WO2023128550A1 - Asm에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2023128550A1
WO2023128550A1 PCT/KR2022/021379 KR2022021379W WO2023128550A1 WO 2023128550 A1 WO2023128550 A1 WO 2023128550A1 KR 2022021379 W KR2022021379 W KR 2022021379W WO 2023128550 A1 WO2023128550 A1 WO 2023128550A1
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asm
antigen
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present
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배재성
진희경
박민희
최병조
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경북대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to ASM (acid sphingomyelinase) and uses thereof, and more particularly, to anti-ASM that has very high binding sensitivity and specificity to ASM protein and has a very excellent effect of inhibiting ASM activity. It relates to a monoclonal antibody and its use for treating/diagnosing neurodegenerative diseases.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • ASM acid sphingomyelinase
  • ASM amyloid- ⁇
  • tricyclic antidepressants e.g. amitriptyline (AMI), desipramine, imipramine, etc.
  • ASM amitriptyline
  • desipramine desipramine
  • imipramine imipramine
  • ASM amitriptyline
  • the main pharmacological action (mode of action) of tricyclic antidepressants is to increase the activity of neurotransmitters through inhibition of reuptake of neurotransmitters in nerve cells, and as a side action, they show ASM inhibitory effects.
  • tricyclic antidepressants act on the nervous system and nerve cells and can cause side effects such as blurred vision, increased light sensitivity, and vomiting, so it is necessary to develop new substances that can directly inhibit ASM activity.
  • the present inventors have excellent specificity and sensitivity to ASM, so that they can not only diagnose degenerative neurological diseases by detecting the ASM protein whose expression is increased in patients with neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, but also directly suppress the activity of ASM to treat degenerative nerve diseases.
  • the antibody having the amino acid sequence provided in the present invention has such excellent activity, and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to obtain a heavy chain complementarity determining region (CDR) 1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3; and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, a vector containing the polynucleotide, and a host cell transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases/depression, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases/depression comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases/depression essentially consisting of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing neurodegenerative diseases consisting essentially of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for preparing a composition for treating neurodegenerative diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating neurodegenerative diseases comprising administering an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for preparing a composition for the treatment of depression.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating depression comprising administering an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • Another object of the present invention is a) obtaining a sample from an individual and binding an antibody that specifically binds to ASM (acid sphingomyelinase); and
  • the present invention provides a heavy chain complementarity determining region (CDR)1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: A heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by 3; and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof, a vector containing the polynucleotide, and a host cell transformed with the vector.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases/depression comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases/depression comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases/depression essentially consisting of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a composition for diagnosing neurodegenerative diseases consisting essentially of the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for preparing a composition for treating neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides a method for treating neurodegenerative diseases comprising administering an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for preparing a composition for the treatment of depression.
  • the present invention provides a method for treating depression comprising administering an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a) obtaining a sample from an individual and binding an antibody that specifically binds to ASM (acid sphingomyelinase); and
  • the present invention provides a heavy chain complementarity determining region (CDR) 1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • a heavy chain variable region comprising; and a light chain variable region comprising a light chain CDR1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, a light chain CDR2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and a light chain CDR3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • the first letter (three letter) of an amino acid refers to the following amino acids according to standard abbreviation conventions in the field of biochemistry: A (Ala): alanine; C(Cys): cysteine; D(Asp): aspartic acid; E (Glu): glutamic acid; F(Phe): phenylalanine; G(Gly): glycine; H(His): histidine; I(IIe): isoleucine; K(Lys): lysine; L (Leu): Leucine; M (Met): methionine; N(Asn): asparagine; O(Ply)pyrrolysine; P(Pro): proline; Q(Gln): glutamine; R(Arg): arginine; S (Ser): serine; T(Thr): threonine; U(Sec): selenocysteine, V(Val): valine
  • expression means the production of a protein or nucleic acid in a cell.
  • the term "host cell” includes heterologous DNA introduced into cells by any means (e.g., electroporation, calcium phosphatase precipitation, microinjection, transformation, viral infection, etc.) refers to prokaryotic or eukaryotic cells that
  • protein is used interchangeably with “polypeptide” and refers to a polymer of amino acid residues, eg as commonly found in proteins in nature.
  • nucleic acid refers to deoxyribonucleotides or ribonucleotides in single- or double-stranded form. Unless otherwise limited, known analogs of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a manner similar to naturally occurring nucleotides are also included.
  • the heavy and light chains of antibodies are structurally divided into variable regions and constant regions according to the variability of amino acid sequences.
  • the heavy chain constant region is composed of three or four heavy chain constant regions such as CH1, CH2, and CH3 (IgA, IgD, and IgG antibodies) and CH4 (IgE and IgM antibodies) depending on the type of antibody, and the light chain has one constant region. It is composed of phosphorus CL.
  • the heavy chain and light chain variable regions each consist of one domain of a heavy chain variable region (VH) or light chain variable region (VL).
  • variable and constant regions of the light chain and the heavy chain are aligned side by side and connected by one covalent disulfide bond, and the heavy chains of the two molecules bonded to the light chain are connected through two covalent disulfide bonds, forming a whole antibody.
  • a whole antibody specifically binds to an antigen through the variable regions of the heavy and light chains, and since a whole antibody is composed of two heavy and light chain pairs (HC/LC), a whole antibody molecule contains two variable regions. Through this, it has bivalent monospecificity that binds to the same two antigens.
  • variable region including the site where the antibody binds to the antigen is subdivided into a framework region (FR) with low sequence variability and a complementary determining region (CDR), which is a hypervariable region with high sequence variability. do.
  • FR framework region
  • CDR complementary determining region
  • three CDRs and four FRs are arranged in the order of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 from the N-terminus to the C-terminus, respectively. It is the site where the CDR with the highest sequence variability within the variable region of the antibody directly binds to the antigen, and is the most important for the antigen specificity of the antibody.
  • a monoclonal antibody of the present invention refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, the individual antibodies comprising the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in minor amounts. Monoclonal antibodies bind very specifically to a single antigenic epitope.
  • the term 'monoclonal' or 'monoclonal' indicates that the antibody is obtained from a substantially homologous population and the characteristics of the antibody, and does not necessarily mean that the antibody must be produced by a specific method.
  • single antibodies of the present invention can be made by the hybridoma method first described by Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, or by recombinant DNA methods (see U.S. Patent No. 4,816,567). ) can be prepared by Also see, for example, Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 and Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731) can be used to isolate them from the phage antibody library.
  • Antibodies of the present invention specifically include chimeric antibodies, in which a portion of the heavy chain and/or light chain originates from a specific species or is identical or homologous to the corresponding sequence of a specific antibody, but the remaining portion is an antibody of the present invention. As long as it exhibits the desired biological activity (eg, selective binding to ASM protein), it may originate from another species or may be identical or homologous to the corresponding sequence of another antibody (US Pat. No. 4,816,567).
  • a humanized antibody is an antibody that contains the sequences of both human and non-human (e.g., murine, rat) antibodies. In general, the rest of the antibody except for the region (CDR) that binds to the epitope is that of a human antibody.
  • the region binding region (CDR) may include sequences of non-human origin.
  • Fully human antibodies refer to antibodies containing only human immunoglobulin protein sequences, and can be produced from mice, mouse cells, or hybridomas derived from mouse cells, or produced by a phage display method.
  • the hybridoma cells can be prepared using methods known in the art. Specifically, the hybridoma cells are prepared by immunizing an animal with ASM protein, which is an immunogen, and fusing antibody-producing B cells derived from the immunized animal with myeloma cells to prepare a hybridoma, and among them, the peptide It can be prepared by selecting a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to. As the animal to be immunized, animals such as goats, sheep, guinea pigs, rats, or rabbits may be used as well as mice.
  • ASM protein which is an immunogen
  • a method of immunizing the immunized animal a method already known in the art may be used.
  • an antigen adjuvant such as physiological saline and/or Freund's adjuvant in an amount of 1 to 100 ⁇ g at a time, subcutaneously in the abdomen of the animal to be immunized.
  • it may be performed by inoculating 2-6 times every 2-5 weeks into the peritoneal cavity.
  • the spleen or lymph nodes are extracted 3-5 days after the final immunization, and B cells contained in their tissues in the presence of a fusion promoter are myeloma according to a cell fusion method already known in the art. to fuse with the cell.
  • a fusion promoter materials such as polyethylene glycol (PEG) may be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the myeloma cells for example, P3U1, NS-1, P3x63.
  • Mouse-derived cells such as Ag 8.653 and Sp2/0-Ag14, and rat-derived cells such as AG1 and AG2 can be used.
