WO2021010799A1 - Wrs 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

Wrs 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 Download PDF

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손성화
김윤선
박지은
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강수진
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Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to WRS (tryptophanyl-tRNA synthetase) protein and its use, and more specifically, specific to a polypeptide of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in a tryptophanyl-tRNA synthetase (WRS) protein. It relates to an antibody or fragment of an antibody that binds to, a polynucleotide encoding the antibody, a vector comprising the same, a cell transformed using the same, and a use thereof.
  • WRS tryptophanyl-tRNA synthetase
  • Aminoacyl-tRNA synthetase is an enzyme that attaches specific amino acids to the corresponding tRNA.
  • ARS is an enzyme that attaches specific amino acids to the corresponding tRNA.
  • AIMP1(p43), (AIMP2)p38, and (AIMP3)p18 which are involved in the formation of the multisynthetase complex, and participates in the multisynthetase complex.
  • some are also present in free form.
  • WRS tryptophanyl-tRNA synthetase
  • WRS was the first to be reported among ARSs that are secreted out of cells and exhibit cytokine activity, and until recently, many papers have been published on the potential of WRS as an important biomarker in various cancers including colon cancer (Ghanipour, A et al The prognostic significance of tryptophanyl -tRNA synthetase in clorectal cancer (2009) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18(11), 2949-2955).
  • WRS levels increase rapidly from the beginning of infection when an infectious disease occurs due to infection with bacteria, viruses, or fungi, and in particular, when accompanied by an infectious inflammatory disease, the level of WRS increases significantly compared to normal people.
  • WRS can exist in the serum of patients with cancer and infectious diseases, and that WRS can be used as an important diagnostic biomarker for these diseases.
  • ARSs have many similarities in protein structure, so antibodies obtained by immune responses from animals show cross-reactions that bind to other ARSs, and highly sensitive antibodies are not produced at all. many.
  • the inventors of the present invention have conducted extensive research in order to develop an antibody that specifically binds to WRS, and as a result, a specific CDR (complementarity determining site) sequence is formed while specifically binding to a polypeptide containing a specific amino acid sequence in the WRS protein.
  • the antibodies having a very high binding specificity (specificity) and binding affinity (affinity) to WRS was found that the utility was very high, and the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide an antibody or antibody fragment that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in a tryptophanyl-tRNA synthetase (WRS) protein.
  • RFS tryptophanyl-tRNA synthetase
  • Another object of the present invention is to provide a polynucleotide encoding the antibody or antibody fragment, a vector comprising the same, and a cell transformed with the vector.
  • Another object of the present invention is the step of culturing the cell under conditions in which the polynucleotide is expressed to produce a polypeptide including a light chain and a heavy chain variable region, and recovering the polypeptide from the cell or a culture medium in which it is cultured. It is to provide a method for producing an antibody or antibody fragment that binds to human WRS, including.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cancer or infectious diseases or infectious complications comprising an antibody or antibody fragment.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cancer or infectious diseases or complications of infection, comprising an antibody or fragment of an antibody.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cancer or infectious diseases or complications of infection, which consists essentially of an antibody or fragment of an antibody.
  • Another object of the present invention is to provide the use of an antibody or fragment of an antibody for preparing a cancer diagnostic agent.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • step b) If the protein expression level measured in step b) is increased, it is to provide a method for diagnosing cancer comprising determining that it is cancer.
  • Another object of the present invention is to provide the use of an antibody or antibody fragment for preparing a preparation for diagnosing infectious diseases or complications of infection.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • step b) To provide a method for diagnosing an infectious disease or an infectious complication comprising determining that it is an infectious disease or an infectious complication when the protein expression level measured in step b) is increased.
  • the present invention provides an antibody or antibody fragment that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in a tryptophanyl-tRNA synthetase (WRS) protein.
  • WFS tryptophanyl-tRNA synthetase
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the antibody or antibody fragment, a vector comprising the same, and a cell transformed with the vector.
  • the present invention provides a step of culturing the cells under conditions in which polynucleotides are expressed to produce a polypeptide comprising a light chain and a heavy chain variable region, and from the cells or a culture medium in which the cells are cultured. It provides a method for producing an antibody or antibody fragment that binds to human WRS, comprising the step of recovering the polypeptide.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer or infectious diseases or complications of infection, including antibodies or fragments of antibodies.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer or infectious diseases or complications of infection comprising an antibody or antibody fragment.
  • the present invention provides a composition for diagnosing cancer or infectious diseases or complications of infection consisting essentially of an antibody or fragment of an antibody.
  • the present invention provides the use of an antibody or antibody fragment to prepare a cancer diagnostic agent.
  • step b) If the protein expression level measured in step b) increases, it provides a method for diagnosing cancer comprising determining that it is cancer.
  • the present invention provides the use of an antibody or fragment of an antibody to prepare a preparation for diagnosing infectious diseases or complications of infection.
  • c) Provides a method for diagnosing an infectious disease or an infectious complication comprising determining that it is an infectious disease or an infectious complication when the protein expression level measured in step b) increases.
  • the present invention provides a fragment of an antibody or antibody fragment that specifically binds to a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in a tryptophanyl-tRNA synthetase (WRS) protein.
  • WLS tryptophanyl-tRNA synthetase
  • WRS refers to tryptophanyl-tRNA synthetase, and is also known as tryptophan-tRNA ligase, TrpRS, WARS, and the like.
  • WRS is an enzyme that mediates the aminoacylation reaction of the amino acid tryptophan and tRNA.
  • WRS is encoded by the WARS gene in humans, and the amino acid sequence and mRNA nucleotide sequence of a protein are known as Genbank accession number NP_004175.2 (protein), Genbank accession number NM_004184.3 (mRNA nucleotide sequence), and the like.
  • WRS has two isoforms: cytoplasmic form (WARS or tryptophanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic) and mitochondrial form (WARS2 or tryptophanyl-tRNA synthetase, mitochondrial).
  • WRS in the present invention is preferably in cytoplasmic form.
  • the'antibody' is also called immunoglobulin (Ig), and is a generic term for a protein that selectively acts on an antigen and is involved in immunity in vivo.
  • Whole antibodies found in nature are generally composed of two pairs of light chain (LC) and heavy chain (HC), which are polypeptides consisting of multiple domains, or two pairs of these HC/LC.
  • the structure is composed of basic units.
  • There are 5 types of heavy chains that make up mammalian antibodies and there are 5 types, denoted by the Greek letters ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ , and different types of antibodies such as IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, respectively, depending on the type of heavy chain. Will constitute.
  • the heavy and light chains of an antibody are structurally divided into a variable region and a constant region according to the variability of the amino acid sequence.
  • the constant region of the heavy chain is composed of 3 or 4 heavy chain constant regions such as CH1, CH2 and CH3 (IgA, IgD and IgG antibodies) and CH4 (IgE and IgM antibodies) depending on the type of antibody, and the light chain is one constant region. It is composed of phosphorus CL.
  • the variable regions of the heavy and light chains each consist of one domain of the heavy chain variable region (VH) or the light chain variable region (VL).
  • the light chain and the heavy chain are connected by one covalent disulfide bond by aligning each variable region and the constant region side by side, and the heavy chain of the two molecules bound to the light chain is connected through two covalent disulfide bonds.
  • the whole antibody specifically binds to the antigen through the variable regions of the heavy and light chains, and the whole antibody consists of two pairs of heavy and light chains (HC/LC), so the entire antibody of one molecule has two variable regions. It has a bivalent single specificity that binds to the same two antigens.
  • the antibody variable region that binds to the antigen is called the antigen-binding site of the antibody, and the portion recognized by the antibody on the surface of the antigen is called the epitope.
  • variable region of an antibody containing an antigen-binding site is a framework region (FR) with low sequence variability and a complementary determining region, which is a hypervariable region with high sequence variability. , CDR).
  • FR framework region
  • CDR complementary determining region with high sequence variability.
  • three CDRs and four FRs are arranged in the order of FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 in the direction from the N-terminus to the C-terminus, respectively.
  • the CDR with the highest sequence variability directly binds to the antigen, and is most important for the antigen specificity of the antibody.
  • the antibody or antibody fragment is an antibody or antibody fragment that specifically binds to a WRS protein or a variant protein thereof, and the amino acid sequence 1 to 47 of the WRS protein represented by SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 2) It is characterized in that it specifically binds to the containing polypeptide.
  • The'antibody' of the present invention can also be expressed as'anti-WRS antibody','humanized anti-WRS antibody','modified humanized anti-WRS antibody', and'anti-WRS antibody', and is used in the broadest sense in the present invention. .
  • monoclonal antibodies including monoclonal antibodies and full-length monoclonal antibodies
  • polyclonal antibodies polyclonal antibodies
  • multispecific antibodies eg bispecific antibodies
  • antibody fragments eg variable antibodies
  • the antibody of the present invention is an antibody in which a specific amino acid sequence is included in the light chain and heavy chain CDRs so as to selectively bind to WRS, and includes both monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, and may preferably be monoclonal antibodies. Further, the antibody of the present invention includes all of a chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody, and may preferably be a human antibody.
  • Monoclonal antibodies of the invention represent antibodies obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, ie, the individual antibodies that make up the population are identical except for possible naturally occurring mutations that may be present in small amounts. Monoclonal antibodies bind very specifically to a single epitope.
  • the term'monoclonal' or'monoclonal' refers to the characteristics of the antibody that the antibody is obtained from a substantially homologous population, and does not necessarily mean that the antibody must be produced by a specific method.
  • a single antibody of the invention can be prepared by the hybridoma method first described in Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, or the recombinant DNA method (see U.S. Patent No. 4,816,567). ) Can be produced. See, for example, Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 and Presta (2005) J. Allergy Clin.Immunol. 116:731) can be used to separate from phage antibody libraries.
  • the antibody of the present invention specifically includes a chimeric antibody, in which case some of the heavy and/or light chains originate from a specific species or are identical or homologous to the corresponding sequence of a specific antibody, but the remainder of the antibody of the present invention It may originate from another species or be identical or homologous to the corresponding sequence of another antibody as long as it exhibits a desirable biological activity (e.g., selective binding with NRS) (US Pat. No. 4,816,567; And Morrison et al. al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).
  • a desirable biological activity e.g., selective binding with NRS
  • Humanized antibodies are antibodies that contain both human and non-human (e.g., rat, rat) antibody sequences. In general, the rest of the antibody except for the region that binds to the epitope (CDR) is from a human antibody, and The part binding site (CDR) may comprise a sequence of non-human origin.
  • a complete human antibody refers to an antibody containing only a human immunoglobulin protein sequence, and can be produced from a mouse, a mouse cell, or a hybridoma derived from a mouse cell, or produced by a phage display method.
