KR102054561B1 - C2 도메인 및 Akt 인산화 도메인 단편의 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

C2 도메인 및 Akt 인산화 도메인 단편의 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 C2 도메인 및 Akt 단백질 단편, 구체적으로 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질 및 상기 융합 단백질의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 융합 단백질이 칼슘의 농도가 높은 조건하에서도 Akt 단백질의 활성을 증가시키고, 상기 융합 단백질을 포함하는 아데노바이러스가 감염된 고지방 식이를 섭취한 동물모델에서 체중 및 지방량을 감소시키고, 인슐린 저항성을 개선시킬뿐만 아니라, 지방간을 개선시킴으로써, 상기 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질은 대사성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

C2 도메인 및 Akt 인산화 도메인 단편의 융합 단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN OF C2 DOMAIN AND AKT KINASE DOMAIN FRAGMENT AND USE THEREOF}
본 발명은 C2 도메인 및 Akt 인산화 도메인 단편, 구체적으로 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질 및 상기 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
대사성 질환은 우리 몸의 각 기관의 신진대사가 원활하지 못하기 때문에 나타나는 질환으로서, 생체 내 당질, 지질, 단백질, 비타민, 미네랄, 수분 등의 불균형에 의한 물질대사가 장애로 발생하는 질환의 총칭이다. 특히 90% 이상의 성인병이 면역력 약화 및 영양공급의 결여로 발생한다.
대표적인 대사성 질환으로는 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 고혈당증, 고지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증, 지방간 등이 있다. 대사성 질환으로 인해 체내에 지방이 축적되면 혈액 내 포도당을 간이나 근육에 보내는 호르몬인 인슐린이 제대로 생성되지 않거나, 기능이 저하되는 인슐린 저항성이 발생하고, 이로 인하여 혈당 증가 및 동맥경화 등이 유발되어 성인병이 발병한다.
대사성 질환의 하나인 당뇨병은 전 세계적으로 1억 명이 넘는 환자가 있다. 당뇨병은 식후 충분한 양의 포도당이 혈중으로 흡수됨에도 불구하고, 흡수된 포도당이 근육 및 지방 세포로 흡수되지 못함으로써 야기된다. 흡수되지 못한 포도당은 포도당의 저장 형태인 글리코겐의 합성을 촉진하고, 동시에 간에서 새로운 포도당의 생성을 억제하지 못함으로써 혈중 포도당의 농도가 증가하는 고혈당증을 유발한다. 당뇨병이 지속되면 심각한 당뇨합병증을 야기시킨다.
한편, 인슐린 저항성은 혈중 인슐린의 농도가 높음에도 불구하고, 지방세포 및 골격근에서 인슐린에 의한 포도당의 세포 내 이동 및 대사에 이상이 생긴 것이다. 또한, 인슐린 저항성은 간에서 새로운 포도당의 생성을 억제하지 못하여 혈중 포도당의 농도가 증가하게 된다. 이와 같은 기능적 결함은 조직에서 인슐린 신호전달 이상으로 인하여 발생한다.
일반적으로, 비만으로 인해 근육 및 간 조직 내에 축적된 지방은 세포 내 칼슘 농도를 증가시켜 당뇨병과 같은 대사성 질환의 주요 원인인 인슐린 저항성을 유발한다. 최근 연구에 의하면 비만 또는 인슐린 저항성 동물 모델에서 포화지방산이 소포체(ER)에서의 칼슘 운반을 억제하고, 이는 세포질 내의 칼슘 농도를 증가시킴이 보고되었다. 이와 같은 칼슘 농도의 증가가 만성적으로 이어지면 ER이나 미토콘드리아와 같은 기관의 기능에 나쁜 영향을 유발하고, 그로 인하여 대사 항상성에 손상이 야기된다. 그러나, 세포 내 칼슘 농도의 과도한 증가가 어떻게 인슐린 저항성을 유발하는지는 명확히 밝혀지지 않았다.
이와 관련하여, 대한민국 특허공개 제10-2016-0139072호는 딱지꽃 추출물 또는 이로부터 유래된 폴리페놀계 화합물을 이용하여 대사성 질환, 구체적으로 비만 및 제2형 당뇨를 치료하기 위한 약학적 조성물을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허공개 제10-2014-0039322호는 당 저감 활성을 갖는 섬유아세포 성장인자(FGF 19) 및 섬유아세포 성장인자 21(FGF21)을 이용하여 고혈당증과 같은 대사성 질환을 치료하는 방법을 개시하고 있다.
이에, 본 발명자들은 대사성 질환을 치료할 수 있는 약물을 개발하기 위해 노력하던 중, 인간 PKCβ(protein kinase C β) 단백질의 N-말단으로부터 159 내지 296번째 아미노산 잔기로 구성되는 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 인산화 도메인 단편의 융합 단백질(C2-Akt 융합 단백질)을 제작하였다. 또한, 제작된 C2-Akt 융합 단백질이 비만 및 당뇨병 상태에 의한 칼슘의 농도가 높은 조건하에서도 C2-Akt 융합 단백질의 활성을 증가시키고, 상기 융합 단백질을 포함하는 아데노바이러스가 감염된 고지방 식이를 섭취한 동물모델에서 체중 및 지방량을 감소시키고, 인슐린 저항성 및 지방간을 개선시킴을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허공개 제10-2016-0139072호 대한민국 특허공개 제10-2014-0039322호
본 발명의 목적은 C2 도메인 및 Akt 단백질 단편의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주세포의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 숙주세포를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 숙주세포를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 발현하고 세포 내 칼슘 농도가 증가된 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 상기 세포에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합 여부를 확인하는 단계; 및 상기 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 대사성 질환 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘 및 PIP 복합체의 혼합물에 피검물질을 처리하는 단계; 상기 혼합물에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘 및 PIP 복합체와의 결합 여부를 확인하는 단계; 및 상기 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 대사성 질환 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질이 비만 및 당뇨병 상태에 의한 칼슘의 농도가 높은 조건하에서도 C2-Akt 융합 단백질 단백질의 활성을 증가시키고, 상기 융합 단백질을 포함하는 아데노바이러스가 감염된 고지방 식이를 섭취한 동물모델에서 체중 및 지방량을 감소시키고, 인슐린 저항성 및 지방간을 개선시킴으로써, 상기 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질은 대사성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 고지방 식이(HFD)를 섭취한 마우스의 간 조직에서 세포 내 칼슘 농도가 일반 식이(chow)를 섭취한 마우스에 비해 증가한 것을 형광현미경으로 촬영한 결과를 나타내는 사진(A), 상기 사진의 형광강도를 나타낸 그래프(B) 및 인슐린 신호기전에 관련된 단백질들의 활성 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과(C)를 보여주는 도면이다.
도 2는 인슐리 저항성이 유도된 세포에서 세포 내 칼슘 농도가 증가한 것을 형광현미경으로 촬영한 결과를 나타내는 사진(A), 상기 사진의 형광강도를 나타낸 그래프(B) 및 인슐린 신호기전에 관련된 단백질들의 활성 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과(C)를 보여주는 도면이다.
도 3은 인슐린 저항성이 유도된 세포에서 PA 처리에 의해 세포 내 칼슘 농도가 증가한 것을 확인한 결과 도면이다.
도 4는 PMA(A) 또는 이오노마이신(B)에 의해 세포 내 칼슘 농도가 증가된 세포에서 Akt 단백질의 인산화가 억제되고, 베라파밀(C 및 D)에 의해 세포 내 칼슘 농도가 감소된 세포에서 Akt 단백질 인산화가 증가함을 확인한 결과이다.
도 5는 정제된 Akt 단백질의 PH 도메인이 PI(3,4)P2 또는 PI(3,4,5)P3와 결합하는 것이 칼슘 농도의 증가에 의해 억제되는 것을 단백질-지질 결합 분석 방법으로 확인한 결과이다.
도 6은 정제된 Akt 단백질의 PH 도메인이 PI(3,4)P2(A), PI(4,5)P2(B), PI(3,4,5)P3(C) 또는 PS(D, 대조군)와 결합하는 것이 칼슘 농도의 증가에 의해 억제되는 것을 ITC(isothermal titration calorimetry) 방법으로 확인한 결과; 및 칼슘 및 PI(3,4,5)P3 복합체와 PS의 구조(E)를 나타낸 도면이다.
도 7은 칼슘 농도가 증가된 조건하에서 칼슘이 PI(3,4,5)P3와 복합체를 형성함으로써, Akt 단백질의 PH 도메인이 PI(3,4,5)P3와 복합체를 형성하지 못함을 나타내는 모식도이다.
도 8은 PKCβ 단백질의 C2 도메인(A)이 PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3와 결합하는 것이 PKCβ 단백질의 C2 도메인의 D187/193A 및 D246/248A 돌연변이형(B)과 달리, 칼슘 농도의 증가에 의해 촉진되는 것을 단백질-지질 결합 분석 방법으로 확인한 결과이다.
도 9는 칼슘 농도가 증가된 조건하에서 PKCβ 단백질의 C2 도메인(B)이 PI(3,4,5)P3와 결합하는 반면, 칼슘이 없거나(A), C2 도메인의 돌연변이형(C)은 PI(3,4,5)P3 결합하지 못하는 것을 ITC 방법으로 확인한 결과이다.
도 10은 Akt 단백질의 PH 도메인(A)은 증가된 칼슘 농도에 의해 세포막으로 이동이 억제되는 반면, C2 도메인(B)은 증가된 칼슘 농도에 의해 세포막으로 이동이 촉진되는 것을 확인한 결과 사진이다.
도 11은 야생형의 Atk 단백질(A)이 PMA 처리에 의해 증가된 칼슘 농도하에서 활성이 억제됨을 웨스턴 블롯(B)으로 확인하고, pAkt(T308)(C) 및 pAkt(T473)(D) 단백질의 발현 변화를 나타낸 결과 그래프; 및 C2-Akt 융합 단백질(C)이 증가된 칼슘 농도하에서 Akt 단백질의 활성을 증가시킴을 웨스턴 블롯(F)으로 확인하고, pAkt(T308)(G) 및 pAkt(T473)(H) 단백질의 발현 변화를 나타낸 결과 그래프이다.
