CN101002098A - 用于探测分子相互作用的系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在体内和体外探测分子之间相互作用的方法,例如,生物活性的分子,以及相关筛选靶分子的方法。本发明中,提供第一和第二探测物质,其中第一探测物质后结合到在外部施加驱动力下迁移的定位子,另外第二探测物结合到标签。因此,可以通过可逆转的变化外部施加驱动力的力度探测第一探测物和第二探测物的复合物,并且有效的筛选所述靶分子。
Description
技术领域
本发明涉及一种实时动态地探测在体内和体外所关注的分子(例如,生物分子)之间相互作用的方法。进一步,本发明涉及一种探测在体内和体外所关注的分子(例如,生物分子)之间相互作用从而筛选靶分子的方法。
背景技术
通常,一种生物活性化学化合物是指一种与体结构结合的化学化合物,例如,蛋白质、核酸、糖化物或脂类,并在体内控制生物分子的功能和生物活动。这种生物活性化学化合物是从有机体中萃取的或者是由化学合成准备的。各种用来减少器官移植后的免疫排斥的抗生素,例如,“环孢霉素A”(Novartis AG)和“FK506”(Fujisawa,藤泽)从微生物、植物或水生物中离析出来。上述的自然或合成的生物活性化学化合物通过使用动物模型和人模型并通过对这些模型进行药理学活动试验和临床试验而作为一种新的药物被开发出来。但是,由于化合物结构的复杂性以及在纯化和分离处理中存在的技术限制,很多自然的生物活性化学化合物并不适合在工业大批量生产系统下生产。因此,引进了组合的化学品和合成生物活性化学化合物的新方法(Schreiber,S.,2000,Target-orientedand diversity-oriented organic synthesis in drug discovery(在药品发现中的靶定向和多样性定向的生物萃取方法),Science(科学)287,1964-1969).
蛋白质在体内通过结合到其他蛋白质而实现其生物功能。补体蛋白质之间相互作用,并且生物活性化学化合物特定地与3-维蛋白质结构的特定部分结合。两个蛋白质之间的相互作用强有力地暗示它们的功能是相关的。因为化合物控制蛋白质的活动,所以与蛋白质的特定部分(具体地与疾病相关)结合的生物活性化学化合物,有可能成为可以用以诊断、防御、治疗疾病或使疾病好转的药物。因此,人们对各种筛选和评估生物活性化学化合物或者靶蛋白质作为药物候选的方法进行了研究,其中的方法是探测对于其功能和特点已知的“诱饵”和与诱饵互相作用的“掠食者”之间互相作用的方法。到现在为止,约有500种与疾病相关的靶蛋白质已被识别,今后的两三年,人们还预期识别5000种或更多的靶蛋白质。
随着对人类基因组的分析,人们已经对生物分子在新陈代谢和细胞内的信号传输中扮演什么角色进行了各种研究。化学基因组学、生物化学和化学蛋白质组学等新的科研领域被引入,并且它们和设计分析、基因组功能、蛋白质组、自动化和生物信息学等方面的多种技术的发展有关。
探测体外蛋白质之间的互相作用的方法如下:常规的生物化方法有交联、放射性示踪配位体结合、X-光结晶学和亲和层析纯化,亲和杂交,免疫沉淀反应以及质谱测量(E.M.Phizicky和S.Fields,Microbiol.Rev.,59:94-123,1995;A.R.Mendelsohn和R.Brent,Science,284:1948-1950,1999)。上述常规方法需要巨大努力去对蛋白质生产和分离处理。另外,上述常规方法都是在体外实施,因此无法提供细胞中互相作用的信息。
为了解决上述常规方法的缺陷,开发了功能克隆,例如,酵母双杂交,酵母三杂交(Licitra,E.J.,和Liu,J.O.,1996,Athree-hybrid systemfor detecting small ligand-protein receptor interactions(一种用以探测小形配合体与受体蛋白的相互作用三杂交系统).Proc.Natl.Acad.Sci.USA93,12817-12821),药物印迹(Tanaka,H.,Ohima,N.,和Hidaka,H.1999,Isolation of cDNAs encoding cellular drug-binding proteins using anovel expression cloning procedure(分离互补DNA编码细胞状药物结合的蛋白质用以克隆程序的新表达方式):drug-western.Mol.Pharmacol.55,356-363),噬菌体展示克隆(phage display cloning)(Sche,P.P.,McKenzie,K.M.,White,J.D.,和Austin,D.J.1999,Display cloning:functional identification of natural product receptors using cDNA-phagedisplay.Chem(展示克隆:使用互补DNA-噬菌体展示进行自然产物受体的功能性识别).Biol.6,707-716),荧光共振能量传输(fluorescenceresonance energy transfer)(FRET;Moshinsky DJ,Ruslim L.,BlakeRA,Tang F.,A widely applicable,high-throughput TR-FRET assay forthe measurement of kinase autophosphorylation:VEGFR-2 as a prototype(广泛适用并高吞吐量地用以测量激酶自动磷酸化的变压整流的-荧光共振能量传输验定法:以VEGF-2为原型).J Biomol Screen.2003Aug;8(4):447-52);和信使RNA显示克隆(McPherson,M.,Yang,Y.,Hammond,P.W.,和Kreider,B.L.,2002,Drug receptor identificationfrom multiple tissues using cellular-derived RNA display libraries (使用细胞导出的RNA显示库从若干生物组织得到的药物受体识别).Chem.Biol.9,691-698),等.
