WO2013022313A2 - 물질의 고집적 디스플레이를 토대로 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서 표적물질과의 상호작용을 정량적으로 감지 및 효과적으로 표지하는 방법 - Google Patents

물질의 고집적 디스플레이를 토대로 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서 표적물질과의 상호작용을 정량적으로 감지 및 효과적으로 표지하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention utilizes energy transfer and signal changes that occur effectively in highly integrated markers to display materials at high density in a nano-assembly matrix, thereby providing a high level of integration between the highly integrated probes.
  • the present invention relates to a method for quantitatively detecting and detecting effectively occurring interactions and sensitively labeling and separating target substances that effectively interact with highly integrated search materials. That is, a method for quantitatively detecting interactions between various bioactive substances occurring in vitro or in vivo based on a highly integrated display, and a method for sensitively labeling target substances interacting with them. It is about.
  • proteins in vivo exert their function by interacting with other proteins.
  • two proteins of complementary structure interact with each other, and the bioactive compound specifically interacts with a specific part of the tertiary structure of the protein.
  • the interaction between two proteins strongly suggests that these proteins are functionally related, and bioactive compounds that specifically interact with specific regions of the protein may be linked to, for example, disease related
  • the development of therapeutic agents that can diagnose, prevent, treat or alleviate diseases is presented.
  • new target proteins can be detected or new drugs can be identified by confirming the interaction between "bait", a substance whose functions and characteristics are already known, and "prey,” an interaction partner to be searched and detected.
  • Various methods for screening bioactive substances as candidates have been studied.
  • Target proteins also enhance understanding of biological pathways and delivery systems and provide information on basic cell regulation and disease mechanisms, which can assist in the discovery and detection of bioactive compounds that interact with target proteins. This is a very surprising and powerful means for the development of new drugs, the improvement of conventional drugs and the discovery of new pharmaceutical uses.
  • target screening is used to identify low molecular weight compounds according to a desired phenotype from a large library of compounds (Strausberg, RL at al., Science 300: 294, 2003; Stockwell, BR Nature 432: 846, 2004).
  • this approach is not easy to identify the low molecular weight compounds found.
  • the effective detection of various intracellular molecular interactions, such as protein (or low molecular weight) -protein interactions is essential for the understanding of dynamic biological processes and regulatory networks, the development of such target identification techniques has led to genetics, proteomics and It is very important in a variety of life sciences, including system biology.
  • the underlying technology analyzes the diversity of interactions between bioactive substances and molecules (eg, interactions between bioactive small molecule and proteins) in living cells over a wide range of different tissues and disease states. It has many limitations and needs to develop new infrastructure technology.
  • the inventors of the present invention in Korea Patent Publication No. 2009-0018585 whether or not to form a nano-assembly matrix (nano-assembly matrix formation) according to the dynamic interaction between the various physiologically active substances (Polymers)
  • the method of exploring and verifying the interactions between the bioactive substances is disclosed by analyzing whether the co-localization on nano-assembly matrix through imaging. This method can qualitatively search and verify the interaction and the like through imaging through a microscope.
  • various physiological (high unit) complexes exist in the form of "-some” or “complex” such as signalsomes in cells and exosomes outside cells in vivo.
  • the presence of one or several physiologically active substances such as related proteins in the physiological high unit complex has been found to effectively regulate specific physiological functions in cells or in vivo.
  • multi / poly-valent interactions play a very important role in most physiological regulation in cells or in vivo as in efficient physiological regulation mediated based on these complexes (Mammen, M. et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 37: 2755, 1998; Kiessling, LL et al., Angew. Chem. Int. Ed. 45: 2348, 2006). That is, multi / poly-valent interactions play an important role in interactions between most bioactive substances such as proteins, rather than mono-valent interactions.
  • the present inventors conducted additional studies based on the high integration characteristics of the physiological complexes, and thus, the present inventors can further quantitatively analyze and search, and detect and label more effectively, instead of qualitative analysis through eye-analysis imaging.
  • the present inventors can further quantitatively analyze and search, and detect and label more effectively, instead of qualitative analysis through eye-analysis imaging.
  • the present inventors can further quantitatively analyze and search, and detect and label more effectively, instead of qualitative analysis through eye-analysis imaging.
  • FRET fluorescence analysis or fluorescence resonance
  • the present invention provides a novel method of sensitively labeling or isolating and identifying a target substance interacting with it by displaying a specific bioactive substance "bait”.
  • the present invention provides a method for quantitatively detecting and detecting an interaction between a specific bioactive substance "bait” and a search and detection target bioactive substance "prey” and a “prey” interacting with the "bait”. It is an object of the present invention to provide a detection method.
  • the present invention is to search for a target material that blocks, inhibits (inhibits), activates or induces the interaction of the "bait” and “play”, and detects the target material of interest It is an object to provide a method.
  • the present invention provides a method for labeling or isolating a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method of labeling or isolating a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method of labeling or isolating a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method of labeling or isolating a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method of labeling or isolating a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method for separating a target material interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method for separating a target material interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method for separating a target material interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method for separating a target material interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method for separating a target material interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also provides a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the prey material library and the nano-high unit complex forming material.
  • the present invention also provides a method for detecting or quantifying the interaction of a substance, comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for detecting or quantifying the interaction of a substance, comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for detecting or quantifying the interaction of a substance, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for detecting or quantifying the interaction of a substance, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for detecting or quantifying the interaction of a substance, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the invention also provides a method for exploring or quantifying the interaction of a substance, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the prey material and the nano-high unit complex forming material.
  • the present invention also provides a targeting, imaging or diagnostic composition associated with a disease, comprising nano-high complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a targeting, imaging or diagnostic composition associated with a disease, comprising nano-high complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a targeting, imaging or diagnostic composition associated with a disease, comprising nanounit complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a targeting, imaging or diagnostic composition associated with a disease, comprising nanounit complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a target, imaging or diagnostic composition comprising the nanounit complex separated by the following steps:
  • the present invention also provides a targeting, imaging or diagnostic composition associated with a disease, comprising nano-high complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a targeting, imaging or diagnostic composition associated with a disease, comprising nano-high complexes separated by the following steps:
  • the invention also provides a method of targeting, imaging or diagnosing a disease of a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the present invention also comprises the steps of introducing the isolated nano-unit complex or nano-unit complex in cells, tissues or in vivo to react with the fray library; And labeling the prey bound by interacting with the bait material and / or mediator that are highly integrated in the nano-high complex as a target material, and measuring the transmission or change of energy signals to target, imaging or A method of targeting, imaging, or diagnosing a disease of a target material interacting with bait, comprising the step of diagnosing.
  • the present invention also provides a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material, comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material, comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material, comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material, comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the present invention also provides a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material, comprising the following steps:
  • bait materials Prey substance; And providing the nanohigh unit complex forming material in the same field or system.
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the prey material and the nano-high unit complex forming material.
  • FIG. 1 shows a construct for exploring interactions between X and Y in nanocomposites when the formation of nanocomposites is induced by direct or indirect interactions between mediators A and B.
  • a and B and C and X and Y are the same or different materials; N is the nanohigh-molecular complex forming material).
  • Labelers are attached to one or more of N, X, Y, A, B, and C to measure the transfer and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • FIG. 2 illustrates the formation of a nano-high complex by the interaction between the first mediator (regulator) A, B, and C, and the searcher X by the interaction between the second mediator (regulator), D, E, and F.
  • Labelers are attached to one or more of N, X, Y, A, B, C, D, E, and F to measure the transmission and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • FIGS. 3 (A) and (B) are schematic diagrams of constructs for exploring direct or indirect interactions between X and Y in nanounit complexes (X and Y and A are the same or different materials; N is Nano high unit complex material). Labelers are attached to one or more of N, X, Y, A to measure the transmission and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • FIGS. 6 are schematics of constructs for exploring direct or indirect interactions between X and Y in nano-high complexes
  • X and Y and A are the same or different materials
  • A use the same nano high unit complexes
  • B different types of nano high unit complexes.
  • Labelers are attached to one or more of N, X, Y, A to measure the transmission and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • Figure 7 is a schematic diagram of the composition for exploring the interaction between X and Y in a situation where direct or indirect interaction between A and B occurs in the nano-high complex (A and B and C and X and Y are the same or different materials; N and N 'are nano-high complex complexes; (A) using the same nano-high complex complexes, (B) different kinds of nano-high complex complexes Use).
  • Labelers are attached to one or more of N, X, Y, A, B, and C to measure the transfer and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • FIGS. 8 (A) and (B) are schematic diagrams of components for exploring the interaction between X and Y in a situation where direct or indirect interactions between A and B occur in the nano-high-composite complex
  • a and B and C and X and Y are the same or different materials
  • N is the nanohigh-molecular complex forming material
  • Labelers are attached to one or more of N, X, Y, A, B, and C to measure the transfer and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • FRET FKBP-labeled
  • YFP FRB-labeled
  • FRET FKBP-labeled (mCerulean) -FT and FRB-labeled (mCitrine) -FT highly integrated in nano-higher complexes formed from ferritin protein (FT) in HeLa cells. This is a quantitative analysis of FRET results depending on the presence of rapamycin).
  • FRET 12 is a mediator (regulator) of the interaction of FKBP-labeled (mCerulean) -FT and FRB-labeled (mCitrine) -FT highly integrated in nano-higher complexes formed from ferritin protein (FT) in HeLa cells. rapamycin), depending on the presence of A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET image taken.
  • FIG. 13 shows the mediation (regulation) of the interaction of FKBP-labeled (mCerulean) -FT and FRB-labeled (mCitrine) -DPS highly integrated on nano-higher complexes formed from ferritin (FT) and DPS proteins in HeLa cells This is a quantitative analysis of FRET results based on the presence of rapamycin.
  • FIG. 14 mediates (modulates) the interaction of FKBP-labeled (mCerulean) -FT and FRB-labeled (mCitrine) -DPS highly integrated with nano-higher complexes formed from ferritin (FT) and DPS proteins in HeLa cells.
  • FKBP-labeled (mCerulean) -FT and FRB-labeled (mCitrine) -DPS highly integrated with nano-higher complexes formed from ferritin (FT) and DPS proteins in HeLa cells.
  • FT ferritin
  • FIG. 14 mediates (modulates) the interaction of FKBP-labeled (mCerulean) -FT and FRB-labeled (mCitrine) -DPS highly integrated with nano-higher complexes formed from ferritin (FT) and DPS proteins in HeLa cells.
  • FT ferritin
  • FIG. 14 mediates (modulates) the interaction of FKBP-labeled (mCerul
  • FIG. 15 shows FRB-labeled (mCitrine) -FT highly integrated in nanounit complexes of ferritin (FT) and DPS protein in HeLa cells;
  • FIG. 16 shows nanoparticles of FKBP-labeled substance (mCerulean) -FT and DPS protein highly integrated in nano-unit complexes formed by FKBP (F36M) 2, the first mediator (regulator) from ferritin (FT) protein in HeLa cells
  • FKBP F36M
  • F36M the first mediator
  • FT ferritin
  • FIG. 17 shows the presence of rapamycin that mediates the interaction of FRB-labeled mCitrine-FT and FKBP-mCerulean highly integrated in nanounit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. It is a quantitative analysis of FRET results depending on whether
  • FIG. 18 is the presence of a rapamycin that mediates the interaction of FRB-labeled mCitrine-FT and FKBP-mCerulean highly integrated in nanounit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. Depending on whether A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET image taken.
  • FIG. 19 shows the presence of a rapamycin that mediates the interaction of FKBP-labeled mCerulean-FT with FRB-labeled mCitrine in the nanounit complex of ferritin (FT) protein in HeLa cells. It is a quantitative analysis of FRET results depending on whether
  • FIG. 20 shows the presence of rapamycin that mediates the interaction of FKBP-labeled mCerulean-FT with FRB-labeled mCitrine in the nanounit complex of ferritin (FT) protein in HeLa cells. Depending on whether A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET image taken.
  • FIG. 21 shows the interaction of FRB-labeled mCitrine-DPS and FKBP-mCerulean highly integrated on the nanounit complex of DPS protein in HeLa cells according to the presence of rapamycin. This is a quantitative analysis of the FRET results.
  • FIG. 22 shows the interaction of FRB-labeled mCitrine-DPS with FKBP-mCerulean highly integrated on the nanounit complex of DPS protein in HeLa cells according to the presence of rapamycin.
  • FIG. 23 shows the presence of rapamycin that mediates the interaction of FRB-labeled (ECFP) -FT and FKBP-labeled (EYFP) highly integrated in nanounit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. It is the result of quantitative analysis of FRET results depending on whether or not.
  • ECFP FRB-labeled
  • EYFP FKBP-labeled
  • FIG. 24 shows the interaction of DHFR-labeled (mRFP) -FT and methotrexate-fluorescein highly integrated in nano-high-unit complexes as the nano-high-unit complexes of ferritin (FT) proteins were formed in HeLa cells. The result of quantitative analysis of FRET results at second intervals.
  • FIG. 25 shows the presence of rapamycin that mediates the interaction of FKBP-labeled (mRFP) -FT and FRB-labeled (EGFP) highly integrated in nanounit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. It is the result of quantitative analysis of FRET results depending on whether or not.
  • mRFP FKBP-labeled
  • EGFP FRB-labeled
  • FIG. 26 shows the interaction of marker (CFP) -FT and RelA-labeler (YFP) and IkBa-labeler (CFP) -FT and RelA-, which are highly integrated on nanounit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells.
  • the result of quantitative analysis of FRET results according to the interaction of the labeling substance (YFP) at second intervals.
  • FIG. 27 shows FRB-FKBP-mCerulean-FT-integrated (rapamycin) -inhibitor (FK506) highly integrated in nanounit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. The results of quantitative analysis of the distribution, intensity, magnitude, and numerical results of nano-high-unit complex-forming signals according to the presence of.
  • FIG. 28 shows FRB-FKBP-labeled (mCerulean) -FT and DHFR-labeled (mRFP) -FT as a mediator (rapamycin) highly integrated on nano-high-unit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. It is the result of quantitative analysis of the interaction signal change between DHFR and methotrexate-fluorescein depending on the presence of.
  • FIG. 29 shows FRB- / FKBP-labeled (mRFP) -FT and IkBa-labeled (ECFP) -FT as a mediator (regamycin) of highly integrated display of nano-unit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. Quantitative analysis of the interaction signal change between IkBa and RelA-labeled substance (YFP) depending on the presence of).
  • mRFP FRB- / FKBP-labeled
  • ECFP IkBa-labeled
  • FIG. 30 shows FKBP- / FRB-labeled (mRFP) -FT and DHFR-labeled (mRFP) -FT mediated (regamycin) highly integrated on nano-high-unit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells. Quantitative analysis of the interaction signal change between DHFR and methotrexate-fluorescein.
  • Figure 31 shows the number of FKBP (F36M) FKBP (F36M) -5-labeled substance (mRFP) -FT mediated (regulator) FKBP (F36M) highly integrated in the nano-high unit complex of ferritin (FT) protein in HeLa cells 5) This is the result of quantitative analysis of the intensity and magnitude change of nano-high complex formation signal depending on the presence or absence of FK506.
  • FIG. 32 shows that FKBP (F36M) 2-labeled substance (mRFP) -FT and FRB-labeled substance (EGFP) are mediated (regulatory) by the highly integrated display of nano-high-unit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells.
  • FKBP F36M 2-labeled substance
  • mRFP 2-labeled substance
  • EGFP FRB-labeled substance
  • the quantitative and second interval analysis of the interaction signal change between FRB and FKBP depends on the presence of.
