KR20130018194A - 물질의 고집적 디스플레이를 토대로 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서 표적물질과의 상호작용을 정량적으로 감지 및 효과적으로 표지하는 방법 - Google Patents

물질의 고집적 디스플레이를 토대로 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서 표적물질과의 상호작용을 정량적으로 감지 및 효과적으로 표지하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노고단위복합체(nano-assembly matrix)에 고집적(high density)로 물질을 디스플레이(display)함으로써, 고집적 표지물질에서 효과적으로 발생하는 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서, 고집적 탐색물질들 사이에서 효과적으로 발생하는 상호작용을 정량적으로 감지 및 검출하고, 고집적 탐색물질과 효과적으로 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 즉, 고집적 디스플레이를 토대로 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 일어나는 다양한 생리활성물질들 사이의 상호작용을 정량적으로 감지하는 방법 그리고 이들과 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지하는 방법에 관한 것이다.

Description

물질의 고집적 디스플레이를 토대로 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서 표적물질과의 상호작용을 정량적으로 감지 및 효과적으로 표지하는 방법{High Density Molecular Display Methods for Quantitatively Tracking and Labelling Target Molecular Interactions Using Energy Transfer and Signal Alterations}
본 발명은 나노고단위복합체(nano-assembly matrix)에 고집적(high density)로 물질을 디스플레이(display)함으로써, 고집적 표지물질에서 효과적으로 발생하는 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서, 고집적 탐색물질들 사이에서 효과적으로 발생하는 상호작용을 정량적으로 감지 및 검출하고, 고집적 탐색물질과 효과적으로 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 즉, 고집적 디스플레이를 토대로 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 일어나는 다양한 생리활성물질들 사이의 상호작용을 정량적으로 감지하는 방법 그리고 이들과 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 다양한 생리활성물질들 사이의 역동적인 상호작용에 의해서 여러 가지 생리적인 기능이 조절된다. 이러한 상호작용이 적절히 일어나지 못하면 문제가 생겨 질환이 발생한다. 가령, 생체내의 단백질은 다른 단백질과 상호작용함에 의해 그 기능을 나타낸다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 상호작용한다. 일반적으로 두 개의 단백질 사이의 상호작용은 이들 단백질이 기능적으로 관련되어 있음을 강하게 암시하며, 단백질의 특정부위에 특이적으로 상호작용하는 생리활성화합물은 그 단백질의 활성을 조절함에 의해 예컨대, 질환 관련 단백질의 경우 질환을 진단, 예방, 치료 또는 경감시킬 수 있는 치료제로서의 개발가능성을 제시한다.
따라서 신약개발 분야에서는 이미 그 기능 및 특성이 밝혀진 물질인 "베이트(bait)"와 탐색 및 검출 대상이 되는 상호작용 파트너인 "프레이(prey)"의 상호작용을 확인함으로써 신규 표적단백질을 검출하거나 신약후보물질로서 생리활성물질을 스크리닝하는 다양한 방법이 연구되고 있다. 이와 같이, 상호작용 분석을 통한 새로운 표적단백질의 동정 및 분리는 약물의 활성, 효과 및 부작용 등에 대한 유용한 정보를 수득하기 위한 매우 중요한 연구개발과제로 간주된다. 또한, 표적단백질은 생물학적 경로 및 전달체계에 대한 이해를 증진시키고 기초 세포조절 및 질환 메커니즘(mechanism)에 대한 정보를 제공하며, 이러한 정보는 표적단백질과 상호작용하는 생리활성 화합물에 대한 탐색 및 검출을 통하여 신약 개발 및 종래 약물의 개량 및 신규 약제학적 용도의 발견 등에 매우 놀랍고도 강력한 수단이 된다.
의약계는 인간의 다양한 질환에 대한 보다 안전하고 효과적인 치료법을 개발하기 위한 도전에 직면해 있지만, 현재 사용되고 있는 많은 약물들은 그들의 표적단백질 및 분자적 타겟(molecular target) 규명 없이 질환 모델에서의 생물학적 효능에 의해 규정되어지고 있는 실정이다(Burdine, L. et al., Chem. Biol. 11: 593, 2004). 게다가, 생물적 활성을 지닌 천연물이 약물 개발에 중요한 원천이 되고 있으나, 그들 활성의 양상은 대부분 알려져 있지 않고 있다(Clardy, J. et al., Nature 432:829, 2004). 그들의 생리적 대상 및 분자적 타겟에 대한 규명은 치료적 효과 및 역효과에 대한 이해에 필수적일 뿐만 아니라, 이에 의해, 보다 개선된 2세대 치료학의 발전을 가능하게 할 것이다. 또한, 임상적으로 증명된 화합물의 새로운 타겟을 발견하는 일은 치료상의 새로운 응용에 기여하게 될 것이다(Ashburn, T.T. et al., Drug Discov. 3:673, 2004).
세포 기반의 스크리닝 방법을 다루는 화학생물학 분야에서 "타겟 스크리닝"은 거대한 화합물 라이브러리로부터 바람직한 표현형에 따라 저분자화합물들을 규명하는데 사용된다(Strausberg, R.L. at al., Science 300:294, 2003; Stockwell, B.R. Nature 432:846, 2004). 상기 스크리닝의 큰 이점에도 불구하고, 이러한 접근은 발견된 저분자화합물을 규명하기에는 쉽지 않은 방법이다. 그러나, 단백질(또는 저분자화합물)-단백질 상호작용과 같은 다양한 세포내 분자 상호작용의 효과적인 검출은 동적인 생물학적 프로세스 및 조절 네트워크의 이해에 필수적이기 때문에, 이러한 타겟 동정 기술의 발달은 유전학, 단백질학 및 시스템 생물학을 포함한 다양한 생명과학 분야에 있어서 매우 중요하다.
타겟 스크리닝 분야에서, 친화성 크로마토그래피(Phizicky, E.M. et al., Microbiol. Rev. 59:94, 1995; Mendelsohn, A.R. et al., Science 284:1948, 1999); 단백질/저분자화합물 마이크로어레이; 파지 디스플레이(Sche, P.P. et al., Chem. Biol. 6:707, 1999); 효모 2종-/3종-하이브리드 어세이(Licitra, E.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12817, 1996); 발현 프로파일링; 및 효모균주 이종결실(heterologous deletions)이 일어난 효모균주의 평행분석(Zheng, O. et al., Chem. Biol. 11: 609, 2004) 등과 같은 몇몇의 기술들이 생리활성 분자들간 상호작용의 분석을 위해 활용되어 왔다.
그러나, 이러한 모든 기술들은 하이-백그라운드(high background), 가양성(false positives), 낮은 민감도(low sensitivity), 단백질 발현 후의 부적절한 폴딩(inappropriate folding), 간접성(indirectness), 단백질 발현 후의 변형 부족, 또는 세포적 적합성이 포함된 제한된 타겟 접근성 등과 같은 다양한 문제들로 어려움을 겪고 있다. 또한, 인 비트로(in vitro) 결합조건 또는 비-포유동물 세포와 같은 인위적인 환경의 사용은 때때로 실험 결과에 오류를 초래한다.
그러므로, 생리학적으로나 약학적으로 높은 민감도 및 선택도가 고려된 조건에서 생리활성물질들 사이의 상호작용을 직접적으로 조사하는 것이 가장 바람직하다. 종합적으로 볼 때, 상기와 같은 기반기술을 발전시키는 것이 종래 기술과 비교하여 여러가지 이점을 제공하는데 매우 중요하다고 할 수 있다.