도 12는 야생형의 Atk 단백질이 PMA 처리에 의해 증가된 칼슘 농도하에서 활성이 억제됨을 웨스턴 블롯(A)으로 확인하고, pAkt(T308)(B) 및 pAkt(T473)(C) 단백질의 발현 변화를 나타낸 결과 그래프; 및 C2-Akt 융합 단백질이 증가된 칼슘 농도하에서 Akt 단백질의 활성을 증가시킴을 웨스턴 블롯(D)으로 확인하고, pAkt(T308)(E) 및 pAkt(T473)(F) 단백질의 발현 변화를 나타낸 결과 그래프이다.
도 13은 C2-Akt 융합 단백질에 의한 신호전달 기전에서 PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3 중 어느 것이 더욱 중요한지 PTEN(A) 또는 SHIP2(B)를 처리하여 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 14는 C2-Akt 융합 단백질에서 C2 도메인의 돌연변이형을 이용하여 제조된 융합 단백질을 나타내는 모식도(A); 상기 제조된 융합 단백질을 이용하여 C2 도메인 내에서 Akt 단백질의 활성을 증가시키는 아미노산 잔기를 확인한 웨스턴 블롯 결과(B); 및 상기 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 그래프(C)이다.
도 15는 고지방 식이를 섭취한 동물모델에 주입한 아데노바이러스 벡터의 구조(A) 및 동물 실험 계획(B)을 나타내는 모식도이다.
도 16은 고지방 식이를 섭취한 동물모델에서 C2-Akt 융합 단백질에 의한 체중 감소(A) 및 사료 섭취량 변화(B)를 나타내는 그래프이다.
도 17은 고지방 식이를 섭취한 동물모델에서 C2-Akt 융합 단백질에 의한 지방 감소(A) 및 마른비만 감소(B)를 나타내는 그래프이다.
도 18은 고지방 식이를 섭취한 동물모델에서 C2-Akt 융합 단백질에 의한 포도당 수준의 감소(A 및 B), 인슐린 감수성의 증가(C), 및 공복시 분비된 인슐린 수준의 감소(D)를 확인한 결과 그래프이다.
도 19는 고지방 식이를 섭취한 동물모델에서 공복시 포도당(A) 및 인슐린(B) 수준 변화를 측정하고, 상기 값을 이용하여 도출된 HOMA-IR(C)을 나타낸 그래프이다.
도 20은 고지방 식이를 섭취한 동물모델의 혈액 샘플로부터 ALT(A), 총 콜레스테롤(B) 및 LDL(C) 수준을 확인한 결과 그래프이다.
도 21은 C2-Akt 융합 단백질을 처리한 고지방 식이를 섭취한 동물모델의 간 조직(A) 및 상기 간 조직에서 지방소립의 감소를 확인한 사진(B)이다.
도 22는 C2-Akt 융합 단백질을 처리한 고지방 식이를 섭취한 동물모델의 간 조직에서 Akt 활성 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과 도면이다.
도 23은 C2-Akt 융합 단백질을 처리된 고지방 식이를 섭취한 동물모델의 간 조직에서 포도당 생성과정(A), 지방 생성과정(B) 및 지방 흡수(C)에 관여하는 유전자의 발현 변화를 확인하고, 상기 유자가 발현된 단백질의 발현 변화(D)를 확인한 결과 도면이다.
도 24는 C2-Akt 융합 단백질에 의해 발현이 증가하는 유전자 5종류 및 발현이 감소하는 유전자 7종류(A); 상기 발현이 증가하는 유전자(B), 발현이 감소하는 유전자(C) 및 지방간을 촉진시키는 유전자(D)의 발현 변화를 확인한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "C2 도메인(C2 domain)"은 단백질을 세포막에 표적화시키는데 관여하는 단백질 구조 도메인(protein structural domain)을 의미한다. 상기 C2 도메인은 일반적으로 2 내지 3개의 칼슘 이온과 결합하는 칼슘 의존성 및 칼슘 이온이 필요하지 않은 칼슘 비의존성이 있다. C2 도메인은 칼슘 이온을 조절하는 8개의 β-가닥(β-strand)으로 구성된 β-샌드위치(β-sandwich)를 갖고, 이의 첫번째 및 마지막 루프에 의해 형성된 공동(cavity)이 세포막의 인지질과 결합한다.
상기 C2 도메인은 약 362 종류의 단백질에서 발견되며, 582개 정도가 존재하는 것으로 알려졌다(http://smart.embl.de/smart/do_annotation.pl?DOMAIN=SM00239). 구체적으로, 상기 C2 도메인은 PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase), PKC(protein kinase C), ABR(active breakpoint cluster region-related), BAIAP3(BAI1-associated protein 3), BCR(breakpoint cluster region), C2CD2(C2 calcium dependent domain containing 2), C2CD3(C2 calcium dependent domain containing 3), CADPS(calcium-dependent secretion activator 1), CADPS2(calcium-dependent secretion activator 2), CAPN5(calpain-5), CAPN6(calpain-6), CC2D1A(coiled-coil and C2 domain-containing protein 1A), CC2D1B(coiled-coil and C2 domain-containing protein 1B), CPNE1(copine-1), CPNE2(copine-2), CPNE3(copine-3), CPNE4(copine-4), CPNE5(copine-5), CPNE6(copine-6), CPNE7(copine-7), CPNE8(copine-8), CPNE9(copine-9), DAB2IP(disabled homolog 2-interacting protein), DOC2A(double C2-like domain-containing protein alpha), DOC2B(double C2-like domain-containing protein beta), DYSF(dysferlin), ESYT1(extended synaptotagmin-1), ESYT3(extended synaptotagmin-3), FAM62B(extended synaptotagmin-2), FER1L3(myoferlin), FER1L5(fer-1 like family member 5), HECW1(C2 and WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1), HECW2(C2 and WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1), ITCH(itchy E3 ubiquitin protein ligase), ITSN1(intersectin-1), ITSN2(intersectin-2), MCTP1(multiple C2 and transmembrane domain containing 1), MCTP2(multiple C2 and transmembrane domain containing 2), MTAC2D1(tandem C2 domains nuclear protein), NEDD4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4), NEDD4L(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated gene 4-like), OTOF(otoferlin), PCLO(protein piccolo), PIK3C2A(phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing alpha), PIK3C2B(phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing beta), PIK3C2G(phosphatidylinositol-4-phosphate 3-kinase C2 domain-containing gamma), PLA2G4A(cytosolic phospholipase A2), PLA2G4B(cytosolic phospholipase A2 beta), PLA2G4D(cytosolic phospholipase A2 delta), PLA2G4E(cytosolic phospholipase A2 epsilon), PLA2G4F(cytosolic phospholipase A2 zeta), PLCB1(1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-1), PLCB2(1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-2), PLCB3(1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-3), PLCB4(1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-4), PLCD1(phospholipase C delta 1), PLCD3(phospholipase C delta 3), PLCD4(phospholipase C delta 4), PLCE1(phospholipase C epsilon 1), PLCG1(phospholipase C gamma 1), PLCG2(phospholipase C gamma 2), PLCH1(phospholipase C eta 1), PLCH2(phospholipase C eta 2), PLCL1(phospholipase C like 1), PLCL2(phospholipase C like 2), PLCZ1(phospholipase C zeta 1), PRF1(perforin-1), PRKCA(protein kinase C alpha), PRKCB1(protein kinase C beta type), PRKCE(protein kinase C epsilon), PRKCG(protein kinase C gamma), PRKCH(protein kinase C eta), RAB11FIP1(Rab11 family-interacting protein 1), RAB11FIP2(Rab11 family-interacting protein 2), RAB11FIP5(Rab11 family-interacting protein 5), RASA1(RAS p21 protein activator 1), RASA2(RAS p21 protein activator 2), RASA3(RAS p21 protein activator 3), RASA4(RAS p21 protein activator 4), RASAL1(RAS protein activator like 1), RASAL2(RAS protein activator like 2), RGS3(regulator of G-protein signaling 3), RIMS1(regulating synaptic membrane exocytosis protein 1), RIMS2(regulating synaptic membrane exocytosis protein 2), RIMS3(regulating synaptic membrane exocytosis protein 3), RIMS4(regulating synaptic membrane exocytosis protein 4), RPGRIP1(X-linked retinitis pigmentosa GTPase regulator-interacting protein 1), RPH3A(rabphilin-3A), SMURF1(E3 ubiquitin-protein ligase SMURF1), SMURF2(E3 ubiquitin-protein ligase SMURF2), SYNGAP1(synaptic Ras GTPase-activating protein 1), SYT1(synaptotagmin-1), SYT10(synaptotagmin-10), SYT11(synaptotagmin-11), SYT12(synaptotagmin-12), SYT13(synaptotagmin-13), SYT14(synaptotagmin-14), SYT15(synaptotagmin-15), SYT16(synaptotagmin-16), SYT17(synaptotagmin-17), SYT2(synaptotagmin-2), SYT3(synaptotagmin-3), SYT4(synaptotagmin-4), SYT5(synaptotagmin-5), SYT6(synaptotagmin-6), SYT7(synaptotagmin-7), SYT8(synaptotagmin-8), SYT9(synaptotagmin-9), SYTL1(synaptotagmin like 1), SYTL2(synaptotagmin like 2), SYTL3(synaptotagmin like 3), SYTL4(synaptotagmin like 4), SYTL5(synaptotagmin like 5), TOLLIP(toll interacting protein), UNC13A(Unc-13 homolog A), UNC13B(Unc-13 homolog B), UNC13C(Unc-13 homolog C), UNC13D(Unc-13 homolog D), WWC2(WW and C2 domain containing 2), WWP1(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1), WWP2(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2) 또는 PTEN(phosphatase and tensin homolog) 단백질로부터 유래된 것일 수 있다.
또한, 상기 C2 도메인은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 갖는 아미노산의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩티드에서의 아미노산 교환은 통상의 기술분야에 공지되어 있다. 상기 폴리펩티드는 경우에 따라서 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 C2 도메인은 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Akt(protein kinase B) 단백질"은 PI(3,4)P2 또는 PI(3,4,5)P3에 의해 매개되는 인슐린 신호전달 시스템에서 주요한 역할을 하는 단백질이다. 특히, Akt 단백질은 GSK3β(glycogen synthase kinase 3β), AS160(160 kDa subatrate of Akt), FOXO3(the forkhead transcription factor) 등과 같은 다양한 단백질을 인산화함으로써, 하위 단계로의 신호전달을 매개한다. Akt 단백질은 이의 N-말단에 약 120여 개의 아미노산으로 구성된 PH(pleckstrin homology) 도메인을 갖는다. 상기 도메인은 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PIP)와 결합함으로써 세포 막과 직접적으로 상호작용한다.
