WO2016117949A1 - 포스파티딜이노시톨포스페이트 결합 물질의 세포 사멸 검출 용도 - Google Patents

포스파티딜이노시톨포스페이트 결합 물질의 세포 사멸 검출 용도 Download PDF

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WO2016117949A1
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Definitions

  • Phosphatidylserine is an important marker for macrophages to recognize and eliminate apoptotic cells (Schlegel, R.A. et al., Cell Death and Differentiation, 2001, 8: 551-563).
  • phosphatidylserine is present inside the cell membrane, but when the cell receives a death signal or erythrocytes age, it is exposed to the outside of the cell membrane and macrophages are recognized through the receptors on the cell surface, causing phagocytosis (Fadok, VA). et al., J immunol 1992, 148: 2207-2216.
  • Diabetes treatment includes oral hypoglycemic agents and insulin, and pancreatic and pancreatic islet transplantation (Hwa Jung Kim et al., J Korean Soc Transplant, December 2009; 23 (3): 214-226).
  • pancreatic and pancreatic islet transplantation Recently, attention has been focused on a procedure for restoring insulin secretion function by transplanting only the pancreatic islets of another person who secretes insulin, thereby improving the results.
  • Pancreatic islet transplantation is less invasive than pancreas transplantation, and the procedure is simpler, so it has fewer side effects, shorter hospital stay, and repetitive procedure.
  • pancreatic islets can be harvested and transplanted even when pancreas transplantation is impossible.
  • Still another object of the present invention is a first step of treating a composition for screening an anticancer agent and a candidate substance with a sample containing cancer cells; And a second step of detecting a labeling substance from the sample.
  • Figure 6a shows the IC-InsP6 uptake by the abdominal macrophages
  • Figure 6b shows the IC-InsP6 uptake by RAW264.7 macrophages.
  • the variant of the CD14 protein exhibits at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 95% and most preferably at least 98% similarity with the amino acid sequence of the CD14 protein.
  • Any protein having an amino acid sequence and substantially having an activity of binding PtdIns (3,4,5) P 3 may be included.
  • the sequence having such similarity is an amino acid sequence having the same or corresponding biological activity as the CD14 protein, it is obvious that protein variants having amino acid sequences in which some sequences are deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the present invention.
  • the variant may be codon optimized (codon optimized) according to the host cell to be expressed.
  • Radioisotopes may include, but are not limited to, 125I, 32P, or 35S as one example, but may include, without limitation, those used in the art as radioisotopes.
  • Detection methods according to labels are well known in the art, but can be performed, for example, by the following method.
  • fluorescent material is used as a detectable label
  • immunofluorescence staining may be used.
  • a substance that binds phosphatidylinositol phosphate is labeled with a fluorescent substance, reacted with a sample, an unbound or nonspecific binding product is removed, and then fluorescence according to the presence of phosphatidylinositol phosphate is measured under a fluorescence microscope, or a fluorescence value is measured.
  • the absorbance may be measured by the color reaction of the substrate through the enzymatic reaction, and in the case of the radioactive substance, the radiation emission may be measured.
  • the first step is to treat a cell-containing sample, the composition for detecting cell death comprising a substance binding to phosphatidylinositol phosphate.
  • the method of treating the composition with the sample can be used without limitation the methods used in the art.
  • the second step is to detect the labeling substance from the sample.
  • the method for detecting the labeling substance is as described above.
  • the present invention provides a composition for screening an anticancer agent, comprising the composition for detecting cell death.
  • the cell death detection composition is as described above.
  • the anticancer agent means a substance that induces or promotes apoptosis of cancer cells, and may be used in the same sense as a cytotoxic drug or apoptosis inducing agent herein.
  • the anticancer agent is cisplatin, vinblastine, mitomycin, mitomycin, cisplatin, cis-diamminedichloroplatinum, doxorubicin, etoposide, tamoxifen, tamtoxifen Camptothecin, inosmycin, or neocarzinostatin, but is not limited to those used in the art as cytotoxic drugs.
  • the first step is a step of treating the sample containing the cancer cells with the composition for screening and the candidate substance of the anticancer agent.
  • the candidate substance may mean any substance suspected of an anticancer agent.
  • the treatment method can be used without limitation a method widely used in the art.
  • the second step is to detect the labeling substance included in the composition for screening from the treated sample.
  • the method for detecting the labeling substance is as described above.
  • the present invention comprises a first step of treating the cell death composition and the candidate material, a sample containing cells; A second step of inducing death of the cells; And a third step of quantifying the labeling substance from the sample.
  • the candidate substance is determined to be apoptosis inhibitor. It may further comprise a fourth step.
  • the first step is a step of treating the sample containing the cells with the composition for detecting cell death and the candidate substance.
  • the candidate material may mean a material suspected of inhibiting cell death.
  • the treatment method can be used without limitation a method widely used in the art.
  • the present invention provides a composition for inhibiting phagocytosis, comprising a substance binding to phosphatidylinositol phosphate.
  • PtdIns (3,4,5) P 3 externalized on the surface of the apoptotic cells was observed in the early stages of apoptosis (FIG. 2A) and the second necrosis stage (FIG. 2B).
  • the externalization was independent of the type of apoptosis inducing agent or cell type (FIG. 2C). Therefore, when apoptosis is induced, the apoptotic cells externalize phosphatidyl inositol phosphate on the plasma membrane outer layer, and it was confirmed that cell death can be detected through observation of phosphatidylinositol phosphate.
  • Jarkat T cells or HeLa cells were incubated for 16 hours in 100 cm 3 plates at a concentration of 1 ⁇ 10 7 cells / ml, respectively. Thereafter, 10 ⁇ M dexamethasone, 4 ⁇ M camptothecin, or 100 ⁇ M cycloheximide was treated at various time points (0, 1, 2, 4, 6, 8, 18, 24 hours) to induce apoptosis, and then cells were recovered. Acidic lipids were extracted by the following method according to the manufacturer's manual (Echelon Biosciences).
  • the cells were washed with 10 mL of cold 0.5 M TCA (trichloroacetic acid), and the cells attached to the flask were collected and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes.
  • the cell pellet was washed twice with 3 mL of 5% TCA containing 1 mM EDTA solution, 2.25 mL of MeOH / CHCl 3 : 12M HCl (80: 40: 1, v / v) was added and then kept at room temperature for 15 minutes. Vortexed four times. It was then centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes.
  • the purified recombinant proteins were then dialyzed with 50 mM Tris pH7.6, 20 mM NaCl and further purified by gel filtration (Superdex-200 FPLC) chromatography to obtain recombinant CD14 receptor protein.
  • the purified wild type or mutant protein is then diluted 4-fold according to protein concentration and transferred to 30 ⁇ l of TBS-T containing 40 ⁇ l of phosphinositol beads or 20 mM IC-InsP6 (Iron-Calcium-InsP6 (Phytate)). , Mix gently for 30 minutes. The sunken beads were washed four times with TBS-T. The proteins were eluted with SDS sample buffer, separated by SDS-PAGE, and detected by immunoblotting (anti-CD14 antibody; HPA002127; Sigma).
  • CD14 did not bind to PIP beads for the mutated protein, whereas PtdIns (3) P, PtdIns (4) P, PtdIns (5) P, PtdIns (4) for wild-type CD14 protein. , 5) P2, PtdIns (3, 4, 5) P3 was confirmed to be defective (FIG. 4C).
  • Intraperitoneal macrophages (Thio-pMacs; thioglycollate-elicited peritoneal macrophages) induced by thioglycolate in C57BL / 6 mice were obtained. Specifically, mice were intraperitoneally injected with 2 ml of 3% Brewer thioglycolate salt medium (Difco, Detroit, MI, USA), and after 3-5 days, the abdominal cavity was washed with cold PBS to recover the abdominal macrophages. The cells were centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes.
  • the cell pellet was washed three times with PBS, resuspended in DMEM medium containing 10% FBS (Gibco) and then cultured on 6-well plates (Nunc, Fisher Scientific) at a density of 1 ⁇ 10 5 cells / ml. It was. Cells were adherent for 16 hours and the slides were washed to remove suspended cells. Thereafter, attached Thio-pMacs cells were incubated for 6 hours with or without 0.5 ⁇ g / ml LPS. LPS induces activation of Thio-pMacs.
  • the cells were treated with 0-0.5 mM IC-InsP 6 for 4 hours. Cells were washed with PBS to free IC-InsP 6 After removing, fixed with 10% neutral buffered formalin for 5 minutes, staining was performed as follows to confirm the uptake of iron in the cells. Specifically, the cover glass was placed in a staining solution (5% potassium ferrocyanide, 12% HCl) for 1 hour, washed three times with distilled water, and stained with Prussian blue. It was then counterstained with Nuclear Fast Tread and placed on mounting medium (Thermoscientific, Somerset, NJ, USA).
  • a staining solution 5% potassium ferrocyanide, 12% HCl
  • the first molecule (-6.2 kcal / mol, binding affinity) was selected for further experiments without the RMSD (root-mean-square deviation) for any steric conformation. .
  • All computer calculations were performed using the published CD14 structure (IWWL) (J. I. Kim et al., J Biol Chem 280, 11347-11351, 2005). All five sequences (bovine, rabbit, human, mouse, rat) corresponding to the CD14 family were downloaded from SwissProt and sorted by ClustalW.
  • liver Cooper cells of mice lacking CD14 were IC-InsP 6 Rarely predated, while wild-type effectively IC-InsP 6 Were fed (FIG. 9A).