  • B cells and myeloma cells are mixed at a ratio of 1: 1-10: 1, and PEG having a molecular weight of 1,000-6,000 is added at a concentration of 10-80% So, it can be performed by a method of incubating at 30-37 ° C. for 1-10 minutes.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to the immunogenic peptide is cultured in a selective medium such as, for example, a HAT medium in which only the hybridoma can survive, and in the hybridoma culture supernatant.
  • Antibody activity can be measured and selected using a method such as ELISA.
  • a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the immunogenic peptide is, for example, a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically binds to the immunogenic peptide. It can be selected by repeating cloning by methods such as dilution.
  • the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof provided by the present invention can generate human antibodies and antibody fragments in vitro from immunoglobulin variable region gene repertoires from non-immunized donors using phage display technology.
  • antibody variable region genes are cloned in frame into a major or minor coat protein of a filamentous bacteriophage, such as M13 or fd, and functional antibody fragments are displayed on the surface of the phage particle. Since the filamentous particle contains a single-stranded DNA copy of the phage genome, selection based on the functional properties of the antibody results in selection of the gene encoding the antibody exhibiting these properties.
  • the phage mimics some properties of B-cells.
  • Phage display can be performed in a variety of formats.
  • Several sources of variable region-gene segments are available for phage display. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolated a diverse array of anti-oxazolone antibodies from a small random combinatorial library of variable region genes derived from the spleen of immunized mice. A repertoire of variable region genes from unimmunized human donors can be constructed and antibodies to a diverse array of antigens (including self antigens) can be isolated by essentially performing techniques known in the art [U.S. Patent No. 5,565,332 and 5,573,905].
  • the fact that the light chain or heavy chain variable region includes a specific amino acid sequence means that it includes the entire amino acid sequence, has the entire amino acid sequence, or consists of the amino acid sequence.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises a heavy chain variable region (VH) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 ( VL) may be included.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • the type of antibody according to the present invention is not specifically limited as long as it specifically recognizes the ASM protein, and as a specific example, the antibody may be selected from the group consisting of IgG, IgA, IgM, IgE and IgD.
  • the antigen-binding fragment of an antibody refers to a fragment of an antibody that retains binding ability to the ASM protein, and preferably, the fragment has at least 20%, 50%, 70%, 80% of the protein affinity of the parent antibody. 90%, 95% or 100% or more. Specifically, it may be in the form of a diabody, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv, and scFv.
  • Fab fragment antigen-binding
  • F(ab')2 is a fragment produced by hydrolysis of an antibody with pepsin, and has a form in which two Fabs are linked by a disulfide bond at a heavy chain hinge.
  • F(ab') is a monomeric antibody fragment in which a heavy chain hinge is added to a Fab obtained by reducing the disulfide bond of the F(ab')2 fragment.
  • Fv variable fragment is an antibody fragment composed only of the variable regions of each of the heavy and light chains.
  • a scFv single chain variable fragment is a recombinant antibody fragment in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) are connected by a flexible peptide linker.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • a diabody refers to a fragment in which the VH and VL of an scFv are connected by a very short linker so that they cannot bind to each other, but bind to the VL and VH of another scFv of the same type to form a dimer.
  • An antibody or fragment thereof of the present invention may contain conservative amino acid substitutions that do not substantially alter its biological activity (referred to as conservative variants of the antibody). For such an amino acid substitution, reference may be made to the above.
  • antibodies or fragments thereof of the present invention may be conjugated to enzymes, fluorescent materials, radioactive materials, proteins, etc., but are not limited thereto.
  • methods for conjugating the substances to antibodies are well known in the art.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • 'polynucleotide' may be described as an oligonucleotide or nucleic acid, and may be expressed using DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA), RNA molecules (eg, mRNA), and nucleotide analogs. Analogs of the DNA or RNA produced (e.g., peptide nucleic acids and non-naturally occurring nucleotide analogs) and hybrids thereof are included.
  • the polynucleotide may be single-stranded or double-stranded.
  • the polynucleotide refers to a nucleotide sequence that encodes an antibody composed of a heavy chain and a light chain having a CDR structure specific to a residue of an ASM protein or a structure of VH and VL.
  • Polynucleotides encoding the antibodies or fragments thereof of the present invention can be obtained by methods well known in the art. For example, oligonucleotide synthesis techniques well known in the art, such as polymerase chain reaction (PCR), etc. can be synthesized using PCR, etc.
  • the polynucleotide encoding the antibody or antigen-binding fragment thereof may include the base sequence shown in Table 1 and/or Table 2 below.
  • the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the 'vector' of the present invention is used for the purpose of replication or expression of the polynucleotide of the present invention for recombinant production of the antibody or fragment thereof of the present invention, and generally includes a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, and one or more of enhancer elements, promoters and transcription termination sequences.
  • the vector of the present invention may preferably be an expression vector, and more preferably may be a vector containing the polynucleotide of the present invention operably linked to a regulatory sequence, for example, a promoter.
  • a plasmid refers to a linear or circular double-stranded DNA molecule into which external polynucleotide fragments can be combined.
  • Another type of vector is a viral vector (eg, replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses), wherein additional DNA fragments are It can be introduced into the viral genome.
  • viral vector eg., replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses
  • Additional DNA fragments are It can be introduced into the viral genome.
  • Certain vectors are self-replicating (e.g., bacterial vectors, including bacterial origin and episomal mammalian vectors) into which they are introduced. autonomous replication).
  • Other vectors e.g., non-episomal mammalian vectors
  • the 'vector' may be understood as the same as 'expression vector', which is a type of vector capable of expressing the polynucleotide.
  • a polynucleotide sequence is "operably linked" to a regulatory sequence if the regulatory sequence affects the expression (eg, level, timing or location of expression) of the polynucleotide sequence.
  • the regulatory sequence is a sequence that affects the expression (eg, level, timing or location of expression) of a nucleic acid to which it is operably linked.
  • the regulatory sequence may, for example, affect the regulated nucleic acid directly or through the action of one or more other molecules (eg, polypeptides that bind to the regulatory sequence and/or the nucleic acid).
  • the control sequences include promoters, enhancers and other expression control elements.
  • the present invention also provides cells transformed with the vector.
  • the cell type of the present invention is not particularly limited as long as it can be used to express the polynucleotide encoding the antibody or fragment thereof included in the expression vector of the present invention.
  • Cells (host cells) transformed with the expression vector according to the present invention may be prokaryotic (eg E. coli), eukaryotic (eg yeast or other fungi), plant cells (eg tobacco or tomato plants) cells), animal cells (eg, human cells, monkey cells, hamster cells, rat cells, mouse cells, insect cells, or hybridomas derived therefrom).
  • prokaryotic eg E. coli
  • eukaryotic eg yeast or other fungi
  • plant cells eg tobacco or tomato plants
  • animal cells eg, human cells, monkey cells, hamster cells, rat cells, mouse cells, insect cells, or hybridomas derived therefrom.
  • it may be a cell derived from mammals including humans.
  • Prokaryotes suitable for this purpose include gram-negative or gram-positive organisms, eg Enterobacteriaceae, eg Escherichia, eg E. E.coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g. Salmonella typhimurium, Serratia (Serratia), eg Serratia marcescans and Shigella, and Bacilli, eg B. Subtilis (B. subtilis) and B. B. licheniformis, Pseudomonas such as P. aeruginosa and Streptomyces.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it can express the vector of the present invention, but preferably E. It could be Coli.
  • Saccharomyces cerevisiae are most commonly used.
  • many other genera, species and strains, but not limited thereto such as Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces host, such as K. Lactis (K. lactis), K. K. fragilis (ATCC 12,424), K. K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. Wickerami (K. wickeramii) (ATCC 24,178), K. K. waltii (ATCC 56,500), K. Drosophilarum (ATCC 36,906), K. drosophilarum. Thermotolerans (K. thermotolerans and K.
  • the term 'transformation' refers to the modification of the genotype of a host cell by introducing a foreign polynucleotide, and refers to the introduction of a foreign polynucleotide into a host cell regardless of the method used for the transformation.
  • the foreign polynucleotide introduced into the host cell may remain integrated into the genome of the host cell or may remain unintegrated, both of which are encompassed by the present invention.
  • a recombinant expression vector capable of expressing the antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention can be prepared by methods known in the art, such as, but not limited to, transient transfection, microinjection, and transduction. ), cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran- mediated transfection, polybrene-mediated transfection ), electroporation, gene gun, and a known method for introducing nucleic acids into cells, which can be introduced into cells to produce antibodies or fragments thereof and transformed.
  • the cell of the present invention is a cultured cell that can be transformed or transfected with the polynucleotide of the present invention or a vector containing the polynucleotide, which can subsequently be expressed in the host cell.
  • a recombinant cell refers to a cell that has been transformed or transfected with a polynucleotide to be expressed.
  • a cell of the present invention may also be a cell that contains a polynucleotide of the present invention, but does not express the desired level thereof unless a regulatory sequence is introduced into the cell such that it is operably linked to the polynucleotide.
