KR101737450B1

KR101737450B1 - 단일 세포 내 마이크로 rna의 고해상도 시각화 방법

Info

Publication number: KR101737450B1
Application number: KR1020150175338A
Authority: KR
Inventors: 박준원; 김영규; 박익범; 김정훈
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2015-12-09
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2017-05-18

Abstract

본 발명은 (a) 표적 마이크로 RNA(miRNA)가 포함된 생체 시료 상에 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 접촉시켜 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성하는 단계, 및 (b) 원자간력 현미경(AFM)용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하여 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하되; 상기 캔틸레버는 탐침 및 상기 탐침의 표면에 고정된 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함하는 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법에 관한 것이다.

Description

단일 세포 내 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법{METHOD FOR HIGH RESOLUTION VISUALIZATION OF MICRORNA IN SINGLE CELL}

본 발명은 단일 세포 내 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 원자간력 현미경(AFM)을 통해 생체 시료 내 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하여 무표지 마이크로 RNA의 공간적 분포를 분석함으로써, 단일 세포 내 마이크로 RNA을 고해상도로 시각화하는 방법에 관한 것이다.

마이크로 RNA는 크기가 19-25개의 극히 작은 염기서열로 이루어진 비번역(noncoding) 단일가닥 RNA분자로서 1993년 하버드대의 V. Ambros 박사 연구팀에 의해 예쁜꼬마선충의 유충 발달시기를 조절하는 유전자로 알려진 'lin-4'가 단백질을 코딩하는 대신에 작은 크기의 RNA쌍을 생산하는 것에서 최초로 발견되었으며(R.C. Lee, et al. Cell 95, 843-854 (1993)) 2000년대에 이르러 인간과 포유종 등을 포함한 다양한 종에서도 발견되고 종 사이에 염기서열의 유사성이 보고됨으로써 큰 주목을 받고 있다(D.P. Bartel, Cell 136, 215-233 (2009)). 마이크로 RNA가 유전자 발현을 조절하는 방법은 특정 메신저 RNA에 결합하여 이를 분해하거나 번역을 억제함으로써 단백질 합성 저해와 단백질 생성을 조절하는 것이다. 이는 인간 전체 유전자 발현의 30% 이상(포유류의 경우 60%)에 관여하는 것으로 알려졌으며 세포 증식, 사멸, 발달 및 분화 등의 다양한 생물학적인 기능을 미세 조정하는 역할을 한다(W.P. Kloosterman et al. Dev . Cell 11, 441-450 (2006)).

마이크로 RNA의 미세 조정 기능이 개체의 발생과정을 조절할 뿐만 아니라 여러가지 질환의 발병원인과 밀접한 관련이 있다는 것이 밝혀짐에 따라 현재 생물학 분야에서 마이크로 RNA에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며 특히, 암과의 연관성에 대한 보고가 주를 이루고 있다(A. Lujambio et al. Nature 482, 347-355 (2012)). 또한, 암 뿐만 아니라 심장 질환, 신경관련 질병 등 다양한 질환에 연관이 있는 것으로 밝혀 졌다. 따라서 생체 조직 및 세포에 존재하는 마이크로 RNA를 이용하여 질병의 조기 진단, 종양의 진단, 질환의 예후용 바이오마커 및 치료법 개발, 치료 반응 예측(약물반응 예보인자) 등에 활용하려는 연구가 지속되고 있다. 한편, 생명체의 최소단위인 단일세포 간에 마이크로 RNA의 발현량이 각각 다를 수 있고, 이러한 발현량의 차이가 생명현상에 있어 중요한 역할을 하기 때문에 단일세포 수준에서 마이크로 RNA를 정량할 수 있는 분석법이 필요하며, 세포 내의 여러 위치에서 특정 마이크로 RNA의 발현량과 분포를 분석할 수 있는 고민감도의 마이크로 RNA 분석법은 마이크로 RNA의 역할과 기작에 대한 새로운 지식을 창출할 수 있을 것이다.

현재까지 개발되고 많이 사용되는 마이크로 RNA 정량 및 분포 분석 기술들은 기존의 길이가 긴 DNA와 RNA 분석에 주로 사용되고 있는 마이크로어레이(microarray)와 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR), 인 시츄 혼성화(in-situ hybridization)를 이용하여 이뤄지고 있다. 우선 정량 분석 기술로 마이크로어레이 기술은 수 내지 수만개의 프로브 DNA가 고정된 칩을 사용하여 표적 마이크로 RNA들을 검출하는 방식이기 때문에 많은 다형성과 서열 변화를 동시에 검사 할 수 있는 장점이 있지만, 최대민감도가 1 pM 수준 정도의 낮은 수준이어서 마이크로 RNA 농도가 높은 경우에만 적용이 가능하며, RT-PCR의 경우 일반적인 프라이머 DNA와 마이크로 RNA의 길이가 유사하여 표적 마이크로 RNA를 선택적으로 연장, 복제하는데 어려움이 있다 (H. Gudnason, et al. Nucleic Acids Res. 35, e127 (2009)).