  • the hybridoma cells can be prepared using a method known in the art. Specifically, the hybridoma cell was prepared by immunizing an animal with the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 as an immunogen, and fusion of B cells, which are antibody-producing cells derived from the immunized animal, with myeloma cells. Next, it can be prepared by selecting a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 among them.
  • the immunized animal may be an animal such as a goat, sheep, mortise, rat or rabbit, as well as a mouse.
  • a method of immunizing the immunized animal a method already known in the art can be used.
  • 1 to 100 ⁇ g of immunogen is emulsified at a time with an equal amount of physiological saline and/or an antigen adjuvant such as Freund's adjuvant, and subcutaneously in the abdomen of the immunized animal.
  • an antigen adjuvant such as Freund's adjuvant
  • it may be performed by inoculating 2-6 times every 2-5 weeks in the abdominal cavity.
  • the fusion accelerator may be, for example, a material such as polyethylene glycol (PEG).
  • the myeloma cells are, for example, P3U1, NS-1, P3x63.
  • Mouse-derived cells such as Ag 8.653 and Sp2/0-Ag14, and rat-derived cells such as AG1 and AG2 can be used.
  • the cell fusion method known in the art is, for example, by mixing B cells and myeloma cells in a ratio of 1:1-10:1, and PEG having a molecular weight of 1,000-6,000 is added thereto at a concentration of 10-80%. Thus, it can be performed by incubating for 1-10 minutes at 30-37°C.
  • hybridomas that produce monoclonal antibodies that specifically bind to the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are cultured in a selection medium such as HAT medium in which only hybridomas can survive, and hybridomas The antibody activity in the cutting board culture supernatant can be measured and selected using a method such as ELISA.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody that specifically binds to the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 produces a monoclonal antibody that specifically binds to the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • the hybridoma to be described can be selected by repeating cloning by a method such as limiting dilution.
  • the monoclonal antibody or fragment thereof provided by the present invention can be in vitro from an immunoglobulin variable region gene repertoire from non-immunized donors using phage display technology [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)].
  • Human antibodies and antibody fragments can be produced from According to this technique, the antibody variable region gene is cloned in frame into a major or minor coat protein of a filamentous bacteriophage, for example M13 or fd, and functional antibody fragments are displayed on the surface of the phage particle. Since filamentous particles contain single-stranded DNA copies of the phage genome, due to selection based on the functional properties of the antibody, genes encoding antibodies exhibiting these properties are selected.
  • the phage mimics several properties of B-cells.
  • Phage display can be performed in various formats. For a review of this, refer to the literature [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)].
  • Several sources of variable region-gene segments can be used for phage display. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolated various arrays of anti-oxazolone antibodies from a small random combinatorial library of variable region genes derived from the spleen of immunized mice. A repertoire of variable region genes from non-immunized human donors can be constructed and described in Marks et al., J. Mol. Biol.
  • the antibody or antibody fragment according to the present invention is preferably (1) a complementarity determining region (CDR) L1 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and a complementarity determining region comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 ( CDR) a complementarity determining region (CDR) comprising an amino acid sequence represented by L2 and SEQ ID NO: 7 (CDR) comprising an antibody light chain variable region (VL) comprising L3 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 H1, the complementarity determining region (CDR) H2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 and the antibody heavy chain variable region (VH) comprising the complementarity determining region (CDR) H3 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 Comprising the antibody or fragment of the antibody;
  • complementarity determining region (CDR) L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, the complementarity determining region (CDR) L2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15
  • Complementarity determining region (CDR) comprising the antibody light chain variable region (VL) including L3 and the complementarity determining region (CDR) H1 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17
  • CDR L1 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, the complementarity determining region (CDR) L2 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31
  • Complementarity determining region (CDR) comprising the antibody light chain variable region (VL) including L3 and the complementarity determining region (CDR) H1 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 32, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33
  • An antibody or antibody fragment comprising an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementarity determining region (CDR) H2 and a complementarity determining region (CDR) H3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 34;
  • CDR L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37
  • CDR L2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39.
  • Complementarity determining region comprising the antibody light chain variable region (VL) including L3 and the complementarity determining region (CDR) H1 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 40, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 41
  • An antibody or antibody fragment comprising an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementarity determining region (CDR) H2 and a complementarity determining region (CDR) H3 comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42;
  • the complementarity determining region (CDR) L1 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, the complementarity determining region (CDR) L2 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47
  • Complementarity determining region (CDR) comprising the antibody light chain variable region (VL) including L3 and the complementarity determining region (CDR) H1 including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 48, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49
  • An antibody or antibody fragment comprising an antibody heavy chain variable region (VH) comprising a complementarity determining region (CDR) H2 and an antibody heavy chain variable region (VH) comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50; selected from the group consisting of It can be characterized by being.
  • the antibody or antibody fragment according to the present invention includes the CDR configurations of the light and heavy chains,
  • VL light chain variable region
  • VH heavy chain variable region
  • (6) a light chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43; And it may be characterized in that it is selected from the group consisting of; an antibody or fragment of an antibody, characterized in that it comprises a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44.
  • the antibody or antibody fragment according to the present invention is not limited in its type as long as it has the above-described CDR, VH and VL, or light and heavy chain configurations, and the antibody may be an IgG, IgA, IgM, IgE or IgD type antibody. have. Preferably, it may be an antibody in the form of an IgG.
  • an antibody fragment refers to a fragment of an antibody that maintains WRS-specific binding ability, and preferably, the fragment is at least 20%, 50%, 70%, 80%, 90% of the affinity of the parent antibody's WRS protein. , 95% or 100% or more. Specifically, it may be in the form of Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, diabody, scFv, etc.
  • Fab fragment antigen-binding
  • F(ab')2 is a fragment produced by hydrolyzing an antibody with pepsin. Two Fabs are linked by a disulfide bond at a heavy chain hinge.
  • F(ab') is a monomeric antibody fragment in which a heavy chain hinge is added to a Fab separated by reducing the disulfide bond of the F(ab')2 fragment.
  • Fv variable fragment is an antibody fragment consisting only of the variable regions of the heavy and light chains.
  • a single chain variable fragment is a recombinant antibody fragment in which a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL) are connected by a flexible peptide linker.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • a diabody refers to a fragment in which the VH and VL of an scFv are connected by a very short linker, so that they cannot be bonded to each other, and form a dimer by binding to the VL and VH of another scFv of the same type, respectively.
  • the antibody fragment is not limited in structure or form as long as it maintains the binding specificity for WRS, but may preferably be scFv.
  • the scFv according to the present invention has a CDR configuration specific to the WRS described above, or a configuration of VH and VL, and the sequence is not particularly limited if the C-terminus of VH and the N-terminus of VL are connected through a linker.
  • the type of the linker is not particularly limited as long as it is known in the art as a linker applied to scFv.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention may contain conservative amino acid substitutions (referred to as conservative variants of the antibody) that do not substantially alter their biological activity.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention described above may be conjugated to an enzyme, a fluorescent substance, a radioactive substance, and a protein, but is not limited thereto.
  • methods for conjugating the substance to an antibody are well known in the art.
  • the antibody of the present invention may be derived from any animal including mammals, birds, and the like, including humans.
  • the antibody may be a human, mouse, donkey, sheep, rabbit, goat, guinea pig, camel, horse, or chicken antibody, most preferably human or mouse.
  • the invention also provides polynucleotides encoding antibodies or fragments of antibodies.
  • the'polynucleotide' may be described as an oligonucleotide or nucleic acid, and DNA molecules (eg, cDNA or genomic DNA), RNA molecules (eg, mRNA), nucleotide analogues are used.
  • DNA molecules eg, cDNA or genomic DNA
  • RNA molecules eg, mRNA
  • nucleotide analogues are used.
  • the resulting analogs of the DNA or RNA eg, peptide nucleic acids and non-naturally occurring nucleotide analogs
  • the polynucleotide may be single-stranded or double-stranded.
  • the polynucleotide refers to a nucleotide sequence encoding an antibody consisting of heavy and light chains having a CDR configuration specific to the polypeptide of SEQ ID NO: 2, or a configuration of VH and VL.
  • the polynucleotide encoding the antibody or fragment thereof of the present invention can be obtained by a method well known in the art. For example, based on the DNA sequence or the corresponding amino acid sequence encoding part or all of the heavy and light chains of the antibody, an oligonucleotide synthesis technique well known in the art, for example, a polymerase chain reaction (PCR) method, etc. Can be used to synthesize.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention also provides a vector comprising the polynucleotide.
  • The'vector' of the present invention is used for the purpose of replication or expression of the polynucleotide of the present invention for recombinant production of the antibody or fragment thereof of the present invention.
  • a signal sequence In general, a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, And one or more of an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence.
  • the vector of the present invention may preferably be an expression vector, more preferably a vector comprising a polynucleotide of the present invention operably linked to a regulatory sequence, for example, a promoter.
  • Plasmid refers to a linear or circular double-helix DNA molecule to which external polynucleotide fragments can be bound.
  • a viral vector e.g., replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses
  • additional DNA fragments are It can be introduced into the viral genome.
  • viral vectors e.g., replication defective retroviruses, adenoviruses and adeno-associated viruses
  • Certain vectors are self-replicating (bacterialvectors) in the host cell into which they are introduced (e.g. bacterial vectors, including bacterial origin and episomal mammalian vectors). autonomous replication).
  • Other vectors e.g., non-episomal mammalian vectors
  • the'vector' may be understood to have the same meaning as the'expression vector', which is a form of a vector capable of expressing the polynucleotide.
  • a polynucleotide sequence is “operably linked” to the regulatory sequence when the regulatory sequence affects the expression (eg, level, timing or location of expression) of the polynucleotide sequence.
  • the regulatory sequence is a sequence that affects the expression (eg, level, timing or location of expression) of the nucleic acid to which it is operably linked.
  • the regulatory sequence exerts its effect, for example, directly on the regulated nucleic acid or through the action of one or more other molecules (e.g., the regulatory sequence and/or polypeptides that bind to the nucleic acid). Can be done.
  • the regulatory sequences include promoters, enhancers and other expression control elements.
  • the vector of the present invention may preferably be pOptiVECTM-TOPO and pcDNATM3.3-TOPO.
  • the present invention also provides a cell transformed with the vector.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that can be used to express a polynucleotide encoding an antibody or fragment thereof contained in the expression vector of the present invention.
  • Cells (host cells) transformed with the expression vector according to the present invention are prokaryotes (e.g., E. coli), eukaryotes (e.g., yeast or other fungi), plant cells (e.g., tobacco or tomato plants). Cells), animal cells (eg, human cells, monkey cells, hamster cells, rat cells, mouse cells), insect cells, or hybridomas derived therefrom. It may be cells derived from mammals, including humans.