  • Cells of the present invention can be cultured in a variety of media.
  • Commercially available media such as Ham's F1O (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), Minimum Essential Medium (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), and Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich Co.) are suitable for culturing the cells.
  • the medium may be supplemented with hormones and/or other growth factors, salts, buffers, nucleotides, antibiotics, trace elements and glucose or equivalent energy sources, if necessary.
  • the present invention includes the steps of culturing the cells under conditions in which polynucleotides are expressed to produce polypeptides containing light and heavy chain variable regions, and recovering the polypeptides from the cells or a culture medium in which they are cultured.
  • a method for producing an antibody or fragment thereof that binds to WRS is provided.
  • the cell of the production method in the present invention is as described above, and contains a polynucleotide encoding the antibody of the present invention.
  • the polypeptide of the above production method may be the antibody or fragment thereof of the present invention itself, or may be an amino acid sequence other than the antibody or fragment thereof of the present invention additionally coupled.
  • the culture medium composition and culture conditions may vary depending on the type of the cell, which can be appropriately selected and adjusted by a person skilled in the art.
  • the antibody molecule may be accumulated in the cytoplasm of cells, secreted from cells, or targeted to the periplasm or extracellular medium (supernatant) by an appropriate signal sequence, which is targeted to the periplasm or extracellular medium. It is desirable In addition, it is preferable to refold the produced antibody molecule using a method well known to those skilled in the art to have a functional conformation.
  • the recovery of the polypeptide may vary depending on the characteristics of the produced polypeptide and the characteristics of cells, which can be appropriately selected and adjusted by those skilled in the art.
  • the polypeptide may be produced intracellularly, in the periplasmic space, or secreted directly into the medium. If the polypeptide is produced intracellularly, the cell can be disrupted to release the protein as a first step. Particulate debris, host cells or lysed fragments are removed, for example by centrifugation or ultrafiltration. If the antibody is secreted into the medium, supernatants from such expression systems are generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. A protease inhibitor, such as PMSF, may be included in any preceding step to inhibit proteolysis, and antibiotics may be included to prevent the growth of adventitious contaminants. Antibodies prepared from cells can be purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and affinity chromatography, and the antibodies of the present invention are preferably purified through affinity chromatography. there is.
  • Antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention are very effective in inhibiting the activity of ASM, and can be used as a preventive or therapeutic agent for various neurodegenerative diseases that can be caused by ASM, including Alzheimer's disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases and depression, comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient.
  • the degenerative neurological diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, progressive supranuclear palsy, multiple system atrophy, olive-pontine-cerebellar atrophy (OPCA), Schey-Drager syndrome, striatal-substantia nigra degeneration, Huntington's disease, and amyotrophic At least one selected from the group consisting of lateral sclerosis (ALS), essential tremor, cortico-basal ganglia degeneration, diffuse Lewy body disease, Parkinson's-ALS-dementia complex, Niemanpick's disease, Pick's disease, cerebral ischemia and cerebral infarction It can be done, but is not limited thereto.
  • ALS lateral sclerosis
  • essential tremor cortico-basal ganglia degeneration
  • diffuse Lewy body disease Parkinson's-ALS-dementia complex
  • Niemanpick's disease Pick's disease
  • cerebral ischemia cerebral infarction It can be done, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include only the antibody or antigen-binding fragment thereof, or may be formulated in a suitable form together with a pharmaceutically acceptable carrier, and may further contain an excipient or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may further include, for example, a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • various drug delivery materials used for oral administration may be included.
  • the carrier for parenteral administration may include water, suitable oil, saline, aqueous glucose and glycol, and the like, and may further include a stabilizer and a preservative.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, and the like in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a talc, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, a kaolin, kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • composition of the present invention can be administered to mammals including humans by any method.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration can be used.
  • composition of the present invention may be formulated into a preparation for oral administration or parenteral administration according to the administration route as described above.
  • composition of the present invention may be formulated into powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. using a method known in the art.
  • preparations for oral use may be obtained by combining the active ingredient with a solid excipient, which is then milled and, after adding suitable auxiliaries, processed into a mixture of granules to obtain tablets or dragees.
  • excipients examples include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol, starches including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, cellulose, Celluloses including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose and hydroxypropylmethyl-cellulose, and the like, fillers such as gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like may be included. In addition, cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate may be added as a disintegrant, if desired. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifier, and a preservative.
  • sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol,
  • preparations for parenteral administration they may be formulated in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, moisturizers, gels, aerosols, and nasal inhalants by methods known in the art. These formulations are described in prescriptions generally known to all pharmaceutical chemists.
  • the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to the patient in a single dose or by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered over a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient according to the severity of the disease.
  • the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 ⁇ g to 10,000 mg, most preferably 0.1 ⁇ g to 500 mg per kg of patient body weight per day.
  • the dose of the pharmaceutical composition is determined by considering various factors such as the formulation method, administration route, and number of treatments as well as the patient's age, weight, health condition, sex, severity of disease, diet, and excretion rate. Therefore, considering this point, those skilled in the art will be able to determine an appropriate effective dosage of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, administration route and administration method as long as it exhibits the effects of the present invention.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention specifically binds to an ASM protein, it is useful, for example, in a diagnostic assay for detecting and quantifying the expression of an ASM protein in a specific cell, tissue, or serum.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof may generally be labeled with a detectable moiety.
  • Radioactivity can be measured, for example, by scintillation counting, and fluorescence can be quantified using a fluorometer.
  • various enzyme-substrate labels are available, examples of which include luciferases such as Drosophila luciferase and bacterial luciferase (U.S. Patent No.
  • luciferin 2,3-dihydrophobe Thalazindiones, malate dehydrogenase, urase, peroxidases such as horseradish peroxidase (HRPO), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharides oxidases (e.g. glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidases (e.g. euricase and xanthine oxidase), lactoperoxidase, microphores oxidase; and the like.
  • HRPO horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase alkaline phosphatase
  • ⁇ -galactosidase glucoamylase
  • lysozyme saccharides oxidases (e.g. glucose oxidase,
  • Labels can be conjugated indirectly to antibodies using a variety of known techniques.
  • an antibody can be conjugated to biotin and any label belonging to the three broad categories mentioned above can be conjugated to avidin or vice versa. Biotin binds selectively to avidin, so this label can be conjugated to the antibody in this indirect manner.
  • the antibody can be conjugated with a small hapten (eg, digoxin) and one of the different types of labels mentioned above is anti- conjugated to hapten antibodies (eg, anti-dixoxin antibodies).
  • hapten antibodies eg, anti-dixoxin antibodies
  • Antibodies or antigen-binding fragments thereof of the present invention can be used in any known assay method, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be used in a packaged combination of reagents in a predetermined amount together with a diagnostic kit, ie, a diagnostic kit for performing a diagnostic assay, ie, an instruction manual.
  • the kit may include a substrate and a cofactor required by the enzyme as a substrate precursor to provide a chromophore or fluorophore.
  • Other additives may also be included, such as stabilizers, buffers (eg, blocking buffers or lysis buffers), and the like.
  • the relative amounts of the various reagents can be varied widely to provide in-solution concentrations of the reagents that sufficiently optimize the sensitivity of the assay.
  • the reagents may be provided as a dry powder, usually lyophilized, containing excipients which upon dissolution will provide a reagent solution having an appropriate concentration.
  • ASM protein is increased in biological samples obtained from patients with neurodegenerative diseases compared to normal subjects. Therefore, the diagnosis of neurodegenerative diseases, the progress of the disease, and the prognosis before and after treatment can be evaluated through the analysis of the expression level of the ASM protein.
  • the present invention provides a composition for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the present invention provides a kit for diagnosing neurodegenerative diseases comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • the diagnostic kit of the present invention may include not only the antibody or antigen-binding fragment thereof, but also one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for the analysis method.
  • the kit may be a diagnostic kit characterized by including essential elements necessary for performing Western blot, immunofluorescence staining, ELISA, and the like. These kits may include antibodies specific for a control protein.
  • the kit may include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (as conjugated forms with antibodies) and their substrates or antibodies capable of binding. may contain other substances and the like.
  • the kit of the present invention may include a washing solution or an eluting solution capable of retaining only bound protein markers while removing substrates and unbound proteins to be color-reacted with the enzyme.
  • the present invention provides a use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for preparing a composition for treating neurodegenerative diseases.
  • the present invention provides a method for treating neurodegenerative diseases comprising administering an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • the present invention provides the use of the antibody or antigen-binding fragment thereof for preparing a composition for the treatment of depression.
  • the present invention provides a method for treating depression comprising administering an effective amount of a composition comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof as an active ingredient to a subject in need thereof.