상기 Akt 단백질은 포유동물, 구체적으로, 인간, 랫트, 토끼, 마우스, 양, 개, 돼지 등으로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 상기 Akt 단백질은 통상의 기술분야에 알려진 어떠한 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있고, 상기 서술한 바와 같은 특징을 포함하는 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 Akt 단백질은 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 Akt 단백질의 PH 도메인은 서열번호 13으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편이 융합된 형태일 수 있다. 상기 융합 단백질은 Akt 단백질의 PH 도메인을 C2 도메인으로 치환한 것일 수 있다. 상기 융합 단백질은 통상의 기술자에 의해 적절한 서열을 이용하여 제조될 수 있으며, 이는 상기 서술한 바와 같은 특징을 포함하는 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.
상기 융합 단백질은 형광 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 형광 단백질은 본 발명에 따른 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번재 아미노산 잔기로 구성되는 단편이 융합된 융합 단백질의 N-말단 및 C-말단으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 말단에 결합될 수 있다. 상기 형광 단백질은 통상의 기술분야에 공지된 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있으며, 구체적으로 GFP, YFP 또는 mCherry 단백질일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 PKCβ 단백질의 C2 도메인과 PH 도메인을 제외한 Akt 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 PCR을 통해 수득하고, 이를 발현벡터에 클로닝하여 Akt 단백질의 PH 도메인 대신 C2 도메인이 융합된 융합 단백질을 제조하였다(도 11 참조).
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 융합 단백질은 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질일 수 있다. 상기 C2 도메인은 이를 포함하는 것으로 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 단백질로부터 유래된 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 Akt 단백질의 단편은 Akt 단백질의 PH 도메인이 제거된 단편일 수 있고, 구체적으로 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.
한편, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드라면 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열을 암호화 하는 염기 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열을 암호화 하는 염기 서열과 70, 80, 90 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 발현 벡터는 원하는 숙주세포에서 본 발명에 따른 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터라면 어떤 것이든 사용할 수 있다. 상기 용어, "벡터(vector)"는 숙주세포에서 목적 펩티드를 발현시킬 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
상기 숙주세포는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드가 포함된 발현벡터가 형질전환된 세포로서, 구체적으로 포유동물세포일 수 있다. 상기 형질전환은 통상의 기술분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, 미세주입법, 리포좀을 이용한 방법, 직접적인 DNA 흡수 방법(directed DNA uptake), 수용체 매개 DNA 트랜스퍼 방법(receptor-mediated DNA transfer), Ca++을 이용한 DNA 운반 방법 또는 바이러스를 이용한 유전자 운반 방법을 사용할 수 있다.
한편, 상기 포유동물세포는 NS/0 골수종 세포(NS/0 myeloma cell), 293 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO cell), HeLa 세포, CapT 세포(인간 양수 유래 세포) 또는 COS 세포일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 숙주세포를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 숙주세포는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 융합 단백질은 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질일 수 있다. 상기 C2 도메인은 이를 포함하는 것으로 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 단백질로부터 유래된 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 Akt 단백질의 단편은 Akt 단백질의 PH 도메인이 제거된 단편일 수 있고, 구체적으로 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.
상기 대사성 질환은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 또는 지방간일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 Akt 단백질의 PH 도메인 대신 C2 도메인이 융합된 C2-Akt 융합 단백질을 제조하고, 상기 C2-Akt 융합 단백질을 HepG2 세포에 형질감염시킨 결과, 본 발명에 따른 C2-Akt 융합 단백질이 형질감염된 세포는 칼슘의 농도가 증가하여도 Akt 단백질이 활성화되었다(도 11 및 12 참조).
또한, 상기 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 고지방 식이를 섭취한 마우스 동물모델에 감염시켰다. 그 결과, 본 발명에 따른 융합 단백질에 의해 마우스의 체중, 지방량 및 마른체중이 감소하였다(도 16 및 17 참조). 또한, 상기 마우스 동물모델은 C2-Akt 융합 단백질에 의해 체내 포도당 농도가 감소되었으며, 인슐린 저항성을 개선시켰다(도 18 및 19 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 마우스 동물모델에 유도된 지방간이 C2-Akt 융합 단백질에 의해 개선되는지를 확인한 결과, C2-Akt 융합 단백질이 지방소립을 감소시키고(도 21), 포도당 및 지방 생성과정이나 지방 흡수 등에 관여하는 유전자의 발현을 감소시킬뿐만 아니라, 상기 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현도 감소시켰다(도 23 참조).
나아가, 본 발명자들은 상기 마우스 동물모델에서 지방간을 개선시키거나, 지방간을 촉진시키는 유전자 및 단백질의 발현변화를 확인한 결과, C2-Akt 융합 단백질이 지방간을 개선시키는 유전자 및 단백질의 발현은 증가시키는 반면, 지방간을 촉진시키는 유전자 및 단백질의 발현을 억제시키는 것을 확인하였다. 또한, 상기 C2-Akt 융합 단백질은 지방소립의 형성이나 지방 저장 등에 관여하는 유전자의 발현도 억제하였다(도 24 참조).
따라서, 본 발명에 따른 C2-Akt 융합 단백질은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병, 지방간 등과 같은 대사성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명의 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 숙주세포를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1가지 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구제제 또는 비경구 제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 내지 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 내지 5 g/kg일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 숙주세포를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터 또는 숙주세포는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 융합 단백질은 C2 도메인 및 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질일 수 있다. 상기 C2 도메인은 이를 포함하는 것으로 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 단백질로부터 유래된 것일 수 있고, 구체적으로 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 Akt 단백질의 단편은 Akt 단백질의 PH 도메인이 제거된 단편일 수 있고, 구체적으로 서열번호 15로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.
상기 대사성 질환은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 또는 지방간일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 C2 도메인 및 PH 도메인이 결손된 Akt 단백질이 융합된 C2-Akt 융합 단백질을 제조하고, 상기 단백질이 높은 칼슘 농도 하에서도 Akt 단백질의 활성을 유지시킴을 확인하였다(도 11 및 12 참조).
또한, 상기 C2-Akt 융합 단백질은 고지방 식이를 섭취하여 비만, 인슐린 저항성, 당뇨, 지방간 등의 증상을 보이는 마우스 동물모델에서 이와 같은 증상을 개선시킴으로써(도 16 내지 19, 23 및 24 참조), 본 발명에 따른 C2-Akt 융합 단백질은 대사성 질환의 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 융합 단백질을 발현하고 세포 내 칼슘 농도가 증가된 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 상기 세포에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합 여부를 확인하는 단계; 및 상기 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 대사성 질환 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 칼슘은 포스파티딜이노시톨 (3,4,5)-트리포스페이트 또는 포스파티딜이노시톨 (4,5)-비스포스페이트와 결합된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합 여부는 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 방법으로도 확인될 수 있으며, 구체적으로, ITC 방법 및 단백질-지질 결합 분석 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 확인될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 세포 내 칼슘 농도가 증가된 세포는 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 또는 지방간의 세포 모델일 수 있고, 상기 세포 모델을 사용하여 스크리닝된 후보물질은 대사성 질환, 구체적으로 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 또는 지방간의 치료를 위한 후보물질일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 본 발명에 따른 융합 단백질이 세포막으로 이동하는 것을 억제하거나, 상기 융합 단백질에 포함된 Akt 단백질의 N-말단으로부터 111 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편에 의한 Akt 신호전달 기전을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 융합 단백질은 검출시약 또는 형광 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 검출시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다. 한편, 상기 형광 단백질은 본 발명에 따른 융합 단백질의 N-말단 및 C-말단으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 말단에 결합될 수 있다. 상기 형광 단백질은 통상의 기술분야에 공지된 단백질이라면 어떠한 단백질도 포함할 수 있으며, 구체적으로 GFP, YFP 또는 mCherry 단백질일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 고지방 식이를 섭취한 마우스 모델 및 인슐린 저항성이 유도된 세포에서 칼슘 농도가 증가하고, 증가된 칼슘 농도하에서 C2 도메인이 칼슘과 상호작용함으로써 PIP와 결합하여 세포막으로 이동하는 것을 확인하였다(도 8 내지 10 참조).
따라서, 상기로부터 세포 내 칼슘의 농도가 증가한 세포에서 C2 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 융합 단백질이 칼슘 및 PIP의 복합체의 결합하는 것을 억제하는 물질을 선별하는 과정을 이용하여 대사성 질환 치료 후보물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
나아가, 본 발명은 시험관 내에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘 및 PIP 복합체의 혼합물에 피검물질을 처리하는 단계; 상기 혼합물에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘 및 PIP 복합체와의 결합 여부를 확인하는 단계; 및 상기 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 대사성 질환 치료 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 칼슘은 포스파티딜이노시톨 (3,4,5)-트리포스페이트 또는 포스파티딜이노시톨 (4,5)-비스포스페이트와 결합된 것일 수 있다. 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 본 발명에 따른 융합 단백질과 칼슘과의 결합 여부는 통상의 기술분야에 잘 알려진 어떠한 방법으로도 확인될 수 있으며, 구체적으로, ITC 방법 및 단백질-지질 결합 분석 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 확인될 수 있다.