단일세포 내 마이크로 RNA의 공간적 분포를 분석하기 위해 주로 인 시츄 혼성화 방법이 사용되는데 짧은 서열을 가지는 마이크로 RNA에 형광이 도입된 probe가 서열 특이적으로 정확하게 혼성화되기가 힘들며 형광 신호를 통해 분석하기 때문에 배경 소음 신호로 인해 정확한 분석이 힘들다. 따라서 형광 분석을 통해 조직에서 특정 마이크로 RNA를 과발현하는 세포를 찾거나, 단일세포 내 마이크로 RNA가 과발현하는 영역을 확인하기에는 용이하나 제한된 공간적 해상도와 민감도 때문에 국소적인 영역에 존재하는 미량의 마이크로 RNA의 정량이나 분포를 분석하기에는 적합하지 않다(H. Dong, et al. Chem . Rev. 113, 6207-6233 (2013)).

최근에 인 시츄 혼성화 방법의 낮은 민감도를 극복하기 위해 신호를 증폭하려는 시도들이 이뤄지고 있다. 한 예로 toehold-initiated rolling circle amplification (TIRCA) 방법을 이용하여 대상 마이크로 RNA의 증폭 과정을 통해 일반적인 상온에서 높은 정확도를 가지고 단일세포내의 대상 마이크로 RNA의 분포와 정량을 동시에 분석할 수 있는 기술이 제안된 바 있다(R. Deng, et al. Angew . Chem. Int . Ed. 53, 2389-2393 (2014)). 이는 마이크로 RNA가 결합된 원형 형태의 프로브가 회전환 증폭(rolling circle amplification, RCA)을 통해 증폭되고 이에 상보적인 서열을 가지는 형광 프로브를 결합시켜 단일세포에서 발현되는 대상 마이크로 RNA를 인시츄 정량 분석 가능한 방법이다. 또한 미량 존재하는 마이크로 RNA의 시그널 증폭을 위해 기존의 형광물질 보다 최대 40배 밝은 형광을 내는 효소표지형광(enzyme-labeled fluorescence, ELF)을 이용한 방법이 개발되었다(J. Lu, et al. Nucleic Acids Res. 37, e100 (2009)). 그러나, 이러한 신호 증폭을 통해 마이크로 RNA의 분포를 분석하는 방법들은 증폭 과정에서 비롯되는 오류로 인해 정확한 분석이 힘들며, 형광 시그널을 통해 대상 마이크로 RNA의 공간적 분포를 분석하기 때문에 해상도가 수백 나노미터 수준으로 낮다는 문제점들이 존재한다.

따라서 위의 기존의 기술들로 단일세포에 존재하는 미량(단일세포에 존재하는 마이크로 RNA는 평균 500 개로 보고됨)의 마이크로 RNA의 정량 과 여러 위치의 중요 부위에 존재하는 마이크로 RNA의 분포를 분석하는 방법은 아직 재현성 및 신뢰도를 획득하지 못하였고, 세포의 국소 영역(예를 들면, 신경세포의 수지상 돌기 가시(dendritic spines), 시냅스(synapse), 1 ㎛ 이하)에 존재하는 마이크로 RNA를 분석하는 기술이 요구되는 실정이다.

한편, 원자간력현미경은 나노미터 크기의 물질의 구조나 특성을 연구하는데 있어서 매우 강력한 기기로 주목받아 왔다. 원자간력현미경이 가지는 피코뉴튼(picoNewton, pN) 수준의 고민감도와 나노미터 수준의 공간 분해능으로 위치적 정확성을 가지며 3 차원 표면 지형도 이미징이 가능할 뿐만 아니라 탐침과 생체 시료 사이의 부착력을 측정할 수 있기 때문에 단일 분자 간의 상호작용력을 분석할 수 있다(K. C. Neuman, et al. Nat. Methods 5, 491-505 (2008)). 특히, 수십에서 수백 나노미터 크기의 DNA나 단백질과 같은 생체분자의 구조를 높은 해상도로 관찰할 수 있으며 생체 내와 유사한 조건(수용액)에서 단일 생체 분자간의 상호작용력 분석이 가능하기 때문에(DNA-DNA, DNA-RNA, 항원-항체, 단백질-리간드 등) 생체물질의 구조, 분자 거동 및 분포, 동역학, 표면 등을 분석할 수 있다(P. Hinterdorfer, et al. Nat. Methods 3, 347-355 (2006)).

