KR20180137102A - 세포내에서 물질의 상호작용을 탐색하는 자성 합성생물학적인 방법 - Google Patents

세포내에서 물질의 상호작용을 탐색하는 자성 합성생물학적인 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자기장에 의해 분리 및 규명된 단백질을 이용해서, 세포내에서 약물과 단백질 등 다양한 생리조절물질의 상호작용을 탐색하는 방법이다. 나아가 상기 상호작용을 저해 또는 촉진하는 생리조절물질을 검출하는 방법 등으로의 활용에 관한 것이다.

Description

세포내에서 물질의 상호작용을 탐색하는 자성 합성생물학적인 방법{Magnetic Biosynthetic Method to Analyze Molecular Interactions Inside Cells}
본 발명은 세포내에서 자기장에 의해 분리된 단백질과 결합한 베이트물질, 프레이물질 및 자성물질을 도입한 다음, 자기장을 인가하기 이전 또는 이후의 프레이물질의 상대적인 위치를 측정하여 베이트물질과 프레이물질의 상호작용을 탐색하는 방법 및 이들의 상호작용과 기능을 조절하는 물질의 검출 방법에 관한 것이다.
현대적인 의약품들은 질병을 치료하기 위해 좀 더 안전하고 효율이 높은 치료효과를 가져야 하고 그 개발방법도 보다 더 효율적이어야 할 필요성이 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 많은 의약품들의 약물은 그들과 결합 및 반응하는 분자적인 타겟이 무엇인지 정확히 알지 못한 체, 질병분석 모델에서 그들의 효과만을 확인함으로서 개발되었다(Chem. Biol. 11: 593, 2004). 더불어 생리활성을 가진 천연물질들이 의약후보물질로서 중요해짐에도 불구하고, 그들의 정확한 분자 타겟 등 분자적인 수준의 작용기작은 밝혀지지 않았다(Nature 432: 829, 2004). 이러한 천연물질들의 생리학적 분자 타겟을 밝혀내는 것은 이들의 약제학적 효과 및 부작용을 이해하는데 필수적일 뿐만 아니라, 보다 진보된 새로운 의약품의 개발을 가능케 하는 데에도 필수적이다. 또한, 임상적으로 증명된 의약품들에서 약물의 새로운 분자 타겟을 발견하는 것은 새로운 약제학적 효능 및 용도를 제공할 수 있다(Nat. Rev. Drug Discov. 3: 673, 2004). 분자 타겟을 동정 및 규명하는 것은 거대한 화합물 라이브러리에서 원하는 표현형을 가지는 저분자화합물을 세포를 기반으로 초고속(high-throughput) 방식으로 스크리닝하는 화학생물학 분야에서도 중요하다(Science 300: 294, 2003 ; Nature 432: 846, 2004). 이러한 스크리닝의 장점에도 불구하고, 발견한 생리활성 저분자화합물의 타겟 규명 및 동정에는 많은 작업과 시일이 소모되어, 상기의 화학생물학적인 방법은 제대로 효율적으로 사용되지 못하고 있는 실정이다. 뿐만 아니라, 타겟 동정 기술의 개발은 지노믹스, 프로테오믹스 및 시스템 바이올로지 등의 다양한 생명과학 분야에서도 중요한데, 이는 단백질(또는 저분자화합물)-단백질 상호작용을 포함하는 다양한 종류의 세포내 다양한 물질들간의 상호작용을 효과적으로 분석 및 검출하는 것이 역동적인 생물학적 프로세스와 조절 네트워크 및 생명현상을 이해하는데 필수적이기 때문이다.
약물 등과 결합하는 질병인자로서 분자 타겟을 규명 및 동정하는데 있어서, 물질의 상호작용을 분석하는 몇 가지 기술로서, 친화성 크로마토그래피(Microbiol. Rev. 59: 94, 1995 ; Science 284: 1948, 1999), 단백질/저분자화합물 마이크로어레이, 파지 디스플레이(Chem. Biol. 6: 707, 1999), 효모 하이브리드(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 12817, 1996), 유전자 발현 프로파일링 및 비상동 결실을 가진 효모 균주의 평형 분석(Chem. Biol. 11: 609, 2004) 등이 널리 알려져 있다.