  • FIG. 33 shows FKBP (F36M) 2-label (mRFP) -FT and IkBa-label (ECFP) -FRB as a mediator (regulator) of the high-density nanocomplex of ferritin (FT) protein in HeLa cells. It is the result of quantitative analysis of the change of interaction signal between IkBa and RelA-labeled substance (EYFP) at intervals according to the presence of rapamycin).
  • FIG. 34 shows FKBP (F36M) 2-labeled (mRFP) -FT and DHFR-labeled (mRFP) -FT mediated (regulatored) material highly integrated on nano-high-unit complexes of ferritin (FT) proteins in HeLa cells.
  • FKBP F36M 2-labeled
  • mRFP 2-labeled
  • mRFP DHFR-labeled
  • FT ferritin
  • RAB5A early endosomal interacting material
  • RAB7A late endosomal interacting substances
  • FIG. 37 is an imaging photograph of Golgi target material detected and labeled with nuclear staining by DAPI using GolNT2, a highly integrated display of GolNT2 interacting substance on fermentin (FT) protein nano-high complex in HeLa cells.
  • FT fermentin
  • FIG. 38 is a schematic diagram of effectively detecting and labeling a target material interacting with the same using a highly integrated material displayed on a nano-high complex.
  • physiologically active compound refers to a compound which binds to a biological material including a protein, nucleic acid, sugar or lipid and modulates their function or activity in vivo.
  • bioactive compounds are extracted from organisms or obtained by chemical synthesis.
  • antibiotics including "cyclosporin A” (Novartis AG) and "FK506” (Fujisawa) are used to mitigate the immune rejection reactions of organ transplants from microorganisms, plants or marine organisms. Separated.
  • Such natural or synthetic physiologically active compounds are tested as their pharmacological activity and are developed as a new drug through clinical trials using animal and human models.
  • the "physiologically active substance” may be defined as a substance that plays a role of regulating a function of a living body to enhance or inhibit the function of a living body.
  • physiologically active substances can be obtained from natural products such as plants and animals, or can be extracted and purified from microorganisms and metabolites of animal and plant cell lines or obtained by chemical synthesis.
  • the bioactive substance may be, for example, a nucleic acid, a nucleotide, a protein, a peptide, an amino acid, a sugar, a lipid, a vitamin or a chemical compound, or the like.
  • bait material means a bioactive material used to explore interactions with other bioactive materials.
  • prey substance means a bioactive substance that is to be searched (analyzed) or detected as an interaction partner of the "bait”.
  • target substance is a term used to collectively refer to a substance to be detected, and may be used as a target substance as a target substance which is a partner which interacts with "bait” as desired.
  • the target material may be a substance that activates, induces, blocks, or inhibits the interaction of the compounds. That is, it includes all the substances to be identified. Among them, substances that inhibit or inhibit the interaction between bait and prey substances are defined as 'inhibitors', and substances that promote or induce are defined as 'promoters'.
  • the term "modulator” refers to a substance that is directly or indirectly related to or interacts with a substance that mediates the function of a cell to be controlled, and the search substance may be a regulator as desired. It may be used to mean a substance that interacts with a probe substance, which activates, induces, blocks, or inhibits intracellular functions mediated by the probe substance or modulator. Inhibiting substances may be used as control substances.
  • a "nano-assembly matrix” refers to a high unit complex (eg, high density) that can be easily observed at high density by the interaction of a nano unit complex with a constant structural skeleton.
  • a high unit complex formed by nanounit complexes having a constant structural skeleton formed by binding proteins 24 subunits such as ferritin through self-assembly to each other the amplified high signal intensity point image that can be easily observed in the present invention. It may be used in the same concept as a pattern).
  • nanoclusters and nanoassemblies are all used in the same sense as nano-higher complexes.
  • the interactions between the probes or the intermediary (regulator) materials are used.
  • the highly integrated complex of nano unit complexes was expressed as nano high unit complex formation, which can be confirmed by the transmission and change of energy signals.
  • transmission and change of energy signals refers to images generated from highly integrated display labels (fluorescent materials, luminescent materials, magnetic materials, enzymes for ELISA or radioactive materials) directly or indirectly in nano (high) unit complexes. Intensity and pattern (e.g., number, area and intensity and distribution in image form such as dot) and signal intensity and pattern (e.g. pulse in Flow Cytometry) Number, width, area, height, distribution, etc.), and further energy generated by resonances in these labels. And various changes such as the intensity and pattern of an image and a signal generated by transfer, interference, and quenching between energy. Therefore, the integrated display includes the transfer of energy signals and various changes occurring between the labels or the labels.
  • a material capable of forming a nano high unit complex means any material having a property and a function capable of forming the nano high unit complex.
  • a poly / multi-valent substance having a plurality of identical or different binding moeity such as ferritin
  • it is complex by interaction or self-assembly with each other.
  • a high signal intensity point image pattern observable by the interaction between mediators (regulators), or a nano-high complex that is, a material forming an observable high signal intensity point image pattern by the interactions between search materials it means.
  • nano unit complex means a complex formed as a base of the nano-high unit complex by self-assembly of proteins or the like. For example, 24 subunits of ferritin protein self-assemble to form nanounit complexes.
  • mediator refers to a material that induces the formation of a nano-unit complex, which is formed by direct or indirect bonding, interaction and fusion with the nano-unit complex forming material. Includes all cases that can lead to Substances that mediate or regulate the activity of such mediators (modulators) may also be referred to as mediators (regulators) in a broad sense.
  • mediator is a concept encompassing not only a specific compound such as a specific compound or protein that induces the formation of a nano-high complex, but also a phenomenon such as a specific mutation and a specific physiological signal.
  • nanohigh-level complexes can be achieved through interactions between proteins according to physiological signals, RNA-protein interactions, specific mutations of specific proteins, or the use of proteins that only respond to specific compounds. Inducible, and are referred to herein as 'mediated (modulator) substances'.
  • label refers to magnetic materials, ELISA enzymes, and radioactive materials that bind to a substance for detection of a signal, including nano-high complex forming materials, bait materials, prey materials, mediators, target materials, and the like. , Fluorescent material, luminescent material and the like.
  • the labeling material may also include labeling inhibitors such as radioactive material, fluorescent material, and gold particles quenching the luminescent material, and in this case, the signal may be detected to decrease or disappear according to the interaction. This is collectively referred to as 'label material' in this specification.
  • display refers to exposing or loading material into or out of a nano (high) composite directly or indirectly through another material. Include form.
  • the present invention in one aspect, relates to a method of labeling or isolating a target substance (“prey”) that interacts with a particular substance (eg, a specific bioactive substance) “bait” in vitro or in vivo .
  • a target substance e.g, a specific bioactive substance
  • a mediator (battery) material As a first specific method of the present invention for labeling or isolating a target material, (i) providing a mediator (battery) material, a bait material and a nano-high complex complex material in the same field or system, At this time, the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material; (ii) forming nano-high unit complexes by the interaction between the mediators to highly display the bait materials; (iii) providing a prey material library to the nano-high complex, and labeling the prey as a target material to be bound through interaction with the bait material highly integrated in the nano-high complex; And (iv) identifying the labeled target material as a transfer or change of energy signal, or isolating and identifying the identified target material.
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • Specific first and second method of the present invention is to form a nano-unit complex by the mediator (regulator) material, and then to the prey material interacting with the bait material displayed on the formed nano-unit complex It can be labeled, separated and identified.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a specific first method of the present invention, in which the formation of a nano-high complex is induced by direct or indirect interactions between mediators A and B in a nano-high complex.
  • a schematic of the construct for exploring the interaction between X and Y (A, B, C, X and Y are the same or different materials; N is the nanohigh-molecular complex forming material).
  • nano-high unit complexes are formed by the interaction of mediators (regulators) that are bound to the nano-high unit complexes, and thus, the bait material bound to the nano-high unit complexes is formed. It will be displayed in high density on the nano-high complex formed.
  • Labelers are attached to one or more of N, X, Y, A, B, and C to measure the transfer and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • Figure 2 is a schematic diagram of a second specific method of the present invention, while the formation of the nano-high unit complex by the interaction between the first mediator (regulator) A, B, C, the second mediator (regulator) D
  • N is the nanohigh unit complex forming material).
  • the nanohigher-level complex is formed by direct or indirect interaction through C of the first mediator (regulating) material bound to the nanohigher-unit complex forming material, and thus, the second intermediate (modulating) Since the bait material (X) bound thereto by the material E is displayed on the nano-high complex, the labeling material is applied to one or more of N, X, Y, A, B, C, D, E, and F. And measure the transmission and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • a third specific method of the present invention relates to a method of labeling or isolating a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a third specific method of the present invention, which is a schematic diagram of a construct for exploring direct or indirect interactions between X and Y in a nanounit complex (where X, Y, and A are the same or Different materials; N is a nanohigh unit complex forming material).
  • the bait material bonded to the nano-high unit complex forming material is displayed on the nano unit complex by forming the complex by the self-assembly of the nano high unit complex forming material, whereby N, X, Y, A Labeling materials are attached to one or more of these to measure the transmission and change of energy signals generated by interactions between the bait materials.
  • a fourth specific method of the present invention relates to a method for labeling or isolating a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a fourth specific method of the present invention, which is a schematic diagram of a composition in which the formation of the nano-high unit complex is induced by direct or indirect interaction between the bait materials as a search material (X and X).
  • X and X search material
  • 'And A are the same or different materials
  • N and N' are nano-higher complex formers
  • A) use the same nano-higher complex formers
  • B use different kinds of nano-higher complexes
  • C Using the same type of bait material).
  • the bait material bound to the nano-high unit complex forming material forms the nano-high unit complex by the interaction between the bait materials and is highly integrated therewith, thereby making one of N, X, X ', A or Labelers are attached to further substances to measure the transmission and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • a fifth specific method of the present invention relates to a method for labeling or isolating a target substance which interacts with a bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • Figure 5 is a schematic diagram of a fifth specific method of the present invention, in which the interaction between X and X 'in the nano-high complex by A and B or a, B and C, which is a mediator (regulator) that is bound to each probe, It is a schematic diagram of the composition indirectly made by (X and X 'and A and B and C are the same or different material; N and N' is a nano-high unit complex forming material; (A) using the same nano-high unit complex forming material) (B) using different types of nano-high-molecular complexes, (C) using the same type of search material). As shown in FIG.
  • the bait material bound to the nano-high complex complex material is displayed on the nano-high complex complex formed by direct or indirect interaction through C between the mediators fused thereto.
  • Labeling materials are attached to one or more of N, X, X ', A, B, or C to measure the transmission and change of energy signals generated by interactions between the probes.
  • the separation of the target material interacting with the bait of the present invention can be separated as follows without the labeling step of the target material.
  • a method for separating the target material interacting with the bait comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • a method for separating a target material interacting with a bait comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • a method for separating a target material interacting with bait comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • a method for separating a target material interacting with a bait comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • a method of separating a target material interacting with a bait comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material and the nano-high unit complex forming material;
  • the material forming the nano-high complex that is, the nano-high complex forming material, bait material, prey material, nano-high complex formation inducing mediator (regulator) material, and the labeling material
  • the bonds between the materials used in may include physical, chemical, electrostatic and biological direct or indirect bonds.
  • a probe including an antibody, a protein, a protein domain, a protein motif, a peptide, or the like may be used.
  • a substance which does not interact with the bait material and the prey material may be further added and displayed on the nano-high unit complex forming material. If the bait material and the material that do not interact with the prey material are displayed together with the nano-high unit complex forming material, the integration degree and the spacing can be properly adjusted, and thus the sensitivity of the FRET can be properly adjusted.
  • the method of the present invention can easily isolate and identify the target material, and in particular, has the advantage of improving the detection and analysis of the target material at high throughput. Therefore, the present invention can be carried out not only in vitro but also in vivo .
  • the nanomaterial complexes or nanounit complexes are formed in cells to target the target material by highly integrated bait material. Highly collected and easily separated.
  • the method of the present invention is very useful because it is possible to easily isolate the nano-high complex or nano-unit complex by lysing the cell to obtain a high concentration of the target material therefrom. .
  • the formation of the nano-unit complex is a method for detecting magnetic, radioactive, ELISA enzyme, fluorescent or luminescent material and optical method, microscope, imaging system, scanner, reader, spectrophotometer (spectrophotometer) Can be measured or detected using commonly known methods such as magnetic resonance imaging (MRI), SQUID, MR relaxometer, fluorescene associated cell sorting (FACS), fluorometer and luminometer. Can be.
  • the separation of the target material may use a known general separation method, but for example, electrophoresis, mass spectrometer, metabolite separation and analysis method, protein separation and analysis method, chromatography, optical method , Microscopes, imaging systems, scanners, readers, spectrophotometers, magnetic resonance imaging (MRI), SQUID, MR relaxometer, fluorescene associated cell sorting (FACS), fluorometers and luminescence Separation and identification may be carried out by a method such as a luminometer.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • SQUID magnetic resonance imaging
  • MR relaxometer fluorescene associated cell sorting
  • FACS fluorescene associated cell sorting
  • the present invention relates to a method for detecting a target substance that interacts with a particular substance (eg, a specific bioactive substance) "bait" in vitro or in vivo .
  • a particular substance eg, a specific bioactive substance
  • a method of detecting a target substance interacting with a bait comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides, as a second specific method, a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides, as a specific third method, a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides a method of detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps as a fourth specific method:
  • the labeling material is bound to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the present invention also provides, as a specific fifth method, a method for detecting a target substance interacting with bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bound to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material library.
  • the nano-unit complex forming material may be bonded to the prey material to form the nano-unit complex by interaction between the bait material and the prey material.
  • the sixth method provides a method for detecting a target substance interacting with a bait, comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the prey material library and the nano-high unit complex forming material.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a sixth specific method of the present invention, which is a schematic diagram of a structure for exploring direct or indirect interactions between X and Y in a nano-high complex (X, Y and A are the same) Or different materials; N and N 'are nanohigh unit complex formers; (A) using the same nano high unit complexes, (B) different types of nano high unit complexes).
  • the bait material and the prey material bound to the nanohigh unit complex forming material form the nano high unit complex through direct interaction or indirect interaction through A, and thus, N, X, Y
  • the transfer and change of energy signals generated by the interaction between the probes are measured.
  • FIG. 7 is another schematic diagram of a seventh specific method of the present invention, in which a structure for searching for an interaction between X and Y in a situation where direct or indirect interaction between A and B occurs in a nano-high complex Schematic (A, B, C, X and Y are the same or different materials; N and N 'are nano-high-molecular complexes; (A) using the same nano-high-molecular complexes, (B) different types of nano Use of high unit complexes).
  • the bait material fused to the mediator modulator is bound to the nano-unit complex forming material by the interaction between the mediators, and the interaction of the prey material bound to the nano-unit complex forming material.
  • FIG. 8 is another schematic view of the sixth specific method of the present invention, in which (A) and (B) show a relationship between X and Y in a situation in which direct and indirect interactions between A and B occur in the nano-high complex.
  • a schematic of the construct for exploring interactions (A and B and C and X and Y are the same or different materials; N is the nanohigh-molecular complex forming agent; (A) when X has no interaction with each other, (B) ) X interacts with each other).
  • the bait material fused to the mediator is bound to the nano-high complex complex material by the interaction between the mediators, and is also bound to the mediators to interact with the mediators.
  • the present invention provides a method for in vitro or in vivo interaction between a particular substance (eg, a specific bioactive substance) "bait” and a substance to be searched and detected (eg, other bioactive substance) "prey”. It is about how to explore the interaction.
  • a particular substance eg, a specific bioactive substance
  • a substance to be searched and detected eg, other bioactive substance
  • a method of exploring or quantifying the interaction of a substance comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • a method of detecting or quantifying the interaction of a substance comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • a method of detecting or quantifying the interaction of a substance comprising:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the prey material and the nano-high unit complex forming material.
