거대한 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되었다.
즉, 상기 실험(2)와 달리 페리틴 단백질에 매개(조절)물질 FRB 만을 부착시킴으로서 보다 거대한 나노고단위복합체을 탐색물질의 다중 상호작용(multiple interactions)에 의해 형성할 수 있음을 확인했다.
이러한 결과들로부터, 나노고단위복합체는 마치 레고(lego)처럼 탐색물질이 상호작용함에 따라 다양한 형태(flexibility)로 세포내에 형성됨을 알 수 있었고, 이에 따라, 다양한 형태(flexibility)로 탐색물질의 상호작용을 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
(4) 형광단백질의 상이한 조합
상기 실험(3)과 같은 방법으로 수행하되, IkBα, RelA 및 페리틴 단백질에 도 19에 나타나 있는 것과 같은, 상기 (3)과는 다른 조합의 형광단백질을 융합하여 사용하였다.
헬라세포에 재조합 유전자 FRB-mRFP-FT, FKBP-YFP-RelA, IkBα-ECFP-FKBP를 함께 도입시킨 후, 페리틴 융합 단백질을 발현시켰다. Rapamycin을 처리함에 따라 FRB와 FKBP 단백질이 서로 상호작용하고 동시에 IkBα와 RelA 단백질이 서로 상호작용함에 따라 거대한 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되었다.
그 결과, 도 19에서처럼, IkBα와 RelA 단백질의 상호작용에 의해 형성 유도되는 나노고단위복합체는 각각의 단백질에 여러 가지 조합의 형광 단백질을 부착 시에도 영향을 받지 않는 것을 확인하였다.
실시예 3: 생리적인 신호에 따른 단백질들간의 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성
외부 신호에 따라 조절되는 단백질의 상호작용을 분석할 수 있는지 알아보고자 하였다. 프레이-베이트 간의 상호작용을 매개(조절)하는 물질로서 외부 신호를 사용하였다.
헬라세포에 재조합 유전자 FRB-ECFP-FT, FKBP-mRFP-bTrCP, IkBα-YFP-FKBP를 함께 도입시킨 후, 각각의 융합 단백질을 발현시켰다. 실시예 2에서 사용한 IkBα 는, RelA 단백질에 대하여는 세포의 외부 자극과 상관없이 항상 상호작용을 하지만, bTrCP 단백질에 대하여는 세포에 TNFa 생리적인 외부 신호가 전달되었을 때에만 상호작용을 하므로, TNFa를 처리하였다.
그 결과, 도 20에서 나타난 바와 같이, IkBα와 bTrCP 단백질이 서로 상호작용하고, 매개(조절)물질의 작용을 조절하는 또 다른 매개(조절)물질 Rapamycin을 처리함에 따라 매개(조절)물질인 FRB와 FKBP 단백질이 서로 상호작용하여, 페리틴의 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되었다.
추가로, 또 다른 예로서 프레이-베이트로 IKKb-IkBα 단백질을 사용하고, 이들의 매개(조절)물질로서 TNFa를 사용하였다. IkBα와 IKKb 단백질은 세포에 TNFa 생리적인 외부 신호가 전달되었을 때에만 상호작용을 한다. IKKb 등의 인산화효소와 그 기질인 IkBα의 상호결합은 세포내에서 가장 약한 상호결합 중의 하나로 알려져 있다.
헬라세포에 재조합 유전자 FRB-ECFP-FT, IKKb-mRFP-FKBP, IkBα-YFP-FKBP를 함께 도입시킨 후, 각각의 융합 단백질을 동시에 발현시킨 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, TNFa를 처리함에 따라 IkBα와 IKKb 단백질이 서로 상호작용함에 따라 거대한 나노고단위복합체가 세포내에서 형성되었다.
따라서 상기 결과들로부터, 나노고단위복합체를 통해 생리적인 신호에 의해 세포내에서 일어나는 매우 민감한 탐색물질의 상호작용을 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4: RNA 와 단백질의 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성
도 22에 나타나 있는 바와 같이, RNA 및 조절 단백질의 상호작용에 따라 나노고단위복합체를 형성하도록 실험을 설계하였다.