在上述功能性克隆中,酵母双杂交系统不能应用于人体,这是因为当基因较大和复杂时,双杂系统的可靠性降低并且分析从该系统里得到的信息也更艰难。所复制系统应该根据蛋白质在细胞中原始的位置而选择。另外库质量、细胞的新陈代谢和细胞的成长都会影响到转录活动。还有,获得的混合蛋白质会有毒。
Y3H系统的特征为该系统探测生物活性的化学化合物与蛋白质之间的互相作用是在活细胞中进行的。但是,所述Y3H系统需要在简单的细胞(例如酵母细胞)中进行,就如同2YH系统一样,该系统有它的局限性并不适于探测全长膜蛋白。进一步,所述系统也不适合通过需要遗传翻译后修饰的内生酵母蛋白质和附件蛋白而探测生物活性化学化合物和蛋白质之间的互相作用。进一步,酵母细胞与其他哺乳细胞相比,具有对于生物相活性化学化合物较低的细胞膜渗透率。
介绍了使用生物信息预测蛋白质相互作用的方法。该方法根据基因序列信息数据库,预测经过分子系统发育或多序列调整后的蛋白质之间的相互作用。此外,近期还引入了虚拟筛选方法,例如,基因结构、分子指纹和多种聚簇分析方法。
如上所述,尽管提出了各种探测蛋白质之间的相互作用的方法,但还需要探寻更有效的探测相互作用的方法。此外,已经开发了通过探测化合物和靶蛋白质之间的相互作用从而筛选生物活性的化学化合物的各种方法。例如,Ding,S.et.al.通过使用亲和层析纯化筛选嘌呤分子库作为生化方法,识别出包括用P19干细胞以区别于神经细胞的化学化合物(Ding,S.,T.Y.H.,Brinker,A.,Peters,E.C.,Hur,W.,Gray,N.S.,和Schultz,P.G.2003,Synthetic small molecules that control stemcell fate(控制干细胞命运的合成小分子)。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,7632-7637)。但是,这种方法只能在姻亲关系为高时使用,为了确保探测的效率,需要提供大量的靶蛋白质。应为大多数生物活性化学化合物是有疏水性的,在疏水的环境里所述化合物相竞地与靶分子结合。所以,如果要被探测的提取物被施加到琼脂糖、或其他附着生物活性化学化合物的支持物时,蛋白质将会与非特定的结合对象和特定的结合对象结合。所以,在这个方法中,为了除去有底姻亲关系的分子结合,需要执行洗刷处理。
为了克服生化方法的缺点,引入了基因方法。Zheng等人为了探测在主体细胞内的异型接合和增强的药品灵敏度而使用了酵母三杂交系。显型和基因型之间的蛋白质关系是该方法的最大优点。那就是,使用这个方法提供了对靶蛋白质的直接基因克隆,因此一次探测就能成功(Jaeger,S.,Eriani,G.,和Martin,F.2004,Results and prospects of the yeastthree-hybrid system(酵母三杂交系统的结果和前途)。FEBS Lett.566,7-12)。在这个系统,新的靶蛋白质候选可以作为蛋白质融合复合物的一部分。
使用生物活性化学化合物确定基因突对细胞的影响的化学染色体组,可以从化学化合物组或从组合库里识别靶活动化学化合物(Schreiber,S.L.2003,The small molecule approach to biology(生物学中的小分子方法)。Chem.& Eng.1199 News 81,51-61;Crews,C.M.,和Splittgerber,U.1999,chemical genetics:exploring and controlling cellularprocesses with chemical probes(化学遗传学:通过化学探针探索和控制细胞处理)。Trends Biochem.Sci.24,317-320)。在这种方法中,数以百计或数以千计的化学化合物与基因改造的细胞一起排列在微滴定量板井中,以探测感兴趣的表型(Clemons,P.A.,Koehler,A.N.,Wager,B.K.,Springs,T.G.,Spring,D.R.,King,R.W.,Schreiber,S.L.,和Foley,M.A.2001,A one-bead,one-stock solution approach tochemical genetics:part 2(化学遗传学中一颗粒一原种方案:第二部).Chem.Biol.6,71-83)。
如上所述,大多数常规探测蛋白质之间或蛋白质和生物活性化学化合物之间的相互作用的技术只能在有限类别的细胞(例如,酵母或细菌细胞)中实施。此外,大多数常规技术将在体外实施。并且由于大多数常规技术需要基因改造和基因显现处理,因此,技术的实施受限于DNA的大小。由于其他参数而导致的高假阳性的命中率降低了结果的可靠性。
所以,我们,发明人,进行研究以开发能够实时动态探测体内/外分子之间相互作用的新方法。因此,我们通过以下操作来完成发明:引进附着有探测标签的生物活性分子、和另一个附着有在磁场中会移动的磁材料或具有磁材料/粒子的分子,然后监控磁场中的被移动的标签,从而探测并验证生物活性的分子相互作用。
发明内容
本发明的目的总体上是提供一种实时探测在体内(即,细胞中、组织或体内)和体外感兴趣的分子(例如生物活性分子)之间的相互作用、以及筛选靶分子的方法。更具体地,本发明提供一种在体内和体外直接探测、评估和筛选某些生物活性分子的“第一探测物质”与生物活性分子的“第二探测物质”之间相互作用的方法。
本发明的另一目的是提供一种在体内和体外直接探测“第一探测物质”与“第二探测物质”之间相互作用、以及筛选靶分子的方法。
本发明的另一目标是提供一种工具箱或芯片用以在体内和体外直接探测“第一探测物质”与“第二探测物质”之间的相互作用。
本发明的另一目标是提供一种探测阻止、抑制、催化或诱惑“第一探测物质”与“第二探测物质”之间相互作用、,以及筛选靶分子的方法。