상기 대사성 질환은 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 또는 지방간일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 고지방 식이를 섭취한 마우스 모델 및 인슐린 저항성이 유도된 세포에서 칼슘 농도가 증가하고, 증가된 칼슘 농도하에서 C2 도메인이 칼슘과 상호작용함으로써 PIP와 결합하여 세포막으로 이동하는 것을 확인하였다(도 8 내지 10 참조). 따라서, 상기로부터 C2 도메인을 포함하는 본 발명에 따른 융합 단백질이 칼슘 및 PIP의 복합체의 결합하는 것을 억제하는 물질을 선별하는 과정을 이용하여 대사성 질환 치료 후보물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 동물모델에서 칼슘 수준의 증가 확인
비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 동물모델의 간세포에서 세포 내(intracellular) 칼슘의 농도 변화를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스(오리엔트바이오, 대한민국)는 이길여 암당뇨 연구센터(가천대학교, 대한민국)의 동물 시설에서 사육하였다. 마우스는 무균실에서 23±1℃의 온도, 12시간의 명/암 주기 조건, 및 자유로운 식이환경에서 사육되었다. 이때, 마우스는 16시간 동안 식이를 제한한 군(Fasted) 및 16시간 동안 식이를 제한하고, 4시간 동안 사료를 제공한 군(Refed)으로 나누고, 각각의 군을 고지방식이(HFD) 또는 일반식이(chow)를 섭취한 군으로 나누어 사육하였다. 고지방식이군(HFD)은 60%의 지방을, 일반식이군(chow)은 10%의 지방을 포함하는 식이를 섭취하였다. 8주 후, 상기 마우스를 마취시킨 뒤, 완충액 1(142 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES 및 2.5 mM의 EGTA, pH 7.4)을 이용하여 간을 관류시켰다. 상기 완충액 1을 완충액 2(0.5 ㎎/㎖ 콜라겐, 66.7 mM NaCl, 6.7 mM KCl, 10 mM HEPES 및 4.8 mM CaCl, pH 7.6)로 교체하고, 관류된 간을 적출하였다. 적출된 간을 세척하고, Percoll cushion gradient를 이용하여 분해시켰다. 분해된 세포는 10% FBS 및 1% 항생제 및 항진균제를 포함하는 Hepatozyme-SFM(Gibco-BRL, 미국) 배양 배지를 이용하여 현탁 및 배양하여 준비하였다. 준비된 세포를 1x107 cells/㎖의 농도가 되도록 DMEM 배지에 희석하고, 여기에 4 μM의 Fluo-3 AM(Invitrogen, 미국)을 첨가하였다. 이를 37℃의 조건에서 45분 동안 반응시킨 뒤, 4% 파라포름알데하이드를 첨가하여 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 PBS를 이용하여 5분 동안 2회 세척하고, 건조시킨 뒤, 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole)을 이용하여 마운팅하였다. 마운팅된 세포를 형광현미경(Zeiss Axioplan 2)을 이용하여 분석한 결과를 도 1A 및 1B에 나타내었다.
도 1A 및 1B에 나타난 바와 같이, 4회 고지방 식이를 한 마우스의 간 조직에서 세포 내 칼슘 수준이 일반 식이를 한 마우스에 비해 현저히 증가하였다(도 1A 및 1B).
실시예 2. 비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 동물모델에서 인슐린 신호기전 억제 확인
비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 동물모델의 간세포에서 인슐린 민감성을 확인하기 위해 Akt 단백질 인산화 기전에 관여하는 단백질의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
먼저, 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 16시간 동안 식이를 제한한 군(Fasted) 및 16시간 동안 식이를 제한하고, 4시간 동안 사료를 제공한 군(Refed)으로 나누고, 각각의 군을 고지방식이(HFD) 또는 일반식이(chow)를 섭취한 군으로 나누어 사육하였다. 사육된 마우스로부터 실시예 1과 동일한 방법 및 조건으로 간세포를 적출하고, 적출된 간세포를 포스파타제(phosphatase, Sigma-Aldrich, 미국) 및 프로테아제 억제제(protease inhibitor, Sigma-Aldrich, 미국)를 포함하는 용해 완충액을 이용하여 용해시켰다. 2 내지 3 ㎎의 간 조직으로부터 추출된 단백질을 조직 균질기(TissuLyser, Qiagen, 미국)를 이용하여 1/30초의 빈도로 1.5분 동안 균질화하였다. 균질화된 용해물을 12,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하고 상청액만을 취했다. 추출된 단백질의 양은 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 사용하여 정량하고, 이때 BSA를 표준시료로서 사용하였다. 3 ㎎의 단백질을 6x 로딩 완충액과 혼합하고, 10% SDS-PAGE 젤을 이용하여 전기영동하였다. 전기영동된 단백질을 이동 완충액을 사용하여 4℃ 및 120 V의 조건하에서 1.5시간 동안 폴리비닐리덴불화물(polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 PVDF 막을 트윈 20이 포함된 TBS(TBS-T, pH 7.6) 완충액에 5% 탈지유가 포함된 블로킹 완충액을 이용하여 30분 동안 전처리하고, 막을 TBS-T로 세척하였다. 세척된 막에 1차 항체로서 Akt(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(T308)(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(S473)(Cell Signaling Technology, 미국), FOXO3A(Cell Signaling Technology, 미국), FOXO3A(S253)(Cell Signaling Technology, 미국), GSK-3β(Cell Signaling Technology, 미국) 또는 GSK-3β(S9)(Cell Signaling Technology, 미국) 단백질에 대한 항체를 첨가하고, 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 이때, 대조군으로서는 액틴(Santa Cruz Biotechnology, 미국) 단백질에 대한 항체를 사용하였다. 반응 후, 상기 1차 항체에 대한 2차 항체를 첨가하고 상온에서 30분 동안 반응시키고, PVDF 막을 TBS-T 완충액으로 3회 세척하였다. 세척된 PVDF 막에 ECL 용액(Thermo Scientific, 미국)을 첨가하고, 이미지를 관찰하였다. 이미지는 LAS 4000 이미징 시스템(GE Healthcare, 미국)을 사용하여 촬영하고, 이를 도 1C에 나타내었다.
도 1C에 나타난 바와 같이, 고지방 식이를 한 마우스의 간 세포에서 Akt 단백질 인산화 및 상기 경로의 하위에 위치한 FOXO3A 및 GSK-3β 신호전달 경로에서 이들 단백질의 인산화가 감소되었다(도 1C).
실시예 3. 인슐린 저항성이 유도된 세포에서 칼슘 수준의 증가 확인
포화된 유리지방산(FFA)에 의해 인슐린 저항성이 유도됨으로써 제조된 시험관 내 지방간 모델 세포에서 칼슘 수준의 증가를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 인간 HepG2 세포를 10% 소태아혈청(FBS), 25 mM 글루코오스, 2 mM L-글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 배양하였다. 이때, 배양은 5% CO2 및 37℃의 조건에서 수행되었다. 배양된 세포를 5.0x105 cells/웰이 되도록 분주하고, 하룻밤 동안 배양하였다. 여기에 0, 100, 300 또는 500 μM의 팔미트산(PA)을 첨가하고 24시간 동안 반응시킨 뒤, 실시예 1과 동일한 조건 및 방법으로 Fluo-3 AM을 이용하여 확인된 결과를 도 2A 및 2B에 나타내었다.
도 2A 및 2B에 나타난 바와 같이, PA 처리된 HepG2 세포의 세포질에서 칼슘의 수준이 증가하였다(도 2A 및 2B).
실시예 4. 인슐린 저항성이 유도된 세포에서 인슐린 신호기전 억제 확인
시험관 내 지방간 모델 세포에 인슐린을 첨가하였을 때, 인슐린 민감도의 변화를 확인하기 위해 인슐린 신호기전에 관련된 단백질들의 인산화를 확인하였다. 이때, 실험은 실시예 3에서 제조된 인간 HepG2 세포에 PA를 첨가하고 24시간 동안 반응시키는 과정에서, 반응이 끝나기 15분 전에 100 nM의 인슐린을 첨가하는 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 2C에 나타난 바와 같이, PA가 처리된 세포에서는 인슐린만 처리한 세포에 비해 Akt 단백질의 인산화가 현저히 억제됨으로써, 인슐린 민감도가 손상되었음을 알 수 있었다(도 2C).
실시예 5. 인슐린 저항성이 유도된 세포에서 세포 내 칼슘 역학 확인
인슐린 저항성이 유도됨으로써 제조된 시험관 내 지방간 모델 세포에서 세포 내 칼슘 역학을 확인하였다. 이때, 실험은 Fluo-3 AM 대신 Fura-2 AM을 사용한 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, PA에 의해 세포 내 칼슘의 농도가 유의적으로 증가하였다(도 3).
실시예 6. 세포에서 칼슘 농도 변화에 의한 인슐린 신호전달 억제 확인
6-1. 칼슘 증가에 의한 영향 확인
칼슘의 플럭스(flux)를 촉진시키는 약물인 PMA(phorbol myristate acetate) 및 이오노마이신(ionomycin)이 인슐린 민감성에 미치는 영향을 확인하였다. PMA 및 이오노마이신은 세포 내 칼슘을 증가시키고, 강한 칼슘 신호를 전달한다고 알려져 있다.
실험은 인간 HepG2 세포에 PA 대신 0, 10, 50 또는 100 nM의 PMA를 첨가하거나, 0, 1, 5, 10 또는 20 μM의 이오노마이신을 첨가한 뒤, 반응이 끝나기 15분 전에 100 nM의 인슐린을 첨가하고, 1차 항체로서 pAkt(T308), pAkt(S473), Akt 또는 액틴 단백질에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다.
그 결과, 도 4A 및 4B에 나타난 바와 같이, PMA 또는 이오노마이신에 의해 Akt 단백질의 인산화가 강하게 억제되었고, 이는 농도의존적으로 나타났다(도 4A 및 4B). 따라서, 이로부터 칼슘의 증가로 인해 인슐린 민감성이 손상됨을 알 수 있었다.
6-2. 칼슘 감소에 의한 영향 확인
칼슘의 감소에 의해 인슐린 민감성에 미치는 영향을 확인하기 위해, L-타입 칼슘 채널 차단제(blocker)인 베라파밀을 이용하였다. 실험은 PMA 또는 이오노마이신 대신 0, 5, 10 또는 100 nM의 베라파밀을 첨가하고, 인슐린의 첨가 유무에 따른 영향을 확인한 것을 제외하고는 실시예 6-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 4C 및 4D에 나타난 바와 같이, 베라파밀에 의해 Akt 단백질의 인산화가 증가하였고(도 4C 및 4D), 이로부터 세포 내 칼슘 감소에 의해 인슐린 민감성이 증가함을 알 수 있었다.
따라서, 상기 결과는 세포 내 칼슘의 농도 변화가 Akt 단백질의 인산화와 관련되어 있음을 나타낸다.