  • Prokaryotes suitable for this purpose are Gram-negative or Gram-positive organisms, for example Enterobacteriaceae, for example Escherichia, for example E. Coli (E. coli), Enterobacter (Enterobacter), El Winiah (Erwinia), keulrep when Ella (Klebsiella), Proteus (Proteus), Salmonella (Salmonella), e.g., Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), Serratia (Serratia), for example, Serratia marsescans ( Serratia marcescans ) and Shigella, and Bacilli, for example B. Subtilis and B.
  • the cells of the present invention are not particularly limited as long as they are capable of expressing the vector of the present invention, but are preferably E. It could be coli.
  • Saccharomyces cerevisiae is most commonly used in eukaryotes.
  • Schizosaccharomyces pombe Cluyveromyces host, for example K. Lactis (K. lactis), Kay. Fragilis ( K. fragili s) (ATCC 12,424), K. Bulgaria kusu (K. bulgaricus) (ATCC 16,045) , K. K. wickeramii (ATCC 24,178), K. K. waltii (ATCC 56,500), K. Draw small Pillar Room (K. drosophilarum) (ATCC 36,906) , K.
  • the term'transformation' refers to a modification of the genotype of a host cell by introduction of an exogenous polynucleotide, and refers to the introduction of an exogenous polynucleotide into a host cell regardless of the method used for the transformation.
  • the foreign polynucleotide introduced into the host cell may be integrated and maintained or not integrated into the genome of the host cell, and the present invention includes both.
  • the recombinant expression vector capable of expressing the antibody or fragment thereof that specifically binds to the WRS protein according to the present invention is a method known in the art, such as, but not limited to, transient transfection, microscopic Injection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene-mediated trait Transformation is carried out by introducing into the cell for producing an antibody or fragment thereof by polybrene-mediated transfection, electroporation, gene gun, and known methods for introducing nucleic acid into the cell.
  • the cell of the present invention is a cultured cell that can be transformed or transfected with the polynucleotide of the present invention or a vector containing the same, which can be continuously expressed in the host cell.
  • Recombinant cells refer to cells transformed or transfected with a polynucleotide to be expressed.
  • the cells of the present invention can also be cells that do not express the polynucleotide of the present invention at a desired level unless a regulatory sequence is introduced into the cell such that it is operably linked to the polynucleotide.
  • the cells of the present invention can be cultured in a variety of media.
  • Commercially available media such as Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), minimal essential media (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), And Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich Co.) is suitable for culturing cells.
  • Hormones and/or other growth factors, salts, buffers, nucleotides, antibiotics, trace elements and glucose or equivalent energy sources may be added to the medium if necessary.
  • the present invention comprises the steps of culturing the cell under conditions in which the polynucleotide is expressed to produce a polypeptide including a light chain and a heavy chain variable region, and recovering the polypeptide from the cell or a culture medium in which the same is cultured. It provides a method for producing an antibody or fragment thereof that binds to WRS.
  • the cell of the production method in the present invention is as described above, and contains a polynucleotide encoding the antibody of the present invention.
  • the polypeptide of the above production method may be an antibody of the present invention or a fragment thereof, or an amino acid sequence other than the antibody or fragment thereof of the present invention may be additionally bound.
  • the culture medium composition and culture conditions may vary depending on the type of cells, which can be appropriately selected and controlled by a person skilled in the art.
  • the antibody molecule may be accumulated in the cytoplasm of the cell, secreted from the cell, or targeted to periplasm or extracellular medium (supernatant) by an appropriate signal sequence, and targeted to periplasm or extracellular medium. It is desirable. In addition, it is desirable to refold the produced antibody molecule using a method well known to those skilled in the art and to have a functional conformation. The recovery of the polypeptide may vary depending on the characteristics of the produced polypeptide and the characteristics of the cells, which can be appropriately selected and controlled by a person skilled in the art.
  • the polypeptide can be produced intracellularly, in the surrounding cytoplasmic space, or directly secreted into the medium. If the polypeptide is produced inside the cell, the cell can be destroyed to release the protein as a first step. Particulate debris, host cells or lysed fragments are removed, for example by centrifugation or ultrafiltration. When the antibody is secreted into the medium, the supernatant from this expression system is generally first concentrated using a commercially available protein concentration filter, such as an Amicon or Millipore Pellicon ultrafiltration unit. Protease inhibitors such as PMSF may be included in any preceding step to inhibit proteolysis, and antibiotics may be included to prevent the growth of accidental contaminants. Antibodies prepared from cells may be purified using, for example, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, and affinity chromatography, and the antibody of the present invention may be preferably purified through affinity chromatography. have.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention specifically binds to WRS, it is useful for diagnostic analysis to detect and quantify WRS protein, for example, to detect WRS expression in specific cells, tissues, or serum.
  • the present invention provides a WRS-specific detection method comprising the step of contacting the antibody or fragment thereof with a sample and detecting the antibody or fragment thereof.
  • the antibody or fragment thereof can generally be labeled with a detectable moiety.
  • Radioactivity can be measured by, for example, scintillation counting, and fluorescence can be quantified by using a fluorimeter.
  • various enzyme-substrate labels may be used, and examples of the enzymatic label include luciferase such as Drosophila lucirupase and bacterial luciferase (U.S. Patent No.
  • luciferin 2,3-dihydrop Peroxidase such as thalazinediones, maleate dehydrogenase, urase, horseradish peroxidase (HRPO), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, lysozyme, saccharide Oxidase (e.g. glucose oxidase, galactose oxidase, and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidase (e.g. uricase and xanthine oxidase), lactoperoxidase, microfur Includes oxidase and the like.
  • 2,3-dihydrop Peroxidase such as thalazinediones, maleate dehydrogenase, urase, horseradish peroxidase (HRPO), alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase,
  • Labels can be indirectly conjugated to antibodies using a variety of known techniques.
  • an antibody can be conjugated to biotin and any of the labels belonging to the three broad categories mentioned above can be conjugated with avidin, or vice versa.
  • Biotin binds selectively to avidin, so this label can be conjugated to the antibody in this indirect manner.
  • the antibody can be conjugated with a small hapten (eg, digoxin) and one of the different types of labels mentioned above is anti- It can be conjugated to a hapten antibody (eg, anti-dioxin antibody).
  • a small hapten antibody eg, digoxin
  • the antibodies or fragments thereof of the present invention can be used in any known assay method, such as competitive binding assays, direct and indirect sandwich assays, and immunoprecipitation assays.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention can be used in a diagnostic kit, that is, a diagnostic kit for performing a diagnostic assay, that is, a packaged combination of reagents in a predetermined amount with instructions for use.
  • the kit may contain a substrate and a cofactor required by the enzyme as a substrate precursor to provide a chromophore or fluorophore.
  • other additives such as stabilizers, buffers (eg, blocking buffer or lysis buffer) may be included.
  • the relative amounts of various reagents can be varied widely to provide a concentration in solution of the reagent that sufficiently optimizes the sensitivity of the assay.
  • the reagents may be provided as a generally lyophilized, dry powder containing excipients that will provide a reagent solution having an appropriate concentration upon dissolution.
  • WRS detected by the antibody of the present invention was the first reported among ARSs that are secreted out of cells and exhibit cytokine activity, and until recently, many papers have been published on the potential as an important biomarker in various cancers including colon cancer (Ghanipour, A et al Theprognostic significancer of tryptophanyl-tRNA synthetase in clorectal cancer (2009) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18(11), 2949-2955).
  • WRS can be used as a diagnostic marker for diagnosis of a specific cancer through detection, evaluation of disease progression and prognosis before and after treatment.
  • Diagnosis and prognosis evaluation of cancer according to the present invention can be performed by detecting the WRS protein in a biological sample.
  • the present invention provides a composition for diagnosis of cancer comprising the antibody or fragment thereof of the present invention as an active ingredient.
  • the type of cancer is not particularly limited, and for example, breast cancer, colon cancer, lung cancer, small cell lung cancer, gastric cancer, liver cancer, blood cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, skin or intraocular melanoma, uterine cancer, Ovarian cancer, rectal cancer, anal cancer, colon cancer, breast cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical cancer, vaginal cancer, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, esophageal cancer, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma , Urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, bladder cancer, kidney or ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma and pituitary adenoma It may be, and preferably, for
  • the level of expression of WRS increases rapidly from the beginning of infection due to infection by bacteria, viruses, or fungi, and that when symptoms such as pneumonia or sepsis appear as complications of infection, it is significantly increased compared to the normal control group. There is a bar. Furthermore, in the case of sepsis patients, the level of WRS expression has a high correlation with the severity and prognosis of sepsis, and since WRS increases only in infectious inflammation, it is possible to quickly and accurately distinguish between infectious and non-infectious inflammatory diseases. It has a very high value as a diagnostic marker in infection complications.
  • the amount of WRS in the serum of sepsis or septic shock patients due to bacterial or fungi infection is significantly increased compared to the serum of healthy normal control group, and sepsis caused by Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria and fungal infections.
  • WRS can all be usefully used for diagnosing sepsis caused by Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, or fungal infections.
  • autoimmune diseases such as systemic inflammation reactive symptoms (SIRS), non-infectious chronic inflammatory diseases such as asthma, rheumatoid arthritis, and Sjogren's syndrome
  • the amount of WRS is statistically significant compared to the normal control group.
  • the expression level of WRS is specifically increased not only in inflammatory reactions caused by bacterial, viral or fungi infection, but not in all inflammatory responses.
  • the level of WRS is further increased in septic shock patients than in sepsis patients, so that the expression level of WRS is also associated with sepsis severity. That is, the higher the expression level of WRS, the more severe the symptoms of sepsis can be determined (Korean Patent Laid-Open Patent No. 10-2017-0027313). That is, by detecting the expression level of WRS in a biological sample, it is possible to diagnose an infectious disease or an infectious complication and predict its prognosis.
  • the present invention provides a composition for diagnosing infectious diseases or complications of infection comprising the antibody or fragment thereof of the present invention as an active ingredient.
  • the biological sample includes blood and other liquid samples of biological origin, a biopsy sample, a solid tissue sample such as a tissue culture, or cells derived therefrom. More specifically, for example, but not limited thereto, tissues, extracts, cell lysates, whole blood, plasma, serum, saliva, eye fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, and the like.
  • the sample can be obtained from an individual. Such individuals include animals, preferably mammals, and most preferably humans.
  • the sample can be pretreated prior to use for detection. For example, it may include filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of interfering components, addition of reagents, and the like.
  • nucleic acids and proteins can be separated from the sample and used for detection.
  • the detection is as described above.
  • infection means that one or two or more types of exogenous bacteria (including all bacteria, gram-negative bacteria, or gram-positive bacteria), viruses, and fungi (bacterium) enter the body and become settled, multiplied, and parasitic.
  • a disease can be any disease that occurs as a result of an infection of a pathogen and causes a reaction in vivo. Responses as a result of an infectious disease may include inflammation, pain, fever, fatigue, swelling, and lowering blood pressure.