本发明的另一目标是提供一种通过监视细胞特点或功能变化直接探测体内和体外“第一探测物质”与“第二探测物质”之间相互作用的方法。
附图说明
图1是本发明的示意图;
图2是共焦显微镜图片,显示了在向细胞中引入包被的纳米颗粒后,通过外加磁场,使具有FITC包被的纳米颗粒产生的迁移;
图3是共焦显微镜图片,显示了与表达EGFP的细胞(绿色)相比,,表达FKBP12-RFP蛋白质的细胞(红色);
图4是共焦显微镜图片,显示了通过外加的相反磁场,使FKBP12-RFP融合蛋白质和FK506-MNP复合物在细胞中产生的迁移,其中所述K506-MNP是FKBP12-RFP融合蛋白质的制药结合对应物;
图5是共焦显微镜图片,显示了当外加磁场磁力变化时,表达mRFP-Cascase-3s的细胞产生的迁移(用红箭头指出);
图6是显示了通过外加可逆磁场,使IκBα蛋白质和RelA蛋白质复合物产生的迁移的共焦显微镜图片;
图7是共焦显微镜图片,显示了使用anti-phospho-IκBα抗体探测磷酸化的IκBα蛋白质的结果,以及通过外加可逆磁场显示了anti-phospho-IκBα抗体和IκBα蛋白质复合物的迁移;
图8是共焦显微镜图片,显示通过外加可逆磁场使UAS寡核苷酸核GAL4蛋白质复合物产生的迁移;
图9是显示了由let-7h的miRNA和lin-28的mRNA相互作用而形成的复合物以及其位置改变的概念图;
图10是显示了通过外加可逆磁场而使miRNA和mRNA复合物产生的位置改变的共焦显微镜图片;
图11是显示了通过外加可逆磁场使β-CD和MBP复合物产生的位置改变的共焦显微镜图片;
图12是显示结合对应物蛋白质和微排列细胞的化验的概念图;
图13是IκBα-mRFP、IκBα-ECFP-FKBP12、EYFP-RelA和mRFP-TrCP融合蛋白质的示意图;
图14是使用anti-phospho-IκBα(Ser32)抗体显示IκBα-mRFP和纳米颗粒之间的相互作用的示意图;
图15是共焦显微镜图片,显示了通过与图14中一样的TNF-α处理得到的纳米颗粒复合物在外加可逆磁场下的迁移;
图16是显示在用TNF-α处理蛋白质之后、图13的蛋白质纳米颗粒复合物的形成;
图17是显示通过外加可逆磁场而使图16的纳米颗粒复合物的迁移的共焦显微镜图片;
图18显示了用于准备表达库的逆转录酶病毒构造的共焦显微镜图片;
图19显示用以识别靶分子的FK506和FK506-生物素的常规结构;
图20是共焦显微镜图片,显示了通过施加外磁场特别局部化的EGFP融合蛋白质。它验证了来自表达库的特定融合蛋白质是FKBP12和FKBP52,FKBP12和FKBP52是FK506的靶;
图21显示CGK1026的常规结构;
图22显示CGK1026抑制HDAC蛋白质的活动;
图23是显示经过FK506处理后,生物素-FK506和FKBP12之间的竞争性抑制的共焦显微镜图片;以及
图24是显示WT抑制ATM磷酸化酶和CGK606之间的相互作用的共焦显微镜图片。
具体实施方式
为了达到本发明上述的目的,我们,发明人设计出两种构建体。更具体地说,第一构建体包括通过外加的驱动场改变位置的定位子,以及第一探测物质,例如要被分析的生物分子,其中第一探测物质通过使用例如连接子直接或者间接地附着于定位子。第一探测的生物分子物质和定位子可以融合的形式提供。进一步,第一结构建体能够被提供为两个或两个以上的片段,这些片段是通过将第一探测的生物分子物质的至少一个和熔合有探针以帮助辨认生物分子的定位器间接结合而形成。第二构建体包括一个或多个第二探测物质,例如生物分子,第二探测物质附有至少一个探测标签。在第二构建体内,以直接融合的形式提供要被分析的生物分子和标签。进一步,第二构建体可被提供为通过将至少一个生物分子物质和熔合有探针以帮助辨认生物分子的定位器间接结合而形成的两个或两个以上片段。对于第一探测物和第二探测物相互作用形成复合物的实时动态探测,是通过使它们在同一系统或场中接近到可以相互作用,然后用合适的设备探测在位置或运动已经转变的标签。进一步,通过监视细胞特征和功能在的变化,本发明可以间接地探测到相互作用。本发明中,如果第一探测物质作为“诱饵”使用,那么第二探测物质作为“掠食者”使用,反之亦然。在本发明中,对于所述位置和运动的变化,可以通过例如使用如显微镜的光学方法来监视,也可以使用扫描器、辐射标签探测装置、荧光偏振阅读器(FP reader)、分光光度计、MRI(核磁共振成像)、超导量子干涉仪、荧光探测器以及冷光探测器来监视。
具体地,本发明探测分子相互作用的方法包括三个步骤:i)提供第一探测物和定位子的结合复合物是第一构建体,所述定位子通过外加的驱动力改变位置;ii)提供包括附有标签用以探测的第二探测物的第二构建体;iii)在同一系统或场中,使第一探测物和第二探测物接近到它们可以相互作用的距离,以及iv)施加外驱动力然后探测位置和运动发生了变化的标签。
进一步,本发明筛选靶分子的方法包括的步骤:i)提供第一探测物和定位子的结合复合物是第一构建体,所述定位子通过外加的驱动力改变位置;ii)提供包括附有标签用以探测的第二探测物的第二构建体;iii)在同一系统或场中,使第一探测物和第二探测物接近到它们可以相互作用的距离,以及iv)施加外驱动力然后探测位置和运动发生了变化的标签;以及v)离析并识别第二构建体的分子。对于靶分子的筛选可以进一步使用常规方法实施,例如,RT-PCR、染色体组的DNA PCR或使用质谱测量。
进一步,依照本发明,为探测分子之间的相互作用以及筛选靶分子提供了三种构建体。具体地,本发明的方法包括以下步骤:提供第一探测物和定位子的结合复合物是第一构建体,所述定位子通过外加的驱动力改变位置;ii)提供包括附有标签用以探测的第二探测物的第二构建体;iii)提供包括要被探测的物质的第三构建体;iv)在同一系统或场中,使三个构建体接近到它们可以相互作用的距离;v)施加外驱动力然后探测位置和运动发生了变化的标签;以及vi)离析并识别所述第三构建体的分子。对于靶分子的筛选可以进一步通过常规方法实施,例如,RT-PCR、染色体组的DNA PCR或使用质谱测量。