첫째, 생리학적으로나 약학적으로 관련된 생리활성물질 및 분자들간 상호작용을 탐색하는 것은 인위적인 실험적 환경에 따른 결과물이 이끌어내는 오류를 크게 감소시킬 수 있고, 둘째, 전체 발현 프로파일 또는 복잡한 생물학적 표현형에 의존하는 여타 간접적 해독 방법과 달리, 생리활성물질 및 분자 상호작용을 명확한 해독 시그널로 직접적으로 해석할 수 있게 한다. 따라서, 생리활성물질 및 분자의 타겟에 대하여 내재된 가(false) 양성/음성 또는 오류를 일으키기 쉬운 추론 등이 미연에 방지될 수 있다. 셋째, 생리활성물질 및 분자들간 상호작용에 있어서 동적인 단일세포 분석이 가능하다. 개개의 살아있는 세포들의 동적 분석(dynamic analysis)은 생리학적 및 약학적으로 광범위한 범위에 걸쳐, 이종간 비동시적으로 일어나는 세포내 프로세스를 탐색할 수 있는 효과적인 방법을 제공한다.
결국, 상기 기반기술은 다른 조직들 및 질환 상태의 넓은 범위에 걸쳐, 살아있는 세포내에서 생리활성물질 및 분자들간의 상호작용(예를 들어, 생리활성 저분자화합물와 단백질간의 상호작용 등)의 다양성을 분석하는데 사용될 수 있는데 많은 한계를 가지고 있으므로 새로운 기반기술의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 한국공개특허 제2009-0018585호에서 다양한 생리활성물질들 사이의 역동적인 상호작용에 따른 나노고단위복합체를 형성하는지(nano-assembly matrix formation) 여부 또는 나노고단위복합체에서 같이 위치하는지(co-localization on nano-assembly matrix) 여부를 이미징을 통해 분석함으로 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색 및 검증하는 방법을 개시하였다. 이 방법은 정성적인 방법으로 현미경 등을 통한 이미징을 통해 상호작용 여부 등을 탐색 및 검증할 수 있다.
한편, 세포 안에서는 signalsome, 생체 안의 세포 밖에서는 exosome 등의 "-some" 또는 "complex" 등의 형태로 다양한 생리적인 (고단위)복합체가 존재하고 있다. 이러한 생리적인 고단위복합체에 하나 또는 여러 종류의 관련된 단백질 등 생리활성물질들이 함께 존재함으로서 세포 또는 생체 안의 특정 생리적인 기능이 효과적으로 조절됨이 규명되었다. 이러한 복합체를 토대로 매개되는 효율적인 생리적인 조절에서 처럼 세포 또는 생체내에서 대부분의 생리적인 조절에 다가적인 상호작용(multi/poly-valent interactions)가 매우 중요한 역할을 함이 규명되었다( Mammen, M. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37:2755, 1998; Kiessling, L.L. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 45:2348, 2006). 즉, 단백질 등 대부분 생리활성물질들 사이의 상호작용에서 단가적인 결합(mono-valent interactions)보다 다가적인 결합(multi/poly-valent interactions)이 주로 중요한 역할을 수행한다.
이에, 본 발명자는 이러한 생리적인 복합체의 고집적 특성을 토대로 추가적인 연구를 수행한 결과, 눈으로 일일이 분석하는 이미징을 통한 정성적인 분석에서 나아가 정량적으로 분석 및 탐색이 가능하고 또한 보다 효과적으로 감지 및 표지하는 새로운 발명을 하게 되었다. 즉, 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 표지물질 또는 표지물질들 사이에서 효과적으로 발생되는 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정할 경우, 가령 한 가지 예로 형광 분석 또는 형광 전이(FRET; fluorescence resonance energy transfer) 등을 포함한 방법으로 물질의 상호작용을 보다 정성적 및 정량적으로 측정 및 판별할 수 있다. 이러한 분석 방법과 더불어, 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이를 통해서 탐색물질들 사이의 상호작용의 효율을 증가시켜서 물질의 상호작용을 보다 민감하게 정성적 및 정량적으로 측정 및 판별할 수 있다. 따라서, 표지가 용이하고 이러한 에너지 신호의 정량적인 분석을 통해 Flow Cytometry, FACS(fluorescence associated cell sorting) 등을 포함한 방법으로 물질의 상호작용을 개별적으로 보다 용이하게 직접 분리 및 동정할 수 있고, 나아가 탐색 및 분석의 고속도(high throughput)을 향상시킬 수도 있는 여러 가지 장점들이 있다. 또한 이러한 에너지 신호의 전달 및 변화를 토대로 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 탐색물질과 상호작용의 효율성이 증가된 특정 표적물질을 민감하게 감지 및 표지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 특정 생리활성물질인 "베이트"를 고집적으로 디스플레이하여 이와 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지 또는 분리 동정하는 새로운 방법을 제공하는데 있다. 아울러, 본 발명은 특정 생리활성물질인 "베이트"와 탐색 및 검출 대상의 생리활성물질인 "프레이" 사이의 상호작용을 정량적으로 감지 및 탐색하는 방법 및, 상기 "베이트"와 상호작용하는 "프레이"의 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 "베이트"와 "프레이"의 상호작용을 억제(blocking), 저해(inhibiting), 촉진(activating) 또는 유도(inducing)하는 표적물질을 탐색하고, 목적하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합(fusion)된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질을 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 나노고단위복합체 형성물질 및 프레이물질 라이브러리를 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질 라이브러리를 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 라이브러리 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 프레이물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 베이트물질을 상기 형성된 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질과 베이트물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질의 질환의 표적, 이미징 또는 진단 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계;
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 프레이 라이브러리와 반응시키는 단계; 및
(iv) 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합된 프레이물질을 표적물질로서 표지하고, 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 질환을 표적, 이미징 또는 진단하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 프레이 라이브러리와 반응시키는 단계; 및 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질 및/또는 매개조절물질과 상호작용을 통하여 결합된 프레이물질을 표적물질로서 표지하고, 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 질환을 표적, 이미징 또는 진단하는 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질의 질환의 표적, 이미징 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하여, 상기 제1매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 표적 후보물질의 존재 하에서, 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 나노단위복합체에 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(ii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 베이트물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 표적 후보물질의 존재 하에서 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명에 따르면, 본 발명의 고집적 디스플레이를 토대로 물질의 상호작용 탐색 방법을 이용할 경우, 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 물질을 토대로 보다 민감하고 보다 용이하게 물질의 상호작용을 정성적이고 정량적으로 판별할 수 있다. 그리고, 나노고단위복합체에 물질의 고집적 디스플레이를 토대로 세포 또는 생체 안에서 물질의 국소농도(local concentration)이 증가되고; 표적물질 등과의 다가적인 상호작용(multi/poly-valent interactions)을 효과적으로 유도함으로써 보다 민감하고 보다 용이하게 특정 표적물질을 감지 및 표지할 수 있다. 또한, Flow Cytometry, FACS(fluorescence associated cell sorting) 등으로 물질의 상호작용를 용이하게 분리 및 동정할 수 있다. 나아가, 탐색 및 분석의 고속도(high throughput)을 향상시킬 수도 있는 장점들이 있다.
또 다른 장점으로서, 기존의 에너지 전달, FRET은 상호작용하는 물질의 일대일(1:1)의 분석인 반면에 본 발명을 통해서 나노고단위복합체에 여러 물질을 고집적시킴으로서 일대다 또는 다대다의 분석을 통해서 생리적인 조건하에서 흔히 관찰되는 여러 개의 물질의 복합적인 상호작용을 분석할 수 있는 장점도 있다.
본 발명자들의 한국공개특허 제2009-0018585호에서는 나노고단위복합체를 형성하는지(nano-assembly matrix formation) 여부 또는 나노고단위복합체에서 같이 위치하는지(co-localization on nano-assembly matrix) 여부를 이미징하여 정성적으로 분석함으로 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색 및 검증하는 방법을 개시하였다. 이 기존 발명에서 나아가 본 발명에서는 상기에 설명한 여러 가지 장점들을 포함해서, 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이 시킨 물질을 통해서 물질의 상호작용을 보다 민감하게 정성적 및 정량적으로 측정 및 판별할 수 있고, 또한 이를 토대로 특정 표적물질을 보다 용이하게 감지 및 표지할 수 있다는 사실을 확인할 수 있게 되었다.