사용한 단백질인 Ago2는 miRNA와 상호작용하는 조절 단백질로서 여러 개의 도메인으로 이루어져 있고 그 중 PAZ 도메인이 miRNA와의 상호작용에 중요하다. 이 도메인을 가진 페리틴 융합 단백질은 miRNA와 상호작용을 할 수 있고, miRNA는 자신의 표적인 mRNA와 특이적으로 결합한다. 이 표적 mRNA의 말단에 MS2 단백질이 결합할 수 있는 염기서열(MS2 binding sequences)을 부착하면, MS2 단백질을 포함한 페리틴 융합 단백질과 상호작용하여, 즉, miRNA가 표적 mRNA와 결합함에 따라 거대한 나노고단위복합체가 형성되도록 실험을 설계하였다.
우선, miRNA와 상호작용하는 조절 단백질 Ago2의 PAZ 도메인과 PiWi 도메인을 기준으로 Full-length, PAZ-PiWi, PiWi, 그리고 PAZ 도메인의 결실 돌연변이 (deletion mutant)를 제작하였다. 그 후, 표적 mRNA인 lin28-MS2bs의 말단에 MS2 단백질이 결합할 수 있는 염기서열(MS2 binding sequences;5'-AAA CAT GAG GAT CAC CCA TGT-3':서열번호 1로 표시함)을 부착하여 MS2CP-mRFP-FT를 제작하였다.
PAZ-CFP-FT, lin28-MS2bs(mRNA)와 MS2CP-mRFP-FT를 전기천공법(electroporation)에 의해 헬라세포내에 도입한 후, 16 시간 동안 발현시킨 후, let7b miRNA의 발현벡터를 세포에 추가적으로 도입하여 20시간 후에 관찰하였다.
그 결과, 도 23에서 나타난 바와 같이, PAZ 도메인을 부착한 PAZ-CFP-FT 페리틴 융합 단백질과 miRNA이 결합하고, let-7b(miRNA)와 lin28-MS2bs(mRNA)이 결합하고, lin28-MS2bs(mRNA)와 MS2CP-mRFP-FT(페리틴 융합 단백질)이 결합함에 따라 거대한 나노고단위복합체가 형성되었다.
실시예 5: 나노고단위복합체 형성의 고속 스크리닝
다양한 생리활성물질들의 상호작용을 탐색 및 스크리닝하기 위한 시스템으로서 HTS(High Throughput Screening)를 이용하였다(도 24).
상기 시스템을 확립하기 위해, 96-well plate(Greiner bio-one)에 헬라세포를 배양한 후, FKBP-mRFP-FT와 FRB-EGFP-FT 유전자를 동시에 도입하여 발현시켰다. 24시간 후 96-well 중 12개의 well만 선택하여 250nM의 Rapamycin을 30분 동안 처리해 주고 Rapamycin에 의한 FRB와 FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성을 In-Cell Analyzer 1000(GE)을 이용하여 고속으로 이미징 하였다.
상기 고속 이미징한 96-well plate에서 Rapamycin에 의한 FRB와 FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성을 In-Cell Analyzer 1000(GE)을 사용해서 확인했다(도 25). 250 nM의 Rapamycin을 30분간 처리한 well에서는 세포질 내의 페리틴 단백질에 융합되어 있는 FKBP와 FRB 단백질이 상호작용하여 나노고단위복합체를 형성한 반면, Rapamycin을 처리하지 않은 well에서는 30분 후에도 페리틴 단백질의 나노고단위복합체가 형성되지 않고 세포질 내에 균일하게 퍼져 있는 것을 관찰할 수 있었다.
상기 세포를 3.5%의 paraformaldehyde로 고정하고 Hoechst로 핵을 염색한 후, 96-well plate 상에서 획득한 나노고단위복합체의 형성 여부를 정량적으로 체계적으로 분석했다. In-Cell Developer(GE)의 앨고리듬을 이용해서 Rapamycin에 의한 FRB와 FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성을 거대분자(granule)로 인식하여 이미징 결과물을 효과적으로 정량적으로 분석 및 스크리닝을 성공했다. 96-well 중에서 각 well에서 나노고단위복합체가 형성되는 세포들의 퍼센트(%) 또는 각 세포 당 나노고단위복합체가 형성되는 숫자를 이용해서 스크리닝 및 정량화를 효과적으로 할 수 있었다(도 26).