  • IC-InsP 6 to the CD14 macrophage mimic PtdIns (3,4,5) P 3 This suggests direct control of the predation of.
  • Jurkat T cells were incubated overnight at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells / ml and treated with 20 ⁇ g / mL dexamethasone for 6 hours.
  • Grown or killed Jurkat T cells were washed with PBS and incubated with pHrodo Red AM (P353721, Life Technologies, USA) for 30 minutes at room temperature.
  • the PHrodo labeled Jurkat T cells were washed with live cell imaging solution (A14291DJ, Life Technologies, USA).
  • activated macrophages isolated from CD14 deficient mice were compared to wild-type macrophages (Jurkat) as shown in FIG. T cell) showed little predation.
  • PdtIns (3,4,5) P 3 of other goods by anti -PdtIns (3,4,5) P 3 antibody treatment, predation action is shown to be suppressed.
  • CD14 recognizes cell death through specific binding to PdtIns (3,4,5) P 3 and induces phagocytosis of dead cells.
  • camptothecin was treated for 6 hours to induce death in HeLa cells and CHO cells, and then fixed in 10% neutral buffered formalin for 5 minutes and washed twice with PBS. The cells are then treated with serum free protein blocking solution (DAKO),
  • Annexin V (Annexin V, 1-319 amino acids) was cloned into pET28a, expressed in Escherichia coli, and separated to prepare recombinant Annexin V.
  • the size of the protein prepared as shown in FIG. 12c was confirmed to be 37 kDa, confirming that it was Annexin V.
  • Annexin V binds very strongly to phosphatidylinositol phosphate when treated with calcium, and thus can detect cell death with higher accuracy.

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Abstract

본 발명은 포스파티딜이노시톨 포스페이트에 결합하는 물질을 이용한 세포 사멸 검출 방법, 항암제 스크리닝 방법, 세포사멸 저해 물질의 스크리닝 방법, 및 식작용 억제 방법에 관한 것이다.

Description

포스파티딜이노시톨포스페이트 결합 물질의 세포 사멸 검출 용도
본 발명은 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 이용한 세포 사멸 검출 방법, 항암제 스크리닝 방법, 세포사멸 저해 물질의 스크리닝 방법, 및 식작용 억제 방법에 관한 것이다(Use of Phosphatidylinositolphosphate binding materials for detection of cell apoptosis).
포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)은 대식세포가 사멸세포(apoptotic cell)를 인식하여 제거하는 중요한 표지자이다(Schlegel, R.A. et al., Cell Death and Differentiation, 2001, 8:551-563). 정상 상태에서 포스파티딜세린은 세포막의 내부에 존재하나, 세포가 사멸신호를 받거나 적혈구가 노화되면 세포막의 외부로 노출되며, 이것을 대식세포가 세포표면의 수용체를 통해서 인식하여 탐식작용을 일으킨다(Fadok, V.A. et al., J immunol 1992, 148:2207-2216).
아넥신 V(annexin V)은 포스파티딜세린과 효과적으로 결합할 수 있는 단백질이다(미국공개특허 2013-0302827). 세포 사멸 초기 단계에서 세포막 구조가 파괴됨에 따라 세포 내부에서만 노출되어있던 포스파티딜세린이 세포 외부로 노출되므로, 이러한 점을 이용하여 개발된 아넥신 V를 포함하는 키트가 세포 사멸 검출을 위하여 널리 사용되고 있다. 국제공개특허 WO 2009107971 A2는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포 검출용 조성물에 대하여 기재하고 있다.
한편, 우리나라 건강보험 심사평가원의 최근 10년간 건강보험자료를 분석한 결과, 당뇨병 환자는 2020년경 국민 7명당 1명꼴인 722만 명(전국민의 14.4%)으로 추정되고 있다(박용수, HANYANG MEDICAL REVIEWS 29(2), 2009). 따라서 이와 동반한 사회경제적 비용 손실도 막대할 것으로 예상되고 있다.
당뇨병의 치료에는 경구혈당강하제 및 인슐린을 이용한 치료방법과 췌장 및 췌도를 이용한 이식이 있다(김화정 외, J Korean Soc Transplant, December 2009; 23(3): 214-226). 최근 인슐린을 분비하는 타인의 췌도만을 이식하여 인슐린 분비 기능을 회복시키는 시술에 대한 관심이 집중되고 이에 따라 성적이 호전되고 있다. 췌도이식은 췌장이식에 비해 덜 침습적이며 시술이 간편하여 시술에 따른 부작용이 적고 입원기간이 짧으며 반복시술이 가능한 장점이 있다. 또한 췌장이식이 불가능한 경우에도 췌도를 채취하여 이식하는 것이 가능하다.
그러나 현재 많이 사용되는 Edmonton 이식법(Shapiro AM et al., N Engl J Med 2006;355:1318-30)을 통해 이식될 경우 혈관 속에서의 면역반응으로 인하여 초급성 혈액 매개성 염증반응(IBMIR)이 일어나 췌도의 세포사멸이 일어날 수 있으며, 두 명 이상의 공여자의 세포를 이식할 경우 서로 다른 HLA 항원으로 인하여 염증반응이 심화되어 거부반응을 초래할 가능성이 존재하게 된다. 따라서, 췌도이식 시 세포사멸을 억제할 수 있는 치료법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명자들은 사멸 세포에서 나타나는 표지 물질을 이용하여 세포의 사멸을 검출하고, 사멸 세포를 식작용으로부터 보호할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 세포 사멸이 유도될 경우 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 사멸 세포의 표면에 외재화되며, 이에 따라 대식세포가 CD14 수용체를 통하여 세포사멸을 인식할 수 있음을 확인하였으며, 이를 이용하여 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 효과적으로 결합할 수 있는 물질이 세포 사멸 검출, 세포 사멸 보호, 및 항암제 스크리닝에 사용될 수 있음을 도출하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 포함하는, 세포 사멸 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포 사멸 검출용 조성물을 포함하는, 세포 사멸 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 사멸 검출용 조성물을 세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계; 상기 시료로부터 표지 물질을 감지하는 제2단계를 포함하는, 세포 사멸 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 사멸 검출용 조성물을 포함하는, 항암제의 스크리닝용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제의 스크리닝용 조성물과 후보 물질을, 암세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계; 및 상기 시료로부터 표지 물질을 감지하는 제2단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 사멸 검출용 조성물과 후보 물질을, 세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계; 상기 세포의 사멸을 유도하는 제2단계; 및 상기 시료로부터 표지 물질을 정량하는 제3단계를 포함하는, 세포 사멸 저해 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 포스파티딜이노시톨 포스페이트에의 결합 물질을 포함하는, 식작용 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 식작용 억제용 조성물을 세포, 조직 또는 장기에 처리하는 단계를 포함하는, 식작용 억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 세포 사멸 검출용 조성물, 키트, 및 세포 사멸 검출 방법은 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 이용하여 세포 사멸 유무 및 그 정도를 용이하게 검출할 수 있다.
이를 이용하여, 본 발명은 항암제 또는 세포 사멸 저해 물질을 용이하게 스크리닝할 수 있으며, 식작용을 억제하여 세포를 보호하고 이식 시 발생하는 부작용을 감소시킬 수 있다.
도 1a는 포스파티딜이노시톨 포스페이트에 결합하는 PH 도메인, CD14, 및 그에 의한 캡핑(capping)을 모식도로 나타낸 것이고, 도 1b는 세포사멸 유도제 처리에 따른 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 외재화 및 이에 따른 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 제조를 모식도로 나타낸 것이고, 도 1c는 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 CD14를 통한 활성화된 대식세포와의 결합을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 세포사멸 유도제 처리에 따른 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 외재화를 나타낸 것으로, 도 2a는 세포사멸 초기단계에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3, 도 2b는 2차 괴사 단계에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3, 도 2c는 세포사멸 유도제에 따른 PtdIns(3,4,5)P3 의 외재화, 도 2d는 외재화된 PtdIns(4,5)P2 를 나타낸 것이다.
도 3a는 시간에 따른 Jarkat T 세포의 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를, 도 3b는 시간에 따른 HeLa 세포의 총 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를 나타낸 것이다.
도 4a 및 도 4b는 단백질-지질 어세이 및 면역 블로팅 결과를 나타낸 것이고, 도 4c는 PIP-친밀도 비드 풀다운 결과를 나타낸 것이다.
도 5은 IC-InsP6 의 화학구조를 나타낸 것이다.
도 6a는 복강 대식세포에 의해서 흡수되는 IC-InsP6를 나타낸 것이고, 도 6b, 도 6c 는 RAW264.7 대식세포에 의해서 흡수되는 IC-InsP6를 나타낸 것이다.
도 7a는 PtdIns(3,4,5)P3 의 1-, 3-, 4-, 5-포스페이트 그룹과 CD14의 R93, R148, R150, R230 아미노산 잔기와의 결합을 나타낸 것이고, 도 7b는 종 간 보존된 아미노산 잔기를 나타낸 것이다.
도 8은 야생형 재조합 CD14 수용체 또는 변이된 CD14 수용체와 PtdIns(3,4,5)P3의 결합을 나타낸 것이다.
도 9a는 CD14가 결손된 마우스 또는 야생형 마우스의 간 쿠퍼 세포의 IC-InsP6 포식을 나타낸 것이고, 도 9b 및 도 9c는 CD14가 결손된 마우스 또는 야생형 마우스의 대식세포의 pHrodo-표지된 사멸세포의 포식을 나타낸 것이다.