미국 특허등록번호 제8,067,169호는 원자간력현미경과 T자 모양의 캔틸레버 (cantilver)를 이용하여 평평한 고체 표면 위에서 짧은 길이의 핵산을 검출하는 방법을 제시하였다. 이 방법은 표면에 단일가닥의 probe DNA를 고정하고 표적 핵산을 혼성화시켰을 때 혼성화된 이중가닥 핵산과 단일가닥 probe DNA의 강성 (stiffness)이 차이나는 것을 이용하여 짧은 길이의 표적 핵산을 검출한 방법이다. 이는 마이크로 RNA를 검출하는데도 적용가능하나(S. Husale et al. Nature 462, 1075-1078 (2009)), (1) 생체 시료에 이중가닥 핵산과 유사한 강성을 가지는 물질이 존재할 시에 분석에 오차가 생기고, (2) 평평하고 강성이 높은 고체 표면에서만 분석이 가능하며, (3) 마이크로 RNA의 전구체인 primary 마이크로 RNA와 precursor 마이크로 RNA를 구별할 수 없다는 한계점이 있다.

본 발명은 (a) 표적 마이크로 RNA(miRNA)가 포함된 생체 시료 상에 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 접촉시켜 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성하는 단계, 및 (b) 원자간력 현미경(AFM)용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하여 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하되; 상기 캔틸레버는 탐침 및 상기 탐침의 표면에 고정된 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함하는 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 (a) 표적 마이크로 RNA(miRNA)가 포함된 생체 시료 상에 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 접촉시켜 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성하는 단계, 및 (b) 원자간력 현미경(AFM)용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하여 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하되; 상기 캔틸레버는 탐침 및 상기 탐침의 표면에 고정된 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함하는 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계 전에, 생체 시료의 분자 고정화 및 세포막 제거를 통해 전처리하여 표적 miRNA가 포함된 단일 세포를 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 분자 고정화는 포름알데하이드(formaldehyde), 글루타알데하이드(glutaraldehyde), 염화수은(mercuric chloride) 및 디메틸수베르이미드산염(DIMETHYL SUBERIMIDATE)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 용액을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 세포막 제거는 트리톤계 계면활성제, 사포닌 계면활성제, 폴리소르베이트계 계면활성제 및 설페이트계 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 (a) 단계에서 DNA/RNA 혼성화체의 형성 전 또는 후에, 면역 염색을 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 (b) 단계에서 공간적 분포 분석은 단일 세포를 단일 영역 또는 복수 영역으로 구분하여, 각 영역 내 결합힘이 관찰되는 픽셀 클러스터의 개수를 카운팅하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 마이너 그루브에 염기서열 비특이적으로 결합할 수 있다.

상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체가 결합하는 DNA/RNA 혼성화체의 결합 위치는 RNA 가닥 중 연속적인 2개 염기의 2'-OH기이고, DNA 가닥 중 3개의 포스포데옥시리보스 단위인 것일 수 있다.

상기 DNA/RNA 혼성화체가 결합하는 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체의 결합 위치는 DNA 가닥이 결합하는 Y3, K33 및 K34; 및 RNA 가닥이 결합하는 W17 및 F32인 것일 수 있다.

상기 하이브리드 결합 도메인은 인간 리보핵산가수분해효소 1(ribonuclease , RNase Ⅰ)의 아미노 말단 도메인일 수 있다.

상기 하이브리드 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 하이브리드 결합 도메인의 변이체는 상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase, GST)가 연결된 것; 상기 하이브리드 결합 도메인에 히스티딘-태그가 연결된 것; 상기 하이브리드 결합 도메인에 비오틴화된 것; 및 상기 하이브리드 결합 도메인 내 위치 특이적 돌연변이가 형성된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 연결된 글루타티온 S-전달효소를 포함하는 하이브리드 결합 도메인의 변이체는 글루타티온 S-전달효소가 탐침에 고정되고, 카르복시 말단은 탐침과 반대방향으로 배향되는 것일 수 있다.

본 발명은 샘플의 표지나 증폭과정 없이도, 마이크로 RNA 전구체나 DNA의 결합에 의한 위양성 신호(false positive)를 배제하면서도, 단일 세포 내 극미량의 마이크로 RNA의 고민감도 검출이 가능하다.

또한, 본 발명은 생체 시료 상에서 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성한 후, 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 공간적 분포를 분석함으로써, 단일 세포 내 마이크로 RNA의 나노미터 수준 고해상도 시각화가 가능한바, 세포 다양성 연구 및 단일 세포 진단에 유용하게 활용할 수 있다.

특히, 본 발명에서 단일 세포를 복수 영역으로 구분하는 경우, 각 영역 간의 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 공간적 분포를 비교 분석할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 단일 세포 내 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법을 나타낸 모식도이다.
도 2는 AFM용 캔틸레버의 접근 및 후퇴에 따라 탐침의 표면에 고정된 HBD가 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선에 착탈을 보여주는 모식도이다.
도 3은 프로브 DNA 혼성화 전 및 후, 단일 해마 신경세포 내 miR-134를 AFM을 통해 고해상도로 시각화한 사진이다.
도 4는 HBD와 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 사이의 결합에 따른 힘-거리 곡선, 결합힘 히스토그램 및 결합거리 히스토그램을 나타낸 그래프이다.
도 5는 자극을 가하지 않은 해마 신경세포 및 KCl로 자극을 가한 해마 신경세포를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 각각 측정한 사진이다.
도 6은 자극을 가하지 않은 단일 해마 신경세포의 소마 영역 및 수지상 돌기 영역에서 마이크로 RNA를 고해상도 시각화한 사진이다.
도 7은 KCl로 자극을 가한 단일 해마 신경세포의 소마 영역 및 수지상 돌기 영역에서 마이크로 RNA를 AFM을 통해 고해상도로 시각화한 사진이다.