실시예 7. 칼슘에 의한 Akt 단백질과 PI(3,4)P 2 또는 PI(3,4,5)P 3 의 결합 억제 확인
Akt 단백질의 Thr308 및 Ser473에 인산화가 일어나, Akt 단백질이 활성화되기 위해서는 Akt 단백질의 PH 도메인이 PI(3,4,5)P3와 결합한 뒤, 이들 복합체가 세포 막으로 이동해야 한다. 이에, 칼슘이 Akt 단백질과 PI(3,4)P2 또는 PI(3,4,5)P3의 결합에 어떠한 영향을 미치는지 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
7-1. Akt 단백질의 PH 도메인의 정제
먼저, Akt1 단백질의 PH 도메인(서열번호 13)을 하기 표 1에 서열번호 3 및 4로 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 수득하였다. 수득된 PCR 산물을 통상적인 방법으로 pET28a 벡터(Novagen, 미국)에 클로닝하였다.
이름 서열(5'→3') 서열번호
hPKCβ1_C2_PN127(NcoI) AAACCATGGGCCACCAGGGGATGAAATGTGACACC 서열번호 1
hPKCβ1_C2_PC296(XhoI) AAACTCGAGCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTCACTTCCTTCTGGTGGCACAGG 서열번호 2
hAkt1_PH_PN1(SacI) AAAGAGCTCATGGGCAGCGACGTGGCTAT 서열번호 3
hAKT1_PH_PC144(SpeI) AAAACTAGTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGCTTGGGCTTGGCCA 서열번호 4
hPKCβ1_C2_PN159(BglII) AAAAGATCTATGCGCGGCCGCATCTACATCCA 서열번호 5
hPKCβ1_C2_PC289(BanHI) AAAGGATCCAGGCACATTGAAGTACTCGC 서열번호 6
hAkt1_PH_PN6(BglII) AAAAGATCTATGATTGTGAAGGAGGGTTGG 서열번호 7
hAkt1_PH_PN111(BamHI) AAAGGATCCCTTGAGGCCGTCAGCCAC 서열번호 8
hPKCβ1_C2_PN127(BglII) AAAAGATCTCGCTCATTGTCCTCGTAAGAGA 서열번호 9
hPKCβ1_C2_PC296(NheI) AAAGCTAGCGGACAAAGATCCCATGAAGT 서열번호 10
hAKT1_kinase_PN(NheI) AAAGCTAGCTTTGAGTACCTGAAGCTGCT 서열번호 11
hAKT1_kinase_PC(KpnI) AAAGGTACCTCAGGCCGTGCCGCTGGCCG 서열번호 12
Akt 단백질의 PH 도메인을 포함하는 벡터를 대장균 BL21(DE3) 세포에 형질전환시키고, 상기 세포를 50 ㎍/㎖의 카나마이신이 포함된 50 ㎖의 LB 배양 배지를 사용하여 배양하였다. 배양은 37℃의 온도에서 8시간 동안 수행되었고, 배양 후, 세포를 25℃의 교반 배양기로 옮겼다. 600 ㎚의 파장에서 흡광도가 0.6 내지 1.0에 도달할 때까지 세포를 배양한 뒤, 1 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하였다. IPTG 첨가 18시간 후, 7,000 xg 및 4℃의 조건하에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득하고, 수득된 세포에 음파처리 평형 완충액(sonication equilibrium buffer, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6)을 첨가하였다. 음파처리 평형 완충액을 첨가한 세포를 음파처리하여 용해시키고, 세포 용해액으로부터, 니켈-니트릴로트리아세트산(nickel-nitrilotriacetic acid)과 HiLoad Superdex-200 컬럼(GE Healthcare life science, 미국)을 사용한 겔 여과 크로마토그래피를 이용하여 Akt 단백질의 PH 도메인을 정제하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용하여 확인하였다.
7-2. 칼슘에 의한 Akt 단백질의 PH 도메인과 PI(4,5)P 2 또는 PI(3,4,5)P 3 의 결합 억제 확인-1
칼슘에 의해 Akt 단백질의 PH 도메인과 PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3의 결합에 어떠한 영향이 미치는지 단백질-지질 결합 분석 방법을 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 분석은 막-고정된 지질 스트립(membrane-immobilized lipid strips, PIP-strips, Echelon Biosciences Inc., 미국)을 사용하여 수행되었다. 이때, 막에는 100 pmol의 농도가 되도록 LPA(lysophosphatidic acid), LPC(lysophosphatidylcholine), PI(phosphatidylinositol), PE(phosphatidylethanolamine), PC(phosphatidylcholine), S1P(sphingosine 1-phosphate), PA(phosphatidic acid) 또는 PS(phosphatidylserine)를 각각 첨가하고, 여기에 칼슘을 0, 0.05 또는 0.1 mM의 농도로 첨가하였다. 각각의 막은 블로킹 완충액[지방산이 포함되지 않은 3% BSA(bovine serum albumin), 0.1%(v/v) 트윈-20 및 TBS(Tris-buffered saline), pH 7.5]을 이용하여 상온에서 30분 동안 전처리하였다. 실시예 7-1에서 정제한 Akt 단백질의 PH 도메인을 3.5 ㎎/㎖의 농도가 되도록 블로킹 완충액을 이용하여 현탁하여 준비하고, 현탁된 단백질을 상기 막-고정된 지질 스트립과 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 지질과 결합된 단백질은 PH 도메인에 대한 항체를 사용하여 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Akt 단백질의 PH 도메인과 PI(3,4)P2 또는 PI(3,4,5)P3가 결합하였고, 상기 결합은 칼슘 농도가 증가함으로써 억제되었다(도 5).
7-3. 칼슘에 의한 Akt 단백질의 PH 도메인과 PI(3,4)P 2 , PI(4,5)P 2 또는 PI(3,4,5)P 3 의 결합 억제 확인-2
칼슘에 의해 Akt 단백질의 PH 도메인과 PI(3,4)P2 , PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3의 결합에 어떠한 영향이 미치는지 ITC(isothermal titration calorimetry) 방법을 사용하여 확인하였다.
구체적으로, 10 mM HEPES(pH 7.0)에 단백질을 현탁시킨 단백질 용액에 인지질-관련된 리간드를 25℃에서 iTC200 미세 열량 측정 시스템(MicroCal Inc., 미국)을 사용하여 적정하고, 생성된 그래프는 Origin 소프트웨어(Microcal Inc., 미국)를 사용하여 보정하였다. 이때, 인지질-관련된 리간드는 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin)의 클로로포름 용액과 POPS(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoserine), PI(3,4)P2(1,2-dipalmotoyl-sn-glycero-3-phosphatidylinositol-3,4-triphosphate), PI(4,5)P2(1,2-dipalmotoyl-sn-glycero-3-phosphatidylinositol-4,5-trisphosphate) 또는 PI(3,4,5)P3(1,2-dipalmotoyl-sn-glycero-3-phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate)를 80:20의 몰비로 혼합하여 리포좀의 형태로 제조하여 사용하였다. 유기용매를 제거하고, 인지질을 이용하여 HEPES 용액(pH 7.0) 내에서 단층의 라멜라를 생성시켰다.
그 결과, 도 6A 내지 6C에 나타난 바와 같이, POPS와 달리 PI(3,4)P2, PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3가 칼슘과 높은 결합력으로 결합하였다(도 6A 내지 6D). 특히, PI(3,4,5)P3는 두 곳의 칼슘 결합 위치를 갖고 있어(도 6E), 그 결합력이 더욱 증가하였다.
지금까지의 결과로부터, PI(3,4,5)P3, PI(3,4)P2 및 PI(4,5)P2는 칼슘에 대해 강한 결합력을 갖고, 세포 내 칼슘이 축적되면 Akt 단백질의 PH 도메인의 결합력이 감소함을 확인하였다. 따라서, 건강한 상태에서는 PI(3,4,5)P3의 탄소고리에 존재하는 인산기(phosphate group)가 음전하를 띄고, PH 도메인이 양전하를 띄어 이들이 안정하게 결합하는데, 비만 상태에서는 세포 내 칼슘 농도가 증가함으로써 칼슘과 PI(3,4,5)P3의 인산기가 결합함으로써, PI(3,4,5)P3 및 PH 도메인 사이의 상호작용이 일어나지 않는다(도 7).
실시예 8. PKCβ 단백질의 C2 도메인과 PI(4,5)P 2 또는 PI(3,4,5)P 3 의 결합 확인
Akt 단백질의 PH 도메인과 같이 칼슘과 상호작용하는 특징을 갖는 C2 도메인을 이용하여 PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3와 결합하는지를 확인하였다. 상기 C2 도메인은 인간의 경우, 약 362 종류의 단백질에서 발견되며, 582개 정도가 존재하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, C2 도메인은 PLC, PI3K 및 PKC 단백질 등에 존재하고, 직접적으로 칼슘과 결합하는 사이트를 갖거나 칼슘 비의존적으로 PIP에 결합할 수 있다.
8-1. PKCβ 단백질의 C2 도메인의 정제
PKCβ 단백질의 C2 도메인(서열번호 14)을 상기 표 1에 서열번호 1 및 2로 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 수득한 것을 제외하고는, 실시예 7-1과 동일한 조건 및 방법으로 PKCβ 단백질의 C2 도메인을 정제하였다. 한편, 대조군으로서 C2 도메인의 돌연변이형인 D187/193A 및 D246/248A를 동일한 방법으로 정제하여 C2 도메인의 D187/193A 및 D246/248A 돌연변이형 단백질을 수득하였다.
8-2. 칼슘에 의한 PKCβ 단백질의 C2 도메인과 PI(4,5)P 2 또는 PI(3,4,5)P 3 의 결합 억제 확인
실시예 8-1에서 정제된 PKCβ 단백질의 C2 도메인과 PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3의 결합이 칼슘에 의해 억제되는지 여부를 단백질-지질 결합 분석 방법 및 ITC 방법으로 확인하였다. 먼저, 단백질-지질 결합 분석 방법은 Akt 단백질의 PH 도메인 대신 PKCβ 단백질의 C2 도메인을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 8-2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 이때, 대조군으로 C2 도메인의 D187/193A 및 D246/248A 돌연변이형 단백질을 사용하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, PKCβ 단백질의 C2 도메인은 PI(4,5)P2 및 PI(3,4,5)P3에 강하게 결합하였다(도 8).