하지만, 상기의 기술들은 높은 백그라운드(high background), 높은 위양성(false-positive), 낮은 민감도(sensitivity), 근본적으로 잘못된 구조 형성(structural folding), 간접적인 결과 도출(indirectness), 전사후 변형조절(posttranslational modification)의 부재 또는 세포내 존재하는 질병인자 등 분자 타겟에 대한 제한된 접근성 등의 여러 가지 다양한 문제점을 가지고 있다. 또한, 생체외 시험관 결합(in vitro binding) 조건 또는 비포유류 세포 결합 조건 등과 같은 본래의 자연적인 환경이 아닌 인위적인 환경(artificial environment)에서의 실험은 종종 잘못된 실험결과를 일으킨다. 따라서, 저분자화합물 등 약물과 질병인자 등의 분자 타겟간 상호작용을 생리학적 및 약학적으로 바람직한 조건에서 높은 민감도와 정확도로 검출하는 기술이 필요하다.
사람 세포 내에서의 물질의 상호작용의 분석 방법으로 FRET(fluorescence resonance energy transfer)과 PCA(protein-fragment complementation assay)이 대표적으로 있다. 그런데, 이 방법들은 결합하는 물질들의 상대적인 간격, 방향 및 위치가 적절하지 않으면 상호작용을 탐색할 수 없는 근본적인 문제점이 있다(Moshinsky et. al., Screen 8: 447, 2003). 나아가, 약효를 결정하는 살아 있는 세포내에서 약물 등의 저분자화합물과 질병인자 등의 분자 타겟의 결합을 분석하기가 여러 가지 기술상의 한계들 때문에 힘들다.
이러한 문제점을 극복하기 위해서, 세포내에서 약물과 질병인자를 포함한 분자 타겟 등 다양한 생리조절물질들간의 상호작용을 탐색하는 방법으로 자성나노입자에 약물을 직접 부착하여 그와 결합하는 질병인자 및 분자 타겟을 자석을 이용해서 자연 상태에서 끌어서 분리하는 방법이 있다. 자석을 이용함으로서 세포를 깨지 않고 세포내에서 질병인자 및 분자 타겟을 분리하는 방법으로 저명한 학술지(Won et. al., Science 309: 121, 2005 이후에 취소)에 발표되는 등 여러 가지 분석의 장점이 많이 있다.
그런데, 재현성 부족 등의 이유로 논문이 취소되는 등 상용화를 위한 기술의 완성도가 떨어진다. 이러한 재현성 부족 등의 문제점과 관련해서, 이 기술의 구현에서 뚜렷이 드러난 한계 및 문제점들 몇 가지만을 간단히 정리하면 다음과 같다.
첫째, 세포의 생물학적인 조건과 적절히 조화되는 자성나노입자를 화학적으로 합성하는 것이 용이치 않다. 대부분의 경우 세포내에 자연스레 퍼져서 분포하지 못하고 화학적으로 합성한 자성나노입자는 서로 뭉쳐져서 덩어리(aggregates)로 존재한다. 이에 따라서, 질병인자 및 분자 타겟과 약물의 결합을 제대로 분석할 수 없다.
둘째, 약물 등 베이트를 포함한 분석하고자 하는 물질 등 여러 가지 필요한 물질을 부가적으로 자성나노입자에 화학적인 방법 등을 통해서 부착해야 한다. 여기에서 부착된 여러 가지 물질들이 서로간의 방해(steric hindrance) 등 상호간섭 및 충돌현상이 흔히 나타난다. 따라서, 부착 물질의 종류와 숫자 및 특성에 따라 상당한 정성적 및 정량적인 분자 분석들과 함께 최적화된 자성나노입자를 합성해야 한다.