따라서 본 발명은 생리활성물질들 사이의 상호작용 탐색 및 감지를 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)에서 단일세포 수준에서 매우 효과적으로 수행할 수 있으므로, 신약개발을 위한 표적단백질 및 신약후보물질의 탐색 및 검출뿐만 아니라 기존의 약물을 개량하거나 새로운 약제학적 용도를 발견하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다. 나아가 특정 표적물질을 효과적으로 감지 또는 표지할 수 있으므로, 진단제 (diagnostics) 개발에도 매우 유용하게 이용될 수 있다. 나아가 특정 표적물질을 효과적으로 감지 또는 표지해서 진단하고 나아가 치료도 할 수 있으므로, 치료진단제(theragnostics) 개발에도 매우 유용하게 이용될 수 있다. 또한 효율적으로 표적물질과 상호작용해서 결합할 수 있기에 다양한 물질의 결합용(binding agent), 포착용(가령, 중금속 흡착제, chelating agents), 분리 정제용(purification platforms), 겔화제(gelling agents) 등에 유용하게 사용될 수 있다. 생체와 관련해서 몇 가지 유용한 예를 들면, 고집적 디스플레이된 물질들의 그 일부 예들로써 항체, 항원 및 에피톱(epitope), 바이러스 단백질 및 펩타이드(HIV Tat, HBV, SARS 단백질 및 펩타이드 등), 질병 세포 특이 수용체 및 마커 결합 단백질 및 펩타이드(disease cell-specific receptor or marker protein-targetting protein/peptide), 치료 수용체 결합 단백질 및 펩타이드 (therapeutic receptor-binding protein/peptide), 치료 단백질 및 펩타이드(therapeutic protein/peptide), 헤모글로빈, Gd3+ 이온, 치료제 약물, 은 농축 펩타이드(silver condensing peptide), 금속 청소 펩타이드(metal scavenging peptide) 등의 여러 특이한 종류의 고집적 디스플레이된 물질에 따라 그와 상호작용하는 세포 또는 생체내의 표적물질의 효율이 증가되어 표적제(targeting agents), 진단제(diagnostics), 이미징용 물질(imaging agents) 뿐만 아니라, 백신(vaccines), 치료제(therapeutics) 등의 개발 등에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 매개(조절)물질 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도될 때 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 2는 제1매개(조절)물질 A, B, C간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되면서, 제2매개(조절)물질 D, E, F간의 상호작용에 의해 탐색물질 X가 형성된 나노고단위복합체에 결합할 때, 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 D와 E와 F와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N, X, Y, A, B, C, D, E, F 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 3 (A)와 (B)는 나노단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 4 (A), (B) 및 (C)는 X 또는 X와 X간 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되고 Y와의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다 (X와 X'와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 베이트물질 이용). N, X, X', A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 5 (A), (B) 및 (C)는 X 또는 X와 X'간의 상호작용이 각 탐색물질에 결합된 매개(조절)물질인 A 및 B에 의하여 또는 A, B 및 C에 의하여 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되고 Y와의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 X'와 A와 B와 C는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 베이트물질 이용). N, X, X', A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 6은 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 7 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 8 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질; (A) X가 서로 상호작용이 없는 경우, (B) X가 서로 상호작용이 있는 경우). N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 9 (A)와 (B)는 페리틴 또는 DPS 단백질의 자기조립에 의하여 형성되는 나노크기의 단위복합체 구조이다.
도 10은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(CFP)-FT과 FRB-표지물질(YFP)-FT의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 11은 헬라세포에서 페리틴 단백질(FT)로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-FT의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 12는 헬라세포에서 페리틴 단백질(FT)로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-FT의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 13은 헬라세포에서 페리틴(FT) 및 DPS 단백질로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 14는 헬라세포에서 페리틴(FT) 및 DPS 단백질로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 15는 헬라세포에서 페리틴(FT) 및 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-FT을 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다. 상호작용이 없기에 FRET 이미징이 되지 않는다.
도 16은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질로부터 제1매개(조절)물질인 FKBP(F36M)2에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS의 상호작용을 제2매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 17은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-FT과 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 18은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-FT과 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 19는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 20은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 21은 헬라세포에서 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS와 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 22는 헬라세포에서 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS와 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 23은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(ECFP)-FT과 FKBP-표지물질(EYFP)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 24는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체를 형성함에 따라 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 DHFR-표지물질(mRFP)-FT과 methotrexate-표지물질(fluorescein)의 상호작용에 따른 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 25는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mRFP)-FT과 FRB-표지물질(EGFP)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 26은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 표지물질(CFP)-FT과 RelA-표지물질(YFP)의 상호작용과 IkBa-표지물질(CFP)-FT과 RelA-표지물질(YFP)의 상호작용에 따른 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 27은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-FKBP-표지물질(mCerulean)-FT이 매개(조절)물질(rapamycin)와 매개(조절)물질의 억제제(FK506)의 존재여부에 따라 나노고단위복합체 형성 신호의 분포, 세기, 크기 및 숫자 결과를 분 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 28은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 DHFR-표지물질(mRFP)-FT이 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 DHFR과 methotrexate-표지물질(fluorescein) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 29는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-/FKBP-표지물질(mRFP)-FT과 IkBa-표지물질(ECFP)-FT가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 IkBa와 RelA-표지물질(YFP) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 30은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-/FRB-표지물질(mRFP)-FT과 DHFR-표지물질(mRFP)-FT이 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 DHFR과 methotrexate-표지물질(fluorescein) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 31은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)1~5-표지물질(mRFP)-FT이 매개(조절)물질 FKBP(F36M)의 숫자(1~5), FK506의 존재 유무에 따라 나노고단위복합체 형성 신호의 세기 및 크기 변화를 분 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 32는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)2-표지물질(mRFP)-FT과 FRB-표지물질(EGFP)가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 FRB와 FKBP 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 그리고 초 간격으로 분석한 결과이다.
도 33은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)2-표지물질(mRFP)-FT과 IkBa-표지물질(ECFP)-FRB가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 IkBa와 RelA-표지물질(EYFP) 사이의 상호작용 신호 변화를 분 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 34는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)2-표지물질(mRFP)-FT과 DHFR-표지물질(mRFP)-FT가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 DHFR과 methotrexate-표지물질(BodipyFL) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 35는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 초기 앤도좀 상호작용 물질(RAB5A)을 이용해서 초기 앤도좀 표적물질을 DAPI에 의한 핵 염색과 함께 감지 및 표지한 이미징 사진이다.
도 36은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 후기 앤도좀 상호작용 물질(RAB7A)을 이용해서 후기 앤도좀 표적물질을 DAPI에 의한 핵 염색과 함께 감지 및 표지한 이미징 사진이다.
도 37은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 골지체 상호작용 물질(GALNT2)을 이용해서 골지체 표적물질을 DAPI에 의한 핵 염색과 함께 감지 및 표지한 이미징 사진이다.
도 38은 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 물질을 이용해서 그와 상호작용하는 표적물질을 효과적으로 감지 및 표지하는 모식도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서 "생리활성화합물"이란 생체 내에서 단백질, 핵산, 당 또는 지질 등을 포함한 생체물질과 결합하여 이들의 기능 또는 활성을 조절하는 화합물을 의미한다. 이러한 생리활성화합물은 유기체로부터 추출하거나 화학적 합성에 의해 수득된다. 예를 들어, 장기 이식 시 발생하는 면역거부반응을 경감시키기 위해 사용되는 "사이클로스포린 A"(Novartis AG) 및 "FK506"(Fujisawa)을 비롯하여 많은 항생물질들(antibiotics)이 미생물, 식물 또는 해양 생물로부터 분리되었다. 이와 같은 천연 또는 합성 생리활성화합물은 이것의 약리활성을 테스트하고, 동물모델 및 사람모델을 사용한 임상시험을 거쳐 하나의 신약으로 개발된다.
본 발명에서 "생리활성물질"이란, 생물이 생을 영위함에 있어서 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 등의 조절 역할을 하는 물질이라 정의할 수 있다. 이러한 생리활성의 물질은 동식물과 같은 천연물로부터 얻거나 미생물 및 동식물 세포주의 대사산물로부터 추출 정제 할수도 있고 화학합성에 의해서도 얻을수 있다. 생리활성물질은 예를 들어, 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 또는 화합물(chemical compound) 등일 수 있다.