도 10는 사멸세포 표면에 외재화된 PdtIns(3,4,5)P3의 역할을 나타낸 모식도 이다.
도 11a는 Akt 단백질의 작용의 모식도를 나타낸 것이고, 도 11b 및 도 11c는 재조합 Akt 단백질의 PH 도메인과 사멸세포 표면에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3의 결합을 나타낸 것이다.
도 12a는 인간 Akt PH 도메인을 포함하는 pET28a 를 나타낸 것이고, 도 12b는 제조된 재조합 PH 도메인을 확인하여 나타낸 것이고, 도 12b는 제조된 재조합 아넥신 V를 확인하여 나타낸 것이다.
도 13은 레이저-스캐닝 공초점 현미경으로 PH 도메인이 결합하는 외재화된 PtdIns (3,4,5)P3 와 아넥신 V가 결합하는 PdtSer을 나타낸 것이다.
도 14는 유세포분석기로 PH 도메인 또는 CD14 단백질이 결합하는 외재화된 PtdIns (3,4,5)P3 와 아넥신 V가 결합하는 PdtSer을 나타낸 것이다.
도 15a는 C2 도메인 단백질에 대한 단백질-지질 어세이 및 면역 블로팅 결과를 나타낸 것이고, 도 15b는 도 15a의 우측 결과를 통계처리하여 나타낸 그래프이다.
도 16은 Annexin V에 대한 단백질-지질 어세이 및 면역 블로팅 결과를 나타낸 것이다.
상기 도면의 각 그래프의 오차 바는 3회 이상의 독립적 실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 각 그룹 간의 통계적 유의성은 스튜턴트 t-테스트로 결정하였으며, P<0.05를 유의한 것으로 판단하였다.
세포 사멸 검출용 조성물, 키트 , 및 검출 방법
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 포함하는, 세포 사멸 검출용 조성물을 제공한다.
포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)는 Ins(1,4,5)P3, Ins(1,3,4,5)P4 와 같은 myo -이노시톨 포스페이트 및 디아실글리세롤으로 구성되는, 세포막의 세포질층에 위치하는 물질이다. 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 이펙터 단백질의 PIP-결합 도메인을 끌어오는 세포질에서의 닻(anchor)이자, 다양한 자극에 의해 유도되는 신호전달을 증폭하는 단백질 활성제로서 생물학적 회로의 온/오프 스위치를 제공하는 역할을 한다(L. C. Cantley, Science 296, 1655, 2002). 그러나 포스파티딜이노시톨 포스페이트과 대식세포의 포식 작용, 또는 세포 사멸 인식과의 관계에 대해서는 알려진바 없다.
본 발명자들은 사멸된 세포에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 외재화되며(도 1b, 도 2a, 2b, 및 2d), 이에 따라 대식세포의 CD14 수용체와 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 특이적으로 결합함으로써, 세포사멸을 인식할 수 있음을 최초로 확인하였다. 따라서, 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 이용하여 효과적으로 세포 사멸을 검출할 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2) 인 것일 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서 세포 사멸을 유도할 경우 특히 PtdIns(3,4,5)P3 와 PtdIns(4,5)P2가 세포 표면으로 외재화되어, 세포 사멸 신호로 작용함을 확인하였다(도 2a 내지 도 2d).
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 CD14 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 CD14 단백질의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서 CD14는 다양한 포스파티딜이노시톨 포스페이트에 대해서만 6.3 pmol의 세기로 강한 결합 친화성을 보인 반면, 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 스핑고신 1 포스페이트에 대해서는 친화성을 보이지 않음을 확인하였다(도 4a, 도 4b). 이러한 결과는 CD14 단백질을 이용하여 이노시톨 포스페이트 그룹을 갖는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 검출할 수 있음을 시사하는 것이다. 또한, PIP-친밀도 비드 풀다운 결과, 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합할 수 없도록 변이된 CD14 단백질의 경우 PIP 비즈와 결합하지 않는 반면, 야생형 CD14 단백질의 경우 PtdIns(3)P, PtdIns(4)P, PtdIns(5)P, PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3와 결함함을 확인하였다(도 4c).
상기 CD14 단백질의 변이체는 CD14 단백질의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열을 가지며, 실질적으로 PtdIns(3,4,5)P3와 결합하는 활성을 갖는 단백질이라면 모두 포함할 수 있다. 이러한 유사성을 갖는 서열로서 상기 CD14 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 또한, 상기 변이체는 발현하고자 하는 숙주세포에 따라 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 CD14 단백질의 변이체는 인간 (Homo sapiens) CD14 단백질 아미노산 서열에서 93, 148, 150, 320번째 아르기닌 잔기인 R93, R148, R150, R230 잔기를 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 일 실시예에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 및 이를 모방하여 행동하는 이노시톨-6-포스페이트(InsP6)에 대한 복강 대식세포의 흡수를 평가한 결과, InsP6 또는 PtdIns(3,4,5)P3 의 1-, 3-, 4-, 5-포스페이트 그룹은 CD14의 R93, R148, R150, R230 아미노산 잔기와 염 브릿지에 의해 고정되는 것으로 나타났다(도 7a). 따라서 R93, R148, R150, R230 잔기를 포함하는 CD14 단백질은 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 인식, 결합하여, 세포 사멸을 검출할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 PH (Pleckstrin Homology) 도메인 함유 단백질을 포함하는 것일 수 있다. PH 도메인은 세포내 PtdIns(3,4,5)P3 에 결합하는 바이오센서이다(도 11a, T. Balla, J Cell Sci 118, 2093-2104, 2005; Benchun Miaoa et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Nov 16;107(46):20126-31). 본 발명에 따른 일 실시예에서 재조합 Akt 단백질이 PH 도메인을 통하여 사멸세포 표면에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3 에 결합함을 확인하였다(도 11b, 도 11c). 또한 대장균에서 발현시킨 재조합 PH 도메인도 세포사멸을 검출함을 확인하였다(도 13, 도 14).
비제한적인 예로서, 상기 PH 도메인 함유 단백질은 Akt(단백질 키나아제 B), Btk(Bruton's tyrosine kinase), PDK1(pyruvate dehydrogenase kinase 1), 및 GRP1(general receptor of phosphoinositides 1)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 Akt, Btk, PDK1, GRP1는 그 서열이 당업계에 공지되어 있으며PH 도메인을 포함하는 단백질로 알려져 있다. 그러나, 포스파티딜이노시톨포스페이트와 결합하는 PH 도메인을 포함하는 단백질이라면 이에 제한되지 않고 포함될 수 있다.
다른 일 예로, 상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 C2 도메인 함유 단백질을 포함하는 것일 수 있다. C2 도메인은 PKC (Protein kinase C)에 포함되는 것을 의미할 수 있다(Adv Exp Med Biol. 2012;740:663-83).
비제한적인 예로서, 상기 C2 도메인 함유 단백질은 전사인자인 Myc가 결합된 PKCβ1 C2 도메인 단백질 (PKCβ1 C2 domain-Myc)일 수 있다. 상기 단백질은 그 서열이 당업계에 공지된 PKCβ1 C2 도메인 단백질에 Myc가 직접 또는 간접적으로 연결된 것일 수 있다. 예를 들어 PKCβ1 C2 도메인 단백질과 Myc는 링커로 연결된 것일 수 있다. 포스파티딜이노시톨포스페이트와 결합하는 C2 도메인을 포함하는 단백질이라면 이에 제한되지 않고 포함될 수 있다.
예를 들어, C2 도메인 함유 단백질을 포함하는 세포 사멸 검출용 조성물은 칼슘을 추가로 포함할 수 있다. 상기 칼슘은 조성물 전체에 대하여 0.0001mM 내지 100mM, 바람직하게는 0.001mM 내지 10mM, 더욱 바람직하게는 0.001mM 내지 0.5mM, 더더욱 바람직하게는 0.001mM 내지 0.1mM 로 포함될 수 있다(도 15a 및 도 15b). 상기 농도로 칼슘을 포함할 경우 C2 도메인 함유 단백질이 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 특히 PI(3,4,5)P3 또는 PI(4,5)P2에 대한 결합력이 우수하므로, 세포 사멸 검출 효과가 보다 우수하다.
또 다른 일 예로, 상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 CD14 단백질 또는 이의 변이체, PH (Pleckstrin Homology) 도메인 함유 단백질, C2 도메인 함유 단백질, 또는 그의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체 또는 항-PtdIns(4,5)P2 항체를 포함할 수 있다. 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체 또는 항-PtdIns(4,5)P2 항체는 PtdIns(3,4,5)P3 또는 PtdIns(4,5)P2 를 인식, 결합하므로, 세포 사멸을 검출하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
일 예로, 본 발명의 조성물은 칼슘; 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질로서 아넥신 V (Annexin V)을 포함하는 것일 수 있다. 아넥신 V는 칼슘과 함께 처리할 경우 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 매우 강하게 결합하므로, 상기 조성물은 세포 사멸을 보다 높은 정확도로 검출할 수 있다(도 16).
상기 칼슘은 조성물 전체에 대하여 0.1 μM 내지 100mM, 바람직하게는 1 μM 내지 100mM, 더욱 바람직하게는 2.5μM 내지 75mM 로 포함될 수 있다. 상기 농도로 칼슘을 포함할 경우 아넥신 V는 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 특히 PI(3,5)P2, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 에 대한 결합력이 우수하므로, 세포 사멸 검출 효과가 보다 우수하다.