셋째, 이러한 모든 조건을 충족하는 자성나노입자를 화학적으로 합성했다고 하더라도, 세포내에 도입되어 세포질에 퍼지게 되면 감소되는 국소농도(local concentration)에 따라 자성이 감소하게 된다. 이에 따라서, 자석에 의해 끌리는 정도가 떨어져 결국 자석에 의해 분리가 용이하지 않는 경우가 대부분이다.
넷째, 이런 힘든 조건하에서 최종적으로 자석에 의해 잘 끌리는 특성과 크기가 균일한 자성나노입자를 화학적으로 합성함으로서 세포내에 도입된 대부분의 자성나노입자가 효과적으로 끌려야 한다. 이렇게 자석에 의해 끌리는 현상을 눈으로 쉽게 확인할 수 있어야 하는데, 이러한 최적화된 자성나노입자를 합성하는 것이 미래 나노기술의 최첨단 분야로서 선정될 만큼 유익성에 비해서 매우 힘든 기술이다. 이렇게 최적화되지 않으면 일부의 자성나노입자가 자석에 의해 끌리게 되고, 끌리지 않는 상당한 자성나노입자들로 인한 높은 백그라운드 때문에 눈으로 쉽게 분석 및 확인할 수가 없다.
다섯째, 이러한 여러 가지 복잡한 조건을 모두 충족시켰다고 하더라도, 세포내로 도입된 자성나노입자는 거의 대부분 소포체에 고립되어 있다. 따라서, 소포체를 파괴하는 용해물질(lytic agent)을 처리해서 질병인자들이 존재하는 세포질로 노출시켜야 한다. 그런데, 이러한 과정에서 적절한 조건을 찾지 못하면 상당한 독성(toxicity) 등 여러 부작용(side effect)을 나타내어 세포는 약효를 나타내는 본래의 세포 상황을 제대로 반영하지 못하는 어려움도 있다.
이러한 여러 가지 제반 문제점들을 극복하기 위해서, 본 발명은 위의 복잡한 특성을 모두 만족하는 합성하기 힘든 자성나노입자 대신에 세포에 존재하는 자기장분리단백질을 이용하여 물질의 상호작용을 탐색하는 방법을 발명하게 되었다. 이러한 자기장분리단백질을 이용하기 위해서, 세포에서 자기장에 의해 분리정제한 단백질을 체계적으로 프로테오믹스 기술을 통해서 새로이 규명했다.
나아가, 이러한 자기장분리단백질에 기반하여 물질의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 물질을 검출하는 방법 등으로의 활용할 수 있는 방법인 것이다. 따라서, 자기장에 의한 본래 자연적인 상태에서 파괴적이지 않은 조건하에 물질의 상호작용을 세포내에서 분석할 수 있어, 기존 기술들의 조절 및 분석상의 여러 가지 다양한 문제점들을 극복할 수 있는 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용 탐색방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 검출방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용 탐색 방법을 제공한다:
(i) 자기장분리단백질과 결합한 베이트물질을 세포 내에 도입하는 단계;
(ii) 상기 세포 내에 프레이물질을 도입하는 단계;
(iii) 상기 세포 내에 자성물질을 도입하는 단계; 및
(iv) 상기 세포에 자기장을 인가하기 이전 또는 이후의 상기 프레이물질의 위치를 토대로 상기 베이트물질과 프레이물질의 상호작용을 탐색하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 검출 방법을 제공한다:
(i) 자기장분리단백질과 결합한 베이트물질을 세포 내에 도입하는 단계;
(ii) 상기 세포 내에 프레이물질 및 표적후보물질을 도입하는 단계;
(iii) 상기 세포 내에 자성물질을 도입하는 단계; 및
(iv) 상기 세포에 자기장을 인가하기 이전 또는 이후의 상기 프레이물질의 위치를 상기 표적후보물질이 존재하지 않는 경우와 존재하는 경우를 서로 비교해서 상기 베이트물질과 프레이물질의 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적후보물질을 표적물질로 선정하는 단계.