실시예 6: 특정 돌연변이(mutation)를 매개(조절)물질로 이용하여 형성 유도된 나노고단위복합체상에서 탐색물질의 상호작용 확인
(1) 돌연변이(mutation)시킨 FKBP 및 FKB의 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성
우선, FKBP 단백질에 특정 돌연변이(mutation)를 통해 자기들끼리 서로 결합해서 자발적으로 나노고단위복합체의 형성을 유도하고자 하였다.
FKBP의 36번째 아미노산인 Phenylalanine을 Methionine으로 바꿔주어 monomeric FKBP를 dimeric 형태로 바꿔주었다. 이러한 변이 FKBP를 페리틴에 융합시켜주어 헬라 세포에 FKBP(F36M)-mRFP-FT와 FRB-EGFP 융합 단백질을 함께 발현시켜세포내에 자발적인 나노고단위복합체가 형성됨을 확인하였다(도 28). 그리고, 상 기 형성된 나노고단위복합체상에 250nM의 Rapamycin을 처리하였다.
그 결과, 나노고단위복합체의 표면에 있는 FKBP(F36M)과 FRB의 상호작용이 유도되어 10분 이내에 빠르게 FRB-EGFP가 나노고단위복합체의 표면에 결합 및 도킹(docking 또는 recruitment)되는 것을 확인할 수 있었다(도 28). 즉, 이 때의 FKBP는 돌연변이에 의한 매개(조절)물질 역할을 하면서, 동시에 FRB(프레이)와 상호작용하는 베이트 기능도 하는 것이다.
추가로, 이 경우에도 탐색물질(FKBP(F36M)-FRB) 간의 상호작용이 이를 매개(조절)하는 물질인 Rapamycin에 특이적인지 알아보기 위하여, FKBP(F36M)과 Rapamycin과의 상호작용에 대한 경쟁화합물로 25μM의 FK506를 처리하였다.
그 결과, 도 29에서 나타난 바와 같이, FRB-EGFP가 나노고단위복합체의 표면으로부터 떨어져 나왔다. 이를 통해 가역적으로 FKBP(F36M)와 FRB의 도킹과정을 조절할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 탐색물질 FKBP-FRB의 상호작용은 이 경우에도 매개(조절) 물질인 Rapamycin을 통해 특이하게 일어남을 확인하였다.
(2) DFX-DHFR의 상호작용 탐색
상기 (1)에서 처럼, 헬라세포에 재조합 유전자 FKBP(F36M)-mRFP-FT, DHFR-mRFT-FT를 함께 도입시킨 후, 페리틴 융합 단백질을 발현시켰다. 그 다음, 10μM의 MTX-BODIPY@FL을 세포에 처리하였다. 즉, FKBP(F36M) 돌연변이 단백질에 의해 나노고단위복합체의 형성을 유도시키고, 그 표면에 DHFR 단백질(베이트)을 드러나도록 페리틴 단백질에 부착시켜 세포내에 발현시켰다. 세포내의 페리틴 융합 단백질의 분포를 형광 현미경으로 분석하였다(도 30).
그 후, 상기 상태에서 BODIPY 염료가 붙어 있는 MTX 화합물(프레이)을 처리해 준 다음, 시간이 지남에 따라 세포내에서 MTX가 DHFR과 결합을 하는지의 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 30에 나타난 바와 같이, DHFR이 없는 나노고단위복합체의 경우에는 MTX가 나노고단위복합체에 도킹(docking 또는 recruitment)되지 않는 반면, DHFR이 표면에 있는 경우에 약 1 시간부터 MTX 화합물이 DHFR이 있는 나노고단위복합체에 결합 및 도킹되는 것이 관찰되었다. 도 31은 MTX 화합물 처리 150분 후에 세포내 나노고단위복합체의 표면에서 MTX 화합물이 DHFR이 있는 나노고단위복합체에 결합 및 도킹(docking 또는 recruitment)되었음을 나타낸 사진이다.
실험예 6-1:FKBP(F36M) 돌연변이 단백질의 연속적 부착 개수에 따라 형성유도되는 나노고단위 복합체
FKBP(F36M) 돌연변이-페리틴 융합단백질에 의한 나노고단위복합체의 형성 유도를 최적화하기 위해서, FKBP(F36M) 돌연변이 단백질을 연속적으로 개수를 6개까지 증가시켜 부착하면서 그 결과를 관찰하였다.
그 결과, 도 32에 나타난 바와 같이, 2개부터 세포내 발현 후 12시간부터 효과적으로 나노고단위복합체가 형성되었다. 그러나 4개부터는 융합 단백질의 세포내 발현율이 현저하게 낮아졌다.