본 발명자들은 생체 시료 상에서 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성한 후, 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 공간적 분포를 분석함으로써, 단일 세포 내 마이크로 RNA의 나노미터 수준 고해상도 시각화가 가능함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 단일 세포 내 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법을 나타낸 모식도이다.

도 1에 나타난 바와 같이, 먼저, 표적 마이크로 RNA(miRNA)가 포함된 생체 시료 상에 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 접촉시켜 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성한다. 이후, 탐침의 표면에 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD)이 고정된 원자간력 현미경(AFM)용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하여 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석한다.

상기 생체 시료는 돼지, 소, 양, 염소, 생쥐, 흰쥐, 토끼 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물로부터 분리된 것일 수 있고, 그 밖에 기타 동물, 식물, 단세포 생물 등으로부터 분리된 것일 수 있다.

따라서, 상기 생체 시료는 동물 세포, 식물 세포, 미생물 세포, 생체 조직으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 생체 시료가 포유동물로부터 분리된 경우, 상기 생체 시료는 신경세포, 간세포, 내피세포, 및 이들로부터 유래한 암세포 등인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

신경 계통에서 뇌 특이적으로 발현하는 마이크로RNA(miR-134)의 경우, 신경세포의 분화, 수지상 발달, 시냅스의 발달 및 가소성 등의 다양한 기능에 큰 영향을 미쳐, 그 발현양이 달라졌을 때 신경 질환을 유발시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 신경세포를 생체 시료로 하여, 단일 신경세포, 특히, 소마 영역 및 수지상 돌기 영역 내 존재하는 마이크로RNA(예컨대, miR-134) 발현양을 비교 분석하였다.

먼저, 본 발명에 따른 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법을 위해, 상기 (a) 단계 전에, 생체 시료의 분자 고정화 및 세포막 제거를 통해 전처리하여 표적 miRNA가 포함된 생체 시료를 준비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 분자 고정화는 생체 시료 내 분자들(단백질, RNA 등)간의 공유 결합을 통해 고정시키기 위한 전처리 과정으로, 포름알데하이드(formaldehyde), 글루타알데하이드(glutaraldehyde), 염화수은(mercuric chloride) 및 디메틸수베르이미드산염(dimethyl suberimdate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 용액을 이용하여 수행되는 것이 바람직하고, 포름알데하이드를 포함하는 용액을 이용하여 수행되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 파라포름알데하이드(paraformaldehyde; PFA) 4%(v/v)를 포함하는 인산완충생리식염수(Phosphate buffer saline; PBS)를 이용하여 수행하였다.

이때, 상기 분자 고정화는 1℃ 내지 4℃에서 10분 내지 15분 동안 수행됨으로써, 단일세포 내 분자들간의 충분한 공유 결합을 형성시킬 수 있다.

상기 세포막 제거는 생체 시료를 둘러싸고 있는 세포막을 화학적 또는 물리적 방법으로 제거하기 위한 전처리 과정으로, 트리톤계 계면활성제, 사포닌 계면활성제, 폴리소르베이트계 계면활성제(폴리소르베이트 20 등) 및 설페이트계 계면활성제(소듐 도데실 설페이트 등)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행되는 것이 바람직하고, 트리톤계 계면활성제를 이용하여 수행되는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 트리톤계 계면활성제로, Triton X-100을 이용하여 수행하였다.

또한, 상기 세포막 제거는 20℃ 내지 25℃에서 10분 내지 15분 동안 수행됨으로써, 단일세포를 둘러싸고 있는 세포막을 제대로 제거할 수 있다.

이후, 생체 시료의 차단막 형성을 추가할 수 있다. 상기 차단막 형성은 면역 염색시 항체와 비특이적 결합을 방지하기 위해, 면역 염색 전에 수행되는 과정으로서, 차단 용액을 이용하는데, 본 발명에서는 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)이 포함된 차단용액을 이용하였다.

다음으로, 본 발명에 따른 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법을 위해, 표적 마이크로 RNA(miRNA)가 포함된 생체 시료 상에 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 접촉시켜 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.

상기 DNA/RNA 혼성화체의 형성 전 또는 후에, 면역 염색을 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 면역 염색의 순서와 관계 없이, 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD)는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선에 결합할 수 있다.