한편, ITC 방법은 인지질-관련된 리간드로서 POPC의 클로로포름 용액과 PI(3,4,5)P3를 80:20의 몰비로 혼합하여 리포좀의 형태로 제조하여 사용하고, 여기에 PKCβ 단백질의 C2 도메인 또는 C2 도메인의 D187/193A 돌연변이형 단백질을 첨가하여 사용한 것을 제외하고는, 실시예 7-3과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9B에 나타난 바와 같이, PKCβ 단백질의 C2 도메인은 PI(3,4,5)P3와 강하게 결합하였다(도 9B). 그러나 C2 도메인의 칼슘 결합 부위에 돌연변이를 발생시킨, C2 도메인의 D187/193A 돌연변이형 단백질은 PI(3,4,5)P3와 매우 약하게 결합하였다(도 9C). 따라서, 상기로부터 C2 도메인 내의 D187 및 D193 잔기가 상기 도메인이 칼슘과 직접적으로 상호작용함을 알 수 있었다.
실시예 9. 칼슘 농도 변화에 의한 PH 또는 C2 도메인의 이동 확인
상기로부터 Akt 단백질의 PH 도메인이나 PKCβ 단백질의 C2 도메인이 세포의 막에 결합하는 것을 확인하였다. 이에, 칼슘 농도 변화가 상기 도메인들의 세포막 결합에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 면역염색을 수행하였다.
먼저, Akt1 단백질의 PH 도메인 또는 PKCβ 단백질의 C2 도메인을 상기 표 1에 서열번호 5 내지 8로 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 수득하였다. 수득된 PCR 산물을 통상적인 방법으로 pmCherry-C1 벡터(Takara Clontech, 일본)에 클로닝하였다. 상기 제조된 벡터를 CHO 세포에 리포펙타민을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 블라스티시딘(blastidicin)을 사용하여 선별하고, mCherry 양성 세포를 유세포 분석기를 사용하여 확인하였다.
Akt1 단백질의 PH 도메인 또는 PKCβ 단백질의 C2 도메인을 발현하는 세포에 100 nM 농도의 PMA, 10 μM 농도의 이오노마이신 또는 100 nM 농도의 인슐린을 첨가하고, 발현된 단백질의 위치를 형광현미경으로 확인한 결과 사진을 도 10에 나타내었다.
도 10A에 나타난 바와 같이, PH 도메인은 인슐린의 첨가에 의해 세포 막으로 이동하였으나, 세포 내 칼슘 농도가 증가한 경우에는 세포 막으로 이동하지 않았다(도 10A). 그러나, 도 10B에 나타난 바와 같이, C2 도메인은 인슐린을 첨가하여도 세포 막으로 이동하지 않았으나, 세포 내 칼슘 농도가 증가함으로써 세포 막으로 이동하였다(도 10B).
상기 결과로부터, 증가된 칼슘의 농도에 의해 Akt 단백질의 PH 도메인과 PI(3,4,5)P3와의 결합이 억제되나, PKCβ 단백질의 C2 도메인은 증가된 칼슘과도 상호작용함으로써 PI(3,4,5)P3와 결합하는 것을 알 수 있었다.
실시예 10. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 Akt 활성화에 대한 영향 확인
Akt 단백질의 PH 도메인 대신 PKCβ 단백질의 C2 도메인이 융합된 융합 단백질을 제조하여, 상기 융합 단백질에 의해 칼슘 농도가 증가된 조건 하에서도 PI3K 의존적으로 Akt 활성화가 일어나는지를 확인하였다.
먼저, PKCβ 단백질의 C2 도메인과 Akt 단백질(서열번호 15)을 상기 표 1에 서열번호 9 내지 12로 기재된 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써 각각 수득하였다. 수득된 각각의 PCR 산물을 통상적인 방법으로 pEGFP-C2 벡터에 클로닝하여 C2 도메인 및 Akt 단백질이 융합된 융합 단백질(서열번호 17)(이하, "C2-Akt 융합 단백질")을 발현하는 벡터를 제작하였다. 이때, 대조군으로서는 PH 도메인을 포함하는 야생형의 Akt 단백질을 발현하는 벡터를 제작하였다.
상기 제조된 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 벡터를 PI3K 단백질을 발현하는 벡터와 함께 HepG2 세포에 리포펙타민을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염된 세포에 0, 10, 50 또는 100 nM의 PMA 또는 0, 5, 10, 15 또는 20 μM의 이오노마이신을 첨가하고 1시간 동안 반응시켰다. 상기 세포를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 실험은 1차 항체로서 Akt(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(T308)(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(S473)(Cell Signaling Technology, 미국), FOXO3A(Cell Signaling Technology, 미국), FOXO3A(S253)(Cell Signaling Technology, 미국), GSK-3β(Cell Signaling Technology, 미국), GSK-3β(S9)(Cell Signaling Technology, 미국) 또는 PI3K(Cell Signaling Technology, 미국) 단백질에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 11 및 12에 나타난 바와 같이, 야생형의 Akt 단백질이 형질전환된 세포에서는 PI3K에 의해 Akt 단백질이 활성화되었는데, 이는 칼슘 농도의 증가로 억제되었다. 그러나, C2-Akt 융합 단백질이 형질전환된 세포에서는 PI3K에 의한 Akt 단백질의 활성화는 칼슘의 농도가 증가하여도 억제되지 않았을뿐만 아니라 오히려 증가하였다(도 11 및 12).
실시예 11. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 신호전달 기전 확인
C2-Akt 융합 단백질에 의한 Akt 단백질의 활성화에 PI(4,5)P2 또는 PI(3,4,5)P3 중 어느 것이 더욱 중요한지 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실험은 C2-Akt 융합 단백질 및 PI3K 단백질을 발현하는 벡터와 함께 PTEN 또는 SHIP2를 처리하고, 1차 항체로서 Akt(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(T308)(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(S473)(Cell Signaling Technology, 미국), PI3K(Cell Signaling Technology, 미국), PTEN(Cell Signaling Technology, 미국) 또는 SHIP2(Upstate Biotechnology, 미국) 단백질에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, PTEN 또는 SHIP2에 의해 세포 내에 존재하는 PI(4,5)P2의 양이 증가함으로써, Akt 단백질의 활성이 감소되었다(도 13). 따라서, 상기로부터 C2-Akt 융합 단백질에 의한 Akt 단백질의 활성 변화에는 PI(4,5)P2보다 PI(3,4,5)P3가 중요하게 작용함을 알 수 있었다.
실시예 12. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질 내 C2 도메인과 칼슘과의 결합 위치 확인
상기로부터 C2-Akt 융합 단백질이 높은 칼슘 농도하에서도 PIP와 결합한 칼슘에 결합하여 Akt를 활성화시키는 것을 확인하였다. 이에, C2 도메인에 존재하는 칼슘 결합 잔기 중, 어떤 잔기가 가장 중요한 역할을 하는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, C2-Akt 융합 단백질 내 C2 도메인에서 칼슘 결합 위치로 알려진 잔기를 돌연변이시킨 C2-Akt 융합 단백질의 돌연변이형을 제조하였다. 구체적으로, C2 도메인의 D187/193A, D246/248A 또는 D254A 돌연변이를 제조하였다(도 14A). 상기 제조된 C2-Akt 융합 단백질 돌연변이형을 이용하여 PI3K 단백질을 발현하는 벡터와 함께 HepG2 세포에 리포펙타민을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염된 세포에 10 μM의 이오노마이신을 첨가하고 1시간 동안 반응시켰다. 상기 세포를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 실험은 1차 항체로서 Akt(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(T308)(Cell Signaling Technology, 미국), Akt(S473)(Cell Signaling Technology, 미국) 또는 PI3K(Cell Signaling Technology, 미국) 단백질에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 14B 및 14C에 나타난 바와 같이, D246/248A 또는 D254A 돌연변이 융합 단백질은 여전히 PI3K에 의해 Akt 단백질을 활성화시켰으나, D187/193A 돌연변이의 경우 Akt 단백질을 활성화시키지 못하였다. 이로부터, C2-Akt 융합 단백질이 높은 칼슘 농도하에서 Akt 단백질을 활성화시키는데 C2 도메인의 D187 및 D193 잔기가 중요한 역할을 함을 확인하였다.
실시예 13. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 치료 효과 확인
13-1. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스의 감염 및 감염된 동물모델의 체중 변화 확인
고지방 식이로인해 비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 동물모델에서 C2-Akt 융합 단백질에 의한 인슐린 저항성 치료 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 8주 동안 HFD 식이(60% 고지방 식이)를 수행하여 비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 동물모델을 제조하였다.
한편, 아데노바이러스 벡터에 야생형의 Akt 단백질 또는 C2-Akt 융합 단백질을 클로닝하여, Ad-Akt 및 Ad-C2Akt 발현벡터를 제작하였다(도 15A). 이때, 대조군으로서는 GFP를 발현하는 벡터인 Ad-GFP를 제작하였다. 상기 제작한 벡터를 AD-293 세포(Invitrogen, 미국)에 통상의 기술분야에 알려진 방법으로 감염시켜, 바이러스를 증폭시켰다. 증폭된 바이러스는 비라바인드-아데노바이러스 정제 키트(ViraBind-Adenovirus Purification Kit, Cell Biolabs Inc., 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 정제하였다. 정제된 바이러스의 역가를 결정하고, 상기 제조된 마우스에 1x109 PFU의 양으로 이를 정맥주사하였다. 바이러스를 주입한 마우스를 2주동안 관찰한 뒤, 부검하였다(도 15B).
바이러스 주입 후 2주 동안 마우스의 체중변화 및 사료 섭취량을 확인한 결과를 도 16에, 지방량 및 마른체중 변화를 도 17에 나타내었다. 도 16에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스에서 체중이 감소하였으나(도 16A), 사료 섭취량은 다른 군의 마우스와 차이가 없었다(도 16B). 또한, 도 17에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스에서 대조군에 비해 지방량 및 마른체중이 감소하였다(도 17).
즉, 상기로부터 C2-Akt 융합 단백질에 의해 고지방 식이로 인한 비만으로 유도된 인슐린 저항성 동물모델에서 비만이 개선되는 것을 알 수 있었다.
13-2. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 내당 능 및 인슐린 내성 확인
실시예 13-1에서 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스를 이용하여 다음과 같은 방법으로 내당능 및 인슐린 내성을 검사하였다.