상기 세포 사멸 검출은 인비트로에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 사멸 검출용 조성물을 이용하여 인비트로에서 배양되는 세포에서 세포 사멸 유무 및 정도를 확인할 수 있다.
상기 세포 사멸 검출용 조성물에서, 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 표지 물질로 표지된 것일 수 있다. 상기 표지 물질은 일 예로 형광 물질, 발색 효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromophore), 상자성 입자(super paramagnetic particles), 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 당해 기술 분야에서 물질의 존재여부를 확인하기 위하여 통상적으로 사용되는 표지 물질이라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 표지 물질은, 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질과 결합을 이루어 그 물질을 가시화시킬 수 있다. 따라서 세포사멸의 신호인 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 유무 및 양을 용이하게 확인할 수 있다.
상기 형광 물질은 형광을 나타내는 물질로, 형광단백질(GFP), HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), Texas-Red 등 당업계에서 형광 표지 물질로 사용하는 것이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 비제한적인 예로, FITC, RITC, alexa 647, APC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 또는 Cy7.5 일 수 있다.
상기 발색효소는 비제한적인 일 예로 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제를 포함할 수 있으나, 당업계에서 발색되는 효소로 사용하는 것이라면 제한하지 않고 포함할 수 있다.
방사성 동위원소는 비제한적인 일 예로 125I, 32P, 또는 35S 를 포함할 수 있으나, 당업계에서 방사성 동위원소로 사용하는 것이라면 제한하지 않고 포함할 수 있다.
상기 크로모포어는 예를 들어 헴(Heme)과 결합하여 산소를 운반하는 철(Fe2+) 또는 세포호흡에서 전자의 전달에 관여하는 구리(Cu+)일 수 있다. 상기 물질 외에도 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 가시화할 수 있는 물질이라면 제한되지 않고 표지 물질로 사용할 수 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 형광물질로 표지시킨 후, 시료와 반응시키고, 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 존재에 따른 형광을 관찰하거나 형광 값을 측정할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포 사멸 검출용 조성물을 포함하는, 세포 사멸 검출용 키트를 제공한다. 세포 사멸 검출용 조성물은 상기한 것과 같다. 상기 세포 사멸 검출용 조성물은 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 가시화할 수 있는 표지 물질을 포함하고 있으므로, 실시간으로 세포 사멸 유무 및 그 정도를 용이하게 검출할 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포 사멸 검출용 조성물을, 세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계; 상기 시료로부터 표지 물질을 감지하는 제2단계를 포함하는, 세포 사멸 검출 방법을 제공한다.
먼저 제1단계는 세포를 포함하는 시료에, 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 포함하는 세포 사멸 검출용 조성물을 처리하는 단계이다. 시료에 조성물을 처리하는 방법은 당업계에서 사용되는 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
제2단계는 상기 시료로부터 표지 물질을 감지하는 단계이다. 상기 표지 물질을 감지하는 방법은 상기한 것과 같다.
*상기 세포 사멸 검출용 조성물은 세포 사멸 신호인 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 가시화할 수 있는 표지 물질을 포함하므로, 실시간으로 세포 사멸 유무 및 그 정도를 용이하게 검출할 수 있다.
항암제의 스크리닝용 조성물, 스크리닝 방법
다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포 사멸 검출용 조성물을 포함하는, 항암제의 스크리닝용 조성물을 제공한다. 상기 세포 사멸 검출용 조성물은 상기한 것과 같다.
본 발명자들은 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 사멸된 세포의 신호로 작용할 수 있음을 확인하여, 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 검출함으로써 암세포의 세포사멸을 유도하는 항암제를 스크리닝할 수 있음을 최초로 밝혀내었다.
상기 항암제는 암세포의 세포 사멸을 유도 또는 촉진하는 물질을 의미하며, 본 명세서에서 세포 독성 약물 또는 세포 사멸 유도제와 동일한 의미로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항암제는 시스플라틴, 빈블라스틴(vinblastine), 마이토마이신(mitomycin), 시스플라틴(cisplatin, cis-diamminedichloroplatinum), 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 타목시펜(tamoxifen), 캠토테신(camptothecin), 이노스타마이신(inostamycin), 또는 네오카르지노스타틴(neocarzinostatin)일 수 있으나, 당업계에서 세포 독성 약물로 사용되는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 항암제의 스크리닝용 조성물과 후보 물질을, 암세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계; 및 상기 시료로부터 표지 물질을 감지하는 제2단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 제2단계에서 표지 물질이 감지될 경우 상기 후보 물질을 항암제로 결정하는 제3단계를 추가로 포함할 수 있다.
제1단계는 상기 항암제의 스크리닝용 조성물 및 후보 물질을, 암세포를 포함하는 시료에 처리하는 단계이다. 상기 후보 물질은 항암제로 의심되는 임의의 물질을 의미할 수 있다. 상기 처리 방법은 당업계에서 널리 사용하는 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
제2단계는 상기 처리된 시료로부터 스크리닝용 조성물에 포함된 표지 물질을 감지하는 단계이다. 상기 표지 물질을 감지하는 방법은 상기한 것과 같다.
상기 스크리닝용 조성물은 세포 사멸 시 외재화되는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 검출할 수 있는 표지 물질을 포함하므로, 실시간으로 항암제에 의한 세포 사멸 유무 및 그 정도를 용이하게 검출할 수 있다. 따라서, 표지 물질에 의하여 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 감지될 경우, 상기 후보 물질을 항암제로 결정할 수 있다.
세포 사멸 저해 물질의 스크리닝용 조성물, 스크리닝 방법
다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포 사멸 검출용 조성물을 포함하는, 세포 사멸 저해 물질의 스크리닝용 조성물을 제공한다. 상기 세포 사멸 검출용 조성물은 상기한 것과 같다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포 사멸 검출용 조성물과 후보 물질을, 세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계; 상기 세포의 사멸을 유도하는 제2단계; 및 상기 시료로부터 표지 물질을 정량하는 제3단계를 포함하는, 세포 사멸 저해 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 제3단계에서 시료로부터 감지되는 표지 물질의 양이, 후보 물질을 처리하지 않고 세포 사멸을 유도한 시료로부터 감지되는 표지 물질의 양보다 적을 경우, 상기 후보 물질을 세포 사멸 저해 물질로 결정하는 제4단계를 추가로 포함할 수 있다.
먼저, 제1단계는 상기 세포 사멸 검출용 조성물과 후보 물질을, 세포를 포함하는 시료에 처리하는 단계이다. 상기 후보 물질은 세포 사멸 저해 물질로 의심되는 물질을 의미할 수 있다. 상기 처리 방법은 당업계에서 널리 사용하는 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
제2단계는 상기 시료에 포함된 세포의 사멸을 유도하는 단계이다. 상기 세포의 사멸을 유도하는 방법은 당업계에서 일반적으로 세포의 사멸을 유도하기 위하여 사용하는 수단을 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포 사멸이 유도될 수 있는 조건에서 세포를 배양할 수 있다. 또는 예를 들어, 세포에 사멸 유도제를 처리하여, 상기 시료에 포함된 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 상기 사멸 유도제는 항암제일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 사멸 유도제로 캄프토테신(camptothecin), 사이클로헥시미드(cycloheximide), 덱사메타손(dexamethasone), 에토포사이드(etoposide)를 사용하였다. 상기 덱사메타손은 15 내지 25 μM의 농도로, 상기 캄프토테신은 2 내지 5 μM의 농도로, 상기 에토포사이드는 80 내지 120 μM의 농도로, 상기 사이클로헥시미드는 150 내지 250 μM의 농도로 시료에 처리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제2단계에서 사멸 유도제는 1 내지 10시간 동안 처리될 수 있다. 바람직하게는 2 내지 8시간 동안 처리될 수 있다. 상기 시간 동안 처리할 경우 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 보다 효과적으로 감지할 수 있다(도 3a, 도 3b).
제3단계는 상기 시료로부터 표지 물질을 정량하는 단계이다. 상기 정량방법은 당업계에서 형광 물질, 발색 효소, 방사성 동위원소, 크로모포어, 상자성 입자, 및 초상자성입자 등 표지 물질을 정량하는 방법이라면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 예를 들어 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 형광물질로 표지시킨 후, 시료와 반응시키고, 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 존재에 따른 형광 값을 측정할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다.
제4단계는 상기 제3단계에서 시료로부터 감지되는 표지 물질의 양이, 후보 물질을 처리하지 않고 세포 사멸을 유도한 시료로부터 감지되는 표지 물질의 양보다 적을 경우, 상기 후보 물질을 세포 사멸 저해 물질로 결정하는 단계이다. 사멸된 세포의 신호로 작용하는 포스파티딜이노시톨 포스페이트가, 후보 물질이 처리된 시료에서, 처리하지 않은 시료에 비하여 보다 적은 양으로 검출될 경우, 상기 후보 물질은 세포 사멸을 저해하는 것으로 판단될 수 있다.
식작용 억제용 조성물, 억제 방법
다른 양태로서, 본 발명은 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 포함하는, 식작용 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 일 실시예에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 사멸된 세포의 신호로 작용하며, 이에 따라 식작용이 유도됨이 확인되었는바, 세포 사멸 시 외재화되는 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 캡핑(capping)할 경우 식작용을 억제할 수 있다. 따라서 상기 식작용 억제용 조성물은 불필요한 식작용을 억제하여 세포 보호 효과를 나타낼 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2) 일 수 있으며, 이는 상기한 것과 같다.