본 발명에서 "베이트(bait) 물질"이란, 다른 생리활성물질과의 상호작용을 탐색하는데 이용되는 생리활성물질을 의미한다.
본 발명에서 "프레이(prey) 물질"이란, 상기 "베이트"의 상호작용 파트너로서 탐색(분석) 또는 검출하고자 하는 대상이 되는 생리활성물질을 의미한다.
본 발명에서 "표적물질"이란 검출하고자하는 대상이 되는 물질을 총칭하여 일컫는 용어로서, 목적하는 바에 따라 "베이트"와 상호작용하는 파트너인 프레이물질을 표적 물질로 할 수도 있고, 상기 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 촉진(activating) 또는 유도(inducing)하거나 억제(blocking) 또는 저해(inhibiting)하는 물질을 표적물질로 할 수도 있다. 즉, 규명하고자 하는 대상이 되는 모든 물질을 포함한다. 그 중에서 베이트와 프레이 물질 간의 상호작용을 억제 또는 저해하는 물질을 '저해물질'이라고 정의하고, 촉진 또는 유도하는 물질을 '촉진물질'라고 정의한다.
본원에서 "조절 물질“이란 조절하고자 하는 대상이 되는 세포 내 기능을 매개하는 물질과 직접 또는 간접으로 관련된 또는 상호작용하는 물질을 일컫는 용어로서, 목적하는 바에 따라 탐색물질이 조절 물질이 될 수도 있고, 탐색물질과 결합하여 상호작용하는 물질을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 세포 내 기능을 촉진(activating), 유도(inducing), 억제(blocking), 또는 저해(inhibiting)하는 물질을 조절 물질로 할 수도 있다.
본원에서 "나노고단위복합체(nano-assembly matrix)"란 일정한 구조골격을 가진 나노단위복합체의 상호작용(interaction)에 의하여 고집적(high density)되어 쉽게 관찰될 수 있는 고단위복합체(예를 들면, 페리틴 등과 같은 단백질 24 subunit이 서로 자기조립을 통해 결합해서 형성된 일정한 구조골격을 갖는 나노단위복합체가 서로 상호작용을 함으로써 형성된 고단위복합체로서, 본 발명에서는 쉽게 관찰할 수 있는 증폭된 고신호강도 점상이미지패턴과 같은 개념으로 사용되기도 한다)를 의미한다. 당업계에서는 나노클러스터(nanoclusters), 나노어셈블리(nanoassemblies)"는 모두 나노고단위복합체와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명의 실시예에서는, 탐색물질간의 상호작용 또는 매개(조절)물질간의 상호작용에 의한 나노단위복합체의 고집적된 복합체를 나노고단위복합체 형성으로 표현하였다. 상기 나노고단위복합체의 형성여부는 에너지 신호의 전달 및 변화로 확인될 수 있다.
본원에서, "에너지 신호의 전달 및 변화"는 나노(고)단위복합체에 직접 또는 간접적으로 고집적 디스플레이한 표지물질(형광성 물질, 발광성 물질, 자성 물질, ELISA용 효소물질 또는 방사성 물질)에서 발생하는 이미지의 세기 및 패턴(가령, 점상 등의 이미지 형태에서 나타나는 숫자(number), 크기(area) 및 세기(intensity) 및 분포위치(distribution) 등)과 신호의 세기 및 패턴(가령, Flow Cytometry에서의 pulse의 숫자(number), 폭(width), 크기(area), 높이(height) 및 분포위치(distribution) 등) 등의 변화를 포함하며, 나아가 이들 표지물질에서 공명(resonance) 등을 통해 발생하는 에너지 그리고 에너지 사이의 전달(transfer), 간섭(interference) 및 퀀칭(quenching) 등으로 발생하는 이미지 및 신호의 세기 및 패턴 등 여러 가지 변화를 포함한다. 따라서 고집적으로 디스플레이함으로써 표지물질 또는 표지물질들 사이에서 발생하는 에너지 신호의 전달 및 여러 가지 변화를 포함한다.
본원에서 "나노고단위복합체를 형성할 수 있는 물질(이하, '나노고단위복합체 형성물질'이라 한다)"이란 상기 나노고단위복합체를 형성할 수 있는 성질 및 기능을 가지고 있는 모든 물질을 의미하며, 한 가지 예로서 페리틴과 같이 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명에서는 매개(조절)물질간의 상호작용에 의해 관찰가능한 고신호강도 점상이미지패턴, 또는 탐색물질간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체,즉, 관찰가능한 고신호강도 점상이미지패턴을 형성하는 물질을 의미한다.
본원에서 "나노단위복합체"란, 상기 나노고단위복합체의 토대가 되는 복합체로서 단백질 등의 자기조립에 의하여 복합체를 형성한 것을 의미한다. 가령, 페리틴 단백질 24 subunit이 자기조립되어 나노단위복합체를 형성한다.
본원에서 "매개(조절)물질"이란 나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질을 의미하며, 이는 상기 나노고단위복합체 형성물질과 직접 또는 간접적인 결합, 상호작용 및 융합을 통해서 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있는 모든 경우를 포함한다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 매개(조절)물질이라고 할 수 있다. 상기 매개(조절)물질은 나노고단위복합체 형성을 유도하는 특정 화합물이나 단백질 등의 구체적인 물질인 경우뿐만 아니라, 특정 돌연변이(mutation) 등의 현상과 특정 생리적인 신호 등을 아우르는 개념이다. 예를 들어, 생리적인 신호에 따른 단백질간의 상호작용, RNA와 단백질의 상호작용이나, 특정 단백질의 특정 돌연변이(mutation), 또는 구체적인 화합물에만 반응하는 단백질의 사용 등을 통해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있고, 이들을 본 명세서에서 '매개(조절)물질'로 나타내고 있다.
본원에서 "표지물질"이란 나노고단위복합체 형성물질, 베이트 물질, 프레이 물질, 매개(조절)물질, 표적물질 등을 포함해서 신호의 감지를 위해 물질에 결합시키는 자성물질, ELISA 효소 물질, 방사성 물질, 형광성 물질, 발광성 물질 등을 의미한다. 나아가 표지물질은 방사성 물질, 형광성 물질, 발광성 물질을 퀀칭(quenching)하는 금입자 등의 표지억제물질도 또한 포함하며 이 경우에는 상호작용에 따라 신호가 감소 또는 사라지는 것을 감지할 수도 있다. 이를 총괄해서 본 명세서에서 '표지물질'로 나타내고 있다.
본원에서 "디스플레이(display)"란, 나노(고)단위복합체 밖 또는 안에 물질을 직접적으로 또는 다른 물질을 매개하여 간접적으로 드러내는(exposing) 또는 나노(고)단위복합체 안에 물질을 적재(loading)하는 형태를 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, in vitro 또는 in vivo 에서 특정 물질(예를 들어, 특정 생리활성물질) "베이트"와 상호작용하는 표적물질 ("프레이")의 표지 또는 분리방법에 관한 것이다.
표적물질을 표지 또는 분리하는 본 발명의 구체적인 제1방법으로서, (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계, 이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함; (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및 (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제1방법 및 제2 방법은 매개(조절)물질에 의해 나노고단위복합체를 형성한 후, 상기 형성된 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질에 의하여 이와 상호작용하는 프레이물질을 표지하거나 분리 및 동정할 수 있는 방법이다.