在本发明中,要探测的分子可以在第一构建体中探测到,第二构建体或第三构建体能够以库的形式提供。
本发明的一个实施方式中使用磁场作为外加的驱动力。第一构建体的定位子使用的是纳米颗粒(优选的半径为5nm-2,000nm),其中,分子例如生物分子结合到或包被在定位子上。定位子可以被两个或更多分子所结合或包被。第二构建体包括与第一构建体的生物分子相互作用的另一个结合对应物的生物分子,其中第二构建体的分子附有标签用于探测。通过对同一细胞中引入第一和第二构建体,并接着施加磁场作为驱动力以及确定改变位置的标签后,所感兴趣的靶分子可以被实时地探测到。进一步,在本发明中,可以通过改变磁场的强度而实现逆向探测。另外,可以通过使用在改变外磁场的强度时,未显示任何位置或运动变化的反向控制、或者显示了位置或运动变化的正向控制来实现对比探测。
本发明的另一实施方式包括以下步骤:i)提供由生物活性化学化合物包被的磁性颗粒,ii)将i)中的被包被的颗粒引入到包含附着有标签的蛋白质的细胞中;iii)为了改变所述细胞中的磁性颗粒的位置,向ii)中的细胞施加磁场;iv)监视标签的位置和运动;以及v)从在其中标签的位置或运动已经发生改变的细胞中离析出和识别出靶分子。
当在体内实现本发明时,例如在的原核生物或真核生物内;在哺乳动物的生物体、组织或细胞内;以及在植物的生物体、组织或细胞内。特别地,本发明的方法可以在斑马鱼、秀丽线虫、酵母、苍蝇或蛙的生物体、组织或细胞实施。第一构建体、第二构建体和第三构建体都是通过以下方式在实现:例如通过使用可转换肽(或fusogenic肽)、脂肪(或脂肪体)或它们的复合物;或通过用Opti-MEM中的细胞培养构建体;或者通过电穿孔和magnetofection。特别地,当本发明在活细胞里实施时,本发明可以在培养皿或微排列里实施。进一步,微排列细胞可以用于本发明。
本发明中的外加的驱动力是依靠于如下特征,例如,第一构建体的定位子的物理、化学和生物的特征。例如,外加的驱动力可以通过光学设备来施加,如光镊子(optical tweezer)。
本发明中,所述“生物分子”应该理解为包括代表体内生物活动的全部物质,例如,核酸、单/少数的/多-核苷酸、蛋白质、单/少数的/多-肽、氨基酸、单/少数的/多-糖、脂肪、维生素、化学化合物和由它们建立的物质。
本发明中,“诱饵(bait)”指用以探测与其它生物分子相互作用的生物分子。
本发明中,“掠食者(prey)”是指要被探测或扫描的、与“诱饵”相互作用的对应物的生物分子。
本发明中,“靶分子”是指和诱饵相互作用的掠食者。另外,靶分子表示全部要被识别的、用于启动或诱导诱饵与掠食者之间相互作用的物质,或要被识别的、用于阻止或抑制诱饵与掠食者之间相互作用的物质。
本发明中“定位子(localizer)”表示根据施加外力的方向改变位置、移位或移动的物质。
本发明中外部施加的驱动力代表全部会造成上面定义的定位子改变位置或运动的力。外部施加的驱动力包括,例如电力、电磁力、磁力和地球引力。
本发明中,第二构建体的标签包括荧光物质,该标签可以自身发出荧光、或通过与其他物质相互作用而产生荧光;其他物质例如是:荧光染料,如FITC和若单明等;荧光蛋白质,如GFP、YFP、CFP和RFP等;四半胱氨酸基序。本发明中,第二构建体的标签包括发光物质,该标签可以自身发光或通过与第一构建体或其他例如荧光素酶的物质相互作用而发光。放射性的标签32p、35S、3H和14C等都可以用以本发明。
本发明中,生物活性分子和定位子之间的集合例如包括物理、化学的直接或间接结合。所述生物活性分子可以包被于定位子或标签的表面上。本发明中,用于探测的第一或第二构建体的探针例如包括抗体、蛋白质 、蛋白域、蛋白基序和肽等。所述探针通过化学、物理、生物、或静电结合到生物分子,并可以与探测物质和定位子组合、或与生物分子和标签组合。
通过下面的实施例描述本发明的优选实施方式。根据说明书公开的内容,位于权利要求的范围内的其他实施方式对于本领域技术人员应该是显而易见的。说明和实施例应该被理解为体现本发明精神和范围的示例。本文中的实施例用来对执行本发明的各个方面进行示例,并不是用来对本发明加以限制。实施例未包括对现有使用方法的详细描述。这些方法对于本领域的技术人员应该是公知的,并在各种公开物中描述。此外,在本文中提到的所有公开物被集合到本文作为参考。
实施例
实施例1
使用荧光FITC包被的纳米颗粒确定细胞的局部化
FITC-MNP-TATHA2复合物,即,FITC包被的超顺磁纳米颗粒(MNP)是经过抗生蛋白链菌素共轭超顺磁纳米颗粒(50nm,抗生蛋白链菌素纳米颗粒)与FITC-生物素和TATHA-生物素的反应形成的。TATHA2肽复合物是通过常规方法合成的(Wadia,et al.,Nat Med.10:310-315(2004)),而且它的N-端被生物素所标签。作为负向控制,QD565-TATHA2经过QD565和TATHA2-生物素反应得到,其中QD565不会被外加磁场改变其位置。HeLa细胞(可从ATTC得到)和生物素被无浆液的DMEM冲洗。然后,在把细胞用FITC-MNP-TATHA2复合物和QD565-TATHA2复合物的混合液处理之后,冲洗后的细胞在37摄度的CO2培养器Opti-MEM(Invitrogen)里培养12小时。在把细胞传送到共焦显微镜的上聚焦板后,利用在商业上可得到的永久磁铁或电磁铁从聚焦板的底部施加磁场。在共焦显微镜的聚焦板被聚焦后,由施加的磁场改变了位置的荧光蛋白质被探测到(图2)。这样,仅在包含FITC-MNP-TATHA2的细胞中观察到FITC-MNP-TATHA2复合物被施加的外部驱动力改变了位置,而在包含QD565-TATHA2的负控制的细胞中并没有观察到位置的改变。