  • the present invention relates to a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between the bait and the prey material.
  • the first specific method is to (i) provide a mediator (battery) material, a bait material and a nano-high complex complex material in the same field or system, and by the interaction of the mediator (regulatory material) Forming a nano high unit complex to display the bait material in high density; (ii) providing a prey material to the formed nano-high complex in the presence of a target candidate; And (iii) target candidates when the transmission and change of energy signals are reduced (inhibited) or increased (promoted) in the presence of target candidates, based on the transmission and change of energy signals when no target candidates are present. Selecting a target inhibitor or a target promoter, respectively, wherein, the labeling material is bound to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-unit complex forming material and the prey material It can be characterized.
  • a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material comprising the following steps:
  • the labeling material is coupled to any one or more of the mediator (regulator) material, the bait material, the nano-high unit complex forming material and the prey material.
  • a method for screening a target material that inhibits or promotes the interaction between bait and prey material comprising the following steps:
  • the labeling material is bonded to any one or more of the bait material, the prey material and the nano-high unit complex forming material;
  • the target candidate when the transmission and change in the energy signal is reduced (inhibited) or increased (promoted) in the presence of the target candidate. Selecting target inhibitors or target promoters, respectively.
  • the material forming the nano-high complex that is, the nano-high complex forming material, bait material, prey material, nano-high complex formation induction mediator (regulator) material, and the labeling material
  • the bonds between the materials used in may include physical, chemical, electrostatic and biological direct or indirect bonds.
  • a probe including an antibody, a protein, a protein domain, a protein motif, a peptide, or the like may be used.
  • the method of the present invention may provide a nano-complex-forming material and a prey while directly or indirectly attaching any searcher to the nano-complex forming material.
  • the modulator may be referred to as a substance involved in turning on / off a change in physiological function (inhibition, activation, etc.) of a desired physiological function.
  • a substance involved in turning on / off a change in physiological function (inhibition, activation, etc.) of a desired physiological function As described above, the formation and dis-assembly or display of a specific substance in the nano-assembly or nano-assembly can be controlled by using bioactive substances that interact with each other. It is also possible to control the physiological function in the cell or in vivo.
  • the nano-high unit complex forming material, the search material or the mediator (regulator) material can be labeled by binding the labeling material, wherein the labeling material is not limited thereto, magnetic materials, radioactive It may be characterized in that the material, ELISA enzyme material, fluorescent material or a luminescent material, the fluorescent material may be characterized in that the fluorescent dye, fluorescent protein or fluorescent nanoparticles and the like.
  • the bait material, the prey material or the mediator (regulator) material may be characterized as a bioactive molecule, wherein the bioactive material is not limited thereto, but the nucleic acid, It may be characterized by one or more substances selected from the group consisting of nucleotides, proteins, peptides, amino acids, sugars, lipids, vitamins and chemical compounds.
  • the method of the present invention can be carried out either in vitro or in vivo .
  • the present invention when carried out in vivo , it can be carried out in vivo , tissues and cells of mammals including eukaryotic cells, prokaryotic cells and humans, in vivo, tissues and cells of plants.
  • the invention may be carried out in the cells, tissues or in vivo of Zebra fish, C. elegans, yeast, Fly or Frog.
  • the nano-high unit complex forming material, the bait material, the prey material, the mediator (nano high unit complex formation inducing material) and the labeling materials used in the present invention can be easily introduced into the cell by a generally known method.
  • a generally known method for example, direct injection, introduction using transducible peptides and fusogenic peptides, lipid transporters or combinations thereof; Introduction using electroporation; Introduction with magnetofection; And parenteral administration, oral administration, intranasal administration, subcutaneous administration, aerosolized administration, and intravenous administration to mammals including humans.
  • the method may be performed by a method selected from the above.
  • the formation of the nano-high unit complex in the methods of the present invention can be confirmed using a labeling material.
  • a labeling material may be used by combining the labeling material with the search material, the nano-high unit complex forming material or mediator (regulator) material.
  • mediator (regulator) material If necessary, on the nano-high complex formed by the interaction between specific materials, as the labeling material of the present invention, a radiolabel, a fluorescent material, or a luminescent material may be used.
  • a radiolabel all the labels generally usable including 32 P, 35 S, 3 H, 14 C, etc. can be used, for example.
  • fluorescent material which shows fluorescence by itself or which is fluorescent by interaction between materials
  • fluorescent dyes such as FITC, rhodamine
  • Fluorescent proteins such as ECFP, TagCFP, mTFP1, GFP, YFP, CFP, and RFP
  • Tetracysteine fluorescent motifs may be fluorescent nanoparticles.
  • a luminescent material such as luciferase or the like which emits light by itself or exhibits luminescence by interaction between materials can be used.
  • the formation of the nano-unit complex is a method for detecting magnetic, radioactive, ELISA enzyme, fluorescent or luminescent material and optical method, microscope, imaging system, scanner, reader, Measured or detected using commonly known methods such as spectrophotometer, magnetic resonance imaging (MRI), SQUID, MR relaxometer, fluorescent scene associated cell sorting (FACS), fluorometer and luminometer Can also be separated.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • SQUID magnetic resonance imaging
  • MR relaxometer magnetic scene associated cell sorting
  • FACS fluorescent scene associated cell sorting
  • fluorometer and luminometer Can also be separated.
  • the energy signal can be used without limitation as long as it can measure energy transfer through energy intensity and resonance, and exemplifies fluorescence transition (FRET) including radioactive transition, luminescent transition, and magnetic transition. can do.
  • FRET fluorescence transition
  • the nano-high complex formed by the method of the present invention or the nano-unit complex loading the regulatory material in the nano-unit complex or the nano-unit complex or nano-composite (dis-assembly) exposed to the load (dis-assembly) may be characterized by regulating or inducing a physiological form or function mediated by the substance.
  • nano high unit complex forming material refers to a material forming a nano high unit complex, which is a poly / multi-valent material having a plurality of identical or different binding moeity.
  • the self-assembly can form a complex.
  • a material capable of forming a composite by self-assembly are preferably composed of nanosized particles.
  • the nano-high unit complex forming material may be characterized by using two or more different nano-high unit complex forming material.
  • a protein including a self-assembly or a self-association domain wherein the protein having the self-assembly or self-binding domain Ferritin or ferritin, DPS or similar protein (DNA binding protein from starved cells), heat shock protein (HSP), magnetosome constituent protein, viral constituent protein, calcium / calmodulin phosphate protein (calcium / calmodulin-dependent kinase II) and dsRed.
  • nano-high unit complexes for example, gold nanoparticles, quantum nanoparticles (Q dot) or magnetic nanoparticles (magnetic nanoparticles), etc.
  • Particles can be used.
  • ferritin protein was used among substances or proteins capable of forming nano-sized unit complexes by self-assembly.
  • the 24 ferritin proteins form spherical nanoparticle complexes by self-assembly, the outer diameter is about 12 nm, the inner diameter is about 9 nm, and contains more than 2500 iron atoms (Chasteen, ND Struc. Biol. 126: 182-194, 1999).
  • Labels such as fluorescent, luminescent, magnetic, and radioactive materials bound to "material” can be dynamically searched by analyzing them using an analyzer such as a microscope.
  • Bioactive substances are all substances that exhibit physiological activity in vivo, and any substance that can interact with various biological substances in a human body to modulate their function or activity may be used. nucleic acid, nucleotide (mono- / oligo- / poly-nucleotide), protein, protein (mono- / oligo- / poly-peptide), amino acid, sugar (mono- / oligo- / poly -saccharides, lipids, vitamins, chemical compounds, but also the smaller molecules that make up the substances.
  • the transmission or change of the energy signal may be characterized in that the energy transfer due to resonance phenomena between markers or the change in intensity or pattern of the image or signal by the markers, wherein the energy transfer is resonance ( energy changes that occur through resonance and the like, and various changes such as the intensity and pattern of an image and a signal that occur due to transfer, interference, and quenching between energy, and the like.
  • Changes in the signal may include the intensity and pattern of the image (e.g., number, area and intensity and distribution, etc.) in the form of an image, such as dots, and the intensity and pattern of the signal (e.g., Number of pulses, width, area, height, distribution, etc. of the pulse in the flow cytometry. It also includes changes in signal strength in ELISA.
  • the energy transfer signal may be used without limitation as long as it can measure the energy transfer signal through resonance and the like, and may exemplify bioluminescence resonance energy transfer (BRET), fluorescence resonance energy transfer (FRET), and the like.
  • BRET bioluminescence resonance energy transfer
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a fluorescent material or a luminescent material may be used as the labeling material of the present invention.
  • Fluorescent materials which fluoresce itself or which are fluorescent by interaction between materials include, for example, fluorescent dyes such as FITC and rhodamine; Fluorescent proteins such as ECFP, TagCFP, mTFP1, GFP, YFP, CFP, and RFP; Tetracysteine fluorescent motifs; Or may be fluorescent nanoparticles.
  • a luminescent material such as luciferase or the like which emits light by itself or exhibits luminescence by interaction between materials can be used.
  • Such transmission or change of the energy signal may be measured by a generally known method, and methods for detecting magnetic, radioactive, ELISA enzymes, fluorescent or luminescent materials, and optical methods, microscopes, imaging systems, and scanners.
  • Reader spectrophotometer, magnetic resonance imaging (MRI), SQUID, MR relaxometer, Flow Cytometry, fluorescent scene associated cell sorting (FACS), fluorometer and luminometer
  • FACS fluorescent scene associated cell sorting
  • the 'bait' corresponding to the search substance and the 'prey' substance corresponding to the partner may be used as long as the candidate substance is expected to interact with each other, but is preferably a bioactive substance.
  • Bioactive substances are all substances that exhibit physiological activity in vivo, and any substance that can interact with various biological substances in a human body to modulate their function or activity may be used. nucleic acid, nucleotide (mono- / oligo- / poly-nucleotide), protein, protein (mono- / oligo- / poly-peptide), amino acid, sugar (mono- / oligo- / poly -saccharides, lipids, vitamins, chemical compounds, but also the smaller molecules that make up the substances.
  • the interaction of the bait and prey pairs include the Leucine Zippers domain, various interacting substances such as drug-drug targets, the interaction of FRB with FKBP protein, a pharmaceutically relevant binding partner of the Rapamycin compound, and the FK506 compound.
  • FKBP protein Interaction of FKBP protein, its pharmaceutically related binding partner, FKBP protein, binding to AP1510 compound, interaction of IkB ⁇ protein with its RelA protein, its binding partner, IkB ⁇ protein regulated by TNFa physiological signals And its binding partner, bTrCP or IKKb protein, intracellular interaction of miRNA with mRNA (let-7b miRNA that binds to lin-28 mRNA), Ago2 protein and miRNA interaction, and MS2 binding mRNA site MS2 protein interactions, intracellular interactions between DHFR proteins and MTX compounds.
  • the 'bait and prey interaction mediator (modulator)' that regulates the bond of the bait-prey pair is a substance that promotes the interaction between the bait and prey to mediate (modulate) the binding between both substances, As long as it is an active substance, there is no limitation whether it is a bioactive substance or a compound. However, materials that specifically react to the bait-prey pairs used are preferred. Since the nano-unit complexes are formed by the interaction of the bait-prey pairs, ultimately, the 'bait and prey interaction mediator (regulator) material' is a substance inducing the formation of the nano-unit complexes defined in the present invention. It can be said to belong to the "mediator (regulator) substance".
  • a protein regulated according to an external signal may be used if necessary, or a miRNA characteristic that specifically binds to its target mRNA may be used.
  • the 'mediator (regulator) material' inducing the formation of the nano-high unit complex of the present invention is any element capable of forming a nano-high unit complex by directly or indirectly interacting with each other on the surface of the nano-high unit complex forming material. It is a concept to include. Substances that mediate or regulate the activity of such mediators (modulators) may also be referred to as “mediators” of the present invention in a broad sense. As described above, when the formation of the nanohigh unit complex is induced by the interaction of the bait-prey, the "mediator or mediator of the bait-prey interaction" is also broadly referred to as the "mediator". Included in
  • Such 'mediators' are not limited so long as they function to induce the formation of nano-higher complexes. Therefore, if the formation of nano-high complexes can be induced by specific phenomena such as binding or mutation between substances that react specifically with each other, both the substance and the specific phenomena can be identified as mediators. That is, in the present invention, the mediator (modulator) is a term that includes all of a specific substance, a specific phenomenon or a specific interaction itself, and such mediator (modulator) may be used in combination of two or more.
  • the bait material used was It is a mediator that induces formation and at the same time exerts the bait function used to explore interactions with its partner Frey.
  • the present invention provides a composition for diagnosing or diagnosing a disease or a disease associated with a disease by separating the nano-high complex or nano-unit complex formed by the above method.
  • the disease may be a disease associated with a nano-unit complex or a substance bound to or captured by a search material or a mediator (regulator) material that is displayed on the nano-unit complex.
  • the separated nano-high complex or nano-unit complex is introduced into cells, tissues or in vivo to react with the Frey library; And labeling the prey bound by interacting with the bait material highly integrated in the nano-high complex as a target material, and targeting, imaging, or diagnosing a disease by measuring an energy signal transmission or change. , Disease can be targeted, imaged or diagnosed.
  • the pharmaceutical composition for diagnosing the disease may be provided as a pharmaceutical composition including the separated nano-high complex or nano-unit complex alone or one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents,
  • the complex may be included in the pharmaceutical composition in an appropriate pharmaceutically effective amount depending on the disease and its severity, age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives.
  • Pharmaceutical compositions of the invention can also be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of sterile injectable solutions and the like.
  • Ferritin genes FTH1 (GenBank Acc. No. BC013724) and FTL (GenBank Acc. No. BC016346) were purchased from Open BioSystems of the United States. Recombination based on pcDNA 3.1, which allows the CMV promoter to express fusion proteins in which FKBP and FRB protein domains and the fluorescent proteins CFP and YFP are fused at the N-terminus of ferritin (FT) proteins in mammalian cells. Gene was prepared.
  • HeLa HeLa, ATCC No. CCL-2
  • Recombinant genes were introduced into HeLa (HeLa, ATCC No. CCL-2) cells incubated on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by 24 hours in a 5% CO 2 incubator fixed at 37 ° C. The fusion protein was expressed while incubating.
  • the culture medium was changed from DMEM (Gibco) containing 10% FBS to OPTI-MEM (Gibco), and images were obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710).
  • ZEISS, LSM710 a confocal microscope
  • CFP obtained 460-500nm images using a 458nm laser
  • YFP obtained 525-545nm images using a 514nm laser
  • FRET images obtained at 525-545nm using a 458nm laser.
  • Images obtained from confocal microscopes were analyzed for FRET by sensitized emission method using MetaMorph software (Molecular Device). Cells were imaged before and after treatment with 250 nM rapamycin (Calbiochem), and the results are shown in FIG. 10 (A and B).
  • Recombination based on pcDNA 3.1 which is capable of expressing fusion proteins in mammalian cells by the CMV promoter, by fusion of the FKBP and FRB protein domains with the fluorescent proteins mCerulean and mCitrine at the N-terminus of ferritin (FT) proteins.
  • FT ferritin
  • HeLa HeLa, ATCC No. CCL-2
  • Recombinant genes were introduced into HeLa (HeLa, ATCC No. CCL-2) cells incubated on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by 24 hours in a 5% CO 2 incubator fixed at 37 ° C. The fusion protein was expressed while incubating.
  • the culture medium was changed from DMEM (Gibco) containing 10% FBS to OPTI-MEM (Gibco), and images were obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710).