  • the infectious diseases of the present invention are salmonellosis, food poisoning, typhoid fever, paratyphoid, pneumonia, pulmonary tuberculosis, tuberculosis, sepsis, septic shock, urinary tract infection, cystitis, pyelonephritis, urethritis, prostate It may be salt, upper respiratory tract infection, or otitis media, more preferably salmonellosis, food poisoning, pneumonia, sepsis, septic shock, most preferably sepsis or septic shock.
  • the sepsis is a systemic inflammatory reaction syndrome that appears as a complication of an infectious disease, and if the cause cannot be diagnosed quickly and accurately, severe sepsis or septic shock, lung, kidney, liver, Multiple organ dysfunction syndrome (MODS), disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), acute respiratory depression syndrome (ARDS), or acute renal failure (AKI), leading to dysfunction such as circulatory organs. It can be a fatal disease.
  • MODS Multiple organ dysfunction syndrome
  • DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
  • ARDS acute respiratory depression syndrome
  • AKI acute renal failure
  • Sepsis as used herein is sepsis associated with the final stage of sepsis, severe sepsis, septic shock and multiple organ dysfunction syndrome (MODS) accompanying sepsis, disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC). , Acute respiratory urgent syndrome (ARDS) or the onset of acute renal failure (AKI), including, but not limited to, all stages of sepsis.
  • MODS multiple organ dysfunction syndrome
  • DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
  • DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
  • ARDS Acute respiratory urgent syndrome
  • AKI acute renal failure
  • the present invention provides the use of an antibody or antibody fragment for preparing a cancer diagnostic agent.
  • step b) If the protein expression level measured in step b) increases, it provides a method for diagnosing cancer comprising determining that it is cancer.
  • the present invention provides a method of diagnosing and treating cancer in an individual (subject) comprising the steps of:
  • a therapeutic drug for treating cancer to the determined individual or treating cancer through surgery with radiation.
  • Step iv) is a step of performing treatment of the disease through means such as administration of a therapeutic drug such as an anticancer agent, irradiation of radiation, or surgery to the subject whose disease is diagnosed in step iii).
  • a therapeutic drug such as an anticancer agent, irradiation of radiation, or surgery to the subject whose disease is diagnosed in step iii).
  • the present invention provides the use of an antibody or antibody fragment for preparing a preparation for diagnosing infectious diseases or complications of infection.
  • c) Provides a method for diagnosing an infectious disease or an infectious complication comprising determining that it is an infectious disease or an infectious complication when the protein expression level measured in step b) increases.
  • the present invention provides a method of diagnosing and treating an infectious disease or infectious complication in an individual (subject) comprising the steps of:
  • Step iv) is a step of performing treatment of the disease through means such as administration of a therapeutic drug or surgery to an individual diagnosed with a disease in step iii).
  • The'treatment' of the present invention generally refers to improving symptoms/infectious diseases or infectious complications or symptoms of cancer or cancer, which includes curing, substantially preventing, or improving the condition. It may be, and includes, but is not limited to, alleviating, curing, or preventing one symptom or most of the symptoms resulting from the disease.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention specifically binds to WRS and does not have cross-reactivity with other proteins including the same ARS family, so WRS detection and inhibition are possible, so cancer, inflammatory disease, or infectious disease, which is a disease related to WRS detection and WRS It can be used effectively in the diagnosis of
  • 1 to 6 show the amino acid sequences of the light chain and heavy chain variable regions of the monoclonal antibody specifically binding to the WRS selected in Examples 1 and 2 of the present invention and the nucleotide sequence encoding the same.
  • WRS protein represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (1-471) and its fragment peptides (48-471, 1-104, 1-154 and 48-154) were prepared and then approximately through electrophoresis. This is the result of confirming the proper molecular weight and band position.
  • WRS protein 1-471
  • its protein through western blotting using each antibody in order to confirm the polypeptide sequence in WRS specifically recognized by the six monoclonal antibodies prepared in the examples of the present invention.
  • the results of detection of fragment peptides 48-471, 1-104, 1-154 and 48-154) are shown.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing a polypeptide in WRS that is specifically recognized by each monoclonal antibody prepared in an example of the present invention, based on the results of the Western blotting experiment confirmed in the experimental result of FIG. 8.
  • 11 is a result of evaluating the cross-reactivity of 6 types of monoclonal antibodies prepared in Examples of the present invention by indirect ELISA assay.
  • Hybridoma cells producing antibodies that bind to the antigen were selected through indirect ELISA.
  • Isotyping was performed by selecting 5 clones with the best results among the screening work.
  • Antibodies were produced so that at least 2 mg of antibody was produced from hybridoma cell lines with the best results during the screening operation.
  • Pristane adjuvant was administered at a rate of 100 ⁇ l/mouse when the mouse had an adaptation period of 3 days or more.
  • Hybridoma cell lines were cultured so that they could be injected 5 to 7 days after administration of Pristane adjuvant.
  • the cultured hybridoma cell line was collected in a 50 ml tube, washed 3 times with 10 ml PBS, and centrifuged.
  • mice injected with the hybridoma cell line After 5 days of injection of the mice injected with the hybridoma cell line, they were observed every day to check whether the stomach was swollen or not.
  • stomach was swollen ascites were collected by puncturing the abdominal cavity of the rat using a product with an injection needle of 23G or less (using a 3 ml or 5 ml syringe).
  • hybridoma cell lines producing monoclonal antibodies that specifically bind to WRS were selected.
  • Antibodies produced in each of the selected hybridoma cell lines were designated as 3B10H5, 6A3B4 and 1D4C3.
  • Example 2 Selection of monoclonal antibodies through phage display
  • Kanamycin was added to the final 70 ⁇ g/ml and incubated at 200 rpm, 30 °C, overnight (15 hr).
  • 2,112 candidate groups were selected from the phage library through biopanning according to the above method.
  • a Secondary antibody (Anti-HA HRP, 1:2,000) is prepared in advance and stored at 4°C.
  • washing buffer (5 mM imidazole in PBS) is added and washing is performed.
  • RNA of hybridoma cells selected in Example 1 was isolated according to the technical manual of the TRIzol reagent. Total RNA was reverse transcribed into cDNA using universal primers according to the technical manual of PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit. The antibody fragments of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) were amplified according to RACD (rapid amplification od cDNA ends). The amplified antibody fragment was separately cloned into a standard cloning vector. Colony PCR was performed to screen for clones with the correct size inserts. Five or more colonies with the correct size inserts were sequenced for each fragment. The sequences of the different clones were aligned and the consensus sequence of these clones was provided.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • Each scFv monoclonal phage selected in Example 2 was subjected to sequencing after extracting plasmid DNA according to the manufacturer's instructions using a HiYield Plasmid Mini kit (Real Biotech corporation, YPD100).
  • the light chain and heavy chain variable region amino acid sequences of a total of six monoclonal antibodies selected in Example 1 and Example 2 and the sequence of the polynucleotide encoding the same were confirmed, and each example thereof is shown in FIGS. 1 to 6 1 to 3: monoclonal antibodies selected according to the method of Example 1, Figs. 4 to 6: monoclonal antibodies selected according to the method of Example 2).
  • Example 4 monoclonal antibody specifically binds WRS Identification of my polypeptide
  • the WRS protein (1-471) of SEQ ID NO: 1 consisting of 471 amino acids and fragments of the protein (1-104, 1-154, 48-154 and 48-471) were prepared in the following manner.
  • Washing is performed by adding Washing Buffer 2.
  • the monoclonal antibody specifically targets a fragment (SEQ ID NO: 2) consisting of amino acids 1-47 among 1-471 amino acids of the WRS protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. I was able to confirm recognition.
  • WRS protein is diluted 1 ⁇ g/ml in PBS, loaded on a 96-well plate, 100 ⁇ l/well, reacted at room temperature for 1 hour, and coated on a well.
  • biotin-attached antibody is diluted with a blocking buffer according to each concentration, and then reacted at room temperature for 1 hour.
  • Streptavidin-HRP was diluted with a blocking buffer, and then reacted at room temperature for 1 hour.
  • Anti human HRP (Genscript, A00166): 1:5,000 dilution: 4H9, 3B6, 4G4
  • Anti-mouse HRP (Millipore, AP181P): 1:10,000 dilution: Abnova, 1D4C3, 3B10H5, 6A3B4
  • Anti-rabbit HRP (Millipore, AP187P): 1:10,000 dilution: Novus
  • the binding specificity of the antibody according to the present invention is significantly higher than that of commercial antibodies.
  • ARS Aminoacyl-tRNA synthetase
  • CRS Cysteinyl-tRNA synthetase
  • AIMP1 Aminoacyl tRNA synthase complex-interacting Multifunctional protein 1
  • GRS Glycyl tRNA synthetase
  • KRS Lysyl tRNA synthetase
  • Antigen coating 1 ⁇ g/ml in PBS, 100 ⁇ l/well, 4 °C, overnight coating
  • the antibody or fragment thereof of the present invention specifically binds to WRS and does not have cross-reactivity with other proteins including the same ARS family, so WRS detection and inhibition are possible, so cancer, inflammatory disease, or infectious disease, which is a disease related to WRS detection and WRS It can be effectively used for diagnosis of medical products, so it is highly applicable in industry

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Abstract

본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편, 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 벡터, 이를 이용하여 형질 전환된 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

WRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
본 출원은 2019년 7월 18일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0087230호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 대한 것으로, 보다 구체적으로 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편, 상기 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 이를 포함하는 벡터, 이를 이용하여 형질 전환된 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
Aminoacyl-tRNA synthetase(ARS)는 특정 아미노산을 그 해당하는 tRNA에 붙여주는 역할을 하는 효소이며. 고등생물의 경우 아미노산 종류에 따른 20 개의 효소외에 AIMP1(p43), (AIMP2)p38, (AIMP3)p18 등 multisynthetase complex 형성에 관여하는 3종류를 포함하여 23종의 효소로 구성되어 있으며 multisynthetase complex에 참여하는 효소 외에 몇몇은 free form 형태로도 존재한다. 그러나 최근에 들어 기본적인 기능 외에 특정 환경에서 다양한 다른 활성기능을 가지고 있음이 보고되었는데 WRS (tryptophanyl-tRNA synthetase)가 그중의 하나이다.