实施例2
探测细胞中不同的生物分子之间的相互作用
1)使用荧光蛋白质的融合蛋白和被生物活性化学化合物包被的纳米
颗粒探测细胞中的相互作用
超顺磁性纳米颗粒(MNPS)通过抗生蛋白链菌素微珠(直径为50纳米,抗生蛋白链菌素微珠,Miltenyi Biotec)和FK506-生物素的反应被FK506包被。用以表达EGFP蛋白质或RFP-FKBP融合蛋白质的融合蛋白质的HeLa细胞被无浆液DMEM冲洗。然后在CO2培养器中,在37摄度下,将冲洗后的细胞在包括被MNP和Opti-MEM(Invitrogen)包被的FK506的媒介中培养12小时,从而将包被有FK506的MNP引入到HeLa细胞内。在把细胞传送到共焦显微镜的聚焦板后,通过在商业上可得到的用磁体或电磁铁从聚焦板的底部施加磁场。在控制共焦显微镜的聚焦板的同时,由施加的磁场改变了位置的荧光蛋白质被探测到(图3)。只有表达RFP与FKBP12的细胞(红色)被施加的外部驱动力局部化(localize),而EGFP表达细胞(绿色),在负控制下,并没有观察到位置被改变。
2)在细胞中,对FK506和其药物结合对应物FKBP12(FK506结合蛋
白质12)之间的相互作用的探测
通过摇动抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec)、FK506-生物素和TATHA2-生物素的反应混合物,使它们在4摄氏度温度下反应1小时得到FK506-MNP复合物。使用捕捉磁性离析器(Captivate magneticseparator)(分子探针)净化反应混合物从而清除里面的未结合配合体。将RFP融合的EGFP和FHBP12表达质粒引入到HeLa细胞(ATCC)后,对该细胞进行培养。然后,FK506包被的MNP被引入到该细胞内,接着使用无浆液DMEM冲洗HeLa细胞。接下来使用Magnetofector(从Chemicell公司可以通过商用的手段得到)或永磁性物质对细胞外加磁场(M.F.)。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜得到活细胞的共焦图片。在图4中,只有表达RFP融合的FKBP12细胞(由红箭头显示)被外部磁场局部化,而EGFP表达细胞(由绿箭头显示),在负控制下,并没由显示任何运动。
3)探测Caspase-3缩氨酸抑制体和其结合对应物caspase-3在细胞中
的相互作用
通过在4摄氏度温度下摇动抗1小时生蛋白链菌素纳米颗粒、caspase-3抑制剂II(DEVD)共轭生物素(CALBIOCHEM)和TATHA2-生物素,使它们反应得到DEVD-MNP复合物。使用永磁体净化反应混合物从而清除里面的未结合配合体。将mRFP-Caspase3和EGFP表达质粒引入HeLa细胞(ATCC)后,该细胞被培养。所述DEVD-MNP被引入细胞,并且使用永磁体或电磁体向细胞外加磁场。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片。在图5中,只有表达mRFP-Caspase3的细胞(由红箭头显示)被外部磁场局部化,而EGFP表达细胞(由绿箭头显示),在负控制下,并没由显示任何运动。
4)探测IκBα蛋白质和它的结合对应物RelA蛋白质在细胞中的相互作用
通过使抗生蛋白链菌素纳米颗粒、FK506-生物素和TATHA2-生物素在4摄氏度温度下反应1小时(同时摇动这些混合物),得到FK506-MNP复合物。使用永磁体净化反应混合物从而清除里面的未结合配合体。将与IκBα蛋白质融合的ECFP和EFKBP12(IκBα-ECFP-FKBP12)以及与RelA融合的EYFP(EYFP-RelA)的表达质粒引入HeLa细胞(ATCC)后,将FK506-MNP引入到细胞中,并且使用永磁性物质或电磁对细胞施加磁场。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片。在图6中,IκBα-ECFP-FKBP12融合的蛋白质和EYFP-RelA融合的蛋白质,通过外部磁场而迁移。
5)探测IκBα蛋白质和其抗磷酸-IB的抗体在细胞中的相互作用
通过在4摄氏度温度下摇动1小时抗生蛋白链菌素纳米颗粒、抗磷酸-IκBα-生物素和TATHA2-生物素的反应混合物得到抗磷酸-IκBα-MNP复合物。使用永磁物净化反应混合物从而清除里面的未结合配合体。将mRFP与IκBα融合的(IκBα-mRFP)表达质粒引入HeLa细胞(ATCC)后,在使用永磁性物质或电磁对细胞施加磁场(M.F.)之后TNF处理5分钟。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(CarlZeiss)得到活细胞的共焦图片(图7)。
6)探测GAL4蛋白质和具有GAL结合部的寡核苷酸(UAS)在细胞中
的相互作用
酵母转录因子的GAL4蛋白质可结合到具有UAS DNA序列(SEQ IDNo.:1)的寡核苷酸,生物索-CCCAGTTTCTAGACGGAG(UAS-生物素)是合成的。通过在4摄氏度温度下摇动1小时抗生蛋白链菌素纳米颗粒、UAS-生物素和TATHA2-生物素的反应混合物得到UAS-MNP复合物。使用永磁物净化反应混合物从而清除里面的未结合配合体。将EGFP与GAL4融合(EGFP-GAL4)的表达质粒引入HeLa细胞(ATCC)后,并且在将UAS-MNP引入到该细胞后,使用永磁性物质或电磁对细胞施加磁场(M.F.)。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片(图8)。
7)探测miRNA和mRNA在细胞中的相互作用