  • ASM acid sphingomyelinase
  • the 'effective amount' of the present invention refers to an amount that exhibits an effect of improving, treating, detecting, diagnosing, or suppressing or reducing a neurodegenerative disease or depression when administered to a subject
  • the 'subject' refers to an animal, preferably may be mammals, especially animals including humans, and may be cells, tissues, organs, etc. derived from animals.
  • the subject may be a patient in need of the effect.
  • the 'treatment' of the present invention comprehensively refers to improving a neurodegenerative disease or depression or symptoms caused by the disease, which may include curing, substantially preventing, or improving the condition of the disease, , including, but not limited to, alleviating, curing or preventing one or most of the symptoms resulting from the disease.
  • the term “comprising” is used in the same meaning as “including” or “characterized by”, and in the composition or method according to the present invention, specifically mentioned It does not exclude additional components or method steps not specified. Also, the term “consisting of” means excluding additional elements, steps or components not separately described. The term “essentially consisting of” means that in the scope of a composition or method, in addition to the described materials or steps, materials or steps that do not substantially affect the basic characteristics thereof may be included.
  • the ASM antibody according to the present invention has very high sensitivity and specificity for ASM, so it can be usefully used for diagnosing neurodegenerative diseases through detection of ASM, and it is also very effective in inhibiting the activity of ASM, so that various diseases including Alzheimer's It can be very useful for the development of prevention or treatment for neurodegenerative diseases and depression.
  • FIG. 1a to 1c are an outline of an experiment (FIG. 1a) performed to investigate the effect of inhibition of ASM activity by injection of an anti-ASM antibody (ASM-ab: monoclonal ASM antibody 23A12C3) on Alzheimer's disease (FIG. 1a) and an Alzheimer's animal model
  • ASM activity Fig. 1b
  • ASM protein concentration Fig. 1c
  • WT wild type
  • AD Alzheimer's animal model (APP/ PS1 mouse)
  • WT wild type
  • AD Alzheimer's animal model (APP/PS1 mouse)
  • FIGS. 4a and 4b are results confirming that increased neuroinflammation in an Alzheimer's animal model is reduced by ASM-ab 23A12C3 injection (WT: wild type, AD: Alzheimer's animal model (APP/PS1 mouse)).
  • GFAP astrocytes
  • 5a to 5d are results showing the degree of recovery of learning and cognitive functions in an Alzheimer's animal model injected with PBS or ASM-ab 23A12C3 (WT: wild type, AD: Alzheimer's animal model (APP/PS1 mouse)).
  • Figure 5b is the result showing the time spent on the target platform on the 11th day of the test.
  • Figure 5c shows the number of entries into the target area of the target platform on day 11 of the test.
  • FIG. 6a and 6b show an outline of an experiment (FIG. 6a) performed to investigate the effect of inhibition of ASM activity by injection of an anti-ASM antibody (ASM-ab: monoclonal ASM antibody 23A12C3) on ALS disease (FIG. 6a) and ALS animal models
  • ASM-ab monoclonal ASM antibody 23A12C3
  • FIG. 7a to 7c are results showing the degree of recovery of motor function in an ALS animal model injected with PBS or ASM-ab 23A12C3 through a tail suspension test (FIG. 7a), a hanging wire test (FIG. 7b), and a Rotarod test (FIG. 7c).
  • FIG. 8a and 8b are an outline of an experiment (FIG. 8a) performed to investigate the effect of inhibition of ASM activity by injection of an anti-ASM antibody (ASM-ab: monoclonal ASM antibody 23A12C3) on depression and an animal model for inducing depression.
  • ASM-ab monoclonal ASM antibody 23A12C3
  • ASM antibody 23A12C3 capable of inhibiting ASM activity was produced through Koma biotech.
  • the sequences of the antibodies are shown in Tables 1 and 2 below.
  • mice were treated with ASM activity inhibition (ASM antibody).
  • ASM antibody 7-month-old APP/PS1 mice were injected with PBS or ASM antibody 23A12C3 at a dose of 50 mg/kg twice a week via intraperitoneal injection.
  • PBS or ASM antibody 23A12C3 One month after injection of PBS or ASM antibody 23A12C3, behavioral analysis was performed, and after behavioral analysis, brain tissues of mice were sampled (FIG. 1a).
  • the ALS animal model used the FUS R512C transgenic mouse line, which was transformed to express the FLAG-tagged human FUS-R521C cDNA using the Syrian hamster prion promoter (The FUS-R521C transgenic mice were generated using Syrian hamster prion promoter driving the expression of FLAG-tagged human FUS-R521C cDNA).
  • ASM activity inhibition ASM antibody 23A12C3
  • 7-week-old ALS mice were injected with PBS or ASM antibody 23A12C3 at a dose of 50 mg/kg twice a week via intraperitoneal injection. 4 weeks after injection of PBS or ASM antibody 23A12C3, behavioral analysis was performed, and serum of mice was sampled after behavioral analysis (FIG. 6a).
  • C57BL/6 mice (Charles River, UK) were induced with Repeated Social Defeat (RSD) stress for 10 days and used as depressed mice.
  • Repeated Social Defeat (RSD) stress was assessed by placing 2 male C57BL/6 mice aged 6-8 weeks with 1 male CD-1 mouse aged 6-8 weeks (aggressive intruder mouse) in the same cage for 2 hours daily for 10 days. put After 10 days, whether or not depression was induced in C57BL/6 mice was confirmed through a depression behavioral test.
  • ASM antibody 23A12C3 6-week-old male C57BL/6 mice were intraperitoneally injected twice a week with PBS or ASM antibody 23A12C3 at a dose of 50 mg/kg for 4 weeks before induction of depression. injected through. After 4 weeks and 10 days of Repeated Social Defeat (RSD) stress was induced, behavioral analysis was performed, and after behavioral analysis, serum of the mice was sampled (FIG. 8a).
  • RSD Social Defeat
  • the concentration level of ASM was determined as follows. Specifically, 3 ⁇ l of a microliter mouse serum sample was mixed with ASM activity buffer and stored at 37°C. After the hydrolysis reaction was terminated by adding 114 ⁇ l of ethanol, the mixture was centrifuged. After transferring 30 ⁇ l of the supernatant to a glass vial, 5 ⁇ l was applied to the UPLC system. The ASM concentration level was quantified by comparison with Bodipy (aminoacetaldehyde) combined with sphingomyelin and ceramide.
  • Extraction and quantification of the sphingomyelin and ceramide is performed by extracting lipids from a known method sample, resuspending the dried lipid extract in 25 ⁇ l of 0.2% Igepal CA-630 (Sigma-Aldrich), and Concentration levels of lipids were quantified using a UPLC system.
  • ASM ELSIA (Mybiosource, MBS724194) was used to measure ASM protein concentration in mouse serum.
  • thioflavin S Sigma-Aldrich
  • anti-GFAP rabbit, 1:500, DAKO
  • anti-Iba-1 rabbit, 1:500, WAKO
  • the area was analyzed using a laser scanning confocal microscope or an Olympus BX51 microscope equipped with Fluoview SV1000 imaging software (Olympus FV1000, Japan).
  • the percentage of the area of the stained area relative to the area of the total tissue was quantified and analyzed using Metamorph software (Molecular Devices).
  • Abeta40 Invitrogen, KHB3481
  • Abeta42 Invitrogen, KHB3441
  • MWM Mesorris water maze
  • mice were placed in a conditioning chamber on the first day, and sound stimulation (10 kHz, 70 dB) and electrical stimulation (0.3 mA, 1 s) were given.
  • sound stimulation 10 kHz, 70 dB
  • electrical stimulation 0.3 mA, 1 s
  • Tail suspension test In order to confirm the improvement of exercise capacity of ALS animal models, Tail suspension test, Hanging wire test, and Rotarod test were sequentially performed at intervals of one day. Open field test, Dark & Light test, Tail suspension test, and Force swim test were sequentially performed at intervals of one day to check whether depression was improved.
  • ASM-ab 23A12C3 a monoclonal anti-ASM antibody was applied to the Alzheimer's animal model twice a week using an Alzheimer's experimental animal model (AD: APP/PS1 mouse). It was administered intraperitoneally (FIG. 1A).
  • ASM-ab 23A12C3 injection In order to confirm whether inhibition of ASM activity by ASM-ab 23A12C3 injection has an effect on Alzheimer's lesions, the cerebral medulla and hippocampus of mice were first stained with Thioflavin S (ThioS) according to a known method to detect fibrillar amyloid- ⁇ deposition was confirmed. In addition, ELSIA of A ⁇ 40 and A ⁇ 42 was performed to confirm amyloid- ⁇ deposition.