  • ZEISS, LSM710 a confocal microscope
  • mCerulean obtained 460-490nm images using a 405nm laser
  • mCitrine obtained 525-550nm images using a 514nm laser
  • FRET images at 525-550nm using a 405nm laser were analyzed for FRET by sensitized emission method using MetaMorph software (Molecular Device). Cells were imaged before and after treatment with 250 nM rapamycin (Calbiochem), and the results are shown in FIGS. 11 and 12.
  • a fusion protein that combines FKBP and FRB protein domains with the fluorescent proteins mCerulean and mCitrine at the N-terminus of ferritin (FT) and DPS proteins can be expressed in mammalian cells by the CMV promoter.
  • One recombinant gene was prepared.
  • the DPS gene was cloned by PCR using known primers.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the culture medium was changed from DMEM (Gibco) containing 10% FBS to OPTI-MEM (Gibco), and images were obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710).
  • rapamycin (Calbiochem) was imaged before and after treatment with 250 nM rapamycin (Calbiochem), and the results are shown in FIGS. 13 and 14. Compared to the rapamycin, which is not a mediator, rapamycin treatment significantly increased the FRET signal above the highest detectable level. Therefore, we found a large increase in FRET signal due to the interaction of FKBP and FRB in nano-high-level composites.
  • FKBP F36M 2 and FRB protein domains, the first mediators (regulators), and the fusion proteins, mCerulean and mCitrine, were fused to the N-terminus of ferritin (FT) and DPS proteins by the CMV promoter.
  • Recombinant genes were prepared based on pcDNA 3.1 that can be expressed in animal cells.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the culture medium was changed from DMEM (Gibco) containing 10% FBS to OPTI-MEM (Gibco), and images were obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710).
  • the fusion protein which fuses the FRB protein domain and mCitrine, the fluorescent protein, to the N-terminus of the ferritin (FT) protein, or the fusion protein, which combines the FKBP protein domain and mCerulean, a fluorescent protein, by the CMV promoter Recombinant genes were prepared based on pcDNA 3.1 that can be expressed in cells.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the culture medium was changed from DMEM (Gibco) containing 10% FBS to OPTI-MEM (Gibco), and images were obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710).
  • rapamycin (Calbiochem) was imaged before and after treatment with 250 nM rapamycin (Calbiochem), and the results are shown in FIGS. 17 and 18. Compared to the rapamycin, which is not a mediator, rapamycin treatment significantly increased the FRET signal above the highest detectable level. Therefore, we found a large increase in FRET signal due to the interaction of FKBP and FRB in the nanocomposite.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the culture medium was changed from DMEM (Gibco) containing 10% FBS to OPTI-MEM (Gibco), and images were obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710).
  • the CMV promoter expresses the fusion protein in which the FKBP protein domain and the fluorescent protein mCerulean are fused or the fusion protein in which the FRB protein domain and the fluorescent protein mCitrine are fused to the N-terminus of the DPS protein by a CMV promoter.
  • a recombinant gene based on pcDNA 3.1 was prepared.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the culture medium was changed from DMEM (Gibco) containing 10% FBS to OPTI-MEM (Gibco), and images were obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710).
  • rapamycin (Calbiochem) was imaged before and after treatment with 250 nM rapamycin (Calbiochem), and the results are shown in FIGS. 21 and 22. Compared to the rapamycin, which is not a mediator, rapamycin treatment significantly increased the FRET signal above the highest detectable level. Therefore, we found a large increase in FRET signal due to the interaction of FKBP and FRB in the nanocomposite.
  • Example 8 Quantitative Analysis of Energy Signal Transmission at Interval of FRKB-ECFP-FT and FKBP-EYFP Fusion Proteins by Interaction of FKBP and FRB in Nano-Unit Complexes
  • the fusion protein which fused the FRB protein domain and the ECFP fluorescence protein to the N-terminus of the ferritin (FT) protein, or the fusion protein that fused the FKBP protein domain and EYFP, the fluorescent protein, to mammalian by CMV promoter.
  • Recombinant genes were prepared based on pcDNA 3.1 that can be expressed in cells.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the rapamycin (Calbiochem) was obtained and quantitatively analyzed by FRET at second intervals using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment, and the results are shown in FIG. 23. Arrows indicate bleaching the FRET acceptor. Compared with the rapamycin, which is a mediator, the rapamycin treatment significantly increased the FRET signal. Therefore, we found a large increase in FRET signal due to the interaction of FKBP and FRB in the nanocomposite.
  • a fusion protein in which the DHFR or FRB-FKBP protein domain and the fluorescent protein mRFP or mCerulean are fused to the N-terminus of ferritin (FT) protein can be expressed in mammalian cells by a CMV promoter.
  • One recombinant gene was prepared.
  • Fluorescent drug (Invitrogen) with fluorescent fluorescein attached to the drug methotrexate was purchased.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was. 10 uM methotrexate-fluorescein fluorescent drug was treated.
  • the rapamycin (Calbiochem) was subjected to quantitative analysis of FRET results at second intervals using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment, and the results are shown in FIG. 24. Arrows indicate bleaching the FRET acceptor. Compared with the rapamycin, which is not a mediator, the rapamycin treatment significantly increased the detection of FRET signals as DHFR was highly integrated into the nanoscale complex. Therefore, we observed a large increase in FRET signal due to the interaction of DHFR and methotrexate in nano-high-level complexes.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the rapamycin (Calbiochem) was subjected to quantitative analysis of FRET results at second intervals using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment, and the results are shown in FIG. 25. Arrows indicate bleaching the FRET acceptor. Compared with the rapamycin, which is not a mediator, rapamycin treatment significantly increased the FRET signal. Therefore, we found a large increase in FRET signal due to the interaction of FKBP and FRB in the nanocomposite.
  • Recombinant genes based on pcDNA 3.1 that can be expressed were prepared.
  • a CFP-FT recombinant gene without IkBa protein was prepared.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • a confocal microscope (ZEISS, LSM710) was used to obtain FRET results images at quantum intervals and analyzed quantitatively, and the results are shown in FIG. 26. Arrows indicate bleaching the FRET acceptor. As IkBa and RelA interacted, FRET signal increased. Therefore, we found a large increase in FRET signal due to the interaction of IkBa and RelA in the nanocomposite.
  • Recombinant gene based on pcDNA 3.1 which can express fusion protein in mammalian cells by CMV promoter, the fusion protein fused with FRB-FKBP protein domain and fluorescent protein mCerulean at the N-terminus of ferritin (FT) protein Prepared.
  • FT ferritin
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the rapamycin (Calbiochem) was obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment and quantitatively analyzed, and the results are shown in FIG. 27.
  • ZEISS, LSM710 confocal microscope
  • the nano-high complex formation pattern and the large increase in signal according to the interaction of FKBP and FRB were confirmed. did.
  • the difference in signal / noise (S / N) is several hundred times larger.
  • Example 13 Quantitative analysis of changes such as intensity of interaction signal between DHFR and methotrexate-fluorescein by expressing FRB-FKBP-mCerulean-FT and DHFR-mRFP-FT fusion proteins in cells
  • the fusion protein which fused the FRB-FKBP protein domain and mCerulean, a fluorescent protein, to the N-terminus of the ferritin (FT) protein, or a fusion protein, which fused the DHFR protein and mRFP, a fluorescent protein, was mammalian by a CMV promoter. Recombinant genes were prepared based on pcDNA 3.1 that can be expressed in animal cells.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. And treated with methotrexate-fluorescein fluorescent.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the rapamycin (Calbiochem) was obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment, and quantitatively analyzed, and the results are shown in FIG. 29.
  • ZEISS, LSM710 confocal microscope
  • FIG. 29 By quantifying the (A) distribution and (B) co-location of the fluorescence signal according to the interaction of IkBa and YFP-RelA, a large increase in the interaction pattern and signal was confirmed.
  • Example 15 Quantitative analysis of changes such as intensity of interaction signal between DHFR and methotrexate-fluorescein by expressing FRB- / FKBP-mCerulean-FT and DHFR-mRFP-FT fusion proteins intracellularly
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was. methotrexate-fluorescein fluorescent drug was treated.
  • the rapamycin (Calbiochem) was obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment and quantitatively analyzed, and the results are shown in FIG. 30. Quantitative quantification of (A) distribution and (B) co-location of the fluorescence signal according to the interaction of DHFR and methotrexate-fluorescein confirmed a large increase in the interaction pattern and signal.
  • Example 16 Quantitative quantification of the distribution, intensity, size, and number of nanohigh-unit complex-forming signals according to the interaction of FKBP and FRB by expressing FKBP (F36M) 1-5-mRFP-FT fusion proteins in cells Phosphorus analysis
  • a fusion protein in which the FKBP (F36M) 1-5 protein domain and the fluorescent protein mRFP are fused to the N-terminus of ferritin (FT) protein can be expressed in mammalian cells by the CMV promoter.
  • FKBP F36M 1-5 protein domain
  • mRFP fluorescent protein mRFP
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • FKBP by quantifying the (A) distribution, (B) size according to FKBP (F36M) number, (C) size according to FK506 treatment, and (D) size following FK506 treatment and removal, in minutes.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the rapamycin (Calbiochem) was obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment and analyzed quantitatively, and the results are shown in FIG. 32.
  • ZEISS, LSM710 confocal microscope
  • Example 18 Quantitative analysis of changes such as the intensity of IkBa and RelA interaction signals by expressing FKBP (F36M) 2-mRFP-FT, IkBa-ECFP-FRB, EYFP-RelA fusion proteins in cells
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • the rapamycin (Calbiochem) was obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment and quantitatively analyzed, and the results are shown in FIG. 33.
  • ZEISS, LSM710 confocal microscope
  • Example 19 Quantitative analysis of changes such as intensity of interaction signal between DHFR and methotrexate-BodipyFL by expressing FKBP (F36M) 2-mRFP-FT and DHFR-mRFP-FT fusion proteins intracellularly
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was. methotrexate-BodipyFL fluorescent drug was treated.
  • the rapamycin (Calbiochem) was obtained using a confocal microscope (ZEISS, LSM710) under conditions before and after treatment and quantitatively analyzed, and the results are shown in FIG. 34. Quantification of the (A) distribution of fluorescence signals according to the interaction of DHFR and methotrexate-BodipyFL, (B) different co-locations with and without DHFR, and (C) different intensity changes with and without DHFR, confirmed a large increase in interaction patterns and signals. did.
  • RAB protein RAB protein
  • FKBP FRB protein domain
  • FT ferritin
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • confocal microscopy (ZEISS, LSM710) was used to detect and label the resulting images. The results are shown in FIGS. 35 and 36. The cells were observed by staining the nuclei using DAPI. Therefore, it was confirmed that the early and late andosome targets were efficiently detected and labeled using the nano-high complex formed by FKBP and FRB interaction.
  • GALNT2 GolNT2 interacting protein
  • FKBP FKBP
  • FRB FRB protein domain
  • mCerulean at the N-terminus of the ferritin (FT) protein.
  • a recombinant gene based on 3.1 was prepared.
  • Recombinant genes were introduced into HeLa cells cultured on a 4-well LabTek II chamber slide using Lipofectamine TM LTX, followed by incubation in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. for 24 hours to express the fusion protein. I was.
  • rapamycin (Calbiochem) treatment rapamycin (Calbiochem) treatment
  • confocal microscopy ZEISS, LSM710 was used to detect and label the resultant images. The results are shown in FIG. 37. The cells were observed by staining the nuclei using DAPI. Therefore, it was confirmed that the Golgi target material was efficiently detected and labeled using the nano-high complex formed by FKBP and FRB interaction.
  • the liRNA according to the present invention has the effect of promoting the immune response in a structure-dependent manner of the liRNA of the present invention as well as the function of inhibiting sequence specific target gene expression of the siRNA constituting the liRNA.
  • siRNA when siRNA is used as a siRNA that targets cancer-related genes such as siSurvivin or si ⁇ -catenin, synergy of cancer cell growth inhibition by promoting the immune response through induction of interferon as well as the effect of inhibiting expression of cancer-related genes. It has a synergistic effect and is very useful as an anticancer drug in the future.

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Abstract

본 발명은 나노고단위복합체(nano-assembly matrix)에 고집적(high density)로 물질을 디스플레이(display)함으로써, 고집적 표지물질에서 효과적으로 발생하는 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서, 고집적 탐색물질들 사이에서 효과적으로 발생하는 상호작용을 정량적으로 감지 및 검출하고, 고집적 탐색물질과 효과적으로 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 즉, 고집적 디스플레이를 토대로 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 일어나는 다양한 생리활성물질들 사이의 상호작용을 정량적으로 감지하는 방법 그리고 이들과 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지하는 방법에 관한 것이다.

Description

물질의 고집적 디스플레이를 토대로 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서 표적물질과의 상호작용을 정량적으로 감지 및 효과적으로 표지하는 방법
본 발명은 나노고단위복합체(nano-assembly matrix)에 고집적(high density)로 물질을 디스플레이(display)함으로써, 고집적 표지물질에서 효과적으로 발생하는 에너지 전달 및 신호 변화를 이용해서, 고집적 탐색물질들 사이에서 효과적으로 발생하는 상호작용을 정량적으로 감지 및 검출하고, 고집적 탐색물질과 효과적으로 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지 및 분리하는 방법에 관한 것이다. 즉, 고집적 디스플레이를 토대로 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)에서 일어나는 다양한 생리활성물질들 사이의 상호작용을 정량적으로 감지하는 방법 그리고 이들과 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 다양한 생리활성물질들 사이의 역동적인 상호작용에 의해서 여러 가지 생리적인 기능이 조절된다. 이러한 상호작용이 적절히 일어나지 못하면 문제가 생겨 질환이 발생한다. 가령, 생체내의 단백질은 다른 단백질과 상호작용함에 의해 그 기능을 나타낸다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 상호작용한다. 일반적으로 두 개의 단백질 사이의 상호작용은 이들 단백질이 기능적으로 관련되어 있음을 강하게 암시하며, 단백질의 특정부위에 특이적으로 상호작용하는 생리활성화합물은 그 단백질의 활성을 조절함에 의해 예컨대, 질환 관련 단백질의 경우 질환을 진단, 예방, 치료 또는 경감시킬 수 있는 치료제로서의 개발가능성을 제시한다.
따라서 신약개발 분야에서는 이미 그 기능 및 특성이 밝혀진 물질인 "베이트(bait)"와 탐색 및 검출 대상이 되는 상호작용 파트너인 "프레이(prey)"의 상호작용을 확인함으로써 신규 표적단백질을 검출하거나 신약후보물질로서 생리활성물질을 스크리닝하는 다양한 방법이 연구되고 있다. 이와 같이, 상호작용 분석을 통한 새로운 표적단백질의 동정 및 분리는 약물의 활성, 효과 및 부작용 등에 대한 유용한 정보를 수득하기 위한 매우 중요한 연구개발과제로 간주된다. 또한, 표적단백질은 생물학적 경로 및 전달체계에 대한 이해를 증진시키고 기초 세포조절 및 질환 메커니즘(mechanism)에 대한 정보를 제공하며, 이러한 정보는 표적단백질과 상호작용하는 생리활성 화합물에 대한 탐색 및 검출을 통하여 신약 개발 및 종래 약물의 개량 및 신규 약제학적 용도의 발견 등에 매우 놀랍고도 강력한 수단이 된다.