为了探测miRNA和作为miRNA靶的mRNA之间的相互作用,选择了可以和lin-28mRNA结合的let-7bmiRNA(SEQ ID No.:2)(图9)。let-7b miRNA合成为UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU-生物素(let-7b-生物素),另外为了对lin-28mRNA(SEQ ID.No.:3)进行标签,合成了FITC-CCCTATAGTGAGTCGTATTA(FITC-lin28p)。通过在4摄氏度温度下摇动1小时抗生蛋白链菌素纳米颗粒、let-7b-生物素和TATHA2-生物素的反应混合物得到let7b-MNP复合物。使用永磁物净化反应混合物从而清除里面的未结合配合体。将lin-28mRNA表达质粒引入HeLa细胞(ATCC)后,并且在将let7b-MNP和FITC-lin28p引入到所述细胞后,使用永磁性物质或电磁对细胞施加磁场(M.F.)。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片(图10)。
8)探测β-环式糊精和MBP蛋白质在细胞中的相互作用
使用EZ-Link NHS-PEO固相生物素基化工箱(Pierce)(CD-生物素)获得β-环式糊精(西格马)。通过在4摄氏度温度下摇动1小时抗生蛋白链菌素CD-生物素和TATHA2-生物素的反应混合物得到let7b-MNP复合物。使用永磁物净化反应混合物从而清除里面的未结合配合体。在将融合了MBP的EGFP(MBP-EGFP)表达质粒引入HeLa细胞(ATCC)后,使用永磁性物质或电磁对细胞施加磁场。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片(图11)。
实施例3
在微列阵细胞中探测结合对应物蛋白质
源于人体的大约1,000个全长ORF(开放阅读框)基因从人类基因功能分析中心(Center for Functional Analysis of Human Genome)(韩国)分布。1,000或更多的基因在E.coll.增生扩散,而且萃取质粒DNA。为了表达在动物细胞里的基因,所萃取的DNA被克隆到pcDNA-GFP-DEST向量(Invitrogen)。被插入到pcDNA-GFP-DEST向量的基因将能够表达由GFP蛋白质和感兴趣的蛋白质的C-端融合所产生的融合蛋白。微阵列细胞通过常规方法准备[参见Ziauddin and Sabatini,Nature 411:107-110(2001)],并由融合的GFP的表达验证。将根据实施例2准备的FK506-MNP引入到微阵列细胞中,然后使用永磁性物质或电磁对细胞施加磁场(M.F.)。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片。正(positive)克隆的RT-PCR和mRNA分析验证了正克隆是FKBP12(其为用于FK506的药物相关靶)。
实施例4
通过信号转导探测蛋白质复合物的后转换修改及变换
通过TNF-α/IκBα信号转导系统探测蛋白质复合物的后转换修改及变换。通过形成具有NF-κB蛋白质例如RelA/p65,p50和c-Rel等的复合物,AIκBα蛋白管制各种信号。如果用TNF-α处理细胞,IκBα的第32丝氨酸和第36丝氨酸由于IκBα激酶(IKK)活动的增加而磷酸化,并且由此IκBα蛋白与βTrCP结合[Brown,et al.,Science 267:1485,(1995)]。因此为了探测通过TNF-α处理而磷酸化的IκBα以及IκBα-βTrCP复合物的形成,表达构建体将按下述内容准备(图13)。通过融合IκBα基因和mRFP基因设计表达向量,以表达IκBα-mRFP融合蛋白质。此外,通过融合IκBα基因、ECFP基因和FKBP12基因,设计该表达向量,以表达IκBα-ECFP-FKBP12融合蛋白质。另外,mRFP-βTrCP融合蛋白质是使用包括各自基因融合的表达向量而得到的。抗磷酸-IκBα-MNP抗体(细胞发信号技术)是通过EZ-LinkNHS-PEO固相生物素基化工箱(Pierce)并且执行免疫印迹(westernblotting)后得到的。
1)通过信号转导探测蛋白质的磷酸化
通过在4摄氏度温度下摇动1小时抗生蛋白链菌素纳米颗粒、生物素-SSFITC和生物素-TATHA2的反应混合物得到IκBα(Ser32)-MNP复合物。根据实施例1所述把IκBα(Ser32)-MNP复合物引入HeLa细胞(ATCC)(IκBα-mRFP表达向量被引入其中),并用10ng/ml的TNF-α对细胞处理5分钟。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片(图14和15)。1mM的SC514作为IKK抑制体。通过TNF-α处理后的磷酸化的IκBα与IκBα(Ser32)-MNP复合物结合,并通过外加磁力而改变位置。另一方面,当处理IKK抑制体的SC514时,因为没有磷酸化的IκBα的出现,所以不会出现位置改变现象。
2)为探测通过信号转导产生的蛋白质复合物,执行下述试验
在同时将IκBα-ECFP-FKBP12融合蛋白质表达向量、EYFP-RelA融合蛋白质表达向量和mRFP-βTrCP融合蛋白质表达向量引入到HeLa细胞(ATCC)里后,将在实施例1中得到的FK506-MNP复合物引入到该细胞中。利用10ng/ml的TNF-α对该细胞处理5分钟。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜(Carl Zeiss)得到活细胞的共焦图片(图16和17)。不管信号如何转导,通过外加磁力,IκBα-ECFP-FKBP12融合蛋白质和EYFP-RelA融合蛋白质都改变了位置。但是,由于信号转导与磷酸化的IκB结合的mRFP-αTrCP融合蛋白质,只在用TNF-α处理时出现位置改变。IKK抑制体的SC-514抑制IκBα-ECFP-FKBP12融合蛋白质与mRFP-βTrCP融合蛋白质的结合,但并没有抑制IκBα-ECFP-FKBP12融合蛋白质和EYFP-RelA融合蛋白质之间的相互作用。