  • Thioflavin S Thioflavin S
  • ASM-ab 23A12C3 To confirm the effect of inhibition of ASM activity by injection of ASM-ab 23A12C3 on changes in neuroinflammation in an Alzheimer's animal model, the present inventors observed changes in microglia and astrocytes in the brain. Compared to the PBS-injected Alzheimer's animal model, it was confirmed that the activities of microglia (Iba-1) and astrocytes (GFAP) were significantly reduced in the medulla and hippocampus of the Alzheimer's animal model administered with ASM-ab 23A12C3 (FIG. 4a). and 4b). Therefore, it was confirmed that inhibition of ASM activity by injection of ASM-ab 23A12C3 modulates the neuroinflammatory response in the brain environment of Alzheimer's disease.
  • Iba-1 microglia
  • GFAP astrocytes
  • MWM Meorris water maze
  • the PBS-injected Alzheimer's animal model showed severe impairments in spatial memory, cognition, and memory formation, but the Alzheimer's animal model injected with ASM-ab showed improvement in these disorders.
  • an anti-ASM antibody (ASM-ab 23A12C3) was intraperitoneally administered twice a week to an ALS animal model using an ALS patient experimental animal model (FUS R512C mouse). (Fig. 6a).
  • ASM activity was confirmed by extracting plasma from an ALS animal model injected with PBS or ASM-ab 23A12C3. As a result, it was confirmed that the level of ASM activity was remarkably low in the plasma of the ALS animal model injected with ASM-ab 23A12C3 (FIG. 6b).
  • Tail suspension test, Hanging wire test, and Rotarod test were performed to confirm the potential effect of ASM activity inhibition by ASM-ab 23A12C3 injection in ALS animal models on exercise capacity.
  • the ALS animal model injected with PBS showed severe motor function impairment, but the ALS animal model administered with ASM-ab 23A12C3 confirmed that such impairment was improved.
  • an ASM antibody (ASM-ab 23A12C3) was applied to depression-induced animal models twice a week using a depression experimental animal model (RSD stress-induced mouse; WT/RSD). Administered intraperitoneally (FIG. 8A).
  • ASM activity was inhibited.
  • plasma was extracted from an animal model injected with PBS or ASM-ab 23A12C3 to induce depression, and ASM activity was confirmed.
  • ASM activity was confirmed that the level of ASM activity was remarkably low in the plasma of depression-induced animal models injected with ASM-ab 23A12C3 (FIG. 8b).
  • Open field test, Dark & Light test, tail suspension test, and force swim test were performed to confirm whether the inhibition of ASM activity by injection of ASM-ab 23A12C3 in an animal model for depression induces depression improvement.
  • the monoclonal anti-ASM antibody according to the present invention can inhibit ASM activity, and in particular, inhibition of ASM activity by anti-ASM antibody injection in Alzheimer's animal models, ALS animal models, and depression-induced animal models It was found that it could reduce A ⁇ plaque deposition and inflammatory response in Alzheimer's animal models, improve learning and memory abilities, and improve motor skills and improve depression symptoms in ALS animal models and depression-induced animal models.
  • the ASM antibody according to the present invention has very high sensitivity and specificity for ASM, so it can be usefully used for diagnosing neurodegenerative diseases through detection of ASM, and it is also very effective in inhibiting the activity of ASM, so that various diseases including Alzheimer's Industrial applicability is very high as it can be used very usefully in the development of prevention or treatment for neurodegenerative diseases and depression.

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Abstract

본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ASM 단백질에 대한 결합 민감도 및 특이도가 매우 높고 ASM 활성을 저해하는 효과가 매우 우수한 항-ASM 단일클론항체 및 이의 퇴행성 신경질환 치료/진단 용도에 관한 것이다.

Description

ASM에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
본 출원은 2021년 12월 27일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2021-0187953호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 ASM 단백질에 대한 결합 민감도 및 특이도가 매우 높고 ASM 활성을 저해하는 효과가 매우 우수한 항-ASM 단일클론항체 및 이의 퇴행성 신경질환 치료/진단 용도에 관한 것이다.
스핑고지질 대사는 정상적인 세포 신호전달을 조절하며, 스핑고지질 대사의 비정상적 변화는 알츠하이머병을 포함한 다양한 신경퇴행성 질환에 영향을 미친다. 한편, 스핑고지질 대사를 조절하는 효소인 ASM(acid sphingomyelinase)은 거의 모든 종류의 세포에서 발현되는 단백질로서, 스핑고지질 대사 및 세포막 턴오버(turnover)에 중요한 역할을 한다.
알츠하이머를 포함한 퇴행성 신경질환 환자의 뇌에서는 ASM의 발현이 정상인에 비해 현저히 증가되어 있으며, 과발현된 ASM의 발현을 저해하거나 ASM의 활성을 저해하면 아밀로이드-β(Aβ)의 축적이 억제되고 학습 및 기억력이 개선되어 퇴행성 신경질환의 치료효과가 나타날 수 있음이 보고된 바 있다(한국 등록특허 10-1521117). 또한 최근 우울증과 같은 신경 질환에서 ASM의 활성이 증가되어 있으며 이러한 ASM의 억제는 우울증 완화 효과를 보인다는 보고가 있다(Nature medicine. 2013 Jul 19(7):934-938, PLoS One. 2016 Sep 6;11(9):e0162498). 따라서 ASM 억제제, 즉 ASM의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발은, 신경퇴행성 질환 및 우울증을 포함하여 ASM의 증가로 인해 야기되는 다양한 질환들의 유용한 치료방법으로서 유망하다.
한편, 현재까지 직접적인 ASM 억제제는 개발되지 않았으나 간접적으로 ASM을 억제할 수 있는 몇 가지 억제제가 동정되었다. 먼저 ASM 간접적 억제제로 가장 널리 사용되는 tricyclic antidepressants (e.g. amitriptyline (AMI), desipramine, imipramine 등)는 항우울제 약물로 실제 임상에 사용되고 있다. 최초에 ASM 억제제로 개발된 것은 아니나 다양한 연구결과들에 의해 본 약물들이 ASM 억제 효과를 나타낸다는 것이 증명되었다. Tricyclic antidepressants의 주된 약리작용 (mode of action)은 신경세포에서 신경전달물질의 재흡수 억제를 통한 신경전달물질의 활성 증가이며, 부수적인 작용으로 ASM 억제 효과를 나타낸다. 그러나 tricyclic antidepressants의 경우 신경계 및 신경세포에 작용하여 몽롱함, 빛 감수성 증가, 구토 등의 부작용을 유발할 수 있으므로 ASM 활성을 직접적으로 억제할 수 있는 새로운 물질의 개발이 필요하다.
본 발명자는 ASM에 대한 특이도 및 민감도가 매우 뛰어나 알츠하이머 등 퇴행성 신경질환 환자에게서 발현이 증가하는 ASM 단백질을 검출함으로써 퇴행성 신경질환을 진단할 수 있을 뿐 아니라, ASM의 활성을 직접적으로 억제하여 퇴행성 신경질환을 치료할 수 있는 신규 항체를 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명에서 제공하는 아미노산 서열의 항체가 이와 같은 활성이 매우 우수한 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환/우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어지는 퇴행성 신경질환/우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 필수적으로 이루어지는 퇴행성 신경질환/우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어지는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 필수적으로 이루어지는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 퇴행성 신경질환 치료용 조성물을 제고하기 위한 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 우울증 치료용 조성물을 제조하기 위한 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 우울증 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 a) 개체로부터 시료를 수득하여 ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체를 결합시키는 단계; 및
b) 상기 측정된 ASM 활성을 기준으로 퇴행성 신경질환을 진단하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단 방법을 제공하는 것이다.
전술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환/우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어지는 퇴행성 신경질환/우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 필수적으로 이루어지는 퇴행성 신경질환/우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어지는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 필수적으로 이루어지는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 퇴행성 신경질환 치료용 조성물을 제고하기 위한 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 우울증 치료용 조성물을 제조하기 위한 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 우울증 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 개체로부터 시료를 수득하여 ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체를 결합시키는 단계; 및
b) 상기 측정된 ASM 활성을 기준으로 퇴행성 신경질환을 진단하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp):아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라긴; O(Ply)피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르기닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 트레오닌; U(Sec):셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 티로신.
본 발명에서 "발현(expression)"이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산의 생성을 의미한다.
본 발명에서 "숙주세포(host cell)"라 함은 임의의 수단(예: 전기충격법, 칼슘 포스파타제 침전법, 미세주입법, 형질전환법, 바이러스 감염 등)에 의해 세포 내로 도입된 이종성 DNA를 포함하는 원핵 또는 진핵 세포를 말한다.
본 발명에서 "단백질" 은 "폴리펩티드(polypeptide)"와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 "핵산", "DNA 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드" 는 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일특이성을 갖게 된다.
항체가 항원에 결합하는 부위를 포함하는 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원 특이성에 가장 중요하다.