의약계는 인간의 다양한 질환에 대한 보다 안전하고 효과적인 치료법을 개발하기 위한 도전에 직면해 있지만, 현재 사용되고 있는 많은 약물들은 그들의 표적단백질 및 분자적 타겟(molecular target) 규명 없이 질환 모델에서의 생물학적 효능에 의해 규정되어지고 있는 실정이다(Burdine, L. et al., Chem. Biol. 11: 593, 2004). 게다가, 생물적 활성을 지닌 천연물이 약물 개발에 중요한 원천이 되고 있으나, 그들 활성의 양상은 대부분 알려져 있지 않고 있다(Clardy, J. et al., Nature 432:829, 2004). 그들의 생리적 대상 및 분자적 타겟에 대한 규명은 치료적 효과 및 역효과에 대한 이해에 필수적일 뿐만 아니라, 이에 의해, 보다 개선된 2세대 치료학의 발전을 가능하게 할 것이다. 또한, 임상적으로 증명된 화합물의 새로운 타겟을 발견하는 일은 치료상의 새로운 응용에 기여하게 될 것이다(Ashburn, T.T. et al., Drug Discov. 3:673, 2004).
세포 기반의 스크리닝 방법을 다루는 화학생물학 분야에서 "타겟 스크리닝"은 거대한 화합물 라이브러리로부터 바람직한 표현형에 따라 저분자화합물들을 규명하는데 사용된다(Strausberg, R.L. at al., Science 300:294, 2003; Stockwell, B.R. Nature 432:846, 2004). 상기 스크리닝의 큰 이점에도 불구하고, 이러한 접근은 발견된 저분자화합물을 규명하기에는 쉽지 않은 방법이다. 그러나, 단백질(또는 저분자화합물)-단백질 상호작용과 같은 다양한 세포내 분자 상호작용의 효과적인 검출은 동적인 생물학적 프로세스 및 조절 네트워크의 이해에 필수적이기 때문에, 이러한 타겟 동정 기술의 발달은 유전학, 단백질학 및 시스템 생물학을 포함한 다양한 생명과학 분야에 있어서 매우 중요하다.
타겟 스크리닝 분야에서, 친화성 크로마토그래피(Phizicky, E.M. et al., Microbiol. Rev. 59:94, 1995; Mendelsohn, A.R. et al., Science 284:1948, 1999); 단백질/저분자화합물 마이크로어레이; 파지 디스플레이(Sche, P.P. et al., Chem. Biol. 6:707, 1999); 효모 2종-/3종-하이브리드 어세이(Licitra, E.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12817, 1996); 발현 프로파일링; 및 효모균주 이종결실(heterologous deletions)이 일어난 효모균주의 평행분석(Zheng, O. et al., Chem. Biol. 11: 609, 2004) 등과 같은 몇몇의 기술들이 생리활성 분자들간 상호작용의 분석을 위해 활용되어 왔다.
그러나, 이러한 모든 기술들은 하이-백그라운드(high background), 가양성(false positives), 낮은 민감도(low sensitivity), 단백질 발현 후의 부적절한 폴딩(inappropriate folding), 간접성(indirectness), 단백질 발현 후의 변형 부족, 또는 세포적 적합성이 포함된 제한된 타겟 접근성 등과 같은 다양한 문제들로 어려움을 겪고 있다. 또한, 인 비트로(in vitro) 결합조건 또는 비-포유동물 세포와 같은 인위적인 환경의 사용은 때때로 실험 결과에 오류를 초래한다.
그러므로, 생리학적으로나 약학적으로 높은 민감도 및 선택도가 고려된 조건에서 생리활성물질들 사이의 상호작용을 직접적으로 조사하는 것이 가장 바람직하다. 종합적으로 볼 때, 상기와 같은 기반기술을 발전시키는 것이 종래 기술과 비교하여 여러가지 이점을 제공하는데 매우 중요하다고 할 수 있다.
첫째, 생리학적으로나 약학적으로 관련된 생리활성물질 및 분자들간 상호작용을 탐색하는 것은 인위적인 실험적 환경에 따른 결과물이 이끌어내는 오류를 크게 감소시킬 수 있고, 둘째, 전체 발현 프로파일 또는 복잡한 생물학적 표현형에 의존하는 여타 간접적 해독 방법과 달리, 생리활성물질 및 분자 상호작용을 명확한 해독 시그널로 직접적으로 해석할 수 있게 한다. 따라서, 생리활성물질 및 분자의 타겟에 대하여 내재된 가(false) 양성/음성 또는 오류를 일으키기 쉬운 추론 등이 미연에 방지될 수 있다. 셋째, 생리활성물질 및 분자들간 상호작용에 있어서 동적인 단일세포 분석이 가능하다. 개개의 살아있는 세포들의 동적 분석(dynamic analysis)은 생리학적 및 약학적으로 광범위한 범위에 걸쳐, 이종간 비동시적으로 일어나는 세포내 프로세스를 탐색할 수 있는 효과적인 방법을 제공한다.
결국, 상기 기반기술은 다른 조직들 및 질환 상태의 넓은 범위에 걸쳐, 살아있는 세포내에서 생리활성물질 및 분자들간의 상호작용(예를 들어, 생리활성 저분자화합물와 단백질간의 상호작용 등)의 다양성을 분석하는데 사용될 수 있는데 많은 한계를 가지고 있으므로 새로운 기반기술의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 한국공개특허 제2009-0018585호에서 다양한 생리활성물질들 사이의 역동적인 상호작용에 따른 나노고단위복합체를 형성하는지(nano-assembly matrix formation) 여부 또는 나노고단위복합체에서 같이 위치하는지(co-localization on nano-assembly matrix) 여부를 이미징을 통해 분석함으로 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색 및 검증하는 방법을 개시하였다. 이 방법은 정성적인 방법으로 현미경 등을 통한 이미징을 통해 상호작용 여부 등을 탐색 및 검증할 수 있다.
한편, 세포 안에서는 signalsome, 생체 안의 세포 밖에서는 exosome 등의 "-some" 또는 "complex" 등의 형태로 다양한 생리적인 (고단위)복합체가 존재하고 있다. 이러한 생리적인 고단위복합체에 하나 또는 여러 종류의 관련된 단백질 등 생리활성물질들이 함께 존재함으로서 세포 또는 생체 안의 특정 생리적인 기능이 효과적으로 조절됨이 규명되었다. 이러한 복합체를 토대로 매개되는 효율적인 생리적인 조절에서 처럼 세포 또는 생체내에서 대부분의 생리적인 조절에 다가적인 상호작용(multi/poly-valent interactions)가 매우 중요한 역할을 함이 규명되었다( Mammen, M. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37:2755,1998; Kiessling, L. L. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 45:2348,2006). 즉, 단백질 등 대부분 생리활성물질들 사이의 상호작용에서 단가적인 결합(mono-valent interactions)보다 다가적인 결합(multi/poly-valent interactions)이 주로 중요한 역할을 수행한다.
이에, 본 발명자는 이러한 생리적인 복합체의 고집적 특성을 토대로 추가적인 연구를 수행한 결과, 눈으로 일일이 분석하는 이미징을 통한 정성적인 분석에서 나아가 정량적으로 분석 및 탐색이 가능하고 또한 보다 효과적으로 감지 및 표지하는 새로운 발명을 하게 되었다. 즉, 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 표지물질 또는 표지물질들 사이에서 효과적으로 발생되는 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정할 경우, 가령 한 가지 예로 형광 분석 또는 형광 전이(FRET; fluorescence resonance energy transfer) 등을 포함한 방법으로 물질의 상호작용을 보다 정성적 및 정량적으로 측정 및 판별할 수 있다. 이러한 분석 방법과 더불어, 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이를 통해서 탐색물질들 사이의 상호작용의 효율을 증가시켜서 물질의 상호작용을 보다 민감하게 정성적 및 정량적으로 측정 및 판별할 수 있다. 따라서, 표지가 용이하고 이러한 에너지 신호의 정량적인 분석을 통해 Flow Cytometry, FACS(fluorescence associated cell sorting) 등을 포함한 방법으로 물질의 상호작용을 개별적으로 보다 용이하게 직접 분리 및 동정할 수 있고, 나아가 탐색 및 분석의 고속도(high throughput)을 향상시킬 수도 있는 여러 가지 장점들이 있다. 또한 이러한 에너지 신호의 전달 및 변화를 토대로 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 탐색물질과 상호작용의 효율성이 증가된 특정 표적물질을 민감하게 감지 및 표지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 특정 생리활성물질인 "베이트"를 고집적으로 디스플레이하여 이와 상호작용하는 표적물질을 민감하게 표지 또는 분리 동정하는 새로운 방법을 제공하는데 있다. 아울러, 본 발명은 특정 생리활성물질인 "베이트"와 탐색 및 검출 대상의 생리활성물질인 "프레이" 사이의 상호작용을 정량적으로 감지 및 탐색하는 방법 및 상기 "베이트"와 상호작용하는 "프레이"의 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 "베이트"와 "프레이"의 상호작용을 억제(blocking), 저해(inhibiting), 촉진(activating) 또는 유도(inducing)하는 표적물질을 탐색하고, 목적하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합(fusion)된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질을 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 나노고단위복합체 형성물질 및 프레이물질 라이브러리를 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질 라이브러리를 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 라이브러리 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 프레이물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 베이트물질을 상기 형성된 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질과 베이트물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질의 질환의 표적, 이미징 또는 진단 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계;
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 프레이 라이브러리와 반응시키는 단계; 및
(iv) 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합된 프레이물질을 표적물질로서 표지하고, 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 질환을 표적, 이미징 또는 진단하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 프레이 라이브러리와 반응시키는 단계; 및 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질 및/또는 매개조절물질과 상호작용을 통하여 결합된 프레이물질을 표적물질로서 표지하고, 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 질환을 표적, 이미징 또는 진단하는 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질의 질환의 표적, 이미징 또는 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하여, 상기 제1매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 표적 후보물질의 존재 하에서, 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 나노단위복합체에 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(ii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 베이트물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 표적 후보물질의 존재 하에서 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 매개(조절)물질 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도될 때 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 2는 제1매개(조절)물질 A, B, C간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되면서, 제2매개(조절)물질 D, E, F간의 상호작용에 의해 탐색물질 X가 형성된 나노고단위복합체에 결합할 때, 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 D와 E와 F와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N, X, Y, A, B, C, D, E, F 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 3 (A)와 (B)는 나노단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 4 (A), (B) 및 (C)는 X 또는 X와 X간 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되고 Y와의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다 (X와 X'와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 베이트물질 이용). N, X, X', A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 5 (A), (B) 및 (C)는 X 또는 X와 X'간의 상호작용이 각 탐색물질에 결합된 매개(조절)물질인 A 및 B에 의하여 또는 A, B 및 C에 의하여 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되고 Y와의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 X'와 A와 B와 C는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 베이트물질 이용). N, X, X', A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 6은 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 7 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 8 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질; (A) X가 서로 상호작용이 없는 경우, (B) X가 서로 상호작용이 있는 경우). N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 9 (A)와 (B)는 페리틴 또는 DPS 단백질의 자기조립에 의하여 형성되는 나노크기의 단위복합체 구조이다.
도 10은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(CFP)-FT과 FRB-표지물질(YFP)-FT의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 11은 헬라세포에서 페리틴 단백질(FT)로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-FT의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 12는 헬라세포에서 페리틴 단백질(FT)로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-FT의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 13은 헬라세포에서 페리틴(FT) 및 DPS 단백질로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 14는 헬라세포에서 페리틴(FT) 및 DPS 단백질로부터 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 15는 헬라세포에서 페리틴(FT) 및 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-FT을 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다. 상호작용이 없기에 FRET 이미징이 되지 않는다.
도 16은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질로부터 제1매개(조절)물질인 FKBP(F36M)2에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS의 상호작용을 제2매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 17은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-FT과 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 18은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-FT과 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 19는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 20은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 FRB-표지물질(mCitrine)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 21은 헬라세포에서 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS와 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 정량적으로 분석한 사진이다.
도 22는 헬라세포에서 DPS 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(mCitrine)-DPS와 FKBP-표지물질(mCerulean)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine, C; FRET 이미징한 사진이다.
도 23은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-표지물질(ECFP)-FT과 FKBP-표지물질(EYFP)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 24는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체를 형성함에 따라 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 DHFR-표지물질(mRFP)-FT과 methotrexate-표지물질(fluorescein)의 상호작용에 따른 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 25는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-표지물질(mRFP)-FT과 FRB-표지물질(EGFP)의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 26은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 표지물질(CFP)-FT과 RelA-표지물질(YFP)의 상호작용과 IkBa-표지물질(CFP)-FT과 RelA-표지물질(YFP)의 상호작용에 따른 FRET 결과를 초 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 27은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-FKBP-표지물질(mCerulean)-FT이 매개(조절)물질(rapamycin)와 매개(조절)물질의 억제제(FK506)의 존재여부에 따라 나노고단위복합체 형성 신호의 분포, 세기, 크기 및 숫자 결과를 분 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 28은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-FKBP-표지물질(mCerulean)-FT과 DHFR-표지물질(mRFP)-FT이 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 DHFR과 methotrexate-표지물질(fluorescein) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 29는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FRB-/FKBP-표지물질(mRFP)-FT과 IkBa-표지물질(ECFP)-FT가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 IkBa와 RelA-표지물질(YFP) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 30은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP-/FRB-표지물질(mRFP)-FT과 DHFR-표지물질(mRFP)-FT이 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 DHFR과 methotrexate-표지물질(fluorescein) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 31은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)1~5-표지물질(mRFP)-FT이 매개(조절)물질 FKBP(F36M)의 숫자(1~5), FK506의 존재 유무에 따라 나노고단위복합체 형성 신호의 세기 및 크기 변화를 분 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 32는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)2-표지물질(mRFP)-FT과 FRB-표지물질(EGFP)가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 FRB와 FKBP 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 그리고 초 간격으로 분석한 결과이다.
도 33은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)2-표지물질(mRFP)-FT과 IkBa-표지물질(ECFP)-FRB가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 IkBa와 RelA-표지물질(EYFP) 사이의 상호작용 신호 변화를 분 간격으로 정량적으로 분석한 결과이다.
도 34는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 FKBP(F36M)2-표지물질(mRFP)-FT과 DHFR-표지물질(mRFP)-FT가 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재여부에 따라 DHFR과 methotrexate-표지물질(BodipyFL) 사이의 상호작용 신호 변화를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 35는 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 초기 앤도좀 상호작용 물질(RAB5A)을 이용해서 초기 앤도좀 표적물질을 DAPI에 의한 핵 염색과 함께 감지 및 표지한 이미징 사진이다.
도 36은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 후기 앤도좀 상호작용 물질(RAB7A)을 이용해서 후기 앤도좀 표적물질을 DAPI에 의한 핵 염색과 함께 감지 및 표지한 이미징 사진이다.
도 37은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질의 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 골지체 상호작용 물질(GALNT2)을 이용해서 골지체 표적물질을 DAPI에 의한 핵 염색과 함께 감지 및 표지한 이미징 사진이다.
도 38은 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 물질을 이용해서 그와 상호작용하는 표적물질을 효과적으로 감지 및 표지하는 모식도이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본 발명에서 "생리활성화합물"이란 생체 내에서 단백질, 핵산, 당 또는 지질 등을 포함한 생체물질과 결합하여 이들의 기능 또는 활성을 조절하는 화합물을 의미한다. 이러한 생리활성화합물은 유기체로부터 추출하거나 화학적 합성에 의해 수득된다. 예를 들어, 장기 이식 시 발생하는 면역거부반응을 경감시키기 위해 사용되는 "사이클로스포린 A"(Novartis AG) 및 "FK506"(Fujisawa)을 비롯하여 많은 항생물질들(antibiotics)이 미생물, 식물 또는 해양 생물로부터 분리되었다. 이와 같은 천연 또는 합성 생리활성화합물은 이것의 약리활성을 테스트하고, 동물모델 및 사람모델을 사용한 임상시험을 거쳐 하나의 신약으로 개발된다.