实施例5
从基因层次DNA表达库筛选、探测和化验在细胞中生物活性的分子
与其结合对应物蛋白质之间的相互作用
1)从基因层次DNA表达库筛选、探测和分析在细胞中FK506与其结
合对应物蛋白质之间的相互作用
制造一个用于准备表达库的逆转录酶病毒构造。在图18描述的pBabe-puro向量用以作为支柱[Morgenstern,et al.,Nucleic Acids Res.18:3587-3596(1990)]。从5′LTR转录并具有EGFP融合蛋白质及mRFP的双顺反子(bicistronic)mRNA从构建的逆转录酶病毒表达。为了最大量地引入将要被引入到EGFP的内框,本发明设计了三种框(图18)。根据常规方法实现到EGFP的3’或5’端的随机DNA融合(Escobar,et al.,Plant Cell 15:1507-1523(2003))。在根据常规方法合成了具有如图19描述的结构的FK506-生物素(McPherson,et al.,Chem Biol.9:691-698(2002))后,使用MALDI MS验证FK506-生物素。通过在4摄氏度温度下使抗生蛋白链菌素纳米颗粒、FK506-MNP生物素和TATHA2-生物素反应一个小时得到FK506-MNP复合物。使用常规方法用Jurkat细胞准备EGFP-融合蛋白质表达库[Escobar,et al.,Plant Cell 15:1507-1523(2003)]。传染性的逆转录酶病毒通过转染连带逆转录酶病毒表达库的细胞包裹(Phoenix-ampho)(G.P Nolan,斯坦福大学,美国)。转染48小时后,从转染的包裹细胞去除上层清液(supernatant),所清除的上层清液经过0.45μm(微孔过滤器)过滤后用以传染Hela细胞。受病毒上层清液(增加了4μg/ml的聚凝胺)传染Hela细胞。受传染两天后,将1μg/ml的puromycine引入到的该受传染的细胞中,并且将该细胞有选择性地培养3天。下一步,准备如同上面所提到的FK506-MNP并把其转移到的细胞里(如同实施例1所述)。通过永磁物质或电磁对该细胞外加磁场(M.F.)。在施加或不施加磁场的同时,使用共焦激光显微镜得到活细胞的共焦图片。在同时用EGFP表达的mRFP被作为假正信号而监控。在图20中,箭头代表正克隆。对于来自正克隆的RT-PCR和mRNA的序列分析显示了所述正克隆是用于FK506的药物相关靶的FKBP12和FKBP52。正克隆的RT-PCR和序列分析是通过常规方法执行的[Escobar,et al.,PlantCell 15:1507-1523(2003)]。
2)从基因层次DNA表达库筛选、探测和分析在细胞中CGK1026与其
结合对应物蛋白质之间的相互作用
经验证CGK1026是增强端粒酶反应活动的生物分子[图21;Won,etal.,PNAS,101:11328-11333(2004)]。为了筛选结合到CGK1026的蛋白质,生成CGK1026-生物素派生的物质。通过在4摄氏度温度下摇动1小时抗生蛋白链菌素纳米颗粒、CGK1026-生物素和TATHA2-生物素的反应混合物得到生物素派生的物质。连接在CGK1026上的蛋白质,使用逆转录酶病毒库验证为HDAC。与公知的TSA的HDAC抑制体相比,CGK1026以相似的层次对HDAC的活动进行抑制(Won,et al.,PNAS,101:11328-11333(2004))(图22)。
实施例6
抑制体和催化体相互作用的药品筛选
1)催化体相互作用的探测
将实施例4的1)所述的IκBα-mRFP融合蛋白质表达向量和IκBα(Ser32)-MNP复合物引入,该细胞接着被不同的化学混合物及生长要素处理。然后在施加磁场时,局部化的IκBα-mRFP融合蛋白质被共焦显微镜探测到。因此在磁场下只有TNF-α、IL-2、LPS和Fas被观察到改变了IκBα-mRFP融合蛋白质的位置。
2)FK506相互作用的抑制
如实施例3所述FKBP12-mRFP融合蛋白质表达向量和IFK506-MNP复合物被引入到细胞里,接着用各种化学混合物对该细胞进行处理,之后位置改变被探测到。观察的结果是,在被处理的混合物中,只有FK506强有力地抑制了FKBP12-mRFP融合蛋白质的位置改变。
3)抑制体相互作用的探测
经验证GK606是ATM(无秩序毛细管扩张)磷酸化酶的抑制体。通过对纳米颗粒包被CGK606和TATHA2,而得到CGK606-MNP复合物。在将ATM-mRFP融合蛋白质表达向量引入到Hela细胞后,CGK606-MNP被引入到该细胞,如上所述。经过不同生物活性的低分子重量的化学混合物处理后,通过施加驱动力,利用共焦显微镜探测到ATM-mRFP融合蛋白质的位置改变。在生物活性的分子中,只有渥曼青霉素抑制ATM-mRFP融合蛋白质由施加的磁场导致的局部化。
工业应用
如上所述,一种实时动态地探测通过相互作用而形成的复合物通过以下来实现:i)第一构建体和定位子,所述定位子通过外部施加的驱动力而改变位置;ii)包括其它生物分子的第二构建体,根据本发明在相同的场或系统中,该生物分子附着有标签用于探测。当改变外部施加的驱动力的大小时,该复合物的位置改变还能够动态地被确定,因此,他它是可逆的。因此,本发明能够在生物分子之间有效地实现,而不会破坏细胞并对要在体外和体内探测的分子的大小没有限制。因此,本发明可用来公开一种与现有的药物不同的新颖的应用,或能够改进现有的药物。
序列表
Sequence Listing
<110>CGK Co.,LTD.