본 발명에 따른 물질의 상호작용 탐색방법은 복잡한 자성나노입자 대신에, 세포에 존재하고 있는 자기장분리단백질을 이용함으로써, 생리조절물질의 상호작용을 인공 상태가 아닌 본래의 자연 상태에서 분석하여 유용하고, 약물의 분자 타겟 등 다양한 생리조절물질의 상호작용을 보다 용이하게 효율적으로 분석함으로써, 공지 기술들의 여러 가지 문제점들을 효과적으로 극복할 수 있다. 나아가, 스크리닝용 토대기술로서 다음의 장점들을 더불어 가지고 있다. 첫째, 용이한 분석 절차에 의해서 인위적인 조건이 아닌 생리적인 조건하에서 다양한 생리조절물질의 상호작용을 손 쉽게 스크리닝할 수 있고, 둘째, 자성에 이끌리는 신호를 세포 본래의 단백질을 이용했기에 변이(batch variation)없이 일관적으로 명백한 신호(clear readout)로 높은 재현성과 함께 손 쉽게 분석 및 스크리닝할 수 있으며, 셋째, 단일 세포 수준에서의 실시간으로 역동적인 분석 및 스크리닝이 가능하고, 넷째, 토대 기술로서 여러 가지 다양한 생리조절물질들의 분석 및 스크리닝을 체계적으로 빠르게 대량으로 프로테오믹스 수준에서 수행할 수 있어 유용하다.
도 1은 세포내에서 자기장에 의해 분리 및 규명한 단백질과 FKBP(베이트) 단백질의 융합단백질에 결합하는 라파마이신 약물(프레이 또는 표적물질)과 FRB(프레이)-EGFP 단백질이 자석에 의해 끌린 결과를 표로 정리한 것이다.
도 2는 도 1에서 정리된 결과들 중에 한 예이다. 자기장에 의해 분리한 LAMP1 또는 RAB5(자기장분리단백질)과 FKBP(베이트) 단백질의 융합단백질에 결합하는 라파마이신(프레이 또는 표적물질)과 FRB(프레이)-EGFP 단백질이 자석에 의한 끌림을 세포내에서 형광현미경으로 분석한 것이다. FKBP(베이트)와 라파마이신 약물(프레이 또는 표적물질), FRB(프레이)이 서로 결합함을 확인할 수 있다.
도 3는 도 1과 도 2의 결과를 토대로 세포내에서 생리조절물질의 상호작용을 분석하는 본 발명의 대표도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "생리활성물질"이란, 세포 및 몸의 다양한 생리적인 조절 역할을 하는 활성물질이라 정의할 수 있다. 이러한 생리활성물질은 동식물과 같은 천연물 또는 미생물 및 동식물 세포주의 대사산물로부터 분리추출 및 정제할 수도 있고 화학적인 합성에 의해서도 얻을 수 있다. 예를 들어, 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 또는 화합물(chemical compound) 등일 수 있다.
본원에서 “자성물질”이란, 화학적으로 또는 생물학적으로 합성한 자성나노입자 및 철 등으로 세포내에서 자기장으로 끌리는 자성을 띤 모든 물질을 총체적으로 지칭한다. 본 발명에서는 자기장에 의해 끌리는 기본적인 자성의 특성을 가지고 세포에 영향을 되도록 주지 않기 위해서 5nm 미만 크기의 일반적이고 단순한(plain) 자성나노입자을 사용할 수 있다.
본 발명에서 “자기장분리단백질”이란, 자성물질을 함유한 세포에서 자기장에 의해 분리정제 및 동정한 다수의 단백질들 중에 본 발명에서의 물질의 상호작용 탐색이 가능한 단백질을 지칭한다. 본 발명에서는 자성나노입자를 세포에 처리한 이후에 세포로부터 자기장에 의해 분리정제한 단백질을 프로테오믹스 기술을 이용해서 동정했다. 동정된 자기장분리단백질은 자체로서 자성을 띠지 않고 자성나노입자 등 자성물질과 직접적인 결합은 없는 것으로 판명되었다.