본 발명에서 "생리활성물질"이란, 생물이 생을 영위함에 있어서 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 등의 조절 역할을 하는 물질이라 정의할 수 있다. 이러한 생리활성의 물질은 동식물과 같은 천연물로부터 얻거나 미생물 및 동식물 세포주의 대사산물로부터 추출 정제 할수도 있고 화학합성에 의해서도 얻을수 있다. 생리활성물질은 예를 들어, 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 또는 화합물(chemical compound) 등일 수 있다.
본 발명에서 "베이트(bait) 물질"이란, 다른 생리활성물질과의 상호작용을 탐색하는데 이용되는 생리활성물질을 의미한다.
본 발명에서 "프레이(prey) 물질"이란, 상기 "베이트"의 상호작용 파트너로서 탐색(분석) 또는 검출하고자 하는 대상이 되는 생리활성물질을 의미한다.
본 발명에서 "표적물질"이란 검출하고자하는 대상이 되는 물질을 총칭하여 일컫는 용어로서, 목적하는 바에 따라 "베이트"와 상호작용하는 파트너인 프레이물질을 표적 물질로 할 수도 있고, 상기 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 촉진(activating) 또는 유도(inducing)하거나 억제(blocking) 또는 저해(inhibiting)하는 물질을 표적물질로 할 수도 있다. 즉, 규명하고자 하는 대상이 되는 모든 물질을 포함한다. 그 중에서 베이트와 프레이 물질 간의 상호작용을 억제 또는 저해하는 물질을 '저해물질'이라고 정의하고, 촉진 또는 유도하는 물질을 '촉진물질'라고 정의한다.
본원에서 "조절 물질“이란 조절하고자 하는 대상이 되는 세포 내 기능을 매개하는 물질과 직접 또는 간접으로 관련된 또는 상호작용하는 물질을 일컫는 용어로서, 목적하는 바에 따라 탐색물질이 조절 물질이 될 수도 있고, 탐색물질과 결합하여 상호작용하는 물질을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 세포 내 기능을 촉진(activating), 유도(inducing), 억제(blocking), 또는 저해(inhibiting)하는 물질을 조절 물질로 할 수도 있다.
본원에서 "나노고단위복합체(nano-assembly matrix)"란 일정한 구조골격을 가진 나노단위복합체의 상호작용(interaction)에 의하여 고집적(high density)되어 쉽게 관찰될 수 있는 고단위복합체(예를 들면, 페리틴 등과 같은 단백질 24 subunit이 서로 자기조립을 통해 결합해서 형성된 일정한 구조골격을 갖는 나노단위복합체가 서로 상호작용을 함으로써 형성된 고단위복합체로서, 본 발명에서는 쉽게 관찰할 수 있는 증폭된 고신호강도 점상이미지패턴과 같은 개념으로 사용되기도 한다)를 의미한다. 당업계에서는 나노클러스터(nanoclusters), 나노어셈블리(nanoassemblies)"는 모두 나노고단위복합체와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명의 실시예에서는, 탐색물질간의 상호작용 또는 매개(조절)물질간의 상호작용에 의한 나노단위복합체의 고집적된 복합체를 나노고단위복합체 형성으로 표현하였다. 상기 나노고단위복합체의 형성여부는 에너지 신호의 전달 및 변화로 확인될 수 있다.
본원에서, "에너지 신호의 전달 및 변화"는 나노(고)단위복합체에 직접 또는 간접적으로 고집적 디스플레이한 표지물질(형광성 물질, 발광성 물질, 자성 물질, ELISA용 효소물질 또는 방사성 물질)에서 발생하는 이미지의 세기 및 패턴(가령, 점상 등의 이미지 형태에서 나타나는 숫자(number), 크기(area) 및 세기(intensity) 및 분포위치(distribution) 등)과 신호의 세기 및 패턴(가령, Flow Cytometry에서의 pulse의 숫자(number), 폭(width), 크기(area), 높이(height) 및 분포위치(distribution) 등) 등의 변화를 포함하며, 나아가 이들 표지물질에서 공명(resonance) 등을 통해 발생하는 에너지 그리고 에너지 사이의 전달(transfer), 간섭(interference) 및 퀀칭(quenching) 등으로 발생하는 이미지 및 신호의 세기 및 패턴 등 여러 가지 변화를 포함한다. 따라서 고집적으로 디스플레이함으로써 표지물질 또는 표지물질들 사이에서 발생하는 에너지 신호의 전달 및 여러 가지 변화를 포함한다.
본원에서 "나노고단위복합체를 형성할 수 있는 물질(이하, '나노고단위복합체 형성물질'이라 한다)"이란 상기 나노고단위복합체를 형성할 수 있는 성질 및 기능을 가지고 있는 모든 물질을 의미하며, 한 가지 예로서 페리틴과 같이 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명에서는 매개(조절)물질간의 상호작용에 의해 관찰가능한 고신호강도 점상이미지패턴, 또는 탐색물질간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체, 즉, 관찰가능한 고신호강도 점상이미지패턴을 형성하는 물질을 의미한다.
본원에서 "나노단위복합체"란, 상기 나노고단위복합체의 토대가 되는 복합체로서 단백질 등의 자기조립에 의하여 복합체를 형성한 것을 의미한다. 가령, 페리틴 단백질 24 subunit이 자기조립되어 나노단위복합체를 형성한다.
본원에서 "매개(조절)물질"이란 나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질을 의미하며, 이는 상기 나노고단위복합체 형성물질과 직접 또는 간접적인 결합, 상호작용 및 융합을 통해서 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있는 모든 경우를 포함한다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 매개(조절)물질이라고 할 수 있다. 상기 매개(조절)물질은 나노고단위복합체 형성을 유도하는 특정 화합물이나 단백질 등의 구체적인 물질인 경우뿐만 아니라, 특정 돌연변이(mutation) 등의 현상과 특정 생리적인 신호 등을 아우르는 개념이다. 예를 들어, 생리적인 신호에 따른 단백질간의 상호작용, RNA와 단백질의 상호작용이나, 특정 단백질의 특정 돌연변이(mutation), 또는 구체적인 화합물에만 반응하는 단백질의 사용 등을 통해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있고, 이들을 본 명세서에서 '매개(조절)물질'로 나타내고 있다.
본원에서 "표지물질"이란 나노고단위복합체 형성물질, 베이트 물질, 프레이 물질, 매개(조절)물질, 표적물질 등을 포함해서 신호의 감지를 위해 물질에 결합시키는 자성물질, ELISA 효소 물질, 방사성 물질, 형광성 물질, 발광성 물질 등을 의미한다. 나아가 표지물질은 방사성 물질, 형광성 물질, 발광성 물질을 퀀칭(quenching)하는 금입자 등의 표지억제물질도 또한 포함하며 이 경우에는 상호작용에 따라 신호가 감소 또는 사라지는 것을 감지할 수도 있다. 이를 총괄해서 본 명세서에서 '표지물질'로 나타내고 있다.
본원에서 "디스플레이(display)"란, 나노(고)단위복합체 밖 또는 안에 물질을 직접적으로 또는 다른 물질을 매개하여 간접적으로 드러내는(exposing) 또는 나노(고)단위복합체 안에 물질을 적재(loading)하는 형태를 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, in vitro 또는 in vivo에서 특정 물질(예를 들어, 특정 생리활성물질) "베이트"와 상호작용하는 표적물질 ("프레이")의 표지 또는 분리방법에 관한 것이다.
표적물질을 표지 또는 분리하는 본 발명의 구체적인 제1방법으로서, (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계, 이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함; (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및 (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제1방법 및 제2 방법은 매개(조절)물질에 의해 나노고단위복합체를 형성한 후, 상기 형성된 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질에 의하여 이와 상호작용하는 프레이물질을 표지하거나 분리 및 동정할 수 있는 방법이다.
도 1은 본 발명의 구체적인 제1방법에 대한 개략도로서, 매개(조절)물질 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도될 때 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). 도 1에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합되어 있는 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체가 형성되고, 이에 따라 나노고단위복합체 형성물질에 결합되어 있는 베이트물질은 형성된 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이되게 된다. N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 2는 본 발명의 구체적인 제2방법에 대한 개략도로서, 제1매개(조절)물질 A, B, C간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되면서, 제2매개(조절)물질 D, E, F간의 상호작용에 의해 탐색물질 X가 형성된 나노고단위복합체에 결합할 때, 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 D와 E와 F와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). 도 2에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 제1매개(조절)물질의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의하여 나노고단위복합체가 형성되고, 이에 제2 매개(조절)물질 E에 의하여 이에 결합된 베이트물질(X)가 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이됨으로서, N, X, Y, A, B, C, D, E, F 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명의 구체적인 제3 방법은 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법에 관한 것이다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
도 3는 본 발명의 구체적인 제3방법에 대한 개략도로서, 나노단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). 도 3에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질은 나노고단위복합체 형성물질이 자기조립에 의하여 복합체를 형성함으로써 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이됨으로써, N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 베이트물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명의 구체적인 제4방법은, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법에 관한 것이다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
도 4는 본 발명의 구체적인 제4방법에 대한 개략도로서, 탐색물질로서 베이트물질간 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되는 구성물에 대한 개략도이다 (X와 X'와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 베이트물질 이용). 도 4에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질은 베이트물질간 상호작용에의하여 나노고단위복합체를 형성하고 이에 고집적으로 디스플레이됨으로써, N, X, X', A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명의 구체적인 제5 방법은, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법에 관한 것이다:
(i) 매개(조절)물질이 결합(fusion)된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
도 5는 본 발명의 구체적인 제5방법의 개략도로서, 나노고단위복합체에서 X와 X' 간의 상호작용이 각 탐색물질에 결합된 매개(조절)물질인 A 및 B에 의하여 또는 A, B 및 C에 의하여 간접적으로 이루어지는 구성물에 대한 개략도이다(X와 X'와 A와 B와 C는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 탐색물질 이용). 도 5에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질은 이에 결합(fusion)된 매개조절물질간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의하여 형성된 나노고간위복합체에 고집적으로 디스플레이됨으로써, N, X, X', A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
한편, 본 발명의 베이트와 상호작용하는 표적물질의 분리는 표적물질의 표지 단계 없이 다음과 같이 분리될 수 있다.
즉, 본 발명의 표적물질 분리방법의 구체적인 제1방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제3방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계; 및
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질을 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제4방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
본 발명의 구체적인 제5방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
상기 각 방법에 대한 개략도는 각각 도 1 내지 도 5의 도면에 대응된다.
본 발명의 상기 방법들에서, 나노고단위복합체를 형성하는 물질들, 즉 나노고단위복합체 형성물질, 베이트 물질, 프레이 물질, 나노고단위복합체 형성 유도 매개(조절)물질, 및 표지물질 등 본 발명에서 사용되는 물질들간의 결합은 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적인 직접 또는 간접 결합을 포함할 수 있다. 그 중에서도, 생물학적 결합이 이루어지는 경우, 항체(antibody), 단백질(protein), 단백질 도메인(domain), 단백질 모티프(motif), 펩타이드 등을 포함하는 탐침(probe)을 사용할 수 있다.
본 발명의 제1방법~제5방법의 (i)단계에서, 베이트 물질 및 프레이 물질과 상호작용하지 않는 물질을 추가로 첨가하여 나노고단위복합체 형성물질 상에 디스플레이시킬 수 있다. 상기 베이트 물질 및 프레이 물질과 상호작용하지 않는 물질을 나노고단위복합체 형성물질과 함께 디스플레이시키면 집적도 및 간격을 적절히 조절할 수 있으므로, FRET의 감도를 적절히 조절할 수 있다.
본 발명의 방법은 표적물질을 용이하게 분리 및 동정할 수 있으며, 특히 표적물질의 탐색 및 분석을 고속도(high throughput)로 향상시킬 수도 있는 장점이 있다. 따라서 본 발명은 인 비트로(in vitro)뿐 아니라 인 비보(in vivo)에서도 수행될 수 있으며, 특히 세포 내에서 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 형성시켜 이에 고집적 디스플레이된 베이트물질에 의하여 표적물질을 고집적으로 포집하여 용이하게 분리할 수 있다. 특히, 세포 내에서 표적물질의 포집이 이루어진 경우, 세포를 lysis 시켜 용이하게 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 분리하여 이로부터 표적물질들을 높은 농도로 얻을 수 있으므로, 본 발명의 방법은 매우 유용하다.
이때, 상기 나노고단위복합체 형성은 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용하여 측정되거나 감지될 수 있으며, 또한 분리될 수 있다.
즉, 표적물질의 분리는 알려진 일반적인 분리방법을 이용할 수 있으나, 예시적으로 전기영동, 질량분석기(mass spectrometer), 대사체 분리 및 분석 방법, 단백체 분리 및 분석 방법, 크로마토그래피(chromatography), 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등의 방법으로 분리 및 동정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, in vitro 또는 in vivo에서 특정 물질(예를 들어, 특정 생리활성물질) "베이트"와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제1방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제3방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제4방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또한, 구체적인 제5방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
추가로, 표적물질의 검출을 위하여, 프레이물질에 나노고단위복합체 형성물질을 결합시켜 베이트물질과 프레이물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성시킬 수 있다.
이러한 구체적인 방법으로서, 제6 방법은 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 나노고단위복합체 형성물질 및 프레이물질 라이브러리를 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질 라이브러리를 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 라이브러리 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
도 6는 본 발명의 구체적인 제6방법의 일 개략도로서, 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). 도 6에 기재된 바와 같이, 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 베이트물질 및 프레이물질은 직접적인 상호작용 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 통하여 나노고단위복합체를 형성하게 되며, 이에 N, X, Y, A 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 7은 본 발명의 구체적인 제7방법의 다른 개략도로서, 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). 도 7에 기재된 바와 같이 매개조절물질에 결합(fusion)된 베이트물질은 매개조절물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체 형성물질에 결합되고, 이와 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 프레이물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하게 되며, 이에 N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
도 8은 본 발명의 구체적인 제6방법의 또다른 개략도로서, (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 탐색하기 위한 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질; (A) X가 서로 상호작용이 없는 경우, (B) X가 서로 상호작용이 있는 경우). 도 8에 기재된 바와 같이 매개조절물질에 결합(fusion)된 베이트물질은 매개조절물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체 형성물질에 결합되고, 역시 매개조절물질에 결합되어 매개조절물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체 형성물질에 결합된 프레이물질과 상호작용하여 나노고단위복합체를 형성하게 되며, N, X, Y, A, B, C 중에서 하나 또는 그 이상의 물질에 표지물질을 부착해서 탐색물질 간의 상호작용에 의해 발생된 에너지 신호의 전달 및 변화를 측정한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, in vitro 또는 in vivo에서 특정 물질(예를 들어, 특정 생리활성물질) "베이트"와 탐색 및 검출 대상 물질(예를 들어, 다른 생리활성물질) "프레이" 사이의 상호작용을 탐색하는 방법에 관한 것이다.
물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제1방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제2방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제3방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제4방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제5방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 물질의 상호작용 탐색을 위한 본 발명의 구체적인 제6방법으로서, 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 또는 정량화하는 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질, 프레이물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
본 발명은 또 다른 관점에서, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
그 구체적인 제1 방법은 (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및 (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계, 이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 구체적인 제2방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하여, 상기 제1매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제3방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 표적 후보물질의 존재 하에서, 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 나노단위복합체에 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
(ii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제4방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 베이트물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제5방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
(ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
또한, 구체적인 제6방법으로서, 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
(ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 표적 후보물질의 존재 하에서 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
(iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계.