구체적으로, 상기 면역 염색은 1차 항체 및 2차 항체를 반응시켜 수행될 수 있는 것으로, 면역 염색시 항체와 비특이적 결합을 방지하기 위해서는 차단막 형성이 선행될 필요가 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법을 위해, 원자간력 현미경(AFM)용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하여 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

상기 공간적 분포 분석은 단일 세포를 단일 영역 또는 복수 영역으로 구분하여, 각 영역 내 결합힘이 관찰되는 픽셀 클러스터의 개수를 카운팅하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 결합힘이 관찰되는 픽셀 클러스터란, 캡쳐된 픽셀의 인접 무리를 의미하는 것으로, 예컨대, 동역학적 거동 너비가 약 30 nm인 분자쌍의 경우, 8nm 픽셀로 관찰된 힘-지도의 경우에는 결합힘이 관찰되는 4개의 인접한 픽셀(픽셀 클러스터)의 위치에; 또는 10nm 픽셀로 관찰된 힘-지도의 경우에는 결합힘이 관찰되는 3개의 인접한 픽셀(픽셀 클러스터)의 위치에 이중나선이 존재하는 것으로 결정할 수 있어, 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 공간적 분포 분석이 가능하다.

상기 공간적 분포 분석은 특정 영역의 결합힘-지도화를 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 5회, 더욱 바람직하게는 3회 내지 5회 수행한 평균값으로 결정하는 경우, 더욱 정확한 값을 얻을 수 있다.

상기 단일 세포를 복수 영역으로 구분하는 경우, 각 영역 간의 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 공간적 분포를 비교 분석할 수 있다.

예컨대, 단일 세포로 신경세포를 사용한 경우, 신경세포의 주요 부위인 소마 영역 및 수지상 돌기 영역 내 결합힘이 관찰되는 픽셀 클러스터의 개수를 각각 카운팅하여, 소마 영역 및 수지상 돌기 영역 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 공간적 분포를 비교 분석할 수 있다. 즉, 소마 영역 및 수지상 돌기 영역 내 존재하는 마이크로RNA(예컨대, miR-134) 발현양의 비교 분석이 가능하다.

본 발명에 따른 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법에 사용되는 원자간력 현미경(AFM)용 캔틸레버는 탐침 및 상기 탐침의 표면에 고정된 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함한다.

상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 마이너 그루브에 염기서열 비특이적으로 결합할 수 있는데, 상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체가 결합하는 DNA/RNA 혼성화체의 결합 위치는 RNA 가닥 중 연속적인 2개 염기의 2'-OH기이고, DNA 가닥 중 3개의 포스포데옥시리보스 단위인 것이 바람직하고, 상기 DNA/RNA 혼성화체가 결합하는 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체의 결합 위치는 DNA 가닥이 결합하는 Y3, K33 및 K34; 및 RNA 가닥이 결합하는 W17 및 F32인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 하이브리드 결합 도메인은 인간 리보핵산가수분해효소 1(ribonuclease Ⅰ, RNase Ⅰ)의 아미노 말단 도메인인 것이 바람직하고, 상기 하이브리드 결합 도메인은 서열번호 1(MFYAVRRGRK TGVFLTWNEC RAQVDRFPAA RFKKFATEDE AWAFVRKSAS)의 아미노산 서열로 이루어진 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 상기 하이브리드 결합 도메인의 변이체는 캔틸리버 탐침에 상기 하이브리드 결합 도메인의 배향을 일정하게 고정시켜, 재현성 있는 마이크로 RNA의 고해상도 시각화 결과를 얻기 위한 것이다. 상기 하이브리드 결합 도메인의 변이체는 상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase, GST)가 연결된 것; 상기 하이브리드 결합 도메인에 히스티딘-태그가 연결된 것; 상기 하이브리드 결합 도메인에 비오틴화된 것; 및 상기 하이브리드 결합 도메인 내 위치 특이적 돌연변이가 형성된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있고, 상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase, GST)가 연결된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 연결된 글루타티온 S-전달효소를 포함하는 하이브리드 결합 도메인의 변이체는 글루타티온 S-전달효소가 탐침에 고정되고, 카르복시 말단은 탐침과 반대방향으로 배향될 수 있다.

따라서, 본 발명은 샘플의 표지나 증폭과정 없이도, 마이크로 RNA 전구체나 DNA의 결합에 의한 위양성 신호(false positive)를 배제하면서도, 단일 세포 내 극미량의 마이크로 RNA의 고민감도 검출이 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

제조예: AFM용 캔틸레버의 제조

(1) GST - HBD 융합 단백질 제조

HBD(서열번호 1)를 AFM 캔틸레버 팁에 배향을 조절하여 고정하기 위해, HBD의 아미노 말단에 GST가 결합되어 있는 융합단백질을 생산하였다. 이를 위해 GST-HBD 유전자를 pGEX-4T-1에 클로닝하였다. 상기 융합단백질을 인코딩하는 유전자 벡터로 Escherichia coli BL21(DE3) 세포를 형질 전환(transformation)하여 LB배양액에서 배양하였다. 단백질의 발현은 0.2mM 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 37℃ 에서 4시간 처리함으로써 촉진되었다. 세포는 0.5% Tween 20(v/v)이 포함된 용액에서 초음파로 분쇄되고, 4℃에서 25,000g로 25 분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. GSH-agarose 구슬(bead)이 채워진 column을 이용하여 GST-HBD를 정제하였다. 정제된 단백질들은 농축하여 사용하기 전까지 -80℃ 에서 보관하였다.