구체적으로, 아데노바이러스 벡터를 주입하고, 16시간 동안 마우스를 금식시켰다. 금식한 마우스에 체중 1 ㎏당 1 g의 포도당(Fisher Scientific, 미국)을 복강 내로 주사하였다. 포도당을 주사한 동물모델의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하고, 채취한 샘플로부터 포도당 수준을 포도당 모니터를 사용하여 측정한 결과를 도 18A 및 18B에 나타내었다.
한편, 상기 마우스에 아데노바이러스 벡터를 주입하고, 4시간 동안 마우스를 금식시켰다. 금식한 마우스에 체중 1 ㎏당 0.65 unit의 인슐린을 복강 내로 주사하였다. 인슐린을 주사한 동물모델의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하고, 이를 1 내지 2시간 동안 얼음에 방치하여 응고시켰다. 응고된 혈액을 8,000 rpm 및 4℃의 조건하에서 10분 동안 원심분리하고, 혈청만을 수득하였다. 수득된 혈청으로부터 ELISA 키트(Millipore, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 인슐린 수준을 측정한 결과를 도 18C 및 18D에 나타내었다.
도 18A 및 18B에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스에서 포도당 수준이 낮았으나(도 18A 및 18B), 인슐린 수준은 통계학적 유의성이 없었다(도 18C 및 18D).
13-3. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 HOMA -IR의 변화 확인
실시예 13-2에서 내당능 및 인슐린 내성을 검사하기 위해, 포도당 또는 인슐린을 주입하기 전 공복상태의 동물모델로부터 혈액 시료를 채취하여 공복시 포도당 또는 인슐린 수준을 측정하고, 상기 값으로부터 HOMA-IR(homeostatic model assessment of insulin resistance) 값을 구했다. 혈액 시료를 공복 상태의 마우스로부터 수득한 것을 제외하고는, 실험은 실시예 13-2와 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 측정된 포도당 및 인슐린 수준을 이용하여, 하기 수학식 1을 사용하여 HOMA-IR 값을 구했다.
[수학식 1]
HOMA-IR = fasting blood glucose(㎎/㎗) x fasting insulin(μU/㎖) / 22.5
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, 공복 상태의 포도당 및 인슐린 수준이 C2-Akt 융합 단백질에 의해 감소하였고, 상기 값으로부터 구한 HOMA-IR 결과에서도 C2-Akt 융합 단백질에 의해 인슐린 저항성이 개선되는 것을 알 수 있었다(도 19).
13-4. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 혈액 내 성분 변화 확인
실시예 13-1에서 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터가 주입된 마우스로부터 혈액 샘플을 채취하여 ALT(alanine aminotransferase), 총 콜레스테롤 및 LDL(low density lipoprotein)의 수준을 측정하였다.
구체적으로, 채취한 혈액 샘플을 3,000 rpm 및 4℃의 조건하에서 15분 동안 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 수득된 혈청으로부터 ALT, 총 콜레스테롤 및 LDL의 수준은 AU480 화학분석기(Beckman Coulter, 미국)를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스에서 ALT, 총 콜레스테롤 및 LDL 수준이 감소하였다(도 20). 따라서, 이로부터 고지방 식이로 인한 비만에 의해 유도된 인슐린 저항성 동물모델에서 C2-Akt 융합 단백질이 동물모델의 간 기능을 개선시킴을 알 수 있었다.
13-5. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 간의 지방소립 감소 확인
실시예 13-1에서 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터가 주입된 마우스로부터 간조직을 채취하여 H&E 염색을 수행함으로써, 간의 지방소립(lipid droplet) 감소를 확인하였다.
구체적으로, 마우스로부터 간을 적출한 뒤(도 21A), 이를 10%(v/v) 중성 포르말린 완충액에 고정시켰다. 1주일 후, 간을 5 ㎛의 두께로 절단하여 절편을 수득하고, 파라핀에 포매하였다. 포매한 조직을 자일렌에 넣어 왁스를 제거하고, 알콜 용액으로 재수화(rehydration)시켰다. 재수화된 간 조직을 슬라이드 글라스에 마운팅하고, H&E(hematoxylin & eosin) 염색약을 첨가한 뒤, 지방소립을 현미경으로 관찰한 결과를 도 21B에 나타내었다.
도 21B에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스에서 대조군과 달리 지방소립이 매우 현저히 감소하였다(도 21B). 이로부터 C2-Akt 융합 단백질이 정상적인 Akt 신호전달 기전을 유도함으로써, 고지방식이에 의해 형성된 지방간을 개선시키는 효과가 있음을 알 수 있었다.
13-5. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 간의 인슐린 신호기전 확인
실시예 13-1에서 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터가 주입된 마우스로부터 수득된 간 조직을 이용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 인슐린 신호기전을 확인하였다.
그 결과, 도 22에서 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스는 Akt, GSK3β 및 FOXO3A의 인산화를 증가시켰다. 따라서, 이로부터 세포 내 칼슘 농도가 증가한 고지방 식이 마우스에서도 C2-Akt 융합 단백질이 Akt를 활성화시킴으로써 C2-Akt 융합 단백질을 막으로 이동시키는 것을 알 수 있었다.
13-5. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 지방간과 관련된 유전자의 발현 변화 확인
실시예 13-1에서 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터가 주입된 마우스로부터 수득된 간 조직을 이용하여 포도당 및 지방 생성과정이나 지방 흡수 등에 관여하는 유전자의 발현 변화를 실시간 PCR의 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 13-1에서 수득된 13 ㎎의 간 조직에 1 ㎖의 트리졸(Invitrogen, 미국)을 첨가하였다. 트리졸이 첨가된 간 조직은 조직 균질기(tissue homogenizer)를 이용하여 용해시키고, 여기에 200 ㎕의 클로로포름을 첨가하였다. 용해물을 12,000 rpm의 조건하에서 20분 동안 원심분리하여 상청액을 수득하고, 수득된 상청액에 500 ㎕의 이소프로판올을 첨가하고 볼텍싱하였다. 이를 실온에서 10분 동안 방치한 뒤, 다시 12,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 에탄올을 이용하여 세척한 뒤, 실온에서 건조시키고 40 ㎕의 DEPC(diethylpyrocarbonate) 처리된 증류수에 현탁시켜 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA는 나노드롭 UV-비스 분광 광도계(Thermo Scientific, 미국)를 사용하여 정량하고, 사용하기 전까지 -80℃에 보관하였다.
상기 분리된 RNA로부터 cDNA 합성 키트(Takara Bio, 일본)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 4 ㎍의 RNA에 적정량의 DNaseI을 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 반응시키고, 75℃에서 10분 동안 추가로 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 5 ㎕의 반응액에 1 ㎕의 랜덤 헥사머 프라이머, 1 ㎕의 dNTP 혼합물 및 3 ㎕의 멸균 증류수를 첨가하고, 65℃에서 5분 동안 반응시켰다. 여기에 4 ㎕의 5x 프라임스크립트(PrimeScript) 완충액, 0.5 ㎕의 RNase 억제제, 1 ㎕의 RTase 및 4.5 ㎕의 멸균 증류수를 첨가하고, 이를 30℃에서 10분, 42℃에서 40분 및 72℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고, 80 ㎕의 멸균 증류스를 첨가하고, 합성된 cDNA를 사용하기 전까지 -20℃에 보관하였다.
상기 합성된 cDNA를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 구체적으로, qRT-PCR(quantitative real-time PCR)은 CFX384 리얼-타임 PCR 디텍션 시스템(Bio-Rad, 미국)을 사용하여, 95℃에서 10분, 95℃에서 15분(40회 반복) 및 60℃에서 1분의 조건으로 수행되었다. 이때, 각각의 유전자를 탐지하기 위한 프라이머는 G6PC, PEPCK, SREBP1C, FAS, Acc1, Acc2, ChREBP, Mttp, CD36, Ldlr 및 CPT1 유전자를 탐지할 수 있다고 알려진 공지의 프라이머를 사용하였다. qRT-PCR 결과 수득된 유전자 산물의 상대적인 발현량은 사이클로필린 유전자의 발현량을 기준으로 정규화되고, ΔΔCt 방법으로 계산되었다.
그 결과, 도 23A 내지 23C에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스에서는 포도당 및 지방 생성과정이나 지방 흡수 등에 관여하는 유전자인 G6PC, PEPCK, SREBP1C, FAS, Acc1, Acc2, ChREBP, Mttp, CD36, Ldlr 및 CPT1 유전자의 발현이 감소되었다(도 23A 내지 23C).
13-6. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 지방간과 관련된 단백질의 발현 변화 확인
실시예 13-5에서 C2-Akt 융합 단백질에 의해 고지방 식이 마우스 모델의 간에서 확인된 포도당 및 지방 생성과정이나 지방 흡수 등에 관여하는 유전자의 발현 억제가 단백질의 발현에도 영향을 미치는지 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 확인하였다.
실험은 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터가 주입된 마우스로부터 수득된 간 조직을 이용하고, 1차 항체로서 pSREBP-1(Santa Cruz Biotechnology, 미국), nSREBP-1(Santa Cruz Biotechnology, 미국), FAS(Santa Cruz Biotechnology, 미국), ACC1(Santa Cruz Biotechnology, 미국) 및 ACC2(Santa Cruz Biotechnology, 미국) 단백질에 대한 항체를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 23D에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 감염된 마우스에서는 ACC1 및 ACC2 단백질의 발현이 감소하였다(도 23D).
실시예 14. PKCβ 단백질의 C2 도메인 및 Akt 단백질의 융합 단백질에 의한 유전자 발현 변화 확인
실시예 13-1에서 C2-Akt 융합 단백질을 발현하는 아데노바이러스 벡터가 주입된 마우스의 간에서 발현되는 RNA의 발현변화를 RNA-서열분석 방법을 사용하여 확인하였다. 그 결과, 도 24A에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질에 의해 발현이 증가하는 유전자 5종류 및 발현이 감소하는 유전자 7종류를 확인하였다.