WRS는 세포 밖으로 분비되어 cytokine 활성을 나타내는 ARS중에 가장 먼저 보고가 되었으며 WRS는 최근까지도 대장암을 비롯한 여러 암에서 중요한 biomarker로서의 가능성에 많은 논문이 발표되고 있다 (Ghanipour, A et al The prognostic significance of tryptophanyl-tRNA synthetase in clorectal cancer(2009) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18(11), 2949-2955). 또한, WRS는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi)의 감염에 의한 감염질환 발생시 체내 WRS 수준이 감염 초기부터 빠르게 증가하며, 특히 감염성 염증 질환을 수반하는 경우 WRS의 수준이 정상인에 비하여 크게 증가하고, 비감염성 염증 질환의 경우 WRS 수준과 관련이 없는 등 WRS의 수준은 감염 질환과 이들의 합병증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 마커로서 사용될 수 있음이 보고된 바 있다(한국공개특허 제10-2017-0027313호).
이와 같은 결과로 WRS는 암 및 감염성질환 환자의 혈청내에 존재할 수 있으며, WRS가 이들 질환의 중요한 진단 바이오마커로 사용될 수 있음을 보여준다.
하지만 WRS를 비롯한 ARS들에 대한 바이오마커로서의 중요성에도 불구하고 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아 동물로부터 면역반응으로 얻어지는 항체는 다른 ARS에도 결합하는 교차 반응을 보이고 아예 고 감도의 항체가 생성되지 않은 경우가 많다.
이에, 본 발명자들은 WRS에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, WRS 단백질 내에서 특정 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하면서 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 갖는 항체들이 WRS에 매우 높은 결합특이성(specificity) 및 결합친화력(affinity)를 나타내어 그 활용도가 매우 높음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 WRS에 결합하는 항체 또는 항체의 단편 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 암 또는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 항체 또는 항체의 단편으로 이루어지는 암 또는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 항체 또는 항체의 단편으로 필수적으로 이루어지는 암 또는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 진단용 제제를 제조하기 위한 항체 또는 항체의 단편의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료에서 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 제제를 제조하기 위한 항체 또는 항체의 단편의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료에서 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 감염 질환 또는 감염 합병증인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 WRS에 결합하는 항체 또는 항체의 단편 생산방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 암 또는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 항체 또는 항체의 단편으로 이루어지는 암 또는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 항체 또는 항체의 단편으로 필수적으로 이루어지는 암 또는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 암 진단용 제제를 제조하기 위한 항체 또는 항체의 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료에서 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 제제를 제조하기 위한 항체 또는 항체의 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료에서 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 감염 질환 또는 감염 합병증인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편의 단편을 제공한다.
본 발명에서 'WRS'는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 의미하며, 트립토판티알엔에이 연결효소(tryptophan-tRNA ligase), TrpRS, WARS 등으로도 알려져 있다. WRS는 아미노산 트립토판과 tRNA의 아미노아실레이션(aminoacylation) 반응을 매개하는 효소이다. WRS는 인간에서는 WARS 유전자에 의해 암호화되며, 단백질의 아미노산 서열과 mRNA 염기 서열은 Genbank accession number NP_004175.2(단백질), Genbank accession number NM_004184.3(mRNA 염기서열) 등으로 공지되어 있다. WRS는 cytoplasmic form(WARS 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic)과 mitochondrial form(WARS2 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase, mitochondrial)의 두 가지 아형(isoform)이 있다. 본 발명에서의 WRS는 바람직하게는 cytoplasmic form이다.
본 발명에서 '항체(antibody)'는 면역글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 구성된다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.
항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일 특이성을 갖게 된다. 항원에 결합하는 항체 가변영역을 항체의 항원결합부위(antigen-binding site)라고 하고, 항원의 표면에서 항체에 의해 인식되는 부분을 항원결정부(epitope)라고 한다.
항원결합부위(antigen-binding site)를 포함하고 있는 항체의 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원 특이성에 가장 중요하다.
본 발명에서 상기 항체 또는 항체의 단편은 WRS 단백질 또는 이의 변이체 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편으로서, 서열번호 1로 표시되는 WRS 단백질의 1 내지 47번째 아미노산 서열(서열번호 2)을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 '항체'는 '항 WRS 항체', '인간화 항 WRS 항체' 및 '변형 인간화 항 WRS 항체', 'anti-WRS antibody'로도 표현될 수 있으며, 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용된다. 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어. 가변 영역 및 목적하는 생물 활성(예를 들어 WRS와의 결합)을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함한다.
본 발명의 항체는 WRS와 선택적으로 결합할 수 있도록 특정 아미노산 서열이 경쇄 및 중쇄 CDR에 포함되어 있는 항체로 단일클론 항체 및 다클론 항체를 모두 포함하며, 바람직하게는 단일클론 항체일 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간 항체 일 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원결정부에 매우 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 '단일클론' 또는 '모노클로날'이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 항체의 특성을 나타내는 말이며, 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 단일 항체는 문헌(Kohler et al.(1975) Nature 256: 495)에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌(참조: Clackson et al.(1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al.(1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 및 Presta(2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731)에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본 발명의 항체는 구체적으로 키메라 항체를 포함하며, 이 경우 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 보이지만, 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학적 활성(예를 들어 NRS와의 선택적 결합)을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다(미국 특허 제4,816,567호;및 Morrison et al.,(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
인간화된 항체는 인간 및 비-인간(예: 쥐, 랫트) 항체의 서열을 모두 포함하는 항체로 일반적으로, 항원결정부와 결합하는 부위(CDR)를 제외한 나머지 부분은 인간 항체의 것이며, 항원결정부와 결합하는 부위(CDR)는 비-인간 유래의 서열을 포함할 수 있다. 완전한 인간항체는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말하며, 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마에서 생산하거나, 파지 디스플레이 방법으로 생산할 수 있다.
상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.
상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다.
또한, 본 발명이 제공하는 단일클론 항체 또는 이의 단편은 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 사용하여 비면역화 공여자로부터의 면역글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체와 항체 단편을 생성할 수 있다. 이러한 기술에 따라서, 항체 가변 영역 유전자를 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd의 메이져 또는 마이너 외피 단백질 내로 프레임내 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에 기능성 항체 단편을 디스플레이 한다. 필라멘트상 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 복사물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 근거로 한 선택으로 인해, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 선별된다. 따라서, 상기 파지는 B-세포의 몇몇 특성을 모사한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대한 고찰은 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조할 수 있다. 가변 영역-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 가변 영역 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 가변 영역 유전자의 레퍼토리를 작제할 수 있고, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술을 필수적으로 수행하여 다양한 배열의 항원 (자가 항원 포함)에 대한 항체를 단리할 수 있다 [미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조].
본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 바람직하게는 (1) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
(2) 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
(3) 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
(4) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
(5) 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편; 및
(6) 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 상기 경쇄와 중쇄의 CDR 구성을 포함하면서,
(1) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(VL); 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
(2) 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
(3) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
(4) 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
(5) 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편; 및
(6) 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 항체의 단편은 상기한 CDR, VH와 VL, 또는 경쇄와 중쇄의 구성을 갖는 것이라면 그 종류에 제한이 없으며, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 또는 IgD 형태의 항체일 수 있다. 바람직하게는 IgG 형태의 항체일 수 있다.
본 발명에서 항체의 단편은 WRS 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 WRS 단백질 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다
Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.
본 발명의 목적상 항체의 단편은 WRS에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 상기한 WRS에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서 VH의 C-말단과 VL의 N-말단이 링커를 통해 연결된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 당업계에 scFv에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다.
또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 항체일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 또는 생쥐일 수 있다.
본 발명은 또한 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에서 '폴리뉴클레오티드'는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(doublestranded)이 될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기한 서열번호 2의 폴리펩티드에 특이적인 CDR구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체를 암호화하는 염기서열을 의미한다.
본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 '벡터(vector)'는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.
벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들 (adenoassociated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterialvectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.
본 발명에서 상기 '벡터'는 '발현벡터(expression vector)'와 동일한 의미로 이해될 수 있으며, 이는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 pOptiVEC™-TOPO 및 pcDNA™3.3-TOPO일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 세포는 본 발명의 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.
본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이( E. coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨( Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스( Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스( B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피.애루기노사( P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현가능 한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이일 수 있다.
본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에( Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베( Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스( K. lactis), 케이. 프라길리스( K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스( K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미( K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티( K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸( K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스( K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스( K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스( Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia(EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사( Neurospora crassa);쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스( A. nidulans) 및 에이. 니거( A. niger)가 사용가능하다.
상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.
본 발명에 따른 WRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있다
또한, 본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.
본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham's) F1O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코(Dulbecco's) 개질 이글(Eagle's) 배지(DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.
본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 WRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.
본 발명에서 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 상기 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다.
이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다. 상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지 조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.
상기 폴리펩타이드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 WRS와 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 WRS 발현을 검출하는, WRS 단백질을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다.
따라서 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 WRS 특이적 검출 방법을 제공한다. 상기 항체 또는 그 단편을 '검출'하기 위하여, 항체 또는 그 단편은 일반적으로 검출가능 모이어티로 표지될 수 있다.
예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다. 또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y.,73: 147-166]에 기술되어 있다.
표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 진단 킷트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 킷트, 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 킷트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명의 항체에 의해 검출되는 WRS는 세포 밖으로 분비되어 cytokine 활성을 나타내는 ARS중에 가장 먼저 보고가 되었으며 최근까지도 대장암을 비롯한 여러 암에서 중요한 biomarker로서의 가능성에 많은 논문이 발표되고 있다 (Ghanipour, A et al Theprognostic significancer of tryptophanyl-tRNA synthetase in clorectal cancer(2009) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18(11), 2949-2955).
따라서, WRS는 검출을 통해 특정 암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료 전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 암의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 WRS 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 암은 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종 일 수 있으며, 바람직하게는 예를 들어 대장암이나 췌장암 일 수 있다.
한편, WRS는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi)에 의한 감염에 의하여 발현 수준이 감염 초기부터 급속하게 증가하며, 감염 합병증으로 폐렴이나 패혈증 같은 증상이 나타나게 되는 경우 정상인 대조군보다 현저하게 증가한다는 것이 보고된 바 있다. 나아가 패혈증 환자의 경우 WRS 발현 수준은 패혈증의 중증도 및 예후와 높은 상관관계를 가지고 있으며, WRS는 감염성 염증에서만 증가하기 때문에 감염성 염증 질환과 비감염성 염증 질환을 신속하고 정확하게 구분할 수 있어, 새로운 감염 질환 및 감염 합병증에서의 진단 마커로서의 가치가 매우 높다. 특히, 박테리아 또는 곰팡이(fungi) 감염으로 인한 패혈증 또는 패혈증 쇼크 환자의 혈청에서 WRS의 양이 건강한 정상인 대조군의 혈청에 비하여 현저하게 증가하며, 그람-음성균 박테리아, 그람-양성균 박테리아 및 곰팡이 감염에 의한 패혈증 환자 각각에서 WRS의 증가 경향에 통계학적으로 유의성 있는 차이가 없어, 그람-음성균 박테리아, 그람-양성균 박테리아 또는 곰팡이 감염에 의한 패혈증 진단에 WRS가 모두 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammation reactive symptom, SIRS), 비감염성 만성 염증 질환인 천식과 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 등 자가면역질환 환자의 혈청에서는 WRS의 양이 정상인 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 없다고 알려져 있으며, 따라서 WRS의 발현 수준은 모든 염증 반응에서 증가하는 것이 아니라, 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi) 감염으로 유발된 염증 반응에서만 특이적으로 증가한다. 또한 WRS의 수준은 패혈증 환자에서 보다 패혈성 쇼크 환자에서 더욱 증가하여, WRS의 발현 수준이 패혈증 중증도와도 관련이 있다. 즉, WRS의 발현 수준이 높을수록 패혈증 증상이 심한 것으로 판단할 수 있다(한국공개특허 제10-2017-0027313). 즉, 생물학적 시료 중에서 WRS의 발현 정도를 검출함으로써 감염 질환 또는 감염 합병증을 진단하고 그 예후를 예측할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 수득될 수 있다. 상기 개체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 포함한다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.