본 발명의 상기 방법들에서, 나노고단위복합체를 형성하는 물질들, 즉 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트물질, 프레이물질, 나노고단위복합체 형성 유도 매개(조절)물질, 그리고 표지물질 등 본 발명에서 사용되는 물질들 간의 결합은 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적인 직접 또는 간접 결합을 포함할 수 있다. 그 중에서도, 생물학적 결합이 이루어지는 경우, 항체(antibody), 단백질(protein), 단백질 도메인(domain), 단백질 모티프(motif), 펩타이드 등을 포함하는 탐침(probe)을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 나노고단위복합체 형성 물질에 임의의 탐색물질을 직접 또는 간접적으로 결합시키는 한편, 나노고단위복합체 형성 물질과 프레이를 결합하여 제공할 수 있다. 또한, 나노고단위복합체 형성 물질과 매개(조절)물질을 결합하여 제공하는 한편, 베이트물질과 프레이물질에 각각 매개(조절)물질을 결합하여 제공할 수 있다.
조절물질은 목적하고자 하는 생리적인 기능의 변화(생리적인 기능의 억제, 활성화 등)의 on/off에 관여하는 물질이라 할 수 있다. 상기와 같이, 나노고단위복합체의 형성(assembly) 및 분열(dis-assembly) 또는 나노고단위복합체에 특정 물질을 디스플레이하는 것은, 서로 상호작용하는 생리활성물질들을 이용함으로써 조절 가능하며, 이러한 조절에 의하여 세포 내 또는 생체 내의 생리적인 기능도 조절할 수 있게 된다.
또한, 목적하고자 하는 생리적인 기능의 변화, 예를 들면 특정 물질의 활성의 촉진 여부, 특정 물질의 생산량의 증가나 억제 등의 변화를 확인함으로써, 상기 방법에 의하여 세포의 생리적 기능이 조절되었는지 여부를 판별할 수 있게 된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 나노고단위복합체 형성물질, 탐색물질 또는 매개(조절)물질은 표지물질이 결합시켜 표지할 수 있으며, 이때, 상기 표지물질은 이로 제한되는 것은 아니나, 자성 물질, 방사성 물질, ELISA용 효소 물질, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 할 수 있고, 상기 형광성 물질은 형광 염료, 형광 단백질 또는 형광 나노입자 등임을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 베이트물질, 프레이물질 또는 매개(조절)물질은 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 할 수 있고, 이때, 상기 생리활성물질은 이로 한정되는 것은 아니나 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 in vitro 또는 in vivo 어느 계에서도 수행 가능하다. 그 중에서 본 발명을 in vivo에서 수행하는 경우, 진핵세포, 원핵세포, 인간을 포함한 포유동물의 생체내, 조직내 및 세포내, 식물의 생체내, 조직내 및 세포내에서 수행할 수 있다. 특히, 본 발명은 제프라 피쉬(Zebra fish), 선충(C. elegans), 효모(Yeast), 초파리(Fly) 또는 개구리(Frog)의 세포내, 조직내 또는 생체내에서도 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트물질, 프레이물질, 매개물질(나노고단위복합체 형성 유도 물질) 및 표지물질들은 일반적으로 널리 알려진 방법에 의해 용이하게 상기 세포내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 직접 도입(direct injection), 세포전달성 펩타이드(transducible peptide 및 fusogenic peptide), 지질 전달체 또는 이들의 결합체를 이용한 도입; 일렉트로포레이션(electroporation)을 이용한 도입; 마그네토펙션(magnetofection)을 이용한 도입; 및 인간을 포함한 포유동물로의 장관외(parenteral) 투여, 경구(oral) 투여, 비강내 (intranasal) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 에어로졸(aerosolized) 투여 및 정맥(intravenous) 투여 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택되는 방법 등에 의해 수행될 수 있음은 자명하다.
한편, 본 발명의 방법들에서 상기 나노고단위복합체 형성은 표지물질을 사용하여 확인될 수 있다. 특히 상기 탐색물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 또는 매개(조절)물질에 표지물질을 결합시켜 사용할 수 있다. 필요한 경우, 특정 물질들 사이의 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체상에서, 본 발명의 표지물질로는 방사성 표지, 형광성 물질 또는 발광성 물질을 사용할 수 있다. 방사성 표지로서는, 예를 들어 32P, 35S, 3H 및 14C 등을 포함하여 일반적으로 사용 가능한 표지를 모두 사용할 수 있다. 그리고, 그 자체로서 형광을 나타내거나 물질들간의 상호작용에 의해 형광성을 나타내는 형광물질(fluorescent material)로서는, 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광 염료들; ECFP, TagCFP, mTFP1, GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질; 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif); 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다. 발광성 물질로서는, 그 자체로서 발광을 내거나 물질들간의 상호작용에 의해 발광을 나타내는 발광체(luminescent material) 예를 들어, 루시퍼레이즈(luciferase) 등을 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법에서, 상기 나노고단위복합체 형성은 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용하여 측정되거나 감지될 수 있으며, 또한 분리될 수 있다.
본 발명에서 에너지 신호는 에너지 세기 및 공명 등을 통한 에너지 전달을 측정할 수 있는 것이라면 제한없이 이용할 수 있으며, 방사성 전이, 발광 전이, 자성 전이를 비롯해서 형광 전이(FRET; fluorescence resonance energy transfer) 등을 예시할 수 있다.
추가로, 본 발명의 방법에 의하여 형성된 나노고단위복합체 또는 상기 나노단위복합체 안에 조절물질을 고집적으로 적재(loading)해서 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체의 분열(dis-assembly)에 따라 노출되는 적재된 물질에 의하여 매개되는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는것을 특징으로 할 수 있다.
이하에서는 상기 방법들에서 사용되는 구체적인 구성 요소에 대해 설명한다.
"나노고단위복합체 형성물질"은 나노고단위복합체를 형성하는 물질은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 자기조립에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질을 사용하는 것이 좋다. 비제한적으로 이들 복합체는 나노크기의 입자로 구성되어 있는 것이 적합하다. 한편, 나노고단위복합체 형성물질은서로 다른 2개 이상의 나노고단위복합체 형성물질을 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
이때, 자기조립에 의한 나노고단위복합체 형성의 바람직한 예로서, 자기조립 또는 자기결합(self-association) 도메인을 포함하는 단백질 등을 들 수 있으며, 이때, 상기 자기조립 또는 자기결합 도메인을 갖는 단백질은 페리틴 또는 유사 단백질(ferritin), DPS 또는 유사 단백질(DNA binding protein from starved cells), HSP(heat shock protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질, 바이러스 구성단백질, 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(calcium/calmodulin-dependent kinase II) 및 dsRed 등을 들 수 있다. 화학적으로 합성한 다양한 나노입자도 나노고단위복합체 형성이 가능한데, 예를 들어, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자나노입자(Q dot) 또는 자성나노입자(magnetic nanoparticle) 등을 포함한 여러 종류의 나노입자를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 자기조립(self-assembly)에 의해 나노크기의 단위복합체를 형성할 수 있는 물질 또는 단백질들 중에 페리틴(ferritin) 단백질을 이용하였다.
페리틴 단백질은 24개가 자기조립에 의해 구형 나노입자복합체을 형성하며 외경은 약 12 nm이며, 내경은 약 9 nm인 구조를 이루며, 2500개 이상의 철 원자를 함유한다(Chasteen, N. D. Struc. Biol. 126:182-194, 1999). 페리틴 단백질의 의해 형성되는 나노입자복합체의 표면상에서 일어나는 "탐색물질" 사이 또는 "매개(조절)물질" 간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성되는 경우, "탐색물질" 또는 "매개(조절)물질"에 결합시킨 형광, 발광, 자성, 방사성 물질 등의 표지물질(label)을 현미경 등의 분석기기를 이용하여 분석함으로써 역동적으로 탐색할 수 있다.
탐색 물질은 서로 간에 상호작용이 일어나는 생리활성물질이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 생리활성물질은 생체 내에서 생리적인 활성을 나타내는 모든 물질로서, 인간의 생체 내의 다양한 생체물질과 상호작용하여 이들의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직한 예로서 핵산(nucleic acid), 뉴클레오타이드(mono-/oligo-/poly-nucleotide), 단백질(protein), 펩타이드(mono-/oligo-/poly-peptide), 아미노산(amino acid), 당(mono-/oligo-/poly-saccharide), 지질(lipid), 비타민, 화합물(chemical compound)을 들 수 있으나, 나아가 상기 물질들을 구성하는 더 작은 분자들도 포함한다.
본 발명에서, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 표지물질간의 공명 현상에 의한 에너지 전달 또는 표지물질에 의한 이미지 또는 신호의 세기 또는 패턴의 변화인 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때, 에너지 전달은 공명(resonance) 등을 통해 발생하는 에너지 변화 그리고 에너지 사이의 전달(transfer), 간섭(interference) 및 퀀칭(quenching) 등으로 발생하는 이미지 및 신호의 세기 및 패턴 등 여러 가지 변화를 포함한다. 신호의 변화는 이미지의 세기 및 패턴(가령, 점상 등의 이미지 형태에서 나타나는 숫자(number), 크기(area) 및 세기(intensity) 및 분포위치(distribution) 등)과 신호의 세기 및 패턴(가령, Flow Cytometry에서의 pulse의 숫자(number), 폭(width), 크기(area), 높이(height) 및 분포위치(distribution) 등) 등의 변화를 포함한다. ELISA에서의 신호의 세기의 변화도 포함한다.
본 발명에서 에너지 전달신호는 공명 등을 통한 에너지 전달신호를 측정할 수 있는 것이라면 제한없이 이용할 수 있으며, BRET(bioluminescence resonance energy transfer), FRET(fluorescence resonance energy transfer) 등을 예시할 수 있다.
한편, 본 발명의 방법들에서 상기 베이트 및 프레이 물질의 상호작용을 알아보기 위하여 표지물질을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 표지물질로는 형광성 물질 또는 발광성 물질을 사용할 수 있다. 그 자체로서 형광을 나타내거나 물질들간의 상호작용에 의해 형광성을 나타내는 형광물질(fluorescent material)로서는, 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광 염료들; ECFP, TagCFP, mTFP1, GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질; 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif); 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다. 발광성 물질로서는, 그 자체로서 발광을 내거나 물질들간의 상호작용에 의해 발광을 나타내는 발광체(luminescent material) 예를 들어, 루시퍼레이즈(luciferase) 등을 사용할 수 있다.
이러한, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 일반적으로 알려진 방법에 의하여 측정될 수 있는데, 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, Flow Cytometry, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등을 이용할 수 있으며, 특히 FACS, MS 등을 이용하여 분리할 수도 있다.
탐색 물질에 해당하는 '베이트' 및 이의 파트너에 해당하는 '프레이' 물질은 서로 간에 상호작용이 일어나리라 예상되는 후보 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직하게는 생리활성물질이다.
생리활성물질은 생체 내에서 생리적인 활성을 나타내는 모든 물질로서, 인간의 생체 내의 다양한 생체물질과 상호작용하여 이들의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직한 예로서 핵산(nucleic acid), 뉴클레오타이드(mono-/oligo-/poly-nucleotide), 단백질(protein), 펩타이드(mono-/oligo-/poly-peptide), 아미노산(amino acid), 당(mono-/oligo-/poly-saccharide), 지질(lipid), 비타민, 화합물(chemical compound)을 들 수 있으나, 나아가 상기 물질들을 구성하는 더 작은 분자들도 포함한다.
베이트 및 프레이 물질 쌍의 상호작용에 대한 구체적인 예로서, Leucine Zippers 도메인, 약물-약물 타겟 등 상호작용하는 다양한 물질, Rapamycin 화합물의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FRB와 FKBP 단백질의 상호작용, FK506 화합물과 이것의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FKBP 단백질의 상호작용, AP1510 화합물과 결합하는 FKBP 단백질의 상호작용, IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 RelA 단백질의 상호작용, TNFa 생리적인 신호에 따라 조절되는 IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 bTrCP 또는 IKKb 단백질의 상호작용, miRNA와 mRNA의 세포내 상호작용(lin-28 mRNA에 결합하는 let-7b miRNA), Ago2 단백질과 miRNA의 상호작용, MS2 결합 mRNA 부위와 결합하는 MS2 단백질의 상호작용, DHFR 단백질과 MTX 화합물 세포내 상호작용 등을 들 수 있다.
상기 베이트-프레이 쌍의 결합을 조절하는 '베이트 및 프레이 상호작용 매개(조절)물질'은 상기 베이트 및 프레이 사이의 상호작용을 촉진하여 양 물질간 결합을 매개(조절)하는 물질이고, 해당 기능을 발휘하는 물질이면 생리활성물질이든 화합물이든 제한이 없다. 그러나, 사용하는 베이트-프레이 쌍에 특이적으로 반응하는 물질이 바람직하다. 이러한 베이트-프레이 쌍의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하므로, 궁극적으로 상기 '베이트 및 프레이 상호작용 매개(조절) 물질'은 본 발명에서 정의하고 있는 '나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질'인 "매개(조절)물질"에 속한다고 할 수 있다.
상기 프레이-베이트간의 상호작용을 매개(조절)함에 있어서, 필요에 따라, 외부 신호에 따라 조절되는 단백질을 사용할 수도 있고, 자신의 표적인 mRNA와 특이적으로 결합하는 miRNA의 특성을 이용할 수도 있다.
본 발명의 나노고단위복합체의 형성을 유도하는 '매개(조절)물질'은 상기 나노고단위복합체 형성물질의 표면에서 서로 직접 또는 간접적으로 상호작용해서 나노고단위복합체를 형성시킬 수 있는 모든 요소를 포함하는 개념이다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 본 발명의 '매개(조절)물질'이라고 할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 베이트-프레이의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되는 경우에, "베이트-프레이의 상호작용을 조절 또는 매개하는 물질" 역시 넓은 의미의 상기 "매개(조절)물질"에 포함된다.
이러한 '매개(조절)물질'은 나노고단위복합체를 형성을 유도한다는 해당 기능을 발휘하는 요소라면 제한이 없다. 그러므로 서로 특이적으로 반응하는 물질간의 결합이나 돌연변이 등의 특정 현상에 의해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있으면, 해당 물질이든 특정 현상이든 모두 매개(조절)물질로 파악될 수 있다. 즉, 본 발명에서 매개(조절)물질이란, 특정 물질, 특정 현상 또는 특정 상호작용 자체 등을 모두 포함하는 용어이며, 이러한 매개(조절)물질은 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
만약 서로 상호작용하는 베이트-프레이 쌍의 성질을 이용하면서 프레이를 탐색하면서, 한편으로는 상기 베이트 물질의 자체 성질을 이용하여 나노고단위복합체의 형성하였다면, 상기 사용된 베이트 물질은 나노고단위복합체의 형성을 유도하는 매개(조절)물질이면서, 동시에 파트너인 프레이와의 상호작용을 탐색하는데 사용된 베이트 기능을 발휘하고 있는 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의하여 형성된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 분리하여, 이를 포함하는 질환의 진단용 또는 질환과 관련된 표적용, 이미징용 또는 진단용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 질환은 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이되는 탐색물질이나 매개(조절)물질에 결합되거나 포집되는 물질이 관련된 질환일 수 있다.
아울러, 상기 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 프레이 라이브러리와 반응시키는 단계; 및 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합된 프레이물질을 표적물질로서 표지하고, 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 질환을 표적, 이미징 또는 진단하는 단계를 포함하여, 질환을 표적, 이미징 또는 진단할 수 있다.
이때, 상기 나노고단위복합체에 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 조절물질을 고집적으로 디스플레이한 후 분리할 수 있다.