(2) 캔틸레버 탐침의 표면에 GST - HBD의 고정

JPK Instruments사의 NanoWizard(원자간력현미경 기기)을 사용하였다. 사용된 캔틸레버는 BudgetSensors 사의 AFM probe(SiNi)에서 평균 약 30 pN/nm의 용수철 상수를 갖는 캔틸레버가 사용되었다.

GST-HBD를 고정하기 위해 캔틸레버 탐침을 세척하고 자기조립 박막을 형성하여 표면 개질하는 과정을 거쳐서, 1차 아민 작용기를 표면에 도입하였다. GST와 특이적으로 결합하는 글루타티온(glutathione, GSH)을 캔틸레버 탐침의 1차 아민기에 링커분자(N-(4-maleimidobutyric acid) hydroxysuccinimide ester (GMBS))를 사용하여 공유결합으로 고정하였다. GST-HBD가 포함된 수용액에 캔틸레버 탐침을 담궈서 탐침의 표면에 도입된 GSH에 GST-HBD가 고정될 수 있도록 하고 과량의 GST-HBD를 세척한 뒤 사용하였다. 완성된 AFM용 캔틸레버의 모식도는 도 2에 도시되어 있다.

실시예 1: 프로브 DNA 혼성화 여부에 따른 단일 해마 신경세포 내 miR-134의 시각화

(1) 프로브 DNA 혼성화 전 단일 해마 신경세포 내 miR -134의 시각화

생쥐(mouse, C57BL/6)의 해마 신경세포(hippocampal neuron)를 1차 배양하여 7일째 되는 날(DIV7) 생체 시료로 사용하였다.

생체 시료를 4℃에서 15분 동안 4%(v/v) PFA/PBS로 분자 고정화하고, 25℃에서 10분 동안 계면활성제인 0.20% Triton X-100 함유 용액을 고정화된 생체 시료 상에 떨어뜨려, 세포막을 제거하였다. 이후, 면역 염색시 항체와 비특이적 결합을 방지하기 위해, 1시간 동안 10% 정상 염소 혈청(normal goat serum)이 포함된 차단 용액(blocking solution)으로 차단막을 형성하였다. 이후, 4℃에서 24 시간 동안, 신경세포의 표지 물질인 생쥐(mouse) 항-MAP2A 항체(Millipore)를 1:500으로 차단 용액에 희석시켜 반응시킨 후, PBS로 3번 세척하였다. 그 다음, 25℃에서 1시간 30분 동안 1:500으로 희석한 Alexa 488 접합 이차 항체(Millipore)를 반응시키고, PBS로 세척하여 면역 염색함으로써, miR-134가 포함된 해마 신경세포를 준비하였다.

형광 현미경으로 단일 해마 신경세포의 위치를 찾은 후, 제조예 1에서 제조된 AFM용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하였다. 단일 해마 신경세포의 임의의 위치에서 1.00㎛×1.00㎛ 영역을 지도화했을 때(10nm 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정, 접근 및 후퇴 속도 2.0㎛/s), 픽셀 클러스터(결합힘이 관찰되는 픽셀이 3 개 이상 인접)가 관찰되지 않았다(도 3a).

(2-1) 면역 염색 및 프로브 DNA 혼성화 후 단일 해마 신경세포 내 miR -134의 시각화

(1) 에서 준비한 miR-134가 포함된 해마 신경세포 상에 miR-134에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA(20μM)가 포함된 용액을 떨어뜨린 후 34℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, 이를 PBS에 담그고 60℃에서 15분 동안 저은 후, PBS로 3번 세척하였다.

형광 현미경으로 (1)과 동일한 단일 해마 신경세포의 위치를 찾은 후, 제조예 1에서 제조된 AFM용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하였다.

단일 해마 신경세포의 임의의 위치에서 1.00㎛×1.00㎛ 영역을 지도화했을 때(10nm 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정, 접근 및 후퇴 속도 2.0㎛/s), 2개의 클러스터(결합힘이 관찰되는 픽셀이 3 개 이상 인접)가 관찰되었다(도 3b).

캔틸레버 탐침이 접촉한 위치에서 마이크로 RNA가 캡쳐되어 있을 경우, HBD와 DNA/RNA 간의 결합을 나타내는 힘-거리 곡선이 관찰되었다. 이러한 힘-거리 곡선을 분석하여 HBD와 DNA/RNA 간의 결합힘 및 결합거리를 알아내었다.