상기 검출에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 감염은 하나 또는 두 종류이상의 외인성 박테리아(세균, 그람 음성균 또는 그람 양성균을 모두 포함한다), 바이러스, 곰팡이 (균)가 몸속에 침입하여 정착, 증식, 기생상태가 되는 것을 의미하며, 감염 질환은 병원체의 감염의 결과로 생체에서 반응을 일으켜서 발생하는 모든 질환일 수 있다. 감염 질환의 결과로 나타나는 반응은 염증, 통증, 발열, 피로감, 부종, 혈압 강하 등이 있을 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 감염 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 폐렴, 폐결핵, 결핵, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 요로감염, 방광염, 신우신염, 요도염, 전립선염, 상기도감염, 중이염일 수 있으며, 더 바람직하게는 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 폐렴, 패혈증, 패혈성 쇼크일 수 있으며, 가장 바람직하게는 패혈증 또는 패혈성 쇼크일 수 있다.
본 발명에서 상기 패혈증은 감염 질환의 합병증으로 나타나는 전신성 염증 반응 증후군으로 원인을 조기에 신속하고 정확하게 진단하지 못할 경우에는 중증 패혈증(severe sepsis)이나 패혈성 쇼크(septic shock), 폐, 신장, 간, 순환기 등의 기능 장애까지 초래되는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전(AKI)으로 진행되어 사망할 수 있는 치명적인 질환이다.
본 명세서에서 사용되는 패혈증은, 패혈증의 최종 단계와 관련된 패혈증, 중증 패혈증, 패혈증성 쇼크 및 패혈증에 수반하는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전 (AKI)의 발병을 포함하나, 이에 제한되지 않으며 패혈증의 모든 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 암 진단용 제제를 제조하기 위한 항체 또는 항체의 단편의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료에서 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 개체(피검체)의 암 진단 및 치료하는 방법을 제공한다:
i) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 시료로부터 WRS 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
iii) 상기 ii) 단계에서 측정된 단백질이 모두 발현이 되었으면 암인 것으로 판단하는 단계; 및
iv) 상기 판단된 개체에 암을 치료하기 위한 치료 약물(항암제 등)을 투여하거나 방사선을 수술을 통해 암을 치료하는 단계.
상기 i) 내지 iv) 단계를 포함하는 방법들은, 전술한 a) 내지 c) 단계를 포함하는 방법에 준하여 이해된다.
상기 iv) 단계는 상기 iii) 단계에서 질환이 진단된 개체에 항암제와 같은 치료 약물 투여, 방사선을 조사하거나 수술 등의 수단을 통해 상기 질환의 치료를 수행하는 단계이다
또한 본 발명은 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 제제를 제조하기 위한 항체 또는 항체의 단편의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은
a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 시료에서 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 감염 질환 또는 감염 합병증인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단 방법을 제공한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 개체(피검체)의 감염 질환 또는 감염 합병증 진단 및 치료하는 방법을 제공한다:
i) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 시료로부터 WRS 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
iii) 상기 ii) 단계에서 측정된 단백질이 모두 발현이 되었으면 감염 질환 또는 감염 합병증인 것으로 판단하는 단계; 및
iv) 상기 판단된 개체에 감염 질환 또는 감염 합병증을 치료하기 위한 치료 약물을 투여하거나 수술을 통해 감염 질환 또는 감염 합병증을 치료하는 단계.
상기 i) 내지 iv) 단계를 포함하는 방법들은, 전술한 a) 내지 c) 단계를 포함하는 방법에 준하여 이해된다.
상기 iv) 단계는 상기 iii) 단계에서 질환이 진단된 개체에 치료 약물 투여, 수술 등의 수단을 통해 상기 질환의 치료를 수행하는 단계이다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 암 또는 암의 증상/감염 질환 또는 감염 합병증 또는 이의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 상기 질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 상기 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 이루어지는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 이루어지는(essentially consisting of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 WRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 WRS 검출 및 억제가 가능하므로 WRS 검출 및 WRS가 관련된 질환인 암, 염증성 질환 또는 감염 질환의 진단에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1 내지 도 6은 본 발명 실시예 1 및 2에서 선별된 WRS에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 WRS 단백질(1-471) 및 이의 단편 펩타이드들(48-471, 1-104, 1-154 및 48-154)을 제작한 후 전기영동을 통해 대략적인 분자량 및 밴드 위치를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예에서 제조된 6종의 단일클론 항체가 특이적으로 인식하는 WRS 내 폴리펩티드 서열을 확인하기 위하여, 각 항체를 이용한 웨스턴 블로팅을 통해 WRS 단백질(1-471) 및 이의 단편 펩타이드들(48-471, 1-104, 1-154 및 48-154)을 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 상기 도 8의 실험결과에서 확인된 웨스턴 블로팅 실험 결과를 바탕으로, 본 발명의 실시예에서 제조된 각 단일클론 항체가 특이적으로 인식하는 WRS 내 폴리펩티드를 표시한 모식도이다.
도 10은 본 발명의 실시예에서 제조된 6종의 단일클론 항체의 WRS에 대한 결합 특이도를 2종의 상용 항체와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 11은 본 발명의 실시예에서 제조된 6종의 단일클론 항체의 교차반응성 여부를 indirect ELISA assay로 평가한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 하이브리도마 세포를 이용한 단일클론 항체의 제조
(1) 하이브리도마 세포의 제작
1) 동물 면역화와 세포 융합
- 면역원 준비: 1.5 ~ 2 mg의 WRS 단백질 (순도 > 75 %, 농도 > 0.4 mg/㎖)
- 동물 면역화: Balb/c 쥐에 면역원을 찔러 항체 생산을 유발하였다.
- 세포 융합: 쥐에서 얻은 B cell과 쥐의 myeloma cell을 electro-fusion하여 최소 10,000개의 하이브리도마 세포를 얻었다.
2) 하이브리도마 세포의 선별
- 1차 선별: indirect ELISA를 통해 항원에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하였다.
- 2차 선별: 1차 선별에서 얻은 양성 클론을 사용하여 웨스턴 블로팅으로 항원에 결합하는 하이브리도마 세포주 3종을 선별하였다.
- Isotyping: 선별작업 중 제일 결과가 좋은 clone 5개를 골라 isotyping을 진행하였다.
3) Subcloning, 세포 증량, 동결보관, 항체 생산
- Subcloning, 세포 증량, 동결보관: 결과가 좋은 클론을 subcloning, 세포 증량, 동결보관을 진행하였다.
- 항체 생산: 선별작업 중 제일 결과가 좋은 하이브리도마 세포주에서 최소 2 mg의 항체가 생산되도록 항체를 생산하였다.
2. Ascites 제작
1) 마우스가 3일 이상의 적응 기간을 거치면 Pristane adjuvant를 100 ㎕/mouse로 투여하였다. 하이브리도마 세포주는 Pristane adjuvant를 투여한지 5~7일이 지났을 때 주입할 수 있도록 배양하였다.
2) 배양한 하이브리도마 세포주를 50 ㎖ tube에 모으고 10 ㎖ PBS로 3번 세척하고 원심분리 하였다.
3) 원심분리가 끝나면 상등액은 석션으로 제거한 뒤 필요한 양의 세포가 100 ㎕에 들어가도록 계산하여 1XPBS를 넣고 잘 섞어준 뒤 1.5 ㎖ tube에 옮겨 담았다.
4) 1 ㎖ syringe에 상기 용액을 취한 뒤 바늘을 위로 향하게 하여 syringe 안의 공기를 제거하였다.
5) Balb/c 쥐 1마리당 100 ㎕를 복강에 주사한 뒤 케이지에 넣어 복수가 차는지를 관찰하였다.
6) 하이브리도마 세포주를 주입한 쥐를 주입한지 5일이 지난 후부터는 매일 관찰하여 배가 부풀었는지 아닌지를 확인하였다.
7) 배가 부풀었다면 주사바늘이 23G 이하인 제품 (3 ㎖ or 5 ㎖ syringe 사용)을 사용하여 쥐의 복강을 찔러 ascites를 수집하였다.
8) Harvest하여 tube에 넣은 ascites는 적혈구가 응집되도록 RT, 10min incubation하고 원심분리 하였다.
9) 원심분리가 끝나면 상등액만 새로운 1.5 ㎖ tube에 넣어 -70℃에 보관하였다.
3. 항체의 생산
1) 생산한 ascites는 -70℃에서 꺼내 4℃에서 녹이며, 정제할 항체의 subtype을 확인하여 사용할 비드를 정했다. 비드의 양은 ascites의 0.5 volume을 사용하였다.
2) 5 ㎖ 크로마토그래피 칼럼에 잘 섞은 Protein A 비드나 G 비드를 계산한 대로 넣고 1X PBS 5 ㎖을 칼럼에 흘려서 비드 워싱을 진행하였다.
3) 워싱이 모두 끝나면 녹인 ascites를 넣고 칼럼의 cap을 씌웠다.
4) 비드와 항체가 binding이 되도록 4℃, 1hr rotation binding을 진행하였다.
5) Rotation binding이 끝난 후 용액을 모두 flow through 과정을 거쳤다.
6) 1XPBS 100 ㎖을 넣어 칼럼 워싱을 진행하였다.
7) 1.5 ㎖ tube에 neutralization buffer를 100 ㎕씩 넣고 칼럼에 1 ㎖의 IgG elution buffer를 가하여 IgG가 elution 되는 즉시 neutralization 될 수 있도록 하였다. 동일 조건으로 총 10개 fraction을 받았다.
8) 각 fraction의 일부를 12 % SDS-PAGE gel에 loading 및 gel 염색하여 밴드를 확인하였다. 염색하는 동안 fraction은 4 ℃에 보관하였다.