본 발명에서 "베이트(bait)물질"이란, 다른 생리활성물질과의 상호작용을 탐색하는데 이용되는 생리활성물질을 의미한다.
본 발명에서 "프레이(prey)물질"이란, 상기 "베이트"의 상호작용 파트너로서 탐색(분석) 또는 검출하고자 하는 대상이 되는 생리활성물질을 의미한다.
본원에서 "매개물질"이란, 물질의 상호작용 및 결합을 매개하는 역할을 가지는 동일한 또는 상이한 이중/다중 복합체를 이루는 물질이다. 이러한 복합체는 무조건적으로 항상 또는 특정 신호에 의해 조건적으로 형성될 수 있다. FK506 화합물-FKBP 단백질 등 화학적 또는 생물학적인 합성에 의한 물질 등을 총망라한다.
본원에서 "표적물질“이란, 베이트물질과 프레이물질 등 상호작용에 관련된 물질의 결합을 촉진 또는 저해하는 물질이다. FKBP 단백질-FRB 단백질의 상호작용을 촉진하는 라파마이신 화합물 또는 FKBP 단백질-FK506 화합물의 상호작용을 저해하는 라파마이신 화합물이 그 간단한 예다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은, 자기장분리단백질, 베이트물질 및 프레이물질을 세포내에 도입한 다음, 자기장을 인가하여, 물질의 상호작용을 탐색하는 방법에 관한 것이다.
우선, 본 발명의 구체적인 제1 태양은, 다음의 단계를 포함하는, 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용 탐색 방법에 관한 것이다:
(i) 자기장분리단백질과 결합한 베이트물질을 세포 내에 도입하는 단계;
(ii) 상기 세포 내에 프레이물질을 도입하는 단계;
(iii) 상기 세포 내에 자성물질을 도입하는 단계; 및
(iv) 상기 세포에 자기장을 인가하기 이전 또는 이후의 상기 프레이물질의 위치를 토대로 상기 베이트물질과 프레이물질의 상호작용을 탐색하는 단계.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 검출 방법에 관한 것이다:
(i) 자기장분리단백질과 결합한 베이트물질을 세포 내에 도입하는 단계;
(ii) 상기 세포 내에 프레이물질 및 표적후보물질을 도입하는 단계;
(iii) 상기 세포 내에 자성물질을 도입하는 단계; 및
(iv) 상기 세포에 자기장을 인가하기 이전 또는 이후의 상기 프레이물질의 위치를 상기 표적후보물질이 존재하지 않는 경우와 존재하는 경우를 서로 비교해서 상기 베이트물질과 프레이물질의 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적후보물질을 표적물질로 선정하는 단계.
즉, 본 발명에서는 세포에서 분리한 자기장분리단백질과 결합한 베이트물질 및 프레이물질을 세포내로 도입한 다음, 자성물질을 도입하고, 자기장을 인가하기 이전 또는 이후에, 프레이물질의 상대적인 위치를 측정함으로써 베이트와 프레이물질간의 상호작용을 판단할 수 있고, 이러한 위치상의 특성을 이용하여, 물질의 상호작용 및 이를 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 베이트물질, 프레이물질 및 표적후보물질은 생리활성물질인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 자기장분리단백질은 세포에 존재하고, 자기장에 의해 분리정제 및 동정된 단백질인 LAMP1 또는 RAB5인 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 자기장분리단백질은 자체로서 자성을 띠지 않고 자성나노입자 등 자성물질과 직접적인 결합은 없는 것으로 판명되었다.