도 4는 HBD와 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 사이의 결합에 따른 힘-거리 곡선, 결합힘 히스토그램 및 결합거리 히스토그램을 나타낸 그래프이다.

도 4에 도시된 힘-거리 곡선과, 결합힘 히스토그램 및 결합거리 히스토그램은 miR-134를 대상으로 하여 얻은 값으로서, 도 4의 히스토그램을 Gaussian 분포에 피팅함으로써 결합힘 및 결합거리의 대표값(±분포의 표준편차)을 각각 21pN, 18nm로 구할 수 있었다. 한편, miR-124 및 miR-486을 대상으로 한 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있었다.

(2-2) 프로브 DNA 혼성화 및 면역 염색 후 단일 해마 신경세포 내 miR -134의 시각화

프로브 DNA 혼성화 후 면역 염색을 실시한 것을 제외하고는, (2-1)과 동일한 방법으로 단일 해마 신경세포 내 miR-134의 시각화한 결과, (2-1)과 동일한 결과가 관찰되었다(도면 미도시).

따라서, 프로브 DNA 혼성화를 통해 DNA/RNA 혼성화체를 형성하는 경우, 면역 염색의 순서와 관계 없이, HBD는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선에 결합함을 확인할 수 있으며, 이러한 결합 여부는 픽셀 클러스터 관찰을 통해 확인되며, 최종적으로, 단일세포 내 마이크로RNA의 발현양을 산출할 수 있음을 의미한다.

실시예 2: KCl 자극 여부에 따른 단일 해마 신경세포( 소마 (soma) 영역 및 수지상 돌기(dendrite) 영역) 내 miR-134의 시각화

(1) 자극을 가하지 않은 단일 해마 신경세포 내 miR -134의 시각화

실시예 1의 (2-2)에서 준비한 miR-134가 포함된 해마 신경세포를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 측정하였다(도 5a). 도 3a에 나타난 것과 같이 Alex 488 파장대에서 녹색의 해마 신경세포의 형광(MAP2A)을 관찰할 수 있으며, 외부 자극이 가해지지 않은 해마 신경세포의 경우 Cy3의 형광(c-Fos)이 거의 나타나지 않음을 확인할 수 있었다.

이후, 제조예 1에서 제조된 AFM용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하였다. 단일 해마 신경세포의 soma 영역(붉은색 박스) 및 dendrite 영역(파란색 박스) 내 1.00㎛×1.00㎛ 영역을 지도화했을 때(10nm 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정, 접근 및 후퇴 속도 2.0㎛/s), soma 영역 내 3개의 픽셀 클러스터(결합힘이 관찰되는 픽셀이 3 개 이상 인접)가, dendrite 영역 내 2 개의 픽셀 클러스터(결합힘이 관찰되는 픽셀이 3 개 이상 인접)가 관찰되었다. 특정 영역의 결합힘-지도화를 반복 수행한 결과, 임의의 soma 영역 내 2~3개의 클러스터가, 임의의 dendrite 영역 내 1~2 개의 클러스터가 평균적으로 관찰되었다(도 6).

(2) KCl로 자극을 가한 단일 해마 신경세포 내 miR-134의 시각화

실시예 1의 (2-2)에서 준비한 miR-134가 포함된 해마 신경세포의 배양액에 KCl 용액을 최종농도가 40 mM이 되도록 주입하여 2 시간 동안 해마 신경세포를 자극하였다.

KCl로 자극을 가한 miR-134가 포함된 해마 신경세포를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 측정하였다(도 5b). 도 5b에 나타난 것과 같이 Alex 488 파장대에서 녹색의 해마 신경세포의 형광(MAP2A)을 관찰할 수 있으며, KCl로 2시간 동안 자극을 가한 해마 신경세포의 경우 핵 내에서 c-Fos 발현량이 급증함을 Cy3 형광신호를 통해 확인할 수 있었다.

이후, 제조예 1에서 제조된 AFM용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하였다. 단일 해마 신경세포의 소마(soma) 영역(붉은색 박스) 및 수지상 돌기(dendrite) 영역(파란색 박스)에서 1.00㎛×1.00㎛ 영역을 지도화했을 때(10nm 픽셀 크기, 픽셀 당 5회 측정, 접근 및 후퇴 속도 2.0㎛/s), soma 영역 내 11개의 픽셀 클러스터(결합힘이 관찰되는 픽셀이 3 개 이상 인접)가, dendrite 영역 내 5개의 픽셀 클러스터(결합힘이 관찰되는 픽셀이 3 개 이상 인접)가 관찰되었다. 특정 영역의 결합힘-지도화를 반복 수행한 결과, 임의의 soma 영역 내 8~12개의 클러스터가, 임의의 dendrite 영역 내 4~5개의 클러스터가 평균적으로 관찰되었다(도 7).