도 1은 본 발명의 구체적인 제1방법에 대한 개략도로서, 매개(조절)물질 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도될 때 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). 도 1에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합되어 있는 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체가 형성되고, 이에 따라 나노고단위복합체 형성물질에 결합되어 있는 베이트물질은 형성된 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이되게 된다. N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 2는 본 발명의 구체적인 제2방법에 대한 개략도로서, 제1매개(조절)물질 A, B, C간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되면서, 제2매개(조절)물질 D, E, F간의 상호작용에 의해 탐색물질 X가 형성된 나노고단위복합체에 결합할 때, 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 D와 E와 F와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). 도 2에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 제1매개(조절)물질의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의하여 나노고단위복합체가 형성되고, 이에 제2 매개(조절)물질 E에 의하여 이에 결합된 베이트물질(X)가 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이됨으로서, N, X, Y, A, B, C, D, E, F 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명의 구체적인 제3 방법은 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법에 관한 것이다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
도 3는 본 발명의 구체적인 제3방법에 대한 개략도로서, 나노단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). 도 3에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질은 나노고단위복합체 형성물질이 자기조립에 의하여 복합체를 형성함으로써 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이됨으로써, N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 베이트물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명의 구체적인 제4방법은, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법에 관한 것이다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
도 4는 본 발명의 구체적인 제4방법에 대한 개략도로서, 탐색물질로서 베이트물질간 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되는 구성물에 대한 개략도이다 (X와 X'와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 베이트물질 이용). 도 4에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질은 베이트물질간 상호작용에의하여 나노고단위복합체를 형성하고 이에 고집적으로 디스플레이됨으로써, N, X, X', A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명의 구체적인 제5 방법은, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법에 관한 것이다:
(i) 매개(조절)물질이 결합(fusion)된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
도 5는 본 발명의 구체적인 제5방법의 개략도로서, 나노고단위복합체에서 X와 X'간의 상호작용이 각 탐색물질에 결합된 매개(조절)물질인 A 및 B에 의하여 또는 A, B 및 C에 의하여 간접적으로 이루어지는 구성물에 대한 개략도이다(X와 X'와 A와 B와 C는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 탐색물질 이용). 도 5에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질은 이에 결합(fusion)된 매개조절물질간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의하여 형성된 나노고간위복합체에 고집적으로 디스플레이됨으로써, N, X, X', A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
한편, 본 발명의 베이트와 상호작용하는 표적물질의 분리는 표적물질의 표지 단계 없이 다음과 같이 분리될 수 있다.
즉, 본 발명의 표적물질 분리방법의 구체적인 제1방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제3방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질을 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제4방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제5방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
상기 각 방법에 대한 개략도는 각각 도 1 내지 도 5의 도면에 대응된다.
본 발명의 상기 방법들에서, 나노고단위복합체를 형성하는 물질들, 즉 나노고단위복합체 형성물질, 베이트 물질, 프레이 물질, 나노고단위복합체 형성 유도 매개(조절)물질, 및 표지물질 등 본 발명에서 사용되는 물질들간의 결합은 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적인 직접 또는 간접 결합을 포함할 수 있다. 그 중에서도, 생물학적 결합이 이루어지는 경우, 항체(antibody), 단백질(protein), 단백질 도메인(domain), 단백질 모티프(motif), 펩타이드 등을 포함하는 탐침(probe)을 사용할 수 있다.
본 발명의 제1방법~제5방법의 (i)단계에서, 베이트 물질 및 프레이 물질과 상호작용하지 않는 물질을 추가로 첨가하여 나노고단위복합체 형성물질 상에 디스플레이시킬 수 있다. 상기 베이트 물질 및 프레이 물질과 상호작용하지 않는 물질을 나노고단위복합체 형성물질과 함께 디스플레이시키면 집적도 및 간격을 적절히 조절할 수 있으므로, FRET의 감도를 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 방법은 표적물질을 용이하게 분리 및 동정할 수 있으며, 특히 표적물질의 탐색 및 분석을 고속도(high throughput)로 향상시킬 수도 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명은 인 비트로(in vitro) 뿐 아니라 인 비보(in vivo)에서도 수행될 수 있으며, 특히 세포 내에서 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 형성시켜 이에 고집적 디스플레이된 베이트물질에 의하여 표적물질을 고집적으로 포집하여 용이하게 분리할 수 있다. 특히, 세포 내에서 표적물질의 포집이 이루어진 경우, 세포를 lysis 시켜 용이하게 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 분리하여 이로부터 표적물질들을 높은 농도로 얻을 수 있으므로, 본 발명의 방법은 매우 유용하다.
이때, 상기 나노고단위복합체 형성은 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용하여 측정되거나 감지될 수 있으며, 또한 분리될 수 있다.
즉, 표적물질의 분리는 알려진 일반적인 분리방법을 이용할 수 있으나, 예시적으로 전기영동, 질량분석기(mass spectrometer), 대사체 분리 및 분석 방법, 단백체 분리 및 분석 방법, 크로마토그래피(chromatography), 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등의 방법으로 분리 및 동정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, in vitro 또는 in vivo 에서 특정 물질(예를 들어, 특정 생리활성물질) "베이트"와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제1방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제3방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제4방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제5방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
추가로, 표적물질의 검출을 위하여, 프레이물질에 나노고단위복합체 형성물질을 결합시켜 베이트물질과 프레이물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성시킬 수 있다.
이러한 구체적인 방법으로서, 제6 방법은 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 나노고단위복합체 형성물질 및 프레이물질 라이브러리를 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질 라이브러리를 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 라이브러리 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
도 6는 본 발명의 구체적인 제6방법의 일 개략도로서, 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). 도 6에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질 및 프레이물질은 직접적인 상호작용 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 통하여 나노고단위복합체를 형성하게 되며, 이에 N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 7은 본 발명의 구체적인 제7방법의 다른 개략도로서, 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). 도 7에 기재된 바와 같이 매개조절물질에 결합(fusion)된 베이트물질은 매개조절물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체 형성물질에 결합되고, 이와 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 프레이물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하게 되며, 이에 N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 8은 본 발명의 구체적인 제6방법의 또다른 개략도로서, (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질; (A) X가 서로 상호작용이 없는 경우, (B) X가 서로 상호작용이 있는 경우). 도 8에 기재된 바와 같이 매개조절물질에 결합(fusion)된 베이트물질은 매개조절물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체 형성물질에 결합되고, 역시 매개조절물질에 결합되어 매개조절물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 프레이물질과 상호작용하여 나노고단위복합체를 형성하게 되며, N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, in vitro 또는 in vivo 에서 특정 물질(예를 들어, 특정 생리활성물질) "베이트"와 와 탐색 및 검출 대상 물질(예를 들어, 다른 생리활성물질) "프레이" 사이의 상호작용을 탐색하는 방법에 관한 것이다.
물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제1방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제3방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제4방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제5방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제6방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 프레이물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또 다른 관점에서, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
그 구체적인 제1 방법은 (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및 (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계, 이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 구체적인 제2방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하여, 상기 제1매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제3방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 표적 후보물질의 존재 하에서, 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 나노단위복합체에 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(ii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제4방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 베이트물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제5방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제6방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 표적 후보물질의 존재 하에서 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계.
본 발명의 상기 방법들에서, 나노고단위복합체를 형성하는 물질들, 즉 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트물질, 프레이물질, 나노고단위복합체 형성 유도 매개(조절)물질, 그리고 표지물질 등 본 발명에서 사용되는 물질들 간의 결합은 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적인 직접 또는 간접 결합을 포함할 수 있다. 그 중에서도, 생물학적 결합이 이루어지는 경우, 항체(antibody), 단백질(protein), 단백질 도메인(domain), 단백질 모티프(motif), 펩타이드 등을 포함하는 탐침(probe)을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 나노고단위복합체 형성 물질에 임의의 탐색물질을 직접 또는 간접적으로 결합시키는 한편, 나노고단위복합체 형성 물질과 프레이를 결합하여 제공할 수 있다. 또한, 나노고단위복합체 형성 물질과 매개(조절)물질을 결합하여 제공하는 한편, 베이트물질과 프레이물질에 각각 매개(조절)물질을 결합하여 제공할 수 있다.
조절물질은 목적하고자 하는 생리적인 기능의 변화(생리적인 기능의 억제, 활성화 등)의 on/off에 관여하는 물질이라 할 수 있다. 상기와 같이, 나노고단위복합체의 형성(assembly) 및 분열(dis-assembly) 또는 나노고단위복합체에 특정 물질을 디스플레이하는 것은, 서로 상호작용하는 생리활성물질들을 이용함으로써 조절 가능하며, 이러한 조절에 의하여 세포 내 또는 생체 내의 생리적인 기능도 조절할 수 있게 된다.