본 발명에 있어서, 자성물질은 세포에 영향을 주지 않는 5nm 미만 크기의 자성물질이 바람직하며 철 등 세포내에서 자기장에 의해 끌리는 기본적인 특성을 가지는 자성물질이면 모두 이용가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 베이트물질은 직접 또는 추가로 매개물질을 통해서 자기장분리단백질과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 매개물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질, 상기표적후보물질, 상기 매개물질, 상기 자성분리단백질 및 상기 자성물질 사이의 결합은 정전기적, 물리적, 화학적 또는 생물학적 결합인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 프레이물질은 자기장에 의한 움직임을 관찰하기 위해서 형광성 표지물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 형광성 표지물질은 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광염료들; CFP, GFP, YFP 및 RFP 또는 테트라시스테인(tetracystein) 및 할로(Halo) 등의 형광단백질 또는 형광성모티프/도메인/펩타이드들; 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 상기 베이트물질, 상기 프레이물질, 상기표적후보물질, 상기 매개물질, 상기 자성분리단백질 및 상기 자성물질은 각각 또는 적절히 결합 및 융합해서 일반적으로 널리 알려진 방법에 의해 용이하게 상기 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 직접 도입, 세포전달성 융합촉진 펩타이드(fusogenic peptide), 지질 전달체 또는 이들의 결합체를 이용한 도입; 전기(electroporation)을 이용한 도입; 자기장(magnetofection)을 이용한 도입 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택되는 방법 등에 의해 수행될 수 있음은 자명하다.
본 발명에 있어서, 상기 매개물질은 동일한 또는 상이한 이중/다중 복합체를 이루는 물질로서 상호작용을 하는 다양한 물질 파트너를 이용할 수 있다. 구체적인 예로서, 화합물과 단백질 또는 단백질과 단백질 등의 다양한 형태로 상호작용한다고 알려진 파트너로서 FK506 화합물-FKBP 단백질, AP1510 화합물-FKBP 단백질, IkBα 단백질-RelA 단백질, MTX 화합물-DHFR 단백질, 라파마이신 화합물-FKBP 단백질-FRB 단백질, TNFa 생리적인 신호에 따라 조절되는 IkBα 단백질-bTrCP 또는 IKKb 단백질 등의 상호작용 등을 들 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 세포에서 자기장에 의해 분리되는 단백질 정제 및 분석
실시예 1-1. 자성나노입자의 제조
~2 nm 크기의 일반적인 자성나노입자을 기존의 방법을 토대로 제조했다(Materials Letters 61: 3124, 2007 ; J. of Bioanal. Biomed. S5: 006. doi:10.4172/1948-593X.S5-006, 2012 ; Nanoscale Research Letters 7: 144, 2012 ; Angew. Chem. Int. Ed. 46: 1222, 2007 ; Russian Chemical Reviews 74: 489, 2005). 자성나노입자를 세포에 처리하기 이전에 세포내 도입 펩타이드(서열번호 1: GRKKRRQRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG)와 혼합해서 반응시켰다.
실시예 1-2. 세포로부터 자기장에 의한 단백질 분리정제 및 규명
미리 배양된 헬라세포(ATCC)를 세척한 이후에, Opti-MEM(Invitrogen) 배지에서 자성나노입자와 반응시켰다. 반응시킨 세포를 37 ℃에서 시간별로 12시간 동안 배양하여 자성나노입자를 세포내로 도입했다. 시간별로 자성나노입자가 도입된 세포를 획득한 이후에, PBS로 세척하고 단백질분해 억제제의 칵테일(Roche)을 처리했다. 처리한 세포를 주사기를 이용해서 기계적으로 분쇄한 이후에, 세포 찌꺼기 등을 원심분리기를 이용해서 제거했다. 상층액에서 자석을 이용해서 단백질 등을 분리정제했다(Proc. Natl. Acad. Sci. 107: 13347, 2010 ; BioMag. Res. and Tech. 2: 7, 2004). 분리정제한 단백질을 EZQ 키트(Invitrogen)을 이용해서 정량한 이후에, 프로테오믹스 분석법인 2D-전기영동(Invitrogen)에 이은 MALDI-TOF 질량분석(Agilent)을 이용해서 단백질을 동정 및 규명했다. 도 1은 이런 과정을 통해서 자기장에 의해 분리정제 및 동정규명된 여러 가지 단백질들 중에서 실시예 2에서처럼 FKBP(베이트) 단백질과의 융합단백질에 라파마이신(프레이 또는 표적물질)과 FRB(프레이)-EGFP 단백질이 결합하여 자석에 의해 끌릴 수 있는 일부 단백질들을 표로 정리한 것이다.