본 발명의 단일클론 항체는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 에피토프에 매우 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 '단일클론' 또는 '모노클로날'이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 항체의 특성을 나타내는 말이며, 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 단일 항체는 문헌(Kohler et al.(1975) Nature 256: 495)에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌(참조: Clackson et al.(1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al.(1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 및 Presta(2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731)에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 항체는 구체적으로 키메라 항체를 포함하며, 이 경우 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 보이지만, 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학적 활성(예를 들어 ASM 단백질과의 선택적 결합)을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다(미국 특허 제4,816,567호).
인간화된 항체는 인간 및 비-인간(예: 쥐, 랫트) 항체의 서열을 모두 포함하는 항체로 일반적으로, 항원결정부와 결합하는 부위(CDR)를 제외한 나머지 부분은 인간 항체의 것이며, 항원결정부와 결합하는 부위(CDR)는 비-인간 유래의 서열을 포함할 수 있다. 완전한 인간항체는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말하며, 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마에서 생산하거나, 파지 디스플레이 방법으로 생산할 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 ASM 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 상기 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 면역원성 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, 상기 면역원성 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 상기 면역원성 펩타이드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다.
또한, 본 발명이 제공하는 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 파지 디스플레이 기술을 사용하여 비면역화 공여자로부터의 면역글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체와 항체 단편을 생성할 수 있다. 이러한 기술에 따라서, 항체 가변 영역 유전자를 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd의 메이져 또는 마이너 외피 단백질 내로 프레임내 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에 기능성 항체 단편을 디스플레이 한다. 필라멘트상 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 복사물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 근거로 한 선택으로 인해, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 선별된다. 따라서, 상기 파지는 B-세포의 몇몇 특성을 모사한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있다. 가변 영역-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 가변 영역 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 가변 영역 유전자의 레퍼토리를 작제할 수 있고, 당업계에 공지된 기술을 필수적으로 수행하여 다양한 배열의 항원 (자가 항원 포함)에 대한 항체를 단리할 수 있다 [미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조].
본 발명에서 경쇄 또는 중쇄가변영역이 특정 아미노산 서열을 포함한다는 것은, 해당 아미노산 서열 전체를 포함하는 경우, 해당 아미노산 서열 전체를 갖는 경우, 또는 해당 아미노산 서열로 이루어진 경우를 모두 의미한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(VL)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 항체는 ASM 단백질을 특이적으로 인식하는 한 그 종류가 구체적으로 제한되지 않으며, 구체적 일례로 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 항체의 항원 결합 단편은 ASM 단백질에 대한 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 단백질 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 디아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv 등의 형태일 수 있다.
Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다. 이와 같은 아미노산 치환에 대해서는 전술한 바를 참고할 수 있다.
또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 '폴리뉴클레오티드'는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(doublestranded)이 될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 ASM 단백질의 잔기에 특이적인 CDR구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 아래 표 1 및/또는 표 2에 기재된 염기 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 '벡터(vector)'는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.
벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들 (adenoassociated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterialvectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명에서 상기 '벡터'는 '발현벡터(expression vector)'와 동일한 의미로 이해될 수 있으며, 이는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이(E.coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피.애루기노사(P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현가능 한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이일 수 있다.
본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K.lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K.wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K.drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K.marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia(EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 사용가능하다.
상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있다
또한, 본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.
본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham's) F1O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코(Dulbecco's) 개질 이글(Eagle's) 배지(DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 WRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 상기 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다.
이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다. 상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지 조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASM의 활성을 억제하는 효과가 매우 뛰어나 알츠하이머를 포함하여 ASM에 의해 유발될 수 있는 다양한 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료제로 활용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 및 우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽병, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편만을 포함하거나, 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있으며, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 아울러, 경구투여용으로 사용되는 다양한 약물전달물질을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈,메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01㎍ 내지 10,000mg, 가장 바람직하게는 0.1㎍ 내지 500mg일 수 있다. 그러나 상기 약학적 조성물의 용량은 제제화 방법, 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 조성물의 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ASM 단백질에 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 ASM 단백질의 발현을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다.
이를 위해 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 일반적으로 검출가능한 모이어티로 표지될 수 있다.
예를 들어, 당업계에 공지된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다. 또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 당업계에 공지되어 있다.
표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침강 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 진단 키트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 키트, 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
한편, 전술한 바와 같이 퇴행성 신경질환 환자로부터 수득된 생물학적 시료에서는 정상인과 비교하여 ASM 단백질의 발현 수준이 증가되어 있음이 보고된 바 있다. 따라서, ASM 단백질의 발현 정도의 분석을 통해 퇴행성 신경 질환의 진단, 병의 진행 상태 및 치료 전후의 예후를 평가할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트에는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역형광염색, ELISA 등을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 이들 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
본 발명은 퇴행성 신경질환 치료용 조성물을 제고하기 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 우울증 치료용 조성물을 제조하기 위한 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 상기의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 우울증 치료 방법을 제공한다.
본 발명은
a) 개체로부터 시료를 수득하여 ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체를 결합시키는 단계; 및
b) 상기 측정된 ASM 활성을 기준으로 퇴행성 신경질환을 진단하는 단계;를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 '유효량'이란 개체에게 투여하였을 때, 퇴행성 신경질환 또는 우울증의 개선, 치료, 검출, 진단 또는 상기 질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 '치료'는 퇴행성 신경질환 또는 우울증 또는 상기 질환으로 인한 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "을 포함하는(comprising)"이란 "함유하는(including)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 있어서, 구체적으로 언급되지 않은 추가적인 구성 성분 또는 방법의 단계 등을 배제하지 않는다. 또한 용어 "로 이루어지는(consisting of)"이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)"이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 물질 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계 등을 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 ASM 항체는 ASM에 대한 민감도 및 특이도가 매우 높아 ASM의 검출을 통한 퇴행성 신경질환 진단에 유용하게 활용될 수 있을 뿐 아니라, ASM의 활성을 억제하는 효과도 매우 뛰어나 알츠하이머를 포함한 다양한 퇴행성 신경질환 및 우울증 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a 내지 1c는 항-ASM 항체(ASM-ab: monoclonal ASM antibody 23A12C3)의 주입에 의한 ASM 활성 억제가 알츠하이머병에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행한 실험의 개요 (도 1a)와 알츠하이머 동물 모델에 PBS 또는 ASM-ab 주입 후 마우스의 혈청에서 ASM 활성도 (도 1b)와 ASM 단백질 농도 (도 1c) 변화를 나타낸 도이다 (n=5/그룹) (WT: 야생형, AD: 알츠하이머 동물모델(APP/PS1 마우스)).
도 2a 및 2b는 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3를 주입받은 알츠하이머 동물 모델의 뇌 수질(도 2a) 및 해마(도 2b)에서 티오플라빈 S (ThioS, 원섬유성 아밀로이드 베타 플라그)의 면역형광염색 및 원섬유성 아밀로이드 베타 플라그가 차지하고 있는 면적을 정량화한 결과이다 (n=4/그룹)(WT: 야생형, AD: 알츠하이머 동물모델(APP/PS1 마우스)).
도 3a 및 3b는 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3를 주입받은 알츠하이머 동물 모델의 뇌 수질 (도 3a) 및 해마 (도 3b)에서 Aβ40 혹은 Aβ42의 축적을 ELISA로 측정하여 나타낸 결과이다 (n=3/그룹)(WT: 야생형, AD: 알츠하이머 동물모델(APP/PS1 마우스)).
도 4a 및 4b는 알츠하이머 동물 모델에서 증가된 신경염증이 ASM-ab 23A12C3주입에 의해 감소됨을 확인한 결과이다 (WT: 야생형, AD: 알츠하이머 동물모델(APP/PS1 마우스)).
도 4a는 야생형 마우스, PBS 또는 ASM-ab 23A12C3를 주입한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 수질 및 해마에서 미세아교세포(Iba-1)의 퍼센트를 정량화환 결과이다 (n=3/그룹).
도 4b는 야생형 마우스, PBS 또는 ASM-ab 23A12C3를 주입한 알츠하이머 동물 모델의 뇌 수질 및 해마에서 별아교세포(GFAP)의 퍼센트를 정량화환 결과이다 (n=3/그룹).
도 5a 내지 5d는 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3를 주입받은 알츠하이머 동물 모델에서 학습 및 인지기능의 회복 정도를 나타내는 결과이다(WT: 야생형, AD: 알츠하이머 동물모델(APP/PS1 마우스)).
도 5a는 야생형 마우스 (n=7), PBS를 주입한 알츠하이머 동물 모델 (n=7), ASM-ab 23A12C3를 주입한 알츠하이머 동물 모델 (n=7)에서 모리스 워터메이즈 테스트를 통한 학습 및 기억력을 평가한 결과이다.
도 5b는 시험 11일째에 표적 플랫폼에서 머무른 시간을 나타낸 결과이다.