실험예 6-2:FKBP(F36M) 돌연변이 단백질의 개수 및 시간에 따라 형성유도되는 나노고단위복합체
상기 실험예 6-1에서처럼, FKBP(F36M) 돌연변이 단백질을 1개부터 3개까지 숫자를 증가시켜 페리틴에 융합하여 자발적인 나노고단위복합체의 형성이 유도하고, 그 양상을 시간대별로 관찰하였다.
그 결과, 도 33에 나타난 바와 같이, FKBP(F36M) 돌연변이 단백질이 1개인 경우 헬라세포내 도입 후 36시간이 지난 후에야 생기기 시작한 반면, 2개와 3개인 경우 세포내 도입 후 12시간 만에 효과적으로 형성함을 확인하였다.
상기 실험예들의 결과로부터 FKBP(F36M) 돌연변이-페리틴 융합단백질에 의한 나노고단위복합체의 형성 유도를 최적화하는 조건을 추측할 수 있었다.
실시예 7: 특정 화합물과 단백질의 상호작용을 매개(조절)물질로 이용하여 형성유도된 나노고단위복합체상에서 탐색물질의 상호작용 확인
본 실험에서는, 나노고단위복합체가 형성 유도물질로서 FKBP(wild type) 단백질을 사용하면서, 이 들간의 결합을 매개(조절)하는 물질로 특정 AP1510 화합물을 사용하였다. AP1510 화합물은 FK506의 유사화합물로서 FKBP단백질에 결합할 수 있는 moiety 두 개를 linker로 연결해 주어 두 분자의 FKBP 단백질과 동시에 상호작용할 수 있는 양친성 매개(조절)물질이다.
FKBP(wild type) 단백질 2개를 연속적으로 페리틴에 융합하여 헬라세포내에 발현시키고 FKBP 상호작용 매개(조절)물질인 1μM의 AP1510 화합물을 처리하여, 1시간 안에 나노고단위복합체가 형성되는 것을 In-Cell Analyzer 1000(GE)을 통해 관찰하였다(도35). 이렇게 나노고단위복합체의 형성을 3시간 동안 유도한 후, 250nM의 Rapamycin을 1시간 동안 처리하였다
그 결과, FKBP의 파트너 탐색물질인 FRB 단백질(프레이)이 상호작용해서 나노고단위복합체 표면에 결합 및 도킹(docking 또는 recruitment)됨을 확인하였다(도 35 및 37).
즉, 이 때의 FKBP는 AP1510 화합물과의 반응에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 매개(조절)물질 역할을 하면서, 동시에 FRB(프레이)와 상호작용하는 베이트 기능도 하는 것이다.
실험예 7-1:부착 형광단백질의 종류에 영향을 받지않는 나노고단위고단위복합체
상기 실시예 7에서 FKBP 단백질에 mRFP를 부착한 경우에 대하여, 상기 FKBP 단백질에 ECFP, TagCFP, mTFP1 등의 여러 가지 형광 단백질에 부착시켜서 AP1510 화합물에 의한 나노고단위복합체 형성 유도 효과를 비교하였다.
우선, FKBP를 페리틴 단백질에 융합하고, FKBP와 페리틴 사이에 상기 3가지 다른 형광 단백질을 부착시킨 후 헬라세포에 발현시켰다. 24시간 발현 후, 각각의 세포에 1μM의 AP1510 화합물을 처리하였다.
그 결과, 도 36에 나타난 바와 같이, ECFP에 비해 TagCFP와 mTFP1의 경우에, AP1510 화합물에 의해 나노고단위복합체의 형성이 보다 효과적으로 유도됨을 확인했다. 그리고, 도 37에 나타난 바와 같이, TagCFP의 경우 AP1510 화합물에 의해 형성이 유도된 나노고단위복합체에 Rapamycin의 처리에 따라 FKBP의 파트너 탐색물질인 FRB 단백질(프레이)이 상호작용해서 나노고단위복합체 표면에 결합 및 도킹(docking 또는 recruitment)됨을 확인하였다.
도 1은 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 본 발명의 제1방법의 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질이고; N은 나노고단위복합체 형성물질).