또한, 목적하고자 하는 생리적인 기능의 변화, 예를 들면 특정 물질의 활성의 촉진 여부, 특정 물질의 생산량의 증가나 억제 등의 변화를 확인함으로써, 상기 방법에 의하여 세포의 생리적 기능이 조절되었는지 여부를 판별할 수 있게 된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 나노고단위복합체 형성물질, 탐색물질 또는 매개(조절)물질은 표지물질이 결합시켜 표지할 수 있으며, 이때, 상기 표지물질은 이로 제한되는 것은 아니나, 자성 물질, 방사성 물질, ELISA용 효소 물질, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 할 수 있고, 상기 형광성 물질은 형광 염료, 형광 단백질 또는 형광 나노입자 등임을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 베이트물질, 프레이물질 또는 매개(조절)물질은 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 할 수 있고, 이때, 상기 생리활성물질은 이로 한정되는 것은 아니나 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 in vitro 또는 in vivo 어느 계에서도 수행가능하다. 그 중에서 본 발명을 in vivo에서 수행하는 경우, 진핵세포, 원핵세포, 인간을 포함한 포유동물의 생체내, 조직내 및 세포내, 식물의 생체내, 조직내 및 세포내에서 수행할 수 있다. 특히, 본 발명은 제프라 피쉬(Zebra fish), 선충(C. elegans), 효모(Yeast), 초파리(Fly) 또는 개구리(Frog)의 세포내, 조직내 또는 생체내에서도 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트물질, 프레이물질, 매개물질(나노고단위복합체 형성 유도 물질) 및 표지물질들은 일반적으로 널리 알려진 방법에 의해 용이하게 상기 세포내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 직접 도입(direct injection), 세포전달성 펩타이드(transducible peptide 및 fusogenic peptide), 지질 전달체 또는 이들의 결합체를 이용한 도입; 일렉트로포레이션(electroporation)을 이용한 도입; 마그네토펙션(magnetofection)을 이용한 도입; 및 인간을 포함한 포유동물로의 장관외(parenteral) 투여, 경구(oral) 투여, 비강내 (intranasal) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 에어로졸(aerosolized) 투여 및 정맥(intravenous) 투여 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택되는 방법 등에 의해 수행될 수 있음은 자명하다.
한편, 본 발명의 방법들에서 상기 나노고단위복합체 형성은 표지물질을 사용하여 확인될 수 있다. 특히 상기 탐색물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 또는 매개(조절)물질에 표지물질을 결합시켜 사용할 수 있다. 필요한 경우, 특정 물질들 사이의 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체상에서, 본 발명의 표지물질로는 방사성 표지, 형광성 물질 또는 발광성 물질을 사용할 수 있다. 방사성 표지로서는, 예를 들어 32P, 35S, 3H 및 14C 등을 포함하여 일반적으로 사용 가능한 표지를 모두 사용할 수 있다. 그리고, 그 자체로서 형광을 나타내거나 물질들간의 상호작용에 의해 형광성을 나타내는 형광물질(fluorescent material)로서는, 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광 염료들; ECFP, TagCFP, m제TFP1, GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질; 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif); 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다. 발광성 물질로서는, 그 자체로서 발광을 내거나 물질들간의 상호작용에 의해 발광을 나타내는 발광체(luminescent material) 예를 들어, 루시퍼레이즈(luciferase) 등을 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법에서, 상기 나노고단위복합체 형성은 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용하여 측정되거나 감지될 수 있으며, 또한 분리될 수 있다.
본 발명에서 에너지 신호는 에너지 세기 및 공명 등을 통한 에너지 전달을 측정할 수 있는 것이라면 제한없이 이용할 수 있으며, 방사성 전이, 발광 전이, 자성 전이를 비롯해서 형광 전이(FRET; fluorescence resonance energy transfer) 등을 예시할 수 있다.
추가로, 본 발명의 방법에 의하여 형성된 나노고단위복합체 또는 상기 나노단위복합체 안에 조절물질을 고집적으로 적재(loading)해서 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체의 분열(dis-assembly)에 따라 노출되는 적재된 물질에 의하여 매개되는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는것을 특징으로 할 수 있다.
이하에서는 상기 방법들에서 사용되는 구체적인 구성 요소에 대해 설명한다.
"나노고단위복합체 형성물질"은 나노고단위복합체를 형성하는 물질은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 자기조립에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질을 사용하는 것이 좋다. 비제한적으로 이들 복합체는 나노크기의 입자로 구성되어 있는 것이 적합하다. 한편, 나노고단위복합체 형성물질은서로 다른 2개 이상의 나노고단위복합체 형성물질을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 자기조립에 의한 나노고단위복합체 형성의 바람직한 예로서, 자기조립 또는 자기결합(self-association) 도메인을 포함하는 단백질 등을 들 수 있으며, 이때, 상기 자기조립 또는 자기결합 도메인을 갖는 단백질은 페리틴 또는 유사 단백질(ferritin), DPS 또는 유사 단백질(DNA binding protein from starved cells), HSP(heat shock protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질, 바이러스 구성단백질, 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(calcium/calmodulin-dependent kinase II) 및 dsRed 등을 들 수 있다. 화학적으로 합성한 다양한 나노입자도 나노고단위복합체 형성이 가능한데, 예를 들어, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자나노입자(Q dot) 또는 자성나노입자(magnetic nanoparticle) 등을 포함한 여러 종류의 나노입자를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 자기조립(self-assembly)에 의해 나노크기의 단위복합체를 형성할 수 있는 물질 또는 단백질들 중에 페리틴(ferritin) 단백질을 이용하였다.
페리틴 단백질은 24개가 자기조립에 의해 구형 나노입자복합체을 형성하며 외경은 약 12 nm이며, 내경은 약 9 nm인 구조를 이루며, 2500개 이상의 철 원자를 함유한다(Chasteen, N.D. Struc. Biol. 126:182-194, 1999). 페리틴 단백질의 의해 형성되는 나노입자복합체의 표면상에서 일어나는 "탐색물질" 사이 또는 "매개(조절)물질" 간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성되는 경우, "탐색물질" 또는 "매개(조절)물질"에 결합시킨 형광, 발광, 자성, 방사성 물질 등의 표지물질(label)을 현미경 등의 분석기기를 이용하여 분석함으로써 역동적으로 탐색할 수 있다.
탐색 물질은 서로 간에 상호작용이 일어나는 생리활성물질이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 생리활성물질은 생체 내에서 생리적인 활성을 나타내는 모든 물질로서, 인간의 생체 내의 다양한 생체물질과 상호작용하여 이들의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직한 예로서 핵산(nucleic acid), 뉴클레오타이드(mono-/oligo-/poly-nucleotide), 단백질(protein), 펩타이드(mono-/oligo-/poly-peptide), 아미노산(amino acid), 당(mono-/oligo-/poly-saccharide), 지질(lipid), 비타민, 화합물(chemical compound)을 들 수 있으나, 나아가 상기 물질들을 구성하는 더 작은 분자들도 포함한다.
본 발명에서, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 표지물질간의 공명 현상에 의한 에너지 전달 또는 표지물질에 의한 이미지 또는 신호의 세기 또는 패턴의 변화인 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때, 에너지 전달은 공명(resonance) 등을 통해 발생하는 에너지 변화 그리고 에너지 사이의 전달(transfer), 간섭(interference) 및 퀀칭(quenching) 등으로 발생하는 이미지 및 신호의 세기 및 패턴 등 여러 가지 변화를 포함한다. 신호의 변화는 이미지의 세기 및 패턴(가령, 점상 등의 이미지 형태에서 나타나는 숫자(number), 크기(area) 및 세기(intensity) 및 분포위치(distribution) 등)과 신호의 세기 및 패턴(가령, Flow Cytometry에서의 pulse의 숫자(number), 폭(width), 크기(area), 높이(height) 및 분포위치(distribution) 등) 등의 변화를 포함한다. ELISA에서의 신호의 세기의 변화도 포함한다.