상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 CD14 단백질 또는 이의 변이체, PH (Pleckstrin Homology) 도메인 함유 단백질, PKC(Protein kinase C)의 C2 도메인 함유 단백질, 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체, 항-PtdIns(4,5)P2 항체, 또는 그의 혼합물을 포함하는 것일 수 있으며, 이는 상기한 것과 같다.
상기 조성물은 칼슘; 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질로 아넥신 V (Annexin V)을 포함하는 것일 수 있다. 아넥신 V는 칼슘과 함께 처리될 경우 다양한 종류의 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합력이 우수하여 식작용을 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 칼슘은 조성물 전체에 대하여 0.1 νM 내지 100mM, 바람직하게는 1 νM 내지 100mM, 더욱 바람직하게는 2.5νM 내지 75mM 로 포함될 수 있다. 상기 농도로 칼슘을 포함할 경우 아넥신 V는 포스파티딜이노시톨 포스페이트, 특히 PI(3,5)P2 , PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 에 대한 결합력이 우수하므로, 식작용 억제 효과가 보다 우수하다.
상기 식작용 억제용 조성물은 이식용 세포, 이식용 조직 또는 이식용 장기에 처리되는 것일 수 있다. 예를 들어 상기 이식용 세포는 췌도(pancreatic islet) 세포일 수 있다. 예를 들어 상기 이식용 조직은 췌장 조직일 수 있다. 예를 들어 상기 이식용 장기는 췌장일 수 있다.
이식용 세포, 이식용 조직 또는 이식용 장기를 분리하는 과정에서 여러 단계에서 세포사멸이 유도될 수 있다. 따라서 상기 식작용 억제용 조성물은, 이식용 세포, 조직 또는 장기의 분리, 적출 시 처리할 수 있다. 식작용 억제용 조성물의 캡핑(capping)을 통하여 분리, 적출 시의 세포사멸 및 그에 따른 식작용을 저해하여 세포, 조직 등의 생존률을 높일 수 있다(도 1a).
다른 일 예로 상기 조성물은 분리, 적출된 세포, 조직 또는 장기의 보관과정에서 처리할 수 있다. 식작용 억제용 조성물의 캡핑(capping)을 통하여 불필요한 식작용을 억제하여 세포를 보호하고 이식의 부작용을 줄일 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않고 당업계에서 식작용 억제 물질을 처리하는 방법이라면 얼마든지 본 발명의 조성물의 처리방법으로 적용 가능하다.
또 다른 양태로, 본 발명은 상기 식작용 억제용 조성물을 세포, 조직 또는 장기에 처리하는 단계를 포함하는, 식작용 억제 방법을 제공한다. 상기 식작용 억제용 조성물은 이식용 세포, 조직 또는 장기에 전처리됨으로써, 불필요한 식작용을 억제하여 세포를 보호하고 이식의 부작용을 줄일 수 있다. 상기 처리 방법은 당업계에서 널리 사용하는 방법을 제한없이 사용할 수 있다.
상기 처리하는 단계는 개체의 체외에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들어 제1개체에서 분리 또는 분리되어 배양, 또는 별도로 제조된 세포, 조직 또는 장기에 상기 식작용 억제용 조성물을 처리한 후, 그 세포, 조직 또는 장기를 제2개체에 이식함으로써, 이식의 부작용, 예를 들어 대숙주 이식편 반응 (graft-versus-host reaction)을 방지할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 식작용 억제 방법을 이용하여 이식과 관련된 면역질환을 치료할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PtdInsPs)의 세포사멸 검출 효과 확인
1-1. 세포 사멸 유도
구체적으로, HeLa 세포, Jarkat T 세포, 또는 CHO(Chinese hamster ovary) K1 세포를 각각 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신 항생제를 포함하는 DMEM 배지, RPMI 배지, 또는 F12 배지에서 배양하였다. 이후, 세포들을 6-웰 플레이트의 커버글라스 상에서 1x105 cells/ml 의 밀도로 24시간 동안 배양한 후, 세포사멸 유도 키트(ab102480; Abcam, Cambridge, MA, USA)를 6시간 동안 37℃에서 처리하였다. 구체적으로, 캄프토테신(camptothecin) 4μM, 사이클로헥시미드 (cycloheximide) 200μM, 덱사메타손(dexamethasone) 20μM, 에토포사이드(etoposide) 100μM을 처리하였다.
1-2. 사멸 세포에서 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 관찰
사멸이 유도된 세포 표면에 포스파티딜이노시톨 포스페이트가 나타나는지 확인하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1-1에서 사멸을 유도한 세포를 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 상기 세포를 무혈청 단백질 블로킹 용액(DAKO)으로 처리하고, 단일클론 마우스 IgM 항-PtdIns(4,5)P2 또는 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체 (1:100, Echelon Biosciences, Salt Lake City, UT, USA)와 함께 30분 동안 처리하고, FITC-표지된 당나귀 항-마우스 IgM 2차 항체로 30분 동안 처리하였다.
그 후, 상기 세포를 현미경에 올려놓은 후, 적절한 여기 및 방출 필터 세트를 이용하여 Zeiss LSM 710 레이저-스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 이미지는 40x 유침 대물렌즈로 촬영하였다. 조작되지 않은 원본 이미지의 형광 강도의 정량을 위하여 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.
그 결과, 세포사멸 초기단계(도 2a) 및 2차 괴사 단계(도 2b)에서 사멸세포의 표면에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3을 관찰할 수 있었다. 상기 외재화는 세포사멸 유도제의 종류나 세포의 종류와는 무관하게 나타났다(도 2c). 따라서, 세포에 사멸이 유도되면 사멸세포가 원형질막 외층에 포스파티딜이노시톨 포스페이트를 외재화하므로, 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 관찰을 통하여 세포 사멸을 검출할 수 있음을 확인하였다.
PtdIns(4,5)P2 또한 프로피디움 요오드화물로 염색되는 세포 사멸의 마지막 단계에서 외재화되어, 세포 사멸을 검출할 수 있음을 확인하였다(도 2d).
실시예 2. 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질의 탐색
2-1. PtdIns(3,4,5)P3의 분리
포스파티딜이노시톨 포스페이트를 검출할 수 있는 물질을 탐색하기 위하여, 먼저 하기와 같이 사멸이 유도된 세포에서 PtdIns(3,4,5)P3 를 분리하였다.
Jarkat T 세포 또는 HeLa 세포를 각각 1x107 세포/ml의 농도로 100 cm3 플레이트에서 16시간 동안 배양하였다. 그 후 10μM 덱사메타손, 4μM 캄프토테신, 또는 100μM 사이클로헥시미드를 다양한 시점(0, 1, 2, 4, 6, 8, 18, 24시간)에 처리하여 세포사멸을 유도한 후, 세포를 회수하고 제조업자(Echelon Biosciences)의 매뉴얼에 따라 하기의 방법으로 산성 지질을 추출하였다.
먼저, 10mL의 차가운 0.5 M TCA(trichloroacetic acid)로 세포를 세척하고, 플라스크에 부착된 세포를 회수하여 1,500 rpm 으로 5분 동안 원심분리하였다. 상기 세포 펠렛을 1 mM EDTA 용액을 포함하는 5% TCA 3mL로 2회 세척하고, MeOH/CHCl3: 12M HCl (80:40:1, v/v) 를 2.25 mL 가한 후, 상온에서 15분 동안 4회 볼텍싱하였다. 그 후 5분 동안 15,000 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 회수하여 0.75 mL의 CHCl3 및 1.35 mL 의 0.1M HCl 을 가하여 산성 지질을 분리하고, 유기상을 진공건조기에서 건조시킨 후, 용도에 따라 -80 ℃ (장기보관) 또는 4 ℃ (곧바로 실험)에서 보관하였다.
그 후, 바이오티닐 단일클론 IgG 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체 및 스트렙타아비딘-홀스래디시 페록시다아제(streptavidin-horseradish peroxidase)를 이용한 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 로 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를 측정하여(K-2500s, Echelon Biosciences) PdtIns(3,4,5)P3 가 생산되었음을 확인하였다(도 3a, 도 3b). 도 3a는 Jarkat T 세포에서 분리된 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를 시간별, 처리 물질 별로 나타낸 것이고, 도 3b는 HeLa 세포에서 분리된 PdtIns(3,4,5)P3 의 농도를 시간별, 처리 물질 별로 나타낸 것이다.
2-2. 재조합 CD14 단백질 및 그의 변이체의 제조
재조합 CD14 단백질은 하기의 방법으로 생산하였다: 먼저, 하기의 프라이머(Genemed Synthesis,Inc.)를 사용하여 CD14 (1-365 잔기) 전체 길이를 코딩하는 인간 야생형 CD14 cDNA를 PCR로 증폭하였다.