이때, 상기 질환의 진단을 위한 약학 조성물은 상기 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 복합체는 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: FKBP-CFP-FT, FRB-YFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴 유전자인 FTH1(GenBank Acc. No. BC013724)와 FTL(GenBank Acc. No. BC016346)은 미국의 Open BioSystems사에서 구입하였다. 페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP와 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 CFP와 YFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa, ATCC No. CCL-2)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다. 각 형광단백질의 이미징을 위해 CFP는 458nm의 레이저를 이용하여 460-500nm의 이미지를, YFP는 514nm 레이저를 이용하여 525-545nm의 이미지를, FRET 이미지는 458nm의 레이저를 이용하여 525-545nm에서 얻었다. 공초점현미경에서 얻은 이미지는 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Device)를 이용하여 sensitized emission 방법으로 FRET 정도를 분석하였다. 250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다(A 및 B).
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우(A)와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우(B)에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 2: FKBP-mCerulean-FT, FRB-mCitrine-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴 (FT) 단백질의 N-말단에 FKBP와 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean와 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa, ATCC No. CCL-2)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다. 각 형광단백질의 이미징을 위해 mCerulean은 405nm의 레이저를 이용하여 460-490nm의 이미지를, mCitrine은 514nm 레이저를 이용하여 525-550nm의 이미지를, FRET 이미지는 405nm의 레이저를 이용하여 525-550nm에서 얻었다. 공초점현미경에서 얻은 이미지는 MetaMorph 소프트웨어(Molecular Device)를 이용하여 sensitized emission 방법으로 FRET 정도를 분석하였다. 250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 11와 도 12에 나타내었다.
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 3: FKBP-mCerulean-FT, FRB-mCitrine-DPS 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 및 DPS 단백질의 N-말단에 FKBP 및 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean 및 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다. DPS 유전자는 공지된 해당 프라이머를 이용해서 PCR하여 클로닝하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 13과 도 14에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 4: FKBP(F36M)2-mCerulean-FT, FRB-mCitrine-DPS 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 및 DPS 단백질의 N-말단에 제1매개(조절)물질인 FKBP(F36M)2 및 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean 및 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 제2매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 5: FRB-mCitirine-FT, FKBP-mCerulean 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 17와 18에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 6: FKBP-mCerulean-FT, FRB-mCitirine 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 19와 20에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 7: FKBP-mCerulean, FRB-mCitirine-DPS 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 분석
FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 DPS 단백질의 N-말단에 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 mCitrine을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
배양된 세포의 이미징을 위해 배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻었다.
250nM 농도의 rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 세포를 이미징 하였고, 그 결과를 도 21와 22에 나타내었다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 감지할 수 있는 최고(high) 이상으로 매우 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 8: FRB-ECFP-FT, FKBP-EYFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 ECFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 EYFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 23에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 9: DHFR-mRFP-FT, FRB-FKBP-mCerulean-FT 융합단백질을 세포내에서 발현하고 methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리해서 나노(고)단위복합체에서 DHFR과 methotrexate의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 DHFR 또는 FRB-FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mRFP 또는 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다. 약물인 methotrexate에 형광인 fluorescein를 부착한 형광약물(Invitrogen)을 구입했다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다. 10uM methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 24에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 DHFR이 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이됨에 따라서 FRET 신호가 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노고단위복합체에서 DHFR과 methotrexate의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 10: FKBP-mRFP-FT, FRB-EGFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mRFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 FRB 단백질 도메인과 형광단백질인 EGFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 25에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. 매개(조절)물질인 rapamycin을 처리하지 않은 경우와 비교해서, rapamycin을 처리한 경우에는 FRET 신호가 큰 폭으로 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 11: IkBa-CFP-FT, RelA-YFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 나노단위복합체에서 IkBa와 RelA의 상호작용에 따른 에너지 신호의 전달을 초 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 IkBa 단백질과 형광단백질인 CFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 RelA 단백질과 형광단백질인 YFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다. 대조군으로 IkBa 단백질이 없는 CFP-FT 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
두 개의 다른 발현 조합 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 초 간격으로 FRET 결과 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 26에 나타내었다. 화살표는 FRET acceptor를 bleaching 함을 표시한다. IkBa과 RelA가 상호작용함에 따라 FRET 신호가 증가 감지되었다. 따라서 나노단위복합체에서 IkBa과 RelA의 상호작용에 따른 FRET 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 12: FRB-FKBP-mCerulean-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 신호의 분포, 세기, 크기 및 숫자를 분 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB-FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 27에 나타내었다. 나노고단위복합체 형성 신호의 (A) 분포와 세기, (B) 크기 및 (C) 숫자를 분 간격으로 정량화함으로써 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다. 가령, S/N(signal/noise)의 차이가 수백배에 이를 만큼 커다란 증가를 확인했다.
실시예 13: FRB-FKBP-mCerulean-FT, DHFR-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 DHFR과 methotrexate-fluorescein의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FRB-FKBP 단백질 도메인과 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질 또는 DHFR 단백질과 형광단백질인 mRFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시키고 methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 28에 나타내었다. DHFR과 methotrexate-fluorescin의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포 및 (B) 세기를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 14: FRB-/FKBP-mCerulean-FT, IkBa-ECFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 IkBa과 YFP-RelA의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 29에 나타내었다. IkBa과 YFP-RelA의 상호작용에 따른 형광신호의 (A) 분포 및 (B) 동일위치를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 15: FRB-/FKBP-mCerulean-FT, DHFR-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 DHFR과 methotrexate-fluorescein의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다. methotrexate-fluorescein 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 30에 나타내었다. DHFR과 methotrexate-fluorescein의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포 및 (B) 동일위치를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 16: FKBP(F36M)1~5-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 신호의 분포, 세기, 크기 및 숫자를 분 간격으로 정량적인 분석
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 FKBP(F36M)1~5 단백질 도메인과 형광단백질인 mRFP를 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
FK506의 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 31에 나타내었다. 나노고단위복합체 형성 신호의 (A) 분포, (B) FKBP(F36M) 숫자에 따른 크기, (C) FK506 처리에 따른 크기 및 (D) FK506 처리와 제거에 따른 크기를 분 간격으로 정량화함으로써 FKBP와 FRB의 상호작용에 따른 나노고단위복합체 형성 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 17: FKBP(F36M)2-mRFP-FT, FRB-EGFP 융합단백질을 세포내에서 발현해서 FKBP과 FRB의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 32에 나타내었다. FKBP과 FRB의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포, (B) 세기 및 (C) 동일위치 변화를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 18: FKBP(F36M)2-mRFP-FT, IkBa-ECFP-FRB, EYFP-RelA 융합단백질을 세포내에서 발현해서 IkBa와 RelA의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 33에 나타내었다. IkBa와 RelA의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포 및 (B) 동일위치 변화를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 19: FKBP(F36M)2-mRFP-FT, DHFR-mRFP-FT 융합단백질을 세포내에서 발현해서 DHFR과 methotrexate-BodipyFL의 상호작용 신호의 세기 등 변화를 정량적인 분석
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다. methotrexate-BodipyFL 형광약물을 처리했다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이전과 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 이미지를 얻고 정량적으로 분석했고, 그 결과를 도 34에 나타내었다. DHFR과 methotrexate-BodipyFL의 상호작용에 따른 형광 신호의 (A) 분포, (B) DHFR 유무에 다른 동일위치 및 (C) DHFR 유무에 다른 세기 변화를 정량화함으로써 상호작용 양상 및 신호의 커다란 증가를 확인했다.
실시예 20: 나노고단위복합체를 이용해서 앤도좀 표적물질을 감지 및 표지
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 RAB 단백질(RAB5A, RAB7A), FKBP 또는 FRB 단백질 도메인 및 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 감지 및 표지 결과 이미지를 얻었고, 그 결과를 도 35과 도 36에 나타내었다. DAPI를 이용해서 핵을 염색함으로써 세포를 관찰했다. 따라서 FKBP와 FRB 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체를 이용해서 초기와 후기 앤도좀 표적물질이 효율적으로 감지 및 표지됨을 확인했다.
실시예 21: 나노고단위복합체를 이용해서 골지체 표적물질을 감지 및 표지
페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 골지체 상호작용 단백질(GALNT2), FKBP 또는 FRB 단백질 도메인 및 형광단백질인 mCerulean을 결합(fusion)시킨 융합단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다.
4-well LabTek II chamber slide에 배양시킨 헬라(HeLa)세포에 재조합 유전자를 LipofectamineTM LTX를 사용하여 도입시킨 후, 37℃로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하면서 상기 융합단백질을 발현시켰다.
rapamycin(Calbiochem)을 처리 이후 조건에서 공초점현미경(ZEISS, LSM710)을 이용하여 감지 및 표지 결과 이미지를 얻었고, 그 결과를 도 37에 나타내었다. DAPI를 이용해서 핵을 염색함으로써 세포를 관찰했다. 따라서 FKBP와 FRB 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체를 이용해서 골지체 표적물질이 효율적으로 감지 및 표지됨을 확인했다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 liRNA는 상기 liRNA를 구성하는 siRNA의 서열 특이적 표적 유전자 발현 억제 기능뿐만 아니라, 본 발명의 liRNA의 구조 의존적으로 면역반응을 촉진시키는 효과가 있다. 예컨대, siRNA를 siSurvivin 또는 siβ-catenin 등의 암 관련 유전자를 표적하는 siRNA로 사용할 경우, 암 관련 유전자의 발현 억제 효과와 더불어 인터페론 유도를 통한 면역반응을 촉진시켜, 궁극적으로는 암 세포 성장 억제의 시너지(synergistic) 효과를 나타내는바, 향후 항암 치료제로서 매우 유용하다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (56)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  2. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  3. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 상기 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  4. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  5. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 표지 또는 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합(fusion)된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 베이트물질과 상호작용을 통하여 결합되는 프레이물질을 표적물질로서 표지하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화로서 표지된 표적물질을 확인하거나, 확인된 표적물질을 분리 및 동정하는 단계.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매개(조절)물질간의 작용 또는 상기 베이트물질간의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매개(조절)물질은 베이트물질에 결합(fusion)되어 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  9. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여, 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  10. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계; 및
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하거나, 상기 나노단위복합체를 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체로 형성시킨 후 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질을 분리하여 동정하는 단계.
  11. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  12. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 분리하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하여 상기 베이트물질과 상호작용한 프레이물질을 표적물질로서 분리하여 동정하는 단계.
  13. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  14. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  15. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  16. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  17. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질 라이브러리를 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 라이브러리 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  18. 다음의 단계를 포함하는, 베이트와 상호작용하는 표적물질을 검출하는 방법:
    (i) 베이트물질, 나노고단위복합체 형성물질 및 프레이물질 라이브러리를 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질 라이브러리를 반응시키는 단계; 및
    (iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별하여 검출하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 라이브러리 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프레이물질 라이브러리에 표지물질이 결합되고, 추가로 상기 나노고단위복합체 형성물질, 상기 베이트물질 및 상기 매개(조절)물질 중 어느 하나 이상에 추가로 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서로 다른 2개 이상의 나노고단위복합체 형성물질을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질간의 상호작용은 직접 또는 간접적으로 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 또는 상기 나노고단위복합체 형성물질 서로간의 상호작용을 매개(조절)하는 물질을 부가적으로 하나 이상 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 또는 상기 나노고단위복합체 형성물질에 결합(fusion)되어 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 또는 상기 매개(조절)물질은 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생리활성물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제13항 또는 제18항에 있어서, 상기 매개(조절)물질간의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지물질은 자성 물질, 방사성 물질, ELISA용 효소 물질, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 형광성 물질은 형광 염료, 형광 단백질 또는 형광 나노입자임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체 형성물질은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 나노고단위복합체를 형성하는 물질은 자기조립 또는 자기결합(self-association) 도메인을 포함하는 단백질, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자나노입자(Q dot) 및 자성나노입자(magnetic nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 자기조립 또는 자기결합 도메인을 갖는 단백질은 페리틴 또는 유사 단백질(ferritin), DPS 또는 유사 단백질(DNA binding protein from starved cells), HSP(heat shock protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질, 바이러스 구성단백질, 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(calcium/calmodulin-dependent kinase II) 및 dsRed로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 조직 또는 생체내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 표지물질간의 공명 현상에 의한 에너지 전달 또는 표지물질에 의한 이미지 또는 신호의 세기 또는 패턴의 변화인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에너지 신호의 전달 또는 변화는 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, Flow Cytometry, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 로 구성된 군에서 선택된 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  36. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 상기 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  37. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  38. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  39. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용을 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  40. 다음의 단계를 포함하는, 물질의 상호작용 탐색 또는 정량화하는 방법:
    (i) 베이트물질, 프레이물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
    (iii) 에너지 신호의 전달 또는 변화를 측정하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질의 상호작용을 판별 또는 정량화하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 조직 또는 생체내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  43. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트 물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  44. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 베이트물질을 상기 형성된 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  45. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질과 베이트물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  46. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  47. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 베이트물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  48. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 질환의 진단 또는 질환 관련 물질의 표적 또는 이미징용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  49. 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질 또는 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  51. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하여, 상기 제1매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  52. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 표적 후보물질의 존재 하에서, 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 나노단위복합체에 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계; 및
    (ii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  53. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 베이트물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  54. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 매개(조절)물질이 결합된 베이트물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하여, 상기 매개(조절)물질의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질을 고집적으로 디스플레이시키는 단계;
    (ii) 표적 후보물질의 존재 하에서, 상기 형성된 나노고단위복합체에 프레이물질을 제공하는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 매개(조절)물질, 상기 베이트물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 및 상기 프레이물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  55. 다음 단계를 포함하는, 베이트 및 프레이물질간의 상호작용을 저해 또는 촉진하는 표적물질의 스크리닝 방법:
    (i) 베이트물질; 프레이물질; 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에 제공하는 단계;
    (ii) 나노고단위복합체를 형성하여 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 고집적 디스플레이시키도록, 표적 후보물질의 존재 하에서 상기 베이트물질과 상기 프레이물질을 반응시키는 단계; 및
    (iii) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 에너지 신호의 전달 및 변화를 기준으로, 표적 후보물질 존재 하에 에너지 신호의 전달 및 변화가 저감(저해) 또는 증가(촉진)되는 경우의 표적 후보물질을, 각각 표적 저해물질 또는 표적 촉진물질로 선정하는 단계,
    이때, 상기 베이트물질, 상기 프레이물질 및 상기 나노고단위복합체 형성물질 중 어느 하나 이상에 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 함.
  56. 제50항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프레이물질에 표지물질이 결합되고, 추가로 상기 나노고단위복합체 형성물질, 상기 베이트물질 및 상기 매개(조절)물질 중 어느 하나 이상에 추가로 표지물질이 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058454A1 (en) * 2005-11-15 2007-05-24 Cgk Co., Ltd. System for detecting molecular interactions
KR20090018585A (ko) * 2007-08-17 2009-02-20 한국과학기술원 물질의 상호작용 검출 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004001019A2 (en) 2002-02-01 2003-12-31 Montana State University Novel nanoparticles and use thereof
AU2003215280A1 (en) 2002-02-15 2003-09-09 Northwestern University Self-assembly of peptide-amphiphile nanofibers under physiological conditions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007058454A1 (en) * 2005-11-15 2007-05-24 Cgk Co., Ltd. System for detecting molecular interactions
KR20090018585A (ko) * 2007-08-17 2009-02-20 한국과학기술원 물질의 상호작용 검출 방법

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI, M. ET AL.: 'Organization of Inorganic Nanoparticles Using Biotin Streptavidin Connectors.' CHEM. MATER. vol. 11, 1999, pages 23 - 26, XP055071209 *
SEKAR, R.B. ET AL.: 'Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations.' THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY vol. 160, no. 5, 03 March 2003, pages 629 - 633, XP055071207 *
WOUTERS, F.S.: 'Imaging biochemistry inside cells.' TRENDS IN CELL BIOLOGY. vol. 11, no. 5, May 2001, pages 203 - 211, XP009098796 *

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