도 5c는 시험 11일째에 표적 플랫폼의 타겟 지역 내로 들어간 횟수를 나타낸다.
도 5d는 야생형 마우스 (n=7), PBS를 주입한 알츠하이머 동물 모델 (n=7), ASM-ab 23A12C3를 주입한 알츠하이머 동물 모델 (n=7)에서 Fear conditioning 테스트를 통해 공간 및 소리에 대한 기억력을 평가한 결과이다.
도 6a 및 6b는 항-ASM 항체(ASM-ab: monoclonal ASM antibody 23A12C3)의 주입에 의한 ASM 활성 억제가 ALS 질환에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행한 실험의 개요 (도 6a)와 ALS 동물 모델에 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3 주입 후 마우스의 혈청 (도 6b)에서 ASM 활성도 변화를 나타낸 도이다 (n=4/그룹) (WT: 야생형, FUS R521C: ALS 마우스 모델).
도 7a 내지 7c는 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3를 주입받은 ALS 동물 모델에서 운동기능의 회복 정도를 Tail suspension test(도 7a), Hanging wire test(도 7b) 및 Rotarod test(도 7c)를 통해 나타내는 결과이다 (n=4~6/그룹) (WT: 야생형, FUS R521C: ALS 마우스 모델).
도 8a 및 8b는 항-ASM 항체(ASM-ab: monoclonal ASM antibody 23A12C3)의 주입에 의한 ASM 활성 억제가 우울증에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행한 실험의 개요 (도 8a)와 우울증 유도 동물 모델에 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3 주입 후 마우스의 혈청(도 8b)에서 ASM 활성도 변화를 나타낸 도이다 (n=4/그룹) (WT: 야생형, WT/RSD: 우울증 유도 마우스 모델).
도 9a 내지 9d는 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3 주입받은 우울증 동물 모델에서 우울증 행동 패턴의 회복 정도를 Open field test(도 9a), Dark & Light test(도 8b), Tail suspension test(도 9c) 및 Force swim test(도 9d)를 통해 나타내는 결과이다 (n=4/그룹) (WT: 야생형, WT/RSD: 우울증 유도 마우스 모델).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험방법
1. ASM antibody 제작
알츠하이머, 루게릭, 우울증 동물 모델에서 ASM 활성 억제에 의한 치료 효과를 검증하기 위해 ASM 활성을 억제시킬 수 있는 monoclonal ASM antibody 23A12C3을 Koma biotech을 통해 제작하였다. 항체의 서열을 아래 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2022021379-appb-img-000001
Figure PCTKR2022021379-appb-img-000002
Figure PCTKR2022021379-appb-img-000003
Figure PCTKR2022021379-appb-img-000004
2. 마우스
IACUC(Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 마우스 실험에 대한 승인을 받았다. C57BL/6 마우스(Charles River, UK)를 바탕으로 APPswe(hAPP695swe) 또는 PS1(presenilin-1M146V)를 과발현시킨 형질전환 마우스 라인을 이용하였다[이하, APP 마우스: APPswe를 과발현하는 마우스, PS1 마우스: presenilin-1M146V를 과발현하는 마우스; GlaxoSmithKline]. ASM 활성 억제 (ASM antibody)의 치료효과를 확인하기 위해 7개월령의 APP/PS1 마우스에 PBS 또는 ASM antibody 23A12C3를 50mg/kg 용량으로 매주 2회씩 복강 주사를 통하여 주입하였다. PBS 또는 ASM antibody 23A12C3 주입 1개월 후, 행동학적 분석을 실시하였고, 행동학적 분석 후에 마우스의 뇌조직을 샘플하였다 (도 1a).
ALS 동물 모델은 Syrian hamster prion 프로모터를 사용하여 FLAG-tagged human FUS-R521C cDNA를 발현하도록 형질 전환시킨 FUS R512C 형질전환 마우스라인을 사용하였다 (The FUS-R521C transgenic mice were generated using Syrian hamster prion promoter driving the expression of FLAG-tagged human FUS-R521C cDNA). ASM 활성 억제 (ASM antibody 23A12C3)의 치료효과를 ALS 동물모델에서 확인하기 위해 7주령의 ALS 마우스에 PBS 또는 ASM antibody 23A12C3를 50mg/kg 용량으로 매주 2회씩 복강 주사를 통하여 주입하였다. PBS 또는 ASM antibody 23A12C3 주입 4주 후, 행동학적 분석을 실시하였고, 행동학적 분석 후에 마우스의 혈청을 샘플하였다 (도 6a).
우울증 유도 동물모델을 위해 C57BL/6 마우스(Charles River, UK)에 10일간 Repeated Social Defeat(RSD) stress를 유도하여 우울증 마우스로 사용하였다. Repeated Social Defeat(RSD) stress는 6-8주령의 2마리의 수컷 C57BL/6 마우스를 6-8주령의 1마리 수컷 CD-1 마우스(aggressive intruder mouse)와 함께 매일 2시간, 10동안 동일 케이지에 두었다. 10일 뒤 C57BL/6 마우스의 우울증 유도 여부는 우울증 행동테스트를 통해 확인하였다. 우울증 동물모델에서 ASM 활성 억제 (ASM antibody 23A12C3)의 치료효과를 확인하기 위해, 6주령의 수컷 C57BL/6 마우스 우울증 유도 전 4주 간 PBS 또는 ASM antibody 23A12C3를 50mg/kg 용량으로 매주 2회씩 복강 주사를 통하여 주입하였다. 4주 후 10일간의 Repeated Social Defeat(RSD) stress를 유도한 뒤 행동학적 분석을 실시하였고, 행동학적 분석 후에 마우스의 혈청을 샘플하였다 (도 8a).
3. ASM 활성 측정
ASM의 농도 수준을 아래와 같이 측정하였다. 구체적으로 마이크로리터의 마우스의 혈청 시료 3㎕를 ASM 활성 완충액과 혼합하여 37℃에서 보관하였다. 114㎕의 에탄올을 가하여 가수분해 반응을 종료시킨 후, 원심분리하였다. 30㎕의 상층액을 유리 바이알에 옮긴 후, 5㎕를 UPLC 시스템에 적용시켰다. 상기 ASM 농도 수준을 스핑고미엘린 및 세라마이드와 결합된 Bodipy(aminoacetaldehyde)와 비교함으로써 정량화하였다. 상기 스핑고미엘린 및 세라미이드의 추출 및 정량화는 공지된 방법 시료에서 지질을 추출하고, 상기 건조된 지질 추출물을 25㎕의 0.2% Igepal CA-630(Sigma-Aldrich)에 재부유시키고, 각각의 지질의 농도 수준을 UPLC 시스템을 이용하여 정량화하였다.
4. ASM 단백질 농도 측정
마우스 혈청 내 ASM 단백질 농도를 측정하기 위해 ASM ELSIA (Mybiosource, MBS724194)가 사용되었다.
5. 면역형광법
마우스의 대뇌 및 해마를 고정 후, 0.5% thioflavin S (Sigma-Aldrich), 항-GFAP(토끼, 1:500, DAKO), 항-Iba-1 (토끼, 1:500, WAKO)을 함께 배양하였다. 상기 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어(Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화하고 분석하였다.
6. 웨스턴블롯
웨스턴 블롯팅을 이용하여 아래 유전자들의 발현을 분석하였다. 우선, LC3, p62[모두, cell signaling Technologies에서 구입], Lamp1(abcam), TFEB(Invitrogen) 및 β-액틴(Santa Cruz)에 대한 항체를 이용하였고, 밀도 정량화(densitometric quantification)는 ImageJ 소프트웨어(US National Institutes of Health)를 이용하여 수행하였다.
7. Abeta40, Abeta42 ELISA
마우스 대뇌 및 해마로부터 단백질을 추출한 후 ELISA를 이용하여 Abeta40 (Invitrogen, KHB3481), Abeta42 (Invitrogen, KHB3441) 양을 측정하였다.
8. 행동실험
학습 및 기억에 대한 잠재적 효과를 확인하기 위하여, MWM(Morris water maze)실험을 수행하였다. MWM는 마우스에 대하여 10일 동안 하루에 4 번씩 과제를 학습시켰고, 11일째 되는 날에 플랫폼을 제거하고, 탐침시험(probe trial)을 수행하였다.
Fear conditioning은 첫째 날은 마우스를 conditioning chamber에 넣고, 소리 자극(10 kHz, 70 dB) 및 전기자극(0.3 mA, 1s)을 주었다. 둘째 날은 첫째 날과 같은 conditioning chamber에서 자극 없이 공간에 대한 기억력을 확인했고, 셋째 날은 다른 conditioning chamber에서 소리 자극만 주었을 때 두려움에 대한 기억력 테스트를 수행하였다.