전방향 프라이머
5'-TTGGTGCCAACAGATGAGGTTCAC-3' - 서열번호 1
역방향 프라이머
5'-TTCTTTCCTACACAGCGGCACCC-3' - 서열번호 2
*그 후, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Invitrogen)를 이용하여 pcDNA6 V5 HisA (Invitrogen)의 HindIII and XbaI 절단 위치로 복제하여, C 말단에 V5 와 His6 태그를 갖는 단백질을 생산하고, 서열 분석을 통하여 검증하였다. 그 후, 제조업체의 설명서에 따라 리포펙타민 플러스 시약(Lipofectamine Plus reagent)을 이용하여 상기 선형 벡터 10ug 를 CHO K1 세포에 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 2일 경과 후, CHO K1세포에 2일 마다 블라스티사이딘(blasticidin) 5μg/ml 로 처리하여 블라스티시딘(blasticidin)-저항성인 안정된 세포주를 얻었다. 항-CD14 항체로 면역블로팅을 진행하고, CHO K1-CD14 세포를 블라스티사이딘 1 μg/ml을 포함하는 F12 배지에 배양하였다. 각 안정된 세포주를 3일 동안 20개의 150 cm3 플레이트 안에서 배양하였다. 그 후, 수집된 세포들을 용해 버퍼 (50mM Tris pH7.6, 500mM NaCl, 20mM imidazole, EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche, Germany))에 현탁하고, 초음파 분해하였다. 각 재조합 단백질을 Ni-NTA 아가로즈 레진 (Qiagen) 상에서 정제하고, 50mM Tris pH7.6, 250mM NaCl, 및 300mM 이미다졸로 녹여 분리하였다. 그 후, 정제된 재조합 단백질들을 50mM Tris pH7.6, 20mM NaCl 로 투석하였고, 젤 여과(Superdex-200 FPLC) 크로마토 그래피로 추가 정제하여, 재조합 CD14 수용체 단백질을 얻었다.
동일한 방법으로 또는 4중 변이된(quadruple mutant) CD14 수용체 단백질(PtdIns(3,4,5)P3을 차단)을 제조하였다.
2-3. CD14 단백질과 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 결합 확인: 단백질-지질 오버레이 어세이 및 면역블로팅
다양한 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 이노시톨 포스페이트 그룹이 대식세포 CD14 수용체와 직접 결합하는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-2에서 제조한 전체 길이의 재조합 인간 CD14 단백질과 변이 CD14 단백질을 이용하여 단백질-지질 오버레이 어세이를 수행하였다. PIP 스트립 또는 PIP 어레이는 Echelon Biosciences에서 구입하였다.
3% BSA를 포함하는 TBS-T (50mM Tris, 0.15 M NaCl and 0.05% Tween-20, pH 7.4, EDTA-free protease inhibitor cocktail; Roche, Germany)로 막을 15분간 배양하여 막에 대한 비특이적 결합을 블로킹하였다. 상기 블로킹 후, 막을 30분 동안 각 정제된 재조합 CD14 단백질 100 ρmol과 함께 인큐베이션하였고, PBS로 3회 세척하고 항-CD14 (rabbit, HPA002127; Sigma-Aldrich)와 함께 다시 배양한 후, 30분 동안 HRP(horseradish peroxidase)-라벨된 2차 항체 (goat; HAF007; R&D Systems)와 함께 배양하였다. 상기 결합은 ImageQuant LAS 4000 (Fujifilm, Japan)로 감지하였다. Toda et al (Mol Cell Biol 32, 118, 2012)에 기재된 것과 같이 PIP-친밀도 비드 풀다운(PIP-affinity bead pulldowns)을 수행하였다.
그 후, 정제된 야생형 또는 변이 단백질을 단백질 농도에 따라 4배 희석하고, 포스포이노시톨 비즈 40 μl 또는 20mM IC-InsP6(Iron-Calcium-InsP6(Phytate))를 포함하는 TBS-T 30 μl 로 옮겨, 30분 동안 부드럽게 혼합하였다. 가라앉은 비즈는 TBS-T로 4회 세척하였다. 상기 단백질들은 SDS 샘플 버퍼로 용출하였고, SDS-PAGE로 분리한 후, 면역 블로팅(anti-CD14 antibody; HPA002127; Sigma)으로 감지하였다.
그 결과, CD14는 다양한 포스파티딜이노시톨 포스페이트에 대해서만 강한 결합 친화성을 보인 반면, 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 스핑고신 1 포스페이트에 대해서는 친화성을 보이지 않음을 확인하였다(도 4a).
또한, 면역 블로팅 결과, CD14는 PtdIns(3,4,5)P3 과 6.3 pmol의 세기로 가장 강하게 결합함을 확인하였다(도 4b). 이러한 결과는 CD14 수용체가 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 이노시톨 포스페이트 그룹을 통하여 직접 결합함을 시사하는 것이다.
또한, PIP-친밀도 비드 풀다운 결과, CD14가 변이된 단백질의 경우 PIP 비즈와 결합하지 않는 반면, 야생형 CD14 단백질의 경우 PtdIns(3)P, PtdIns(4)P, PtdIns(5)P, PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3와 결함함을 확인하였다(도 4c).
실시예 3. CD14 단백질의 PtdInsPs 과의 특이적 결합을 통한 세포 사멸 검출 효과 확인
3-1. IC- InsP6의 제조
PtdInsPs는 Ins(1,4,5)P3, Ins(1,3,4,5)P4와 같은 myo-이노시톨 포스페이트 및 디아실글리세롤으로 구성되므로, InsP6는 PtdInsPs를 모방하여 행동한다. 따라서 InsP6을 이용하여 하기의 실험을 진행하였다.
한편 철이온은 프루시안 블루에 의해 염색되기 때문에, InsP6의 세포 내 위치를 용이하게 모니터링하기 위하여 InsP6에 철을 결합시켰다(Fe3 +-InsP6). 구체적으로, 등몰 농도의 Fe3 + 이온과 InsP6 (파이테이트, hexakisphosphate) 용액 (pH 6.0)을 혼합하여 Fe3 +-InsP6 용액 10mM을 제조하였다. 그 후, Fe3 +-InsP6 가 혈액 내 칼슘을 킬레이팅할 가능성을 최소화하기 위하여 등몰 농도의 Ca2 + 이온을 Fe3 +-InsP6 용액에 첨가하였다. 그리고 1 N NaOH 을 첨가하여 pH를 6.0으로 조정한 IC-InsP6 (Fe3 +-Ca2+-InsP6)용액을 제조하였다. 도 5은 IC-InsP6 의 화학구조를 나타낸 것이다.
3-2. 복강 대식세포에 의한 IC- InsP6의 흡수 평가
동물 실험들은 동물관리사용위원회에서 승인을 받았으며, 모든 사용되는 동물들은 가천대학교 이길여 암당뇨연구원의 동물 실험을 위한 윤리 가이드라인 및 유전자 조작 실험을 위한 안전 가이드라인에 따라 진행되었다.
C57BL/6 마우스에서 티오글리콜산염에 의해 유발된 복강 대식세포 (Thio-pMacs; thioglycollate-elicited peritoneal macrophages)를 수득하였다. 구체적으로, 2 ml 의 3% Brewer 티오글리콜산염 배지 (Difco, Detroit, MI, USA)를 마우스에 복강내 주사하고, 3-5일 후, 차가운 PBS로 복강을 세척하여 복강 대식세포를 회수하였다. 상기 세포를 1,500 rpm 으로 5분간 원심분리하였다. 상기 세포 펠렛을 PBS로 3회 세척하고, 10% FBS (Gibco)를 포함하는 DMEM 배지에 재현탁한 후, 1x105 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트의 커버글라스(Nunc, Fisher Scientific) 상에서 배양하였다. 세포를 16시간 동안 부착배양하였고, 부유 세포를 제거하기 위하여 상기 슬라이드를 세척하였다. 그 후, 부착된 Thio-pMacs 세포를 0.5μg/ml의 LPS 유무에 따라 6시간 동안 배양하였다. LPS는 Thio-pMacs의 활성화를 유도한다.
배양 후, 상기 세포를 0~0.5 mM IC-InsP6 로 4시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하여 자유 IC-InsP6 를 제거하고, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후, 세포 내 철의 흡수를 확인하기 위하여 다음과 같이 염색을 진행하였다. 구체적으로 커버글라스를 염색 용액(5% potassium ferrocyanide, 12% HCl)에 1시간 동안 놓아둔 후, 증류수로 3회 세척하고, 프루시안 블루 염색하였다. 그 후 뉴클리어패스트레드로 대조염색하고, 마운팅 배지(Thermoscientific, Somerset, NJ, USA)에 올려두었다.
그 결과, LPS에 의해 자극되어 활성화된 Thio-pMacs 는 자극하지 않은 Thio-pMacs과 비교할 때 IC-InsP6를 효과적으로 포식하며, 이러한 효과는 처리 농도 의존적으로 증가하였다(도 6a).
한편, 동일한 실험 결과 RAW264.7 대식세포 또한 IC-InsP6를 농도 의존적으로 효과적으로 포식함을 확인하였다(도 6b, 도 6c). 이러한 결과는 IC-InsP6 이 활성화된 대식세포에 의하여 선택적으로 포식됨을 시사하는 것이다.
3-3. 분자 모델링 및 서열 정렬
CD14 수용체와 결합하는 InsP6의 잔기를 확인하기 위하여 하기와 같이 분자 모델링을 진행하였다.
먼저, AutoDock PyRx (http://pyrx.sourceforge.net/)를 이용하여 hADAR2(PDBid: 1ZY7)에서 고도로 정제된 InsP6 좌표를 CD14 (PDBid:1WWL) 결정 구조에 도킹시켰다. 도킹시키는 동안 CD14를 수용체로 처리하였고 견고함을 유지하면서, CD14의 회전가능한 결합의 유연성을 유지하였다. 그리드 박스는 CD14 단백질 전체의 x, y, z 방향으로 커버되었다. AutoDock PyRx에 의해 보고된 10개의 최저 에너지 구조는 PyMOL software (www.pymol.org)에 의하여 점검되었다. 10개의 최저 에너지 구조(energy conformation) 중, 어떠한 입체 배좌에 대한 RMSD (평균 제곱근 편차, root-mean-square deviation) 없이 첫 번째 분자(-6.2 kcal/mol, binding affinity)를 추가실험을 위하여 선정하였다. 모든 컴퓨터 계산은 출판된 CD14 구조(IWWL)를 이용하여 수행하였다(J. I. Kim et al., J Biol Chem 280, 11347-11351, 2005). CD14 패밀리에 해당하는 5개의 서열(소, 토끼, 인간, 마우스, 래트) 모두 SwissProt에서 다운로드 받고 ClustalW로 정렬하였다.