따라서, KCl로 자극을 가한 단일 해마 신경세포 내 존재하는 miR-134 발현양의 경우, 자극을 가하지 않은 단일 해마 신경세포 내 존재하는 miR-134 발현양 보다 2~4배 정도 증가함을 확인할 수 있었다.

또한, soma 영역 및 dendrite 영역 내 존재하는 miR-134의 발현량은 서로 상이한 것으로 확인되는바, 신경세포의 각 주요 영역에 따라 miR-134의 발현량의 차이가 나타나는 것을 의미한다. 따라서, 단일세포 내 미량의 마이크로RNA를 시각화하기 위해서는 다중 영역으로 구분한 후, 각 영역 별로 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 공간적 분포를 분석하는 것이 보다 정확한 결과를 보장한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> METHOD FOR HIGH RESOLUTION VISUALIZATION OF MICRORNA IN SINGLE CELL <130> PB15-12818 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hybrid binding domain <400> 1 Met Phe Tyr Ala Val Arg Arg Gly Arg Lys Thr Gly Val Phe Leu Thr 1 5 10 15 Trp Asn Glu Cys Arg Ala Gln Val Asp Arg Phe Pro Ala Ala Arg Phe 20 25 30 Lys Lys Phe Ala Thr Glu Asp Glu Ala Trp Ala Phe Val Arg Lys Ser 35 40 45 Ala Ser 50

Claims

(a) 생체로부터 분리되고, 표적 마이크로 RNA(miRNA)가 포함된 세포 포함 시료 상에 상기 표적 miRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 포함하는 프로브 DNA를 접촉시켜 DNA/RNA 혼성화체를 인시츄(in-situ) 형성하는 단계, 및
(b) 원자간력 현미경(AFM)용 캔틸레버를 통해 특정 영역의 결합힘-지도화를 수행하여 상기 시료 중 단일 세포 내 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선의 존재를 검출하고, 공간적 분포를 분석하는 단계를 포함하되;
상기 캔틸레버는 탐침 및 상기 탐침의 표면에 고정된 하이브리드 결합 도메인(hybrid binding domain, HBD) 또는 이의 변이체를 포함하는
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계 전에, 생체로부터 분리되고, miRNA가 포함된 세포 포함 시료의 분자 고정화 및 세포막 제거를 통해 전처리하는 단계를 추가로 포함하는
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제2항에 있어서,
상기 분자 고정화는 포름알데하이드(formaldehyde), 글루타알데하이드(glutaraldehyde), 염화수은(mercuric chloride) 및 디메틸수베르이미드산염(DIMETHYL SUBERIMIDATE)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 용액을 이용하여 수행되는 것인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제2항에 있어서,
상기 세포막 제거는 트리톤계 계면활성제, 사포닌 계면활성제, 폴리소르베이트계 계면활성제 및 설페이트계 계면활성제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 이용하여 수행되는 것인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 DNA/RNA 혼성화체의 형성 전 또는 후에, 면역 염색을 실시하는 단계를 추가로 포함하는
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 공간적 분포 분석은 단일 세포를 단일 영역 또는 복수 영역으로 구분하여, 각 영역 내 결합힘이 관찰되는 픽셀 클러스터의 개수를 카운팅하여 수행되는 것인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제1항에 있어서,
상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체는 DNA/RNA 혼성화체의 이중나선 마이너 그루브에 염기서열 비특이적으로 결합하는
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제7항에 있어서,
상기 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체가 결합하는 DNA/RNA 혼성화체의 결합 위치는 RNA 가닥 중 연속적인 2개 염기의 2'-OH기이고, DNA 가닥 중 3개의 포스포데옥시리보스 단위인 것인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제7항에 있어서,
상기 DNA/RNA 혼성화체가 결합하는 하이브리드 결합 도메인 또는 이의 변이체의 결합 위치는 DNA 가닥이 결합하는 Y3, K33 및 K34; 및 RNA 가닥이 결합하는 W17 및 F32인 것인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제1항에 있어서,
상기 하이브리드 결합 도메인은 인간 리보핵산가수분해효소 1(ribonuclease Ⅰ, RNase Ⅰ)의 아미노 말단 도메인인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제1항에 있어서,
상기 하이브리드 결합 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제1항에 있어서,
상기 하이브리드 결합 도메인의 변이체는
상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase, GST)가 연결된 것;
상기 하이브리드 결합 도메인에 히스티딘-태그가 연결된 것;
상기 하이브리드 결합 도메인에 비오틴화된 것; 및
상기 하이브리드 결합 도메인 내 위치 특이적 돌연변이가 형성된 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.
제12항에 있어서,
상기 하이브리드 결합 도메인의 아미노 말단에 연결된 글루타티온 S-전달효소를 포함하는 하이브리드 결합 도메인의 변이체는 글루타티온 S-전달효소가 탐침에 고정되고, 카르복시 말단은 탐침과 반대방향으로 배향되는 것인
마이크로 RNA의 고해상도 시각화 방법.