본 발명에서 에너지 전달신호는 공명 등을 통한 에너지 전달신호를 측정할 수 있는 것이라면 제한없이 이용할 수 있으며, BRET(bioluminescence resonance energy transfer), FRET(fluorescence resonance energy transfer) 등을 예시할 수 있다.
한편, 본 발명의 방법들에서 상기 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 알아보기 위하여 표지물질을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 표지물질로는 형광성 물질 또는 발광성 물질을 사용할 수 있다. 그 자체로서 형광을 나타내거나 물질들간의 상호작용에 의해 형광성을 나타내는 형광물질(fluorescent material)로서는, 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광 염료들; ECFP, TagCFP, mTFP1, GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질; 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif); 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다. 발광성 물질로서는, 그 자체로서 발광을 내거나 물질들간의 상호작용에 의해 발광을 나타내는 발광체(luminescent material) 예를 들어, 루시퍼레이즈(luciferase) 등을 사용할 수 있다.
이러한, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 일반적으로 알려진 방법에 의하여 측정될 수 있는데, 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, Flow Cytometry, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등을 이용할 수 있으며, 특히 FACS, MS 등을 이용하여 분리할 수도 있다.
탐색 물질에 해당하는 '베이트' 및 이의 파트너에 해당하는 '프레이' 물질은 서로 간에 상호작용이 일어나리라 예상되는 후보 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직하게는 생리활성물질이다.
생리활성물질은 생체 내에서 생리적인 활성을 나타내는 모든 물질로서, 인간의 생체 내의 다양한 생체물질과 상호작용하여 이들의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직한 예로서 핵산(nucleic acid), 뉴클레오타이드(mono-/oligo-/poly-nucleotide), 단백질(protein), 펩타이드(mono-/oligo-/poly-peptide), 아미노산(amino acid), 당(mono-/oligo-/poly-saccharide), 지질(lipid), 비타민, 화합물(chemical compound)을 들 수 있으나, 나아가 상기 물질들을 구성하는 더 작은 분자들도 포함한다.
베이트 및 프레이 물질 쌍의 상호작용에 대한 구체적인 예로서, Leucine Zippers 도메인, 약물-약물 타겟 등 상호작용하는 다양한 물질, Rapamycin 화합물의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FRB와 FKBP 단백질의 상호작용, FK506 화합물과 이것의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FKBP 단백질의 상호작용, AP1510 화합물과 결합하는 FKBP 단백질의 상호작용, IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 RelA 단백질의 상호작용, TNFa 생리적인 신호에 따라 조절되는 IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 bTrCP 또는 IKKb 단백질의 상호작용, miRNA와 mRNA의 세포내 상호작용(lin-28 mRNA에 결합하는 let-7b miRNA), Ago2 단백질과 miRNA의 상호작용, MS2 결합 mRNA 부위와 결합하는 MS2 단백질의 상호작용, DHFR 단백질과 MTX 화합물 세포내 상호작용 등을 들 수 있다.
상기 베이트-프레이 쌍의 결합을 조절하는 '베이트 및 프레이 상호작용 매개(조절)물질'은 상기 베이트 및 프레이 사이의 상호작용을 촉진하여 양 물질간 결합을 매개(조절)하는 물질이고, 해당 기능을 발휘하는 물질이면 생리활성물질이든 화합물이든 제한이 없다. 그러나, 사용하는 베이트-프레이 쌍에 특이적으로 반응하는 물질이 바람직하다. 이러한 베이트-프레이 쌍의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하므로, 궁극적으로 상기 '베이트 및 프레이 상호작용 매개(조절) 물질'은 본 발명에서 정의하고 있는 '나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질'인 "매개(조절)물질"에 속한다고 할 수 있다.
상기 프레이-베이트간의 상호작용을 매개(조절)함에 있어서, 필요에 따라, 외부 신호에 따라 조절되는 단백질을 사용할 수도 있고, 자신의 표적인 mRNA와 특이적으로 결합하는 miRNA의 특성을 이용할 수도 있다.
본 발명의 나노고단위복합체의 형성을 유도하는 '매개(조절)물질'은 상기 나노고단위복합체 형성물질의 표면에서 서로 직접 또는 간접적으로 상호작용해서 나노고단위복합체를 형성시킬 수 있는 모든 요소를 포함하는 개념이다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 본 발명의 '매개(조절)물질'이라고 할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 베이트-프레이의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되는 경우에, "베이트-프레이의 상호작용을 조절 또는 매개하는 물질" 역시 넓은 의미의 상기 "매개(조절)물질"에 포함된다.
이러한 '매개(조절)물질'은 나노고단위복합체를 형성을 유도한다는 해당 기능을 발휘하는 요소라면 제한이 없다. 그러므로 서로 특이적으로 반응하는 물질간의 결합이나 돌연변이 등의 특정 현상에 의해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있으면, 해당 물질이든 특정 현상이든 모두 매개(조절)물질로 파악될 수 있다. 즉, 본 발명에서 매개(조절)물질이란, 특정 물질, 특정 현상 또는 특정 상호작용 자체 등을 모두 포함하는 용어이며, 이러한 매개(조절)물질은 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
만약 서로 상호작용하는 베이트-프레이 쌍의 성질을 이용하면서 프레이를 탐색하면서, 한편으로는 상기 베이트 물질의 자체 성질을 이용하여 나노고단위복합체의 형성하였다면, 상기 사용된 베이트 물질은 나노고단위복합체의 형성을 유도하는 매개(조절)물질이면서, 동시에 파트너인 프레이와의 상호작용을 탐색하는데 사용된 베이트 기능을 발휘하고 있는 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의하여 형성된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 분리하여, 이를 포함하는 질환의 진단용 또는 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 질환은 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이되는 탐색물질이나 매개(조절)물질에 결합되거나 포집되는 물질이 관련된 질환일 수 있다.
아울러, 상기 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 프레이 라이브러리와 반응시키는 단계; 및 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합된 프레이물질을 표적물질로서 표지하고, 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 질환을 표적, 이미징 또는 진단하는 단계를 포함하여, 질환을 표적, 이미징 또는 진단할 수 있다.
이때, 상기 나노고단위복합체에 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 조절물질을 고집적으로 디스플레이한 후 분리할 수 있다.
이때, 상기 질환의 진단을 위한 약학 조성물은 상기 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 복합체는 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
FKBP-CFP-FT, FRB-YFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴 유전자인 FTH1(GenBank Acc. No. BC013724)와 FTL(GenBank Acc. No. BC016346)은 미국의 Open BioSystems사에서 구입하였다. 페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP와 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 CFP와 YFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa, ATCC No. CCL-2)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다. 각 형광단백질의 이미징을 위해 CFP는 458nm의 레이저를 이용하여 460-500nm의 이미지를, YFP는 514nm 레이저를 이용하여 525-545nm의 이미지를, FRET 이미지는 458nm의 레이저를 이용하여 525-545nm에서 얻었다. 공초점현미경에서 얻은 이미지는 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Device)를 이용하여 sensitized emission 방법으로 FRET 정도를 분석하였다. 250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다(A 및 B).