그 결과, InsP6 또는 PtdIns(3,4,5)P3 의 1-, 3-, 4-, 5-포스페이트 그룹은 R93, R148, R150, R230 아미노산 잔기와 염 브릿지에 의해 고정되는 것으로 나타났다(도 7a). 이러한 결과는, 단백질-지질 오버레이 실험에서 재조합 CD14가 PtdIns(3,4,5)P3 에 가장 높은 결합력을 나타낸 결과(도 3b)를 설명할 수 있다. 구조에 기초한 서열 정렬은, 이러한 아미노산 잔기가 종 간에 잘 보존되었음을 나타낸다(도 7b). 산성 이노시톨 포스페이트 그룹은 단백질의 염기성 아미노산 잔기에 결합하는데 필수적이므로, CD14에서 아르기닌의 염기성의 잔기인 R93, R148, R150, R230가 단백질-지질 결합을 중재할 수 있음을 알 수 있다.
3-4. CD14 단백질과 사멸세포의 상호작용 확인
CD14 단백질이 사멸 세포에 노출된 PtdIns(3,4,5)P3 를 직접 인식하는지 확인하기 위하여, 하기의 실험을 진행하였다.
먼저, 4μM의 캄프토테신을 6시간 동안 처리하여 HeLa 세포와 CHO 세포에 사멸을 유도한 후, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 상기 세포를 무혈청 단백질 블로킹 용액(DAKO)으로 처리하고, 2μg의 정제된 재조합 야생형(WT) CD14 또는 4중 변이된(quadruple mutant) CD14 수용체 단백질(PtdIns(3,4,5)P3을 차단)과 30분 동안 배양하였다. 그 후, 재조합 단백질-결합된 상기 세포들을 래빗 항-CD14 항체 (HPA00212; 1:200, Sigma-Aldrich USA) 또는 단일클론 마우스 항-Akt1 항체의 PH(Pleckstrin homology) 도메인 (05-591, 1:100, Millipore)으로 30분 동안 처리하고, FITC-표지된 2차 항체로 30분 동안 처리하였다. 그 후, DAPI로 대조염색하여 핵을 가시화하고, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)로 대조염색하여 사멸 세포를 분별할 수 있도록 하였다.
그 후, 상기 세포를 차등간섭대비현미경(DIC: differential interference contrast)에 올려놓은 후, 적절한 여기 및 방출 필터 세트를 이용하여 Zeiss LSM 710 레이저-스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 이미지는 40x 유침 대물렌즈로 촬영하였다. 조작되지 않은 원본 이미지의 형광 강도의 정량을 위하여 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.
그 결과, 도 8에 도시된 것과 같이, 야생형 재조합 CD14 수용체는 곧바로 사멸세포의 표면에 결합하는 반면, PtdIns(3,4,5)P3의 결합을 차단하도록 변이된 CD14 수용체의 경우 사멸세포를 사로잡을 수 없었다. 이러한 결과는, CD14가 사멸세포에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3와 직접 결합함으로써 사멸세포를 인식하며, 식작용의 신호로 작용함을 시사하는 것이다.
3-5. CD14-/- 마우스 대식세포의 PtdIns(3,4,5)P3에 대한 결합 능력 소실
(1) 간 쿠퍼 세포( Kupffer cell)의 식작용 평가
Jackson laboratory USA에서 구입한 CD14가 결손된(CD14-/-) C57BL/6 마우스에 IC-InsP6 를 동맥주사하고, 이로부터 간을 분리한 후, IC-InsP6 에 대한 식작용을 면역조직화학법(Immunohistochemistry) 및 프루시안 블루 염색을 통하여 하기와 같이 확인하였다.
먼저, CD14가 결손된 C57BL/6 마우스(각 그룹당 n=5)로부터 각각 간 조직을 분리하고, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 고정한 후 파라핀에 넣어두었다. 그 후, Tris/EDTA (pH 9.0)에서 2분 동안 전자레인지로 끓이면서 항원을 회수하였다. 세포질 대식세포에서의 IC-InsP6 를 감지하기 위하여, 간 조직을 래트 단일클론 항- F4/80 (Bm8, 1:100; eBioscience, San Diego, CA, USA)과 함께 상온에서 90분 동안 배양하였다. 그 후, 홀스래디시 페록시다아제 결합된 2차 항체를 30분 동안 함께 배양하고, 3,3'-디아미노-벤지딘 테트라히드로클로라이드 기질 (3,3'-diamino-benzidine tetrahydrochloride; Dako, Glostrup, Denmark)로 IC-InsP6를 감지하였다. 그 후 프루시안 블루 염색을 진행하였다. F4/80 항체로 쿠퍼 세포를 확인하였고, 프루시안 블루염색을 통하여 식작용을 확인하였다.
그 결과, CD14가 결손된 마우스의 간 쿠퍼 세포는 IC-InsP6 를 거의 포식하지 못한 반면, 야생형의 경우 효과적으로 IC-InsP6 를 포식하였다(도 9a). 이러한 결과는, 대식세포의 CD14가 PtdIns(3,4,5)P3 를 모방하는 IC-InsP6 의 포식을 직접적으로 조절함을 시사하는 것이다.
(2) 인-비트로 식작용 에세이 (n vitro phagocytosis assay)
CD14 매개 식작용에 PdtIns(3,4,5)P3 의 외재화가 필수적인지 확인하기 위하여, 야생형 또는 CD14 결손 마우스로부터 분리된 것으로서 LPS에 의해 자극된 대식세포에 의하여, PHrodo로 표지된 사멸 Jurkat T 세포에 대한 인비트로 식작용 에세이를 진행하였다. 이 때 항-PdtIns(3,4,5)P3 항체 처리 유무를 달리하였다.
먼저, Jurkat T 세포를 밤새 5x106세포/ml의 농도로 배양하고, 20μg/mL의 덱사메타손을 6시간 동안 처리하였다. 자라거나 사멸한 Jurkat T 세포를 PBS로 세척하고, pHrodo Red AM (P353721, Life Technologies, USA)와 함께 상온에서 30분 동안 배양하였다. PHrodo 표지된 상기 Jurkat T 세포를 live cell imaging solution (A14291DJ, Life Technologies, USA) 으로 세척하였다.
한편, Thio-pMacs를 6-웰 플레이트에서 5x105 세포/well의 밀도로 16시간 동안 배양하고, 0.5μg/ml LPS 를 6시간 동안 처리하였다.
그 후, PHrodo 표지된 상기 Jurkat T 세포에, LPS로 자극된 Thio-pMacs를 2.5시간 동안 처리하였다. 배양 후, 상기 플레이트를 PBS를 통해 세척하여 PHrodo로 표지된 Jurkat T 세포를 제거하고, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후, 핵을 가시화하기 위하여 DAPI로 대조염색하였다. 식작용의 정도는 상기 실시예들에서 기재한 것과 같이 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 9b 및 이를 정량화하여 나타낸 도 9c와 같이, CD14 결손된 마우스로부터 분리된 활성화된 대식세포(LPS-stimulated Thio-pMacs)는 야생형의 대식세포와 비교할 때 pHrodo-표지된 사멸세포(Jurkat T cell)를 거의 포식하지 못하는 것으로 나타났다. 또한 항-PdtIns(3,4,5)P3 항체 처리에 의한 PdtIns(3,4,5)P3 의 외재화를 억제하자, 포식작용이 억제되는 것으로 나타났다.
즉, 이러한 결과는 도 10와 같이, CD14는 PdtIns(3,4,5)P3 와의 특이적 결합을 통하여 세포 사멸을 인식하며, 사멸 세포에 대한 식작용을 유도할 수 있음을 시사한다.
실시예 4. Akt 단백질의 PH 도메인의 세포 사멸 검출 확인
Akt 단백질의 PH 도메인은 세포내 PtdIns(3,4,5)P3 에 결합하는 바이오센서이다(도 11a, T. Balla, J Cell Sci 118, 2093-2104, 2005). 따라서 이를 이용하여 PH 도메인을 함유하는 단백질이 세포 사멸을 검출할 수 있는지 확인하는 실험을 진행하였다.
먼저, 4μM의 캄프토테신을 6시간 동안 처리하여 HeLa 세포와 CHO 세포에 사멸을 유도한 후, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 상기 세포를 무혈청 단백질 블로킹 용액(DAKO)으로 처리하고,
2μg의 재조합 Akt 단백질(Millipore) 과 30분 동안 배양하였다. 그 후, 재조합 단백질-결합된 상기 세포들을 래빗 항-CD14 항체 (HPA00212; 1:200, Sigma-Aldrich USA) 또는 단일클론 마우스 항-Akt1 항체의 PH(Pleckstrin homology) 도메인 (05-591, 1:100, Millipore)으로 30분 동안 처리하고, FITC-표지된 2차 항체로 30분 동안 처리하였다. 그 후, DAPI로 대조염색하여 핵을 가시화하고, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)로 대조염색하여 사멸 세포를 분별할 수 있도록 하였다.