9) 밴드가 뚜렷한 fraction을 모아서 dialysis tubing에 넣고 클립으로 새지 않도록 밀봉하였다. 1X PBS 1 L가 들어있는 비커에 dialysis tubing과 stirrer bar를 넣고 1hr, 4℃, stirrer에서 dialysis를 진행하였다.
10) 새로운 1X PBS 1 L에 overnight (15hr)동안 상기 9)과 같은 조건으로 dialysis 하였다.
11) 다음날, dialysis tubing에서 용액을 수집한 뒤 바로 BCA assay kit를 이용하여 정량하였다.
상기 방법에 따라, WRS에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 세 종류의 하이브리도마 세포주가 선별되었다. 상기 선별된 각 하이브리도마 세포주에서 생산되는 항체는 3B10H5, 6A3B4 및 1D4C3로 명명하였다.
실시예 2: 파지 디스플레이(Phage display)를 통한 단일클론 항체의 선별
(1) ScFv 파지 디스플레이 바이오패닝
1) Immunotube에 1㎖ 1XPBS와 WRS antigen 10 ㎍을 넣고 vortexing 해준 후 테이프로 입구를 봉하여 200 rpm, 37℃, 1hr coating 한다.
2) ER2537 E.coli cell을 SB media 20 ㎖에 50 ㎕를 접종 후 OD600=0.5가 될 때까지 200 rpm, 37 ℃ incubation 한다.
3) Coating solution을 버리고 tap water를 이용하여 1번 washing 후 3 % skim milk 5 ㎖로 RT, 1hr 동안 blocking 한다. 이때 phage library (tube당 400 l)에도 각각 600 l의 3 % skim milk를 넣고 RT, 1hr blocking 한다.
4) Blocking이 끝난 Ag coating tube 에 blocking한 phage를 넣고 (input test를 위해 약 5 ㎕ 정도 남긴다) 1hr 30min동안 150 rpm, 37 ℃ shaking incubator에서 binding 진행한다.
5) Phage binding이 끝난 Ag coating tube의 solution을 제거하고 2번 tap water로 채우고 버리는 washing을 한다. 그 후 0.05% PBST를 이용하여 2번 washing한다. 0.05 % PBST washing은 1 ㎖ 정도 넣은 후 vortexing 후 PBST로 채운 후 버리는 방식으로 진행한다. (2 nd round 이후부터는 washing을 5번으로 늘린다)
6) Antigen에 binding한 phage를 elution하기 위해 100 mM trietylamine (TEA solution)을 1 ㎖ 넣고 RT, 8 min 동안 incubation 한다.
7) Incubation을 진행하는 동안 50 ㎖ tube에 0.5 ㎖ 1 M Tris-HCl (pH. 7.4)를 넣어둔 후, incubation이 끝나면 eluted phage solution을 넣고 pipetting으로 섞어 neutralization한다.
8) 2)에서 길러놓은 ER2537 E.coli cell을 neutralized phage에 8.5 ㎖ 넣고 120 rpm, 37 ℃, 1hr 동안 infection 과정을 진행한다 (Output).
9) Output sample을 3,000 rpm, 4℃, 5min. centrifuge한 다음 soup을 버리고 100 l SB media를 이용하여 pellet을 pipetting하여 150 mm dish (LB agar plate, Amp+) 에 spreading 한다.
10) Input, output titration
- Input titer: 2.32 ㎕ of library stock left from step 6 in 500 ㎕ of SB → 2.32 ㎕ in 500㎕ of SB → 2.32 ㎕ in 500 ㎕ of SB → 1 ㎕ in 100 ㎕ of E.coli cell → 100 ㎕ spreading → 다음날 colony수 counting (n) → Input=n*10 -10
- Output titer: 1 ㎕ of output sample in 1 ㎖ of SB (Output 1) → 10 l in 100 ㎕ of SB (Output 2) → Output 1, 2 (n1, n2) 모두 100 ㎕씩 spreading → Output1=n1*10 -5, Output2=n2*10 -6
11) 다음날 Output sample spreading 해놓았던 150 mm output dish에 5 ㎖ SB media를 넣고 scraper로 모든 colony를 긁어모은다.
12) 그 후에 15 ㎖ tube에 긁은 bacteria solution을 3 ㎖ 넣고 50% glycerol (autoclave)을 1.5 ㎖씩 넣고 섞어서 3개 vial로 나누어 -70 ℃에 stock으로 보관한다.
13) 20 ㎖ SB-ampicillin을 넣은 50 ㎖ tube에 50 ㎕의 panning output stock을 넣고 200 rpm, 37 ℃, OD600 < 1 정도가 될 때까지 키운다.
14) Helper phage 1 ㎖을 넣어준 후 120 rpm, 37 ℃, 1hr 동안 infection한다.
15) Kanamycin을 최종 70 ㎍/㎖이 되도록 넣고 200 rpm, 30 ℃, overnight (15 hr) 으로 incubation한다.
16) 다음날, Overnight culture output phage solution 을 4 ℃, 12,000 rpm, 20 min 동안 centrifuge한다. Supernatant를 5 ㎖ 5X PEG buffer가 들어있는 50 ㎖ tube에 넣고 inverting한 후 ice에서 30min 동안 incubation한다.
17) Incubation한 output phage solution을 4 ℃, 12,000 rpm, 20min 동안 centrifuge한다. Supernatant를 버리고 pellet을 400 ㎕ PBS에 re-suspension하여 1.5 ㎖ micro tube에 옮긴 후 14,000 rpm, 4 ℃, 2min 동안 centrifuge를 진행한다. Supernatant를 새 tube에 옮긴 후 다음 round panning의 input library로 사용한다.
18) 각 round 별 Stock을 만들어서 -70 ℃에 보관한다.
- 2 nd round부터는 WRS antigen의 양을 줄여서 사용한다.
- 2 nd library를 사용할 때에는 ER2537 E.coli cell 대신에 TG1 E.coli cell을 사용한다.
상기 방법에 따른 바이오패닝을 통해서 파지 라이브러리로부터 2,112개의 후보군을 선정하였다.
(2) ELISA 스크리닝
1) Enrich된 round의 stock을 -70 ℃에서 꺼내 녹인다.
2) Single colony를 얻기 위해 녹인 stock을 1/1,000, 1/10,000으로 dilution하여 90 mm LB (+Amp) plate에 spreading하여 incubator에서 37 ℃, overnight (15 hr) incubation 한다.
3) 다음날, 96 well cell culture plate에 well당 200 ㎕의 SB(+Amp.)를 넣고 (실험용 plate), stock용으로 쓰일 copy 96 well plate에는 well당 150 ㎕의 SB(+Amp.)을 넣어준다.
4) Copy plate는 잠시 4 ℃에 보관하고 실험용 plate에 멸균된 이쑤시개를 사용하여 90 mm LB plate에 있는 single colony를 picking 후 1개의 well에 넣어준다.
5) 실험용 plate를 plate shaker에 끼우고 speed 2.5로, 80% 이상이 뿌옇게 자랄 때까지 shaking incubation한다.
6) Copy plate를 꺼낸 후 96 pin replicator를 사용하여 실험용 plate의 자란 세포를 찍은 후 copy plate에 다시 찍어 copy한다.
7) 실험용 plate에는 IPTG를 1 mM이 되도록 넣고 (1 M IPTG 11 ㎕ per SB(+Amp.) 1 ㎖) copy plate와 30℃, overnight (15hr.), plate shaker speed 2로 shaking incubation한다.
8) 다음날, overnight으로 키운 copy plate는 well당 75 ㎕ 50% glycerol을 넣은 후 -70 ℃에 넣어 보관한다. Overnight으로 induction을 진행한 실험용 plate는 꺼내어 4 ℃, 3,500 rpm, 20min 동안 centrifuge를 진행한다.
9) Centrifuge를 진행하는 동안, screening에 필요한 antigen을 96 well half plate에 4 ㎍/㎖로 37 ℃, 1hr 동안 coating한다. Negative control로 antigen이 coating되지 않은 plate를 사용한다.
10) Centrifuge를 진행한 실험용 plate는 상층액을 버리고 휴지에 살짝 털어준 후 well당 60 ㎕ 1X TES buffer를 넣고 37 ℃, 20min 간 plate shaker에서 speed 4로 shaking을 진행한다.
11) 실험용 plate well당 90 ㎕ 0.2X TES buffer를 추가로 넣고 37 ℃, 5min 간 plate shaker에서 speed 2.5로 shaking을 진행한다.
12) 실험용 plate를 ice에서 30min 이상 incubation한다.
13) Antigen이 coating된 plate에 solution을 버리고 tap water로 한번 씻은 후 휴지에 물기를 털어준다.
14) Antigen이 coating된 plate에 3% Skim milk를 well당 130 ㎕를 넣고 RT, 1hr 동안 blocking한다.
15) Blocking time이 20min 정도 남았을 때 ice에 incubation해놓은 실험용 plate를 3,500 rpm, 4 ℃, 20min 동안 centrifuge를 진행한다.
16) Antigen이 coating된 plate의 blocking solution을 제거하고 tap water로 한번 씻은 후 휴지에 물기를 털어준다.
17) 실험용 plate에서 antigen coating된 plate와 negative control plate에 각각 well당 25 ㎕의 supernatant를 넣어준다. 이 때 well의 같은 자리에 넣어준 뒤 RT, 1hr 동안 binding 과정을 진행한다.
18) Binding과정을 진행하는 동안 Secondary antibody (Anti-HA HRP, 1:2,000)를 미리 준비하여 4 ℃에 보관한다.
19) Antigen coating된 plate의 binding solution을 버린 뒤 1X PBS-T를 well당 130 ㎕넣은 후 버린다 (washing 과정). 이 과정을 2번 더 반복한다 (총 3번). 마지막엔 건조한 티슈에 살짝 털어준다.
20) Secondary antibody를 well당 100 ㎕을 넣은 후 RT, 1hr 동안 binding 과정을 진행한다.
21) 19)의 washing과정을 반복한다.
22) TMB solution을 well당 50 ㎕을 넣은 후 RT에서 최대 15min 동안 incubation 후 stop solution (H 2SO 4)을 well당 50 ㎕을 넣고 반응을 종료하여 ELISA reader, OD 450 nm에서 값을 측정한다.
상기 방법을 통해 209개의 scFv 후보군을 다시 한번 선별하였다.
(3) ScFv 클론의 정제
1) 상기 선별된 Monoclonal Phage를 -70℃에 보관중인 stock에서 5 ㎕를 따서 3 ㎖ SB가 들어있는 14 ㎖ tube에 넣는다.
2) 200 rpm, 37℃, 2hr 동안 incubation을 진행한다. 이후 100 ㎖ SB가 들어있는 flask에 cell을 모두 넣고 OD600 <1이 되도록 200 rpm, 37℃로 키운다.