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우(A)와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우(B)에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP-mCerulean-FT, FRB-mCitrine-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴 (FT) 단백질의 N-말단에 FKBP와 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean와 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa, ATCC No. CCL-2)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다. 각 형광단백질의 이미징을 위해 mCerulean은 405nm의 레이저를 이용하여 460-490nm의 이미지를, mCitrine은 514nm 레이저를 이용하여 525-550nm의 이미지를, FRET 이미지는 405nm의 레이저를 이용하여 525-550nm에서 얻었다. 공초점현미경에서 얻은 이미지는 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Device)를 이용하여 sensitized emission 방법으로 FRET 정도를 분석하였다. 250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 11와 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP-mCerulean-FT, FRB-mCitrine-DPS 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 및 DPS 단백질의 N-말단에 FKBP 및 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean 및 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다. DPS 유전자는 공지된 해당 프라이머를 이용해서 PCR하여 클로닝하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 13과 도 14에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP(F36M)2-mCerulean-FT, FRB-mCitrine-DPS 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 및 DPS 단백질의 N-말단에 제1매개(조절)물질인 FKBP(F36M)2 및 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean 및 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 제2매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FRB-mCitirine-FT, FKBP-mCerulean 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 17와 18에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP-mCerulean-FT, FRB-mCitirine 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 19와 20에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP-mCerulean, FRB-mCitirine-DPS 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 DPS 단백질의 N-말단에 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 21와 22에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FRB-ECFP-FT, FKBP-EYFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 ECFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 EYFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 23에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
DHFR-mRFP-FT, FRB-FKBP-mCerulean-FT 융합단백질을 세포내에서 발현하고 methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리해서 나노(고)단위복합체에서 DHFR과 methotrexate의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 DHFR 또는 FRB-FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mRFP 또는 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다. 약물인 methotrexate에 형광인 fluorescein를 부착한 형광약물(Invitrogen)을 구입했다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다. 10uM methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 24에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 DHFR이 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이됨에 따라서 FRET 신호가 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 DHFR과 methotrexate의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP-mRFP-FT, FRB-EGFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mRFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 EGFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 25에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
IkBa-CFP-FT, RelA-YFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 IkBa와 RelA의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 IkBa 단백질과 형광단백질인 CFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 RelA 단백질과 형광단백질인 YFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다. 대조군으로 IkBa 단백질이 없는 CFP-FT 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
두 개의 다른 발현 조합 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 26에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. IkBa과 RelA가 상호작용함에 따라 FRET 신호가 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 IkBa과 RelA의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FRB-FKBP-mCerulean-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 신호의 분포, 세기, 크기 및 숫자를 분 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB-FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 27에 나타내었다. 나노고단위복합체 형성 신호의 (A) 분포와 세기, (B) 크기 및 (C) 숫자를 분 간격으로 정량화함으로써 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다. 가령, S/N(signal/noise)의 차이가 수백배에 이를 만큼 커다란 증가를 확인했다.
FRB-FKBP-mCerulean-FT, DHFR-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 DHFR과 methotrexate-fluorescein의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB-FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 DHFR 단백질과 형광단백질인 mRFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시키고 methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 28에 나타내었다. DHFR과 methotrexate-fluorescin의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포 및 (B) 세기를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FRB-/FKBP-mCerulean-FT, IkBa-ECFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 IkBa과 YFP-RelA의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 29에 나타내었다. IkBa과 YFP-RelA의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포 및 (B) 동일위치를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FRB-/FKBP-mCerulean-FT, DHFR-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 DHFR과 methotrexate-fluorescein의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다. methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 30에 나타내었다. DHFR과 methotrexate-fluorescein의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포 및 (B) 동일위치를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP(F36M)1~5-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 신호의 분포, 세기, 크기 및 숫자를 분 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP(F36M)1~5 단백질 도메인과 형광단백질인 mRFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
FK506의 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 31에 나타내었다. 나노고단위복합체 형성 신호의 (A) 분포, (B) FKBP(F36M) 숫자에 따른 크기, (C) FK506 처리에 따른 크기 및 (D) FK506 처리와 제거에 따른 크기를 분 간격으로 정량화함으로써 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP(F36M)2-mRFP-FT, FRB-EGFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 FKBP과 FRB의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 32에 나타내었다. FKBP과 FRB의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포, (B) 세기 및 (C) 동일위치 변화를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP(F36M)2-mRFP-FT, IkBa-ECFP-FRB, EYFP-RelA 융합단백질을 세포내에서 발현해서 IkBa와 RelA의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 33에 나타내었다. IkBa와 RelA의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포 및 (B) 동일위치 변화를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
FKBP(F36M)2-mRFP-FT, DHFR-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 DHFR과 methotrexate-BodipyFL의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다. methotrexate-BodipyFL 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 34에 나타내었다. DHFR과 methotrexate-BodipyFL의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포, (B) DHFR 유무에 다른 동일위치 및 (C) DHFR 유무에 다른 세기 변화를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
나노고단위복합체를 이용해서 앤도좀 표적물질을 감지 및 표지
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 RAB 단백질(RAB5A, RAB7A), FKBP 또는 FRB 단백질 도메인 및 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 감지 및 표지 결과 이미지를 얻었고, 그 결과를 도 35과 도 36에 나타내었다. DAPI를 이용해서 핵을 염색함으로써 세포를 관찰했다. 따라서 FKBP와 FRB 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체를 이용해서 초기와 후기 앤도좀 표적물질이 효율적으로 감지 및 표지됨을 확인했다.
나노고단위복합체를 이용해서 골지체 표적물질을 감지 및 표지
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 골지체 상호작용 단백질(GALNT2), FKBP 또는 FRB 단백질 도메인 및 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 감지 및 표지 결과 이미지를 얻었고, 그 결과를 도 37에 나타내었다. DAPI를 이용해서 핵을 염색함으로써 세포를 관찰했다. 따라서 FKBP와 FRB 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체를 이용해서 골지체 표적물질이 효율적으로 감지 및 표지됨을 확인했다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
부호 없음

Claims (56)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  2. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  3. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  4. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  5. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합(fusion)된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매개(조절)물질간의 작용 또는 상기 베이트물질간의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매개(조절)물질은 베이트물질에 결합(fusion)되어 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  9. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  10. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계; 및
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질을 분리하여 동정하는 단계.
  11. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  12. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  13. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  14. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  15. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  16. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  17. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  18. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 베이트물질, 나노고단위복합체 형성물질 및 프레이물질 라이브러리를 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질 라이브러리를 반응시키는 단계; 및
    (iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 라이브러리 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프레이물질 라이브러리에 표지물질이 결합되고, 추가로 상기 나노고단위복합체 형성물질, 상기 베이트물질 및 상기 매개(조절)물질 중 어느 하나 이상에 추가로 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서로 다른 2개 이상의 나노고단위복합체 형성물질을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질간의 상호작용은 직접 또는 간접적으로 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 또는 상기 나노고단위복합체 형성물질 서로간의 상호작용을 매개(조절)하는 물질을 부가적으로 하나 이상 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 또는 상기 나노고단위복합체 형성물질에 결합(fusion)되어 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 또는 상기 매개(조절)물질은 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생리활성물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제13항 또는 제18항에 있어서, 상기 매개(조절)물질간의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지물질은 자성 물질, 방사성 물질, ELISA용 효소 물질, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 형광성 물질은 형광 염료, 형광 단백질 또는 형광 나노입자임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체 형성물질은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 나노고단위복합체를 형성하는 물질은 자기조립 또는 자기결합(self-association) 도메인을 포함하는 단백질, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자나노입자(Q dot) 및 자성나노입자(magnetic nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 자기조립 또는 자기결합 도메인을 갖는 단백질은 페리틴 또는 유사 단백질(ferritin), DPS 또는 유사 단백질(DNA binding protein from starved cells), HSP(heat shock protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질, 바이러스 구성단백질, 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(calcium/calmodulin-dependent kinase II) 및 dsRed로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 조직 또는 생체내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 표지물질간의 공명 현상에 의한 에너지 전달 또는 표지물질에 의한 이미지 또는 신호의 세기 또는 패턴의 변화인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, Flow Cytometry, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 로 구성된 군에서 선택된 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  36. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  37. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  38. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  39. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  40. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 베이트물질, 프레이물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
    (iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 조직 또는 생체내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  43. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  44. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 베이트물질을 상기 형성된 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  45. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질과 베이트물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  46. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  47. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  48. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 또는 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  51. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하여, 상기 제1매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  52. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 표적 후보물질의 존재 하에서, 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 나노단위복합체에 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
    (ii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  53. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 베이트물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  54. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  55. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 표적 후보물질의 존재 하에서 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프레이물질에 표지물질이 결합되고, 추가로 상기 나노고단위복합체 형성물질, 상기 베이트물질 및 상기 매개(조절)물질 중 어느 하나 이상에 추가로 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
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