도 2의 위 그림은 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성이 유도될 때 탐색물질 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 본 발명의 제2방법의 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C는 동일한 또는 상이한 물질이고;. X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질이며; N은 나노고단위복합체 형성물질).
도 2의 아래 그림은 제1매개(조절)물질 A, B, C, D간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되면서, 제2매개(조절)물질 E, F간의 상호작용에 의해 탐색물질 X가 형성된 나노고단위복합체상에 결합할 때, X-Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 본 발명의 제3방법의 구성물에 대한 개략도이다(A와 B, C와 D는 동일한 또는 상이한 물질이고;. E와 F는 동일한 또는 상이한 물질이며, X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질이며; N은 나노고단위복합체 형성물질).
도 3은 페리틴 단백질의 자기조립에 의하여 형성되는 나노크기의 단위복합체의 구조이다.
도 4는 매개물질인 Rapamycin에 의해 FKBP와 FRB의 탐색물질이 서로 상호작용함에 따라 나노고단위복합체가 형성되는 개략도이다
도 5는 세포내에서 FKBP-FRB의 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성을 보 여주는 형광 현미경 사진이다
도 6은 FKBP-FRB의 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성을 시간대별로 보여주는 공초점현미경 사진이다.
도 7은 FKBP와 FRB에 결합된 형광단백질을 서로 맞교환한 경우에서의 형광 현미경 사진이다.
도 8 및 9는 두 단백질 FKBP와 FRB간의 특이적 상호작용을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 10는 사람의 줄기세포내에서의 FKBP-FRB 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 11는 FK506을 Rapamycin의 경쟁화합물로 처리한 경우의 형광 현미경 사진이다.
도 12 및 도 13는 여러 가지 다양한 형광 단백질의 부착에 따른 영향을 관찰한 형광 현미경 사진이다.
도 14는 NLS(Nuclear Localization Signal)를 부착시킨 페리틴 단백질을 이용하여, 핵내에서의 FKBP-FRB 상호작용에 따른 나노고단위복합체를 형성에 대한 형광 현미경 사진이다.
도 15는 IkBα와 RelA의 탐색물질이 서로 다양한 형식(A, B, C)으로 다중 상호작용(multiple interactions)함에 따라 나노고단위복합체가 형성되는 개략도이다.
도 16은 도 15 A의 경우에서처럼 IkBα와 RelA 단백질의 상호작용에 따른 나 노고단위복합체 형성을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 17은 도 15 B의 경우에서처럼 Rapamycin을 처리한 FRB와 FKBP의 상호작용및 IkBα-RelA의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 18는 도 15 C의 경우에서처럼 Rapamycin을 처리한 FRB와 FKBP의 상호작용및 IkBα-RelA의 상호작용에 따른, 또다른 예의 거대한 나노고단위복합체 형성을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 19는 다양한 형광 단백질의 영향을 살펴본 형광 현미경 사진이다.
도 20은 Rapamycin을 처리한 FRB-FKBP의 상호작용 및, 생리적인 신호인 TNFa를 처리한 IkBα-bTrCP의 상호작용에 따른 거대한 나노고단위복합체 형성을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 21은 TNFa에 의한 IKKb-IkBα 상호작용에 따른 거대한 나노고단위복합체 형성을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 22는 RNA와 조절 단백질이 서로 다중 상호작용함에 따라 페리틴 융합 단백질에 의한 거대한 나노고단위복합체가 형성되는 개략도이다.
도 23는 PAZ와 miRNA의 결합, let-7b (miRNA)와 lin28-MS2bs (mRNA)의 결합및 lin28-MS2bs(mRNA)와 MS2CP의 결합에 따른 거대한 나노고단위복합체 형성을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 24 및 25는 96-well plate에서 Rapamycin에 의한 FRB-FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성을 In-Cell Analyzer 1000(GE)을 이용하여 고속으로 이미징한 형광 현미경 사진이다.
도 26는 In-Cell Developer(GE)의 알고리즘을 이용하여 이미징 결과물을 정량적으로 분석한 그래프이다.
도 27는 FKBP 단백질의 특정 돌연변이(mutation; mt) 및 FRB-FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성 및 도킹에 관한 개략도이다.
도 28는 FKBP 단백질의 특정 돌연변이(mutation; mt) 및 FRB-FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성 및 도킹에 관한 형광 현미경 사진이다.