실시예 2. 자기장에 의해 분리된 단백질을 이용해서 약물과 단백질 등 생리조절물질의 상호작용을 세포 내에서 분석
실시예 1-2에서 자기장에 의해 분리 및 규명된 단백질들을 이용해서 아래의 방법으로 물질의 상호작용을 세포내에서 분석할 수 있다. 한 예로서 LAMP1 또는 RAB5(자기장분리단백질)에 FKBP(베이트) 단백질을 융합한 단백질과 함께 FRB(프레이)-EGFP 단백질을 Liopfectamone(Invitrogen)을 이용해서 배양된 헬라세포주에 도입해서 발현시켰다. 발현시킨 헬라세포를 세척한 이후에, Opti-MEM(Invitrogen) 배지에서 실시예 1-1에서 제조한 자성나노입자와 1~2시간 동안 반응시켰다. 이어서 헬라세포에 라파마이신 약물(프레이 또는 표적물질)를 추가로 1시간 동안 처리하고 자석에 의한 형광단백질의 위치를 형광현미경에 의해서 추적 관찰했다. 자석에 의한 끌린 결과를 통해서 라파마이신 약물과 표적단백질(FKBP, FRB)들의 상호작용을 세포내에서 확인할 수 있었다(도 2). 기존의 방법(Won et. al., Science 309: 121, 2005 이후에 취소)에 비해 4~5배의 높은 재현율과 함께 FKBP(베이트)-라파마이신(프레이 또는 표적물질)-FRB(프레이)의 상호작용을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> T&K BioInnovation Inc. <120> Magnetic Biosynthetic Method to Analyze Molecular Interactions Inside Cells <130> P17-B123 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Cell-penetrating peptide <400> 1 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 30

Claims (10)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용 탐색 방법:
    (i) 자기장분리단백질과 결합한 베이트물질을 세포 내에 도입하는 단계;
    (ii) 상기 세포 내에 프레이물질을 도입하는 단계;
    (iii) 상기 세포 내에 자성물질을 도입하는 단계; 및
    (iv) 상기 세포에 자기장을 인가하기 이전 또는 이후의 상기 프레이물질의 위치를 토대로 상기 베이트물질과 프레이물질의 상호작용을 탐색하는 단계.
  2. 다음 단계를 포함하는, 자기장분리단백질을 이용한 물질의 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적물질의 검출 방법:
    (i) 자기장분리단백질과 결합한 베이트물질을 세포 내에 도입하는 단계;
    (ii) 상기 세포 내에 프레이물질 및 표적후보물질을 도입하는 단계;
    (iii) 상기 세포 내에 자성물질을 도입하는 단계; 및
    (iv) 상기 세포에 자기장을 인가하기 이전 또는 이후의 상기 프레이물질의 위치를 상기 표적후보물질이 존재하지 않는 경우와 존재하는 경우를 서로 비교해서 상기 베이트물질과 프레이물질의 상호작용을 저해(억제) 또는 촉진(유도)하는 표적후보물질을 표적물질로 선정하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 표적후보물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 자기장분리단백질은 세포에 자성물질을 도입하고 자기장에 의해서 분리정제 및 동정한 단백질로서 자체는 자성물질이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 자기장분리단백질은 LAMP1 또는 RAB5 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베이트물질은 직접 또는 추가로 매개물질을 통해서 자기장분리단백질과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 매개물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질(lipid), 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질, 상기표적후보물질, 상기 매개물질, 상기 자기장분리단백질 및 상기 자성물질 사이의 결합은 정전기적, 물리적, 화학적 또는 생물학적 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프레이물질은 형광성표지물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 형광성 표지물질은 형광염료, 형광단백질 또는 형광나노입자인 것을 특징으로 하는 방법.
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