그 후, 상기 세포를 현미경에 올려놓은 후, 적절한 여기 및 방출 필터 세트를 이용하여 Zeiss LSM 710 레이저-스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 이미지는 40x 유침 대물렌즈로 촬영하였다. 조작되지 않은 원본 이미지의 형광 강도의 정량을 위하여 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.
그 결과, 재조합 Akt 단백질이 PH 도메인을 통하여 사멸세포 표면에 외재화된 PtdIns(3,4,5)P3 에 결합하여, 세포 사멸을 인식함을 확인하였다(도 11b, 도 11c).
실시예 5. 재조합 PH 도메인의 세포 사멸 검출 확인
5-1. 재조합 PH 도메인의 제조
도 12a에 도시된 것과 같이, 인간 Akt PH 도메인(1-144번째 아미노산)을 pET28a에 클로닝하였다. 이를 대장균에서 발현시킨 후, Ni-NTA컬럼 및 겔침투크로마토그래피 (Gel permeation chromatography)를 통하여 분리하여 재조합 PH 도메인을 제조하였다.
도 12b와 같이 상기 제조한 단백질의 크기가 21kDa로 확인되어 PH 도메인임을 확인하였다.
동일한 방식으로 인간 아넥신 V(Annexin V, 1-319 아미노산)을 pET28a에 클로닝하고 대장균에서 발현시킨 후 분리하여, 재조합 아넥신 V를 제조하였다. 도 12c와 같이 제조된 단백질의 크기가 37kDa로 확인되어 아넥신 V임을 확인하였다.
5-2. 재조합 PH 도메인의 세포 사멸 검출 확인
먼저, 4μM의 캄프토테신을 6시간 동안 처리하여 CHO 세포에 사멸을 유도한 후, 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 PBS로 2회 세척하였다. 이후 상기 세포를 무혈청 단백질 블로킹 용액(DAKO)으로 처리하고, 상기 5-1에서 제조한 재조합 PH 도메인과 30분 동안 배양하였다. 그 후, 상기 세포들을 단일클론 마우스 항-Akt1 항체의 PH 도메인 (05-591, 1:100, Millipore)으로 30분 동안 처리하고, FITC-표지된 2차 항체로 30분 동안 처리하였다. 그 후 PBS로 세포를 세척하고 10% 중성으로 완충된 포르말린으로 5분 동안 고정한 후 염색을 진행하였다. 프로피디움 요오드화물로 대조염색하여 사멸 세포를 분별할 수 있도록 하였다.
상기 5-1에서 제조한 재조합 아넥신 V에 대해서도 동일한 방식으로 실험하고 FACS 분석하였다.
그 후, 상기 세포를 현미경에 올려놓은 후, 적절한 여기 및 방출 필터 세트를 이용하여 Zeiss LSM 710 레이저-스캐닝 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 촬영하였다. 이미지는 40x 유침 대물렌즈로 촬영하였다. 조작되지 않은 원본 이미지의 형광 강도의 정량을 위하여 ZEN 2010 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하였다.
그 결과, PH 도메인과 아넥신 V이 사멸 세포 표면상에서 서로 상이한 위치에 결합하는 것으로 나타났으며, 사멸을 유도한 세포의 표면에 PH 도메인이 결합하는 외재화된 PtdIns (3,4,5)P3 와 아넥신 V가 결합하는 PdtSer이 동시에 검출됨을 확인하였다(도 13).
또한 이러한 세포사멸을 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과, PtdIns(3,4,5)P3에 결합하는 재조합 Akt PH 도메인 또는 재조합 CD14 단백질이 나타나는 사멸세포에서, 아넥신 V가 결합하는 PdtSer이 동시에 검출됨을 확인하였다(도 14).
실시예 6. C2 도메인 단백질과 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 결합 확인: 단백질-지질 오버레이 어세이 및 면역블로팅
PKCβ1 C2 domain-Myc 단백질과 다양한 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 이노시톨 포스페이트 그룹이 직접 결합하는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-3과 같은 방법으로 단백질-지질 오버레이 어세이와 면역블로팅을 수행하였다. PIP 스트립 또는 PIP 어레이는 Echelon Biosciences에서 구입하였다.
그 결과, PKCβ1 C2 domain 단백질은 100 ρmol에서도 다양한 포스파티딜이노시톨 포스페이트에 대해서만 강한 결합 친화성을 보인 반면, 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 스핑고신 1 포스페이트에 대해서는 친화성을 보이지 않음을 확인하였다(도 15a 좌측).
또한, C2 도메인 단백질은 칼슘의존적으로 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 것으로 나타났다(도 15a 우측). 이를 통계처리하여 도 15b에 나타내었다. 특히 0.01 내지 0.25mM의 농도에서 거의 100%의 결합률을 나타내었다.
실시예 7. Annexin V의 칼슘 의존적 결합 확인
포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 것으로 알려진 아넥신 V에 대하여 상기 실시예 2-3과 같은 방법으로 단백질-지질 오버레이 어세이와 면역블로팅을 수행하였다.
도 16 좌측에 나타난 것과 같이, 아넥신 V을 5 mM EDTA과 혼합하여 실험한 경우, 포스파티딜이노시톨 포스페이트과 결합이 나타나지 않았다.
그러나 도 16 우측에 나타난 것과 같이, 아넥신 V을 5 μM CaCl2과 혼합하여 실험한 경우, 아넥신 V 농도 100 ρmol에서도 다양한 종류의 포스파티딜이노시톨 포스페이트에 결합하는 것으로 나타났다. 구체적으로 PI(3,5)P2, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 에 가장 강한 결합을 나타내었고, PI(3,4)P2 외에도 PI(5)P, PI(3)P, PI(4)P 과도 결합하는 것으로 나타났다. 그러나 포스파티딜세린과는 결합하지 않았다.
이와 같이, 아넥신 V는 칼슘과 함께 처리할 경우 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 매우 강하게 결합하므로, 세포 사멸을 보다 높은 정확도로 검출할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명은 세포사멸 검출, 항암제 또는 세포 사멸 저해 물질의 스크리닝, 식작용을 억제, 세포 사멸 보호, 이식 시 발생하는 부작용 감소 용도에 사용할 수 있다.

Claims (23)

  1. 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 포함하는, 세포 사멸 검출용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2) 인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 CD14 단백질 또는 이의 변이체, PH (Pleckstrin Homology) 도메인 함유 단백질, PKC(Protein kinase C)의 C2 도메인 함유 단백질, 또는 그의 혼합물을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 PH 도메인 함유 단백질은 Akt(단백질 키나아제 B), Btk(Bruton's tyrosine kinase), PDK1(pyruvate dehydrogenase kinase 1), 및 GRP1(general receptor of phosphoinositides 1) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 C2 도메인 함유 단백질은 Myc가 결합된 PKC β1 C2 도메인 단백질인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체 또는 항-PtdIns(4,5)P2 항체인 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 칼슘; 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질로 아넥신 V (Annexin V)을 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 세포 사멸 검출은 인비트로에서 이루어지는 것인, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 표지 물질로 표지된 것이며, 상기 표지 물질은 형광 물질, 발색 효소, 방사성 동위원소, 크로모포어, 상자성 입자, 및 초상자성입자로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 조성물.
  10. 제9항의 조성물을 포함하는, 세포 사멸 검출용 키트.
  11. 제9항의 조성물을 세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계;
    상기 시료로부터 표지 물질을 감지하는 제2단계를 포함하는, 세포 사멸 검출 방법.
  12. 제9항의 조성물을 포함하는, 항암제의 스크리닝용 조성물.
  13. 제12항의 조성물과 후보 물질을, 암세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계; 및
    상기 시료로부터 표지 물질을 감지하는 제2단계를 포함하는, 항암제의 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 방법은 제2단계에서 표지 물질이 감지될 경우 상기 후보 물질을 항암제로 결정하는 제3단계를 추가로 포함하는 것인, 항암제의 스크리닝 방법.
  15. 제9항의 조성물과 후보 물질을, 세포를 포함하는 시료에 처리하는 제1단계;
    상기 제1단계의 세포의 사멸을 유도하는 제2단계; 및
    상기 시료로부터 표지 물질을 정량하는 제3단계를 포함하는, 세포 사멸 저해 물질의 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 제2단계는 세포에 사멸 유도제를 처리하여 세포 사멸을 유도하는 것인, 방법.
  17. 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질을 포함하는, 식작용 억제용 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트는 포스파티딜 이노시톨-3,4,5-삼인산(PtdIns(3,4,5)P3) 또는 포스파티딜 이노시톨-4,5-이인산(PtdIns(4,5)P2) 인 것인, 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질은 CD14 단백질 또는 이의 변이체, PH (Pleckstrin Homology) 도메인 함유 단백질, PKC(Protein kinase C)의 C2 도메인 함유 단백질, 항-PtdIns(3,4,5)P3 항체, 항-PtdIns(4,5)P2 항체, 또는 그의 혼합물을 포함하는 것인, 조성물.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 칼슘; 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트와 결합하는 물질로 아넥신 V (Annexin V)을 포함하는 것인, 조성물.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 식작용 억제용 조성물은 이식용 세포, 조직 또는 장기에 처리되는 것인, 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 이식용 세포는 췌도(pancreatic islet) 세포인 것인, 조성물.
  23. 제17항 내지 제22항의 식작용 억제용 조성물을 세포, 조직 또는 장기에 처리하는 단계를 포함하는, 식작용 억제 방법.
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