도 29는 도 28의 나노고단위복합체에 표면에서의 도킹에 대한, 경쟁화합물 FK506의 억제효과를 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 30 및 31는 FKBP(F36M) 돌연변이 및 DHFR 단백질-MTX 화합물간의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성 및 도킹에 관한 형광 현미경 사진이다.
도 32는 FKBP(F36M) 돌연변이 단백질의 숫자를 조절한 경우의 나노고단위복합체 형광 현미경 사진이다.
도 33는 FKBP(F36M) 돌연변이 단백질의 숫자를 조절한 경우의 시간대별 나노고단위복합체의 양상에 대한 형광 현미경 사진이다.
도 34는 FKBP 상호작용 매개(조절)화합물인 AP1510의 처리를 포함하는 FRB-FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 및 도킹에 관한 개략도이다.
도 35 및 도 37은 FKBP 상호작용 매개(조절)화합물인 AP1510의 처리를 포함하는 FRB-FKBP의 상호작용에 따른 나노고단위복합체의 형성 및 도킹에 관한 형광 현미경 사진이다.
도 36은 다양한 형광 단백질의 영향을 관찰한 형광 현미경 사진이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> The Methods for Detecting Molecular Interactions <130> P08-B141 <150> KR10-2007-0082973 <151> 2007-08-17 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MS2 binding sequence <400> 1 aaacatgagg atcacccatg t 21

Claims (39)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법:
    (i) 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질, 베이트(bait) 물질 및 프레이 (prey) 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 베이트 물질과 프레이 물질의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계; 및
    (iii) 상기 나노고단위복합체의 형성여부를 측정하여 상기 상호작용을 판별하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, (i)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용은 직접 또는 간접적으로 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (i)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용을 매개(조절)하는 물질을 하나 이상 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 베이트 물질 및 프레이 물질은 각각 표지 물질이 결합 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용을 매개(조절)하는 물질은 표지 물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법:
    (i) 매개(조절)물질 및 베이트 물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계;
    (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 존재하는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계.
  7. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질 및 제2매개(조절)물질을 결합시킨 베이트 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개물질간의 작용에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상에 베이트물질을 결합시키는 단계;
    (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 결합되어 있는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, (ii)단계에서 상기 매개(조절)물질의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, (iv)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용을 매개 또는 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 베이트 물질, 프레이 물질 및 매개(조절) 물질은 각각 표지 물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트 물질, 프레이 물질 및/또는 매개(조절)물질은 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생리활성물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드,아미노산, 당, 지질, 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체 형성물질은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 물질로서, 서로 간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성하는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 자기조립에 의해 복합체를 형성하는 물질은 페리 틴(ferritin), 페리틴 유사 단백질(ferritin-like protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질, 바이러스 구성단백질, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자점(Q dot) 및 자성나노입자(magnetic nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 표지물질은 방사성 표지, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 형광성 물질은 형광염료, 테트라시스테인 형광성 모티브(tetracystein motif), 형광 단백질 또는 형광 나노입자임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 표지물질은 방사성 표지, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 형광성 물질은 형광염료, 테트라시스테인 형광성 모 티브(tetracystein motif), 형광 단백질 또는 형광 나노입자임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 조직 또는 생체 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제프라 피쉬(Zebra fish), 선충(C. elegans), 효모(Yeast), 초파리(Fly), 개구리(Frog), 인간을 제외한 포유동물 및 식물로 구성된 군에서 선택된 세포, 조직 또는 생체인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 세포, 조직 또는 생체 내로의 도입은 세포전달성 펩타이드(transducible peptide 및 fusogenic peptide), 지질 유전자 전달체 또는 이들의 결합체의 이용, 일렉트로포레이션(electroporation) 이용, 및 마그네토펙션(magnetofection) 이용으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체의 형성 측정은 광학적 방법, 스캐너(scanner)이용, 방사성 표지 감지 수단의 이용, FP 리더(fluorescence polarization reader)의 이용, 스펙트로포토미터(spectrophotometer)의 이용, MRI(magnetic resonance imaging)의 이용, SQUID의 이용, MR relaxometer의 이용, 형광검출기의 이용 및 발광검출기의 이용으로 구성된 군에서 선택된 측정방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제6항 또는 제7항에 있어서, 베이트 물질과 프레이 물질의 상호작용에 의한 결합위치는 광학적 방법, 스캐너(scanner)이용, 방사성 표지 감지 수단의 이용, FP 리더(fluorescence polarization reader)의 이용, 스펙트로포토미터(spectrophotometer)의 이용, MRI(magnetic resonance imaging)의 이용, SQUID의 이용, MR relaxometer의 이용, 형광검출기의 이용 및 발광검출기의 이용으로 구성된 군에서 선택된 측정방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질의 검출방법:
    (i) 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질, 베이트(bait) 물질및 프레이 (prey) 물질의 라이브러리를 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 베이트 물질 및 프레이 물질 라이브러리의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체의 형성여부를 측정하여 베이트와 프레이 물질간 상호작용을 판별하는 단계; 및
    (iv) 상기 베이트와 상호작용하여 나노고단위복합체를 형성하는 프레이 물질을 표적물질로, 선택, 분리 및 동정하는 단계.