ALS 동물 모델의 운동 능력 개선을 확인하기 위하여, Tail suspension test, Hanging wire test 및 Rotarod test 실험을 하루 간격으로 순차적으로 수행하였다. 우울증 개선 여부를 확인하기 위해서는 Open field test, Dark & Light test, Tail suspension test 및 Force swim test실험을 하루 간격으로 순차적으로 수행하였다.
9. 통계학적 분석
두 그룹의 비교를 위하여 학생의 T-test를 수행하는 반면, 다수의 그룹의 비교를 위해서는 SAS 통계학적 패키지 (release 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC)에 따라서 Tukey's HSD 테스트 및 분산 테스트의 반복측정분석을 수행하였다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001를 유의적인 것으로 간주하였다.
실험결과
1. ASM antibody를 투여한 알츠하이머 동물 모델에서 ASM 활성 변화 확인
ASM 활성 억제에 의한 알츠하이머 병변 완화 효과를 in vivo 상에서 검증하기 위해 알츠하이머 실험동물 모델 (AD: APP/PS1 마우스)을 이용하여 monoclonal anti-ASM antibody(ASM-ab 23A12C3)를 알츠하이머 동물 모델에 매주 2회씩 복강 투여하였다 (도 1a).
첫 번째로 ASM 활성 억제 여부를 확인하기 위해 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3 주입한 알츠하이머 동물 모델의 혈장을 추출하여 ASM 활성도를 확인하였다. 그 결과, ASM-ab 23A12C3 주입한 알츠하이머 동물 모델의 혈장 (도 1b)에서 ASM 농도의 수준이 현저히 낮음을 확인하였다. 반면, 혈장 내 ASM 단백질 농도는 그룹간 차이가 없었다 (도 1c). 즉, ASM-ab 23A12C3 투여는 알츠하이머 동물 모델의 혈장 내 ASM 단백질 농도에는 영향을 주지 않으면서 활성도만 억제시켜줄 수 있음을 알 수 있었다.
2. ASM antibody를 투여한 알츠하이머 동물 모델에서 아밀로이드-β 침착 확인
ASM-ab 23A12C3 주입에 의한 ASM 활성 억제가 알츠하이머 병변에 효과를 나타내는지 확인하기 위해 먼저 마우스의 대뇌 수질 및 해마 부위를 공지된 방법에 따라 티오플라빈 S(ThioS)로 염색하여 원섬유성 아밀로이드-β 침착을 확인하였다. 또한, Aβ40 및 Aβ42의 ELSIA를 실시하여 아밀로이드-β 침착을 확인하였다.
실험결과, PBS 주입한 알츠하이머 동물 모델과 비교하여 ASM-ab 23A12C3를 주입한 알츠하이머 동물 모델의 수질 및 해마 부위에서 원섬유성 Aβ 침착 (도 2a 및 2b) 및 Aβ40과 Aβ42 (도 3a 및 3b)의 침착이 현저히 낮은 것을 확인하였다.
3. 항-ASM 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델에서 신경염증 변화 확인
알츠하이머 동물 모델에서 ASM-ab 23A12C3 주입에 의한 ASM 활성 억제가 신경염증 변화에 미치는 영향을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 뇌에서 미세아교세포 및 별아교세포의 변화를 관찰하였다. PBS를 주입한 알츠하이머 동물 모델과 비교해, ASM-ab 23A12C3 투여한 알츠하이머 동물 모델의 대뇌 수질과 해마에서 미세아교세포 (Iba-1) 및 별아교세포 (GFAP)의 활성이 현저히 저하됨을 확인하였다 (도 4a 및 4b). 따라서, ASM-ab 23A12C3 주입에 의한 ASM 활성 억제는 알츠하이머 뇌환경에서 신경 염증 반응을 조절한다는 것을 확인할 수 있었다.
4. 항-ASM 항체를 투여한 알츠하이머 동물 모델에서 기억력 호전 확인
알츠하이머 동물 모델에서 ASM-ab 23A12C3 주입에 의한 ASM 활성억제가 기억력에 대한 잠재적 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, MWM (Morris water maze) 테스트와 fear conditioning 테스트를 수행하였다.
도 5a 내지 5d에 나타낸 바와 같이, PBS를 주입한 알츠하이머 동물 모델은 공간기억, 인지력 및 기억력 형성에 심각한 장애를 보였으나, ASM-ab를 투여한 주입한 알츠하이머 동물 모델은 이러한 장애가 개선됨을 확인하였다.
5. 항-ASM 항체를 투여한 ALS 동물 모델에서 ASM 활성 변화 확인
ASM 활성 억제에 의한 ALS 병변 완화 효과를 in vivo 상에서 검증하기 위해 ALS 환자의 실험동물 모델 (FUS R512C 마우스)을 이용하여 anti-ASM antibody(ASM-ab 23A12C3)를 ALS 동물 모델에 매주 2회씩 복강 투여하였다 (도 6a).
첫 번째로 ASM 활성 억제 여부를 확인하기 위해 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3 주입한 ALS 동물 모델의 혈장을 추출하여 ASM 활성도를 확인하였다. 그 결과, ASM-ab 23A12C3 주입한 ALS 동물 모델의 혈장에서 ASM 활성도의 수준이 현저히 낮음을 확인하였다 (도 6b).
6. 항-ASM 항체를 투여한 ALS 동물 모델에서 운동능력 호전 확인
ALS 동물 모델에서 ASM-ab 23A12C3 주입에 의한 ASM 활성 억제가 운동능력에 대한 잠재적 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, Tail suspension test, Hanging wire test 및 Rotarod test를 수행하였다.
도 7a 내지 7c에 나타낸 바와 같이, PBS를 주입한 ALS 동물 모델은 운동 기능에 심각한 장애를 보였으나, ASM-ab 23A12C3를 투여한 ALS 동물 모델은 이러한 장애가 개선됨을 확인하였다.
7. 항-ASM 항체를 투여한 우울증 유도 동물 모델에서 ASM 활성 변화 확인
ASM 활성 억제에 의한 우울증 병변 완화 효과를 in vivo 상에서 검증하기 위해 우울증 실험동물 모델 (RSD 스트레스 유도 마우스; WT/RSD)을 이용하여 ASM antibody(ASM-ab 23A12C3)를 우울증 유도 동물 모델에 매주 2회씩 복강 투여하였다 (도 8a).
ASM 활성 억제 여부를 확인하기 위해 PBS 또는 ASM-ab 23A12C3 주입한 우울증 유도 동물 모델의 혈장을 추출하여 ASM 활성도를 확인하였다. 그 결과, ASM-ab 23A12C3 주입한 우울증 유도 동물 모델의 혈장에서 ASM 활성도의 수준이 현저히 낮음을 확인하였다 (도 8b).
8. 항-ASM 항체를 투여한 우울증 유도 동물 모델에서 우울증 개선 확인
우울증 유도 동물 모델에서 ASM-ab 23A12C3 주입에 의한 ASM 활성 억제가 우울증 개선에 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, Open field test, Dark & Light test, Tail suspension test 및 Force swim test를 수행하였다.
도 9a 내지 9d에 나타낸 바와 같이, PBS를 주입한 우울증 유도 동물 모델은 심각한 우울증 증세를 보였으나, ASM-ab 23A12C3를 투여한 우울증 동물 모델은 이러한 우울증 증세가 현저히 개선됨을 확인하였다.
상기의 결과들을 종합하면, 본 발명에 따른 monoclonal 항-ASM 항체는 ASM 활성도를 억제시킬 수 있으며 특히 알츠하이머 동물 모델, ALS 동물 모델 및 우울증 유도 동물 모델에서 항-ASM 항체 주입에 의한 ASM의 활성 억제는 알츠하이머 동물모델의 Aβ 플라크 침착과 염증반응을 감소시키고, 학습 및 기억능력을 향상시킬 수 있으며, 또한 ALS 동물 모델과 우울증 유도 동물 모델에서 운동능력 개선 및 우울증 증세를 호전시킬 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명에 따른 ASM 항체는 ASM에 대한 민감도 및 특이도가 매우 높아 ASM의 검출을 통한 퇴행성 신경질환 진단에 유용하게 활용될 수 있을 뿐 아니라, ASM의 활성을 억제하는 효과도 매우 뛰어나 알츠하이머를 포함한 다양한 퇴행성 신경질환 및 우울증 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위(CDR)1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄가변영역을 포함하는, ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(VH) 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체의 항원 결합 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  7. 제6항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽병, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 우울증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물.
  12. 퇴행성 신경질환 치료용 조성물을 제고하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료 방법.
  14. 우울증 치료용 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 용도.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 우울증 치료 방법.
  16. a) 개체로부터 시료를 수득하여 ASM(acid sphingomyelinase)에 특이적으로 결합하는 항체를 결합시키는 단계; 및
    b) 상기 측정된 ASM 활성을 기준으로 퇴행성 신경질환을 진단하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단 방법.
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