<120>SYSTEM FOR DETECTING MOLECULAR INTERACTIONS
<130>IPN-29264
<150>KR 10-2004-0056476
<151>2004-07-20
<150>KR 10-2005-0013813
<151>2005-02-18
<160>3
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>UAS
<400>1
cccagtttct agacggag 18
<210>2
<211>22
<212>RNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>let-7b miRNA
<400>2
ugagguagua gguugugugg uu 22
Sequence Listing
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>line-28 mRNA
<400>3
ccctatagtg agtcgtatta 20
Claims (28)
1.一种探测分子之间相互作用的方法,包括:
i)提供第一构建体,所述第一构建体包括第一探测物质和定位子的结合复合物,所述定位子通过外部施加的驱动力而改变位置;
ii)提供第二构建体,所述第二构建体包括附着有标签用于探测的第二探测物质;
iii)在同一域或系统里使所述第一构建体和第二构建体接近到能够相互作用的距离;
iv)施加外部驱动力,并探测所述标签是否根据所述相互作用而改变了位置或运动;以及
可选地选择所述相互作用引起的细胞特征或功能的变化。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述分子是生物活性分子。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述生物活性分子是从核酸、核苷酸、蛋白质、肽、氨基酸、糖类、类脂类和化学混合物以及其构建物质中选择出的一个或多个分子。
4.如权利要求1到3任何一项所述方法,其中施加的所述外部驱动力是磁场。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述磁场是电磁或永磁场。
6.如权利要求4或5所述的方法,其中所述探测是通过变化所述磁场的强度可逆地完成的。
7.如权利要求4到6任何一项所述方法,其中所述定位子包括磁性物质。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述定位子的直径在5nm到2,000之间。
9.如权利要求1到8中任何一项所述方法,其中所述标签是有辐射性的、荧光的或冷光的物质。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述荧光的或冷光的物质本身放射荧光或冷光,或者在与第一构建体的分子或其它分子结合时显现荧光或冷光。
11.如权利要求10所述的方法,其中所述的荧光物质是半胱氨基酸荧光基序、或荧光蛋白质例如GFP、YFP、CFP或RFP、或者荧光纳米颗粒。
12.如权利要求1到11任何一项所述方法,其中所述第一构建体的定位子结合到两个或多个分子,或用所述两个或多个分子包被。
13.如权利要求1到12任何一项所述方法,其中所述定位子通过静电、物理、化学或生物的结合方式结合到所述第一探测物质。
14.如权利要求1到13任何一项所述方法,其中所述第二构建体的所述标签直接或间接地结合到所述第二探测物质。
15.如权利要求1到14任何一项所述方法,其中所述第二构建体的所述标签通过静电、物理、化学或生物的结合方式结合到第二探测物质。
16.如权利要求1到15任何一项所述方法,其中从抗体、蛋白质、蛋白质域、蛋白脂基序和肽中选择一个或多个作为探针,以在所述第一构建体中将探测物质或所述定位子结合,以探测所述第一或第二探测物质中的物质。
17.如权利要求1到16任何一项所述方法,其中在体内实现所述第一构建体和所述第二构建体的相互结合作用。
18.如权利要求17所述的方法,其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
19.如权利要求17或18所述的方法,其中通过可转换肽或融合肽、脂肪或脂肪体或它们的复合物;通过在Opti-MEM中培育所述构建体;或者通过电穿孔或磁转染将所述第一构建体和所述第二构建体引入到所述细胞。
20.如权利要求17到19中任何一项所述方法,其中所述相互作用是由在培养皿或盘上的活细胞或微阵列细胞完成。
21.如权利要求1到16中任何一项所述的方法,其中在上述步骤iii)中,所述第一构建体核所述第二构建体之间的所述相互作用在体外完成。
22.如权利要求4到21中任何一项所述方法,其中根据施加的所述磁场的强度变化而改变位置或未改变位置的任何物质分别被比作正控制或负控制。
23.如权利要求1到22中所述任何一方法,其中所述第一构建体或所述第二构建体的所述探测物质以库的方式提供。
24.一种筛选靶分子的方法,进一步包括:在探测到根据权利要求1到23中任一项所述的方法的相互作用后,从所述第二构建体离析和识别分子。
25.如权利要求24所述的方法,其中所述第一构建体或所述第二构建体的所述探测物以库的形式提供。
26.一种探测分子相互作用的方法,包括:
i)提供第一构建体,所述第一构建体包括第一探测物质和定位子的结合复合物,所述定位子通过外部施加的驱动力而改变位置;;
ii)提供第二构建体,所述第二构建体包括附着有标签用于探测的第二探测物质;
iii)提供包括第三被探测物质的第三构建体;
iv)在同一域或系统里使所述构建体接近到能够相互作用的距离;以及
v)施加外部驱动力,之后探测所述标签是否根据所述相互作用而改变了位置或运动;以及
vi)从所述第二构建体离析和识别分子。
27.如权利要求26所述的方法,其中所述第一、第二或第三构建体的所述探测物以库的形式提供。
28.一种通过将第一构建体或第二构建体内化到微阵列细胞而探测所述第一构建体和第二构建体之间的相互作用的系统,其中,所述细胞包括第一构建体,所述第一构建体通过组合第一探测物质和定位子而形成,所述定位子通过外施加的驱动力而被局部化,所述第二构建体包括附着有标签的第二探测材料。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106501349A (zh) * | 2017-01-05 | 2017-03-15 | 中国科学院化学研究所 | 一种基于光学原子磁力仪的原位力谱方法 |
CN107727732A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-02-23 | 上海交通大学 | 一种用于蛋白相互作用组单分子力谱方法 |
CN113636101A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-11-12 | 中国商用飞机有限责任公司 | 用于点火源检测的可燃气体燃爆装置 |
-
2005
- 2005-07-20 CN CN 200580024797 patent/CN101002098A/zh active Pending
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070718 |