  25. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질의 검출방법:
    (i) 매개(조절)물질 및 베이트 물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하는 단계;
    (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질 라이브러리를 제공하는 단계;
    (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 존재하는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계; 및
    (v) 상기 베이트와 상호작용하여 나노고단위복합체상 같이 위치하는 프레이 물질을 표적물질로, 선택, 분리 및 동정하는 단계.
  26. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질의 검출방법:
    (i) 제1매개(조절)물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질 및 제2매개(조절)물질을 결합시킨 베이트 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개물질간의 작용에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상에 베이트물질을 결합시키는 단계;
    (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질 라이브러리를 제공하는 단계;
    (iv) 상기 형성된 나노고단위복합체상에 결합되어 있는 베이트 물질과의 상호작용에 의한 프레이 물질의 결합위치를 측정하여, 상기 베이트 물질과 동일위치에 존재(co-localization)하는지 여부를 확인하여 상기 상호작용을 판별하는 단계; 및
    (v) 상기 베이트와 상호작용하여 나노고단위복합체상 같이 위치하는 프레이 물질을 표적물질로, 선택, 분리 및 동정하는 단계.
  27. 제24항에 있어서, (i)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용은 직접 또는 간접적으로 일어나는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  28. 제24항에 있어서, (ii)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용을 매개(조절) 하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  29. 제25항 또는 제26항에 있어서, (ii)단계에서 상기 매개(조절)물질의 작용을 매개 또는 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서, (iv)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용을 매개(조절) 하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  31. 제24항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트 물질, 프레이 물질 및 매개(조절)물질은 각각 표지 물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  32. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질 검출 방법:
    (i) 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질, 베이트(bait) 물질및 프레이 (prey) 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재하에서, 베이트 물질과 프레이 물질의 상호작용에 따른 나노고단위복합체를 형성하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 베이트와 프레이 물질간 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성정도에 비해, 표적 후보물질 존재하에 베이트와 프레이 물질간 상호작용에 의한 나노고단위복합체 형성이 저해(억제) 또는 촉진(유도)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계.
  33. 다음의 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질 검출 방법:
    (i) 매개(조절)물질 및 베이트 물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재하에서, 상기 매개(조절)물질의 작용에 따른 나노고단위복합체를 형성하는 단계;
    (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도에 비해, 표적후보물질 존재하에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도가 저해(억제) 또는 촉진(유도)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계.
  34. 다음의 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이 물질간 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질 검출 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질을 결합시킨 나노고단위복합체(nano-assembly matrix) 형성 물질 및 제2매개(조절)물질을 결합시킨 베이트 물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재하에서, 상기 제1매개(조절)물질간의 작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개물질간의 작용에 의해 상기 형성된 나노고단위복합체상에 베이트물질을 결합시키는 단계;
    (iii) 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이 물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도에 비해, 표적후보물질 존재하에 베이트와 프레이 물질이 같이 위치하는 정도가 저해(억제) 또는 촉진(유도)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계.
  35. 제32항에 있어서, (i)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용은 직접 또는 간접적으로 일어나는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  36. 제32항에 있어서, (ii)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용을 매개(조절) 하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  37. 제33항 또는 제34항에 있어서, (ii)단계에서 상기 매개(조절)물질의 작용을 매개 또는 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  38. 제33항 또는 제34항에 있어서, (iv)단계에서 베이트 물질과 프레이 물질 간의 상호작용을 매개(조절) 하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
  39. 제32항, 제33항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트 물질, 프레이 물질 및 매개(조절)물질은 각각 표지 물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 검출방법.
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