이에, 상기 마우스의 간 조직과 LCN2, Selenbp2, FABP5, Orm2, FGFR1, Acot3, RGS16, Lpin1, Vnn1, Klf10, Cidea, Cideb 또는 CideC 유전자를 탐지할 수 있다고 알려진 공지의 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 13-5와 동일한 조건 및 방법으로 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 24B 내지 24D에 나타난 바와 같이, C2-Akt 융합 단백질에 의해 지방간을 개선시키는데 관여하는 유전자인 LCN2, Selenbp2, FABP5, Orm2 및 Fgfr1 유전자의 발현은 증가하고, 지방간을 촉진시키는 유전자인 Acot3, Rgs16, Lpin1, Vnn1 및 Klf10 유전자의 발현은 감소하였다(도 24B 및 24C). 한편, 지방소립의 형성, 지방 저장 등에 관여하는 Cidea(cell death inducing DNA fragmentation factor-alpha-like effector protein a) 및 Cidec 유전자의 발현도 감소하였다(도 24D).
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Sequence <220> <223> hPKC beta1_C2_PC289(BanHI) <400> 6 aaaggatcca ggcacattga agtactcgc 29 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAkt1_PH_PN6(BglII) <400> 7 aaaagatcta tgattgtgaa ggagggttgg 30 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAkt1_PH_PN111(BamHI) <400> 8 aaaggatccc ttgaggccgt cagccac 27 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPKC beta1_C2_PN127(BglII) <400> 9 aaaagatctc gctcattgtc ctcgtaagag a 31 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hPKC beta1_C2_PC296(NheI) <400> 10 aaagctagcg gacaaagatc ccatgaagt 29 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAKT1_kinase_PN(NheI) <400> 11 aaagctagct ttgagtacct gaagctgct 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hAKT1_kinase_PC(KpnI) <400> 12 aaaggtacct caggccgtgc cgctggccg 29 <210> 13 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PH domain of Akt protein <400> 13 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 <210> 14 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 domain of PKC beta protein <400> 14 His Gln Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Met Met Asn Val His Lys Arg 1 5 10 15 Cys Val Met Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Thr Asp His Thr Glu Arg 20 25 30 Arg Gly Arg Ile Tyr Ile Gln Ala His Ile Asp Arg Asp Val Leu Ile 35 40 45 Val Leu Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Val Pro Met Asp Pro Asn Gly 50 55 60 Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Ser 65 70 75 80 Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Lys Cys Ser Leu Asn Pro Glu 85 90 95 Trp Asn Glu Thr Phe Arg Phe Gln Leu Lys Glu Ser Asp Lys Asp Arg 100 105 110 Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Leu Thr 115 120 <210> 15 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Akt protein w/o PH domain <400> 15 Lys Lys Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser 1 5 10 15 Asp Asn Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys 20 25 30 His Arg Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys 35 40 45 Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg 50 55 60 Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp 65 70 75 80 Glu Val Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg 85 90 95 His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg 100 105 110 Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His 115 120 125 Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly 130 135 140 Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val 145 150 155 160 Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly 165 170 175 His Ile Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp 180 185 190 Gly Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro 195 200 205 Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly 210 215 220 Leu Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr 225 230 235 240 Asn Gln Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile 245 250 255 Arg Phe Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly 260 265 270 Leu Leu Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp 275 280 285 Ala Lys Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln 290 295 300 His Val Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr 305 310 315 320 Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met 325 330 335 Ile Thr Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp 340 345 350 Ser Glu Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly 355 360 365 Thr Ala 370 <210> 16 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Akt protein <400> 16 Met Ser Asp Val Ala Ile Val Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly 1 5 10 15 Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Asn Asp 20 25 30 Gly Thr Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Gln Asp Val Asp Gln Arg 35 40 45 Glu Ala Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Gln Cys Gln Leu Met Lys 50 55 60 Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp 65 70 75 80 Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Glu Thr Pro Glu Glu Arg 85 90 95 Glu Glu Trp Thr Thr Ala Ile Gln Thr Val Ala Asp Gly Leu Lys Lys 100 105 110 Gln Glu Glu Glu Glu Met Asp Phe Arg Ser Gly Ser Pro Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Glu Met Glu Val Ser Leu Ala Lys Pro Lys His Arg 130 135 140 Val Thr Met Asn Glu Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr 145 150 155 160 Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr 165 170 175 Ala Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val 180 185 190 Ala His Thr Leu Thr Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro 195 200 205 Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys 210 215 220 Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser 225 230 235 240 Arg Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu 245 250 255 Ile Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr 260 265 270 Arg Asp Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile 275 280 285 Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala 290 295 300 Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val 305 310 315 320 Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly 325 330 335 Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln 340 345 350 Asp His Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe 355 360 365 Pro Arg Thr Leu Gly Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu 370 375 380 Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys 385 390 395 400 Glu Ile Met Gln His Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val 405 410 415 Tyr Glu Lys Lys Leu Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu 420 425 430 Thr Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr 435 440 445 Ile Thr Pro Pro Asp Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu 450 455 460 Arg Arg Pro His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 465 470 475 480 <210> 17 <211> 667 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C2-Akt fusion protein <400> 17 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser 225 230 235 240 Gly Arg Thr Gln Ile Ser Leu Ile Val Leu Val Arg Asp Ala Lys Asn 245 250 255 Leu Val Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys Leu 260 265 270 Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Ser Glu Ser Lys Gln Lys Thr Lys Thr 275 280 285 Ile Lys Cys Ser Leu Asn Pro Glu Trp Asn Glu Thr Phe Arg Phe Gln 290 295 300 Leu Lys Glu Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu Ser Val Glu Ile Trp Asp 305 310 315 320 Trp Asp Leu Thr Ser Arg Asn Asp Phe Met Gly Ser Leu Ser Ala Ser 325 330 335 Phe Glu Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile 340 345 350 Leu Val Lys Glu Lys Ala Thr Gly Arg Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu 355 360 365 Lys Lys Glu Val Ile Val Ala Lys Asp Glu Val Ala His Thr Leu Thr 370 375 380 Glu Asn Arg Val Leu Gln Asn Ser Arg His Pro Phe Leu Thr Ala Leu 385 390 395 400 Lys Tyr Ser Phe Gln Thr His Asp Arg Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr 405 410 415 Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe 420 425 430 Ser Glu Asp Arg Ala Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu 435 440 445 Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys Asn Val Val Tyr Arg Asp Leu Lys Leu 450 455 460 Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr Asp Phe 465 470 475 480 Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Lys Asp Gly Ala Thr Met Lys Thr Phe 485 490 495 Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp Asn Asp 500 505 510 Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met Tyr Glu 515 520 525 Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu Lys Leu 530 535 540 Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg Phe Pro Arg Thr Leu Gly 545 550 555 560 Pro Glu Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Lys Lys Asp Pro Lys 565 570 575 Gln Arg Leu Gly Gly Gly Ser Glu Asp Ala Lys Glu Ile Met Gln His 580 585 590 Arg Phe Phe Ala Gly Ile Val Trp Gln His Val Tyr Glu Lys Lys Leu 595 600 605 Ser Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr Arg Tyr 610 615 620 Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Met Ile Thr Ile Thr Pro Pro Asp 625 630 635 640 Gln Asp Asp Ser Met Glu Cys Val Asp Ser Glu Arg Arg Pro His Phe 645 650 655 Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Gly Thr Ala 660 665

Claims (19)

  1. 서열번호 14로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 C2 도메인 및 서열번호 16으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 Akt 단백질의 N-말단으로부터 150 내지 480번째 아미노산 잔기로 구성되는 단편의 융합 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 17로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드인, 융합 단백질.
  6. 제1항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  8. 제7항의 발현 벡터가 형질전환된 숙주세포.
  9. 제1항의 융합 단백질, 제6항의 폴리뉴클레오티드, 제7항의 발현 벡터 또는 제8항의 숙주세포를 유효성분으로 함유하는 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 및 지방간으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 삭제
  11. 제1항의 융합 단백질, 제6항의 폴리뉴클레오티드, 제7항의 발현 벡터 또는 제8항의 숙주세포를 유효성분으로 함유하는 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 및 지방간으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  12. 1) 제1항의 융합 단백질을 발현하고 세포 내 칼슘 농도가 증가된 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 세포에서 융합 단백질과 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-트리포스페이트 또는 융합 단백질과 포스파티딜이노시톨(4,5)-비스포스페이트와의 결합 여부를 확인하는 단계; 및
    3) 피검물질의 무처리 대조군과 비교하여 상기 결합을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 PKCβ 단백질의 활성화를 억제하는 후보물질의 스크리닝 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 칼슘이 포스파티딜이노시톨(3,4,5)-트리포스페이트 또는 포스파티딜이노시톨(4,5)-비스포스페이트와 결합된, PKCβ 단백질의 활성화를 억제하는 후보물질의 스크리닝 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 단계 2)의 결합 여부가 ITC(isothermal titration calorimetry) 방법 및 단백질-지질 결합 분석 방법으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 방법으로 확인되는, PKCβ 단백질의 활성화를 억제하는 후보물질의 스크리닝 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 세포 내 칼슘 농도가 증가된 세포가 비만, 인슐린 저항성, 당뇨병 또는 지방간의 세포 모델인, PKCβ 단백질의 활성화를 억제하는 후보물질의 스크리닝 방법.
  16. 삭제
  17. 제12항에 있어서, 제1항의 융합 단백질이 세포막으로 이동하는 것을 억제하는 물질을 선별하는 단계를 추가로 포함하는, PKCβ 단백질의 활성화를 억제하는 후보물질의 스크리닝 방법.
  18. 제12항에 있어서, 제1항의 융합 단백질에 의한 Akt 신호전달 기전을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 추가로 포함하는, PKCβ 단백질의 활성화를 억제하는 후보물질의 스크리닝 방법.
  19. 1) 시험관 내에서 제1항의 융합 단백질과, 칼슘 및 포스파티딜이노시톨 (3,4,5)-트리포스페이트의 복합체 또는 칼슘 및 포스파티딜이노시톨(4,5)-비스포스페이트의 복합체의 혼합물에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 혼합물에서 융합 단백질과 상기 복합체와의 결합 여부를 확인하는 단계; 및
    3) 피검 물질의 무처리 대조군과 비교하여 융합 단백질과 상기 복합체와의 결합을 억제하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 PKCβ 단백질의 활성화를 억제하는 후보물질의 스크리닝 방법.
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Constance Agamasu 등, J. Biol. Chem., Vol.290, No.45 pp.27403-27413 (2015.09.21.)
Zhengyi Zhang 등, Diabetes Research and Clinical Practice, Vol.17, pp.30315-30317 (2017.10.27.)

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KR20190059161A (ko) 2019-05-30
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