3) 1 M IPTG를 final 1 mM이 되도록 100 ㎕를 넣고 200 rpm, 30℃, overnight(15hr)으로 induction을 진행한다.
4) 다음날, Cell을 50 ㎖ tube 2개로 모은 후 3,500 rpm, 4℃, 15min 동안 centrifuge를 진행하여 supernatant는 버리고 pellet만 취한다.
5) Pellet을 3 ㎖ 1X TES로 잘 풀어준 후, 4.5 ㎖ 0.2X TES를 넣고 ice에서 30min 이상 incubation을 진행한다.
6) 12,000 rpm, 4℃, 30min 동안 centrifuge를 진행하고 supernatant(crude extract)를 취하여 0.45 ㎛ filter를 사용하여 filtering을 진행한다.
7) Column에 200 l Ni-NTA bead를 넣고 5 ㎖ 1X PBS을 넣어 bead washing을 진행한다.
8) 이후 filtering한 extract를 넣고 떨어지는 extract를 받아 한번 더 내려 Ni-NTA bead에 binding을 진행한다.
9) Binding이 끝나면 30 ㎖ washing buffer (5 mM imidazole in PBS)를 넣고 washing을 진행한다.
10) 5 ㎖의 elution buffer (200 mM imidazole in PBS)를 넣고 eluent 를 1개의 1.5 ㎖ tube에 1 ㎖을 4개의 1.5 ㎖ tube에 0.5 ㎖씩 받는다.
11) 5개의 새로운 1.5 ㎖ tube에 5X sample buffer를 4 ㎕씩 넣고 eluent 16 ㎕씩 넣어준 후 tube를 100 ℃에서 7min간 끓여준다.
12) 10% SDS-PAGE gel을 cassette에 조립 후 tank에 넣고 gel 안쪽과 바깥쪽 tank에 1X Running buffer를 채운다.
13) Protein marker 5 ㎕, 5개의 sample 20 ㎕를 순서대로 loading 한다.
14) 전기영동을 실시한다.
15) Loading이 끝나면 cassette에서 gel을 분리하여 gel이 잠길 때까지 instant blue staining solution을 사용하여 staining을 진행한다.
16) Staining이 끝나면 band의 굵기를 확인한다. Band가 나타나는 fraction의 solution을 dialysis tube, 1XPBS를 이용하여 4℃, 1hr 동안 dialysis를 진행한다.
17) 1hr 뒤에 새로운 1X PBS 1 L로 갈아준 후 4℃, overnight (15hr)으로 dialysis를 진행한다.
18) 다음날, sample을 꺼낸 후 dialysis tube의 위의 입구를 열어 샘플의 harvest를 진행한다.
19) BCA test를 이용하여 단백질 정량을 진행한다.
20) 정량이 끝난 정제된 scFv는 -70℃에 보관한다.
상기 정제과정 이후에 human cell lysate를 이용한 웨스턴 블롯, 면역침강법(immunoprecipitation) 및 IgG engineering을 통해 최종적으로 3개의 scFv 클론을 선별하였다.
실시예 3: 서열 시퀀싱(sequencing)
상기 실시예 1에서 선별된 하이브리도마 세포의 총 RNA는 TRIzol 시약의 기술 매뉴얼에 따라 분리하였다. PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit의 기술 매뉴얼에 따라 범용 프라이머를 사용하여 총 RNA를 cDNA로 역전사시켰다. 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)의 항체 단편은 RACD(rapid amplification od cDNA ends)에 따라 증폭하였다. 증폭된 항체 단편을 표준 클로닝 벡터에 별도로 클로닝 하였다. 콜로니 PCR은 정확한 크기의 삽입물을 가진 클론을 스크리닝하기 위해 수행되었다. 정확한 크기의 인서트를 가진 5 개 이상의 콜로니가 각각의 단편에 대해 서열화되었다. 상이한 클론의 서열을 정렬하고 이들 클론의 컨센서스 서열을 제공하였다.
상기 실시예 2에서 선별된 각 scFv 단클론 파지를 HiYield Plasmid Mini kit(Real Biotech corporation, YPD100)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 plasmid DNA를 추출한 후 시퀀싱을 진행하였다.
상기 방법에 따라 실시예 1 및 실시예 2에서 선별된 총 6종의 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열을 확인하였고, 이의 각 일례를 도 1 내지 6에 나타내었다(도 1 내지 3: 실시예 1의 방법에 따라 선별된 단일클론 항체, 도 4 내지 6: 실시예 2의 방법에 따라 선별된 단일클론 항체).
실시예 4: 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 WRS 내 폴리펩티드의 확인
상기 실시예 1 및 2에서 제조한 단일클론 항체가 인식하는 폴리펩티드 영역을 확인하기 위해 471개의 아미노산으로 이루어진 서열번호 1의 WRS 단백질(1-471) 및 단백질의 단편(1-104, 1-154, 48-154 및 48-471)을 다음과 같은 방법으로 준비하였다.
1) WRS fragment protein을 정제하기 위해 pET28a vector에 WRS fragment gene이 cloning된 plasmid를 protein 발현을 위한 competent cell에 transformation한다.
2) Transformation한 cell은 LB(+Kanamycin) plate에 spreading한 뒤 37 ℃, 15hr culture한다.
3) 다음날, 1개의 colony를 3 ㎖ LB(+Kan)에 접종한 뒤 200 rpm, 37 ℃, 3hr culture한다.
4) Small culture한 cell을 500 ㎖ LB(+Kan)에 모두 넣고 37 ℃, 200 rpm, 4hr culture한다.
5) 0.8<OD value<1로 측정될 때 1 M IPTG stock을 250 ㎕씩 넣고 (Final 0.5 mM IPTG) 18 ℃, 200 rpm, overnight (15hr) induction한다.
6) 다음날, Induction을 진행한 cell을 4,000 rpm, 10min centrifuge한다.
7) Supernatant를 제거하고 각각의 pellet에 washing buffer 1을 10 ㎖씩 넣고 pellet을 풀어준다.
8) Sonicator를 사용하여 cell을 lysis한다. AMPL 35 %, 2sec 동안 진행하며 1min 동안 ice에 보관한다. 이 방식을 14번 반복한다. (Total 15번의 sonication)
9) 15,000 rpm, 4 ℃, 30min centrifuge하여 pellet과 supernatant를 분리한다.
10) Poly-Prep Chromatography Columns에 Ni-NTA bead를 200 ㎕ 넣고 5 ㎖의 washing buffer 1을 넣어 equilibrium을 진행한다.
11) Centrifuge가 끝난 50 ㎖ tube에서 supernatant를 0.45 μm filter를 이용하여 filtering한다. Bead가 들어있는 column에 넣어 흘려준다. 한번 더 진행한다.
12) Washing buffer 1을 넣어 washing을 진행한다.
13) Washing buffer 2을 넣어 washing을 진행한다.
14) Washing buffer 3을 넣어 washing을 진행한다.
15) Washing buffer 4을 넣어 washing을 진행한다.
16) 1.5 ㎖ tube에 washing이 끝난 column을 올려놓고 elution buffer를 넣어 eluate를 받는다.
17) 5 ㎖ tube에 5X sample buffer, DW를 넣고 flow through, washing buffer, eluate를 넣어준 후 5 min간 heat block에서 끓여준다.
18) 미리 만들어놓은 15 comb, 15% SDS-PAGE gel을 cassette에 조립 후 tank에 넣고 gel 안쪽과 바깥쪽 tank에 1X Running buffer를 채운다.
19) Protein marker, sample를 순서대로 loading 한다.
20) Gel loading할 동안 dialysis tubing을 100 ℃에서 10분간 DW에 중탕한다. 새로운 DW로 교체하여 2회 더 반복한 후 차갑게 식은 1X PBS 200 ㎖에 넣은 후 차게 식힌다.
21) Loading이 끝나면 cassette에서 gel을 분리하여 gel이 잠길 때까지 instant blue를 부어 staining을 진행한다. (도 7)
상기 방법을 통해 제조한 WRS 단백질, 이의 단편들 및 1차 항체로 상기 실시예 1 및 2에서 제조된 6종의 각 단일클론 항체를 이용하여 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이 상기 단일클론 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 WRS 단백질의 1-471 아미노산 중에서 1-47번째 아미노산으로 이루어진 단편(서열번호 2)을 특이적으로 인식함을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 항체의 결합 친화도 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제조된 6종의 각 단일클론 항체 및 상용 항체 2종(Abnova, 항-WRS 항체(Cat# H00007453-M02) 및 Novus biological, 항-WRS 항체(Cat# NBP2-32186))의 결합 친화도를 평가하고자, 서열번호 1의 full-length WRS 단백질에 대한 indirect ELISA assay를 수행하였다.
간략하게, 다음과 같은 방법에 따라 항체의 결합 친화도를 평가하였다:
1) WRS 단백질은 PBS에 1 ㎍/㎖로 희석하여 96-well plate에 100㎕/well 로딩한 후 상온에서 1시간 반응시켜 well에 coating한다.
2) Coating이 완료되면 PBST(0.05% tween-20) 버퍼로 1회 washing한 후, 3% BSA, PBST(0.1% tween-20)을 분주한 후 상온에서 1시간 반응시켜 blocking을 수행한다.
3) Biotin이 부착된 항체를 각 농도에 따라 blocking buffer로 희석한 후, 상온에서 1시간 반응시킨다.
4) PBST(0.05% tween-20)으로 washing을 수행한다.
5) Streptavidin-HRP를 blocking buffer로 희석한 후, 상온에서 1시간 반응시킨다.
6) PBST(0.05% tween-20)으로 5회 washing을 수행하여, 부착되지 않은 잔여물질을 모두 제거한다.
7) TMB를 50 ㎕/well 넣고, 상온에서 5분 반응한 후 2M H 2SO 4를 동량 첨가하여 반응을 종료시킨다.
8) Spectrophotometer(Sunrise, Tecan)로 흡광도를 측정한다. (450 nm)
9) 8)의 결과를 통해 EC 50값을 계산한다.
이에 대한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
3B6 4G4 4H9 6A3B4 1D4C3 3B10H5 Abnova Novus
EC 50 508.1 95.3 55.4 78.4 59.8 64.7 1655.6 532.8
상기 표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 항체 6종은 상용 항체 2종과 비교해 WRS 단백질에 대한 친화도가 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 항체의 결합 특이도 분석
상기 실시예 1 및 2에서 제조된 6종의 각 단일클론 항체 및 상용 항체 2종(Abnova, 항체-WRS 항체(Cat# H00007453-M02) 및 Novus biological, 항-WRS 항체(Cat# NBP2-32186))의 결합 특이도를 평가하고자 HCT116 세포의 용해물(lysate) 20 ㎍에 아래 조건에 따른 각각의 1차 항체 및 2차 항체를 처리하여 통상적인 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다:
* 1차 항체 (상온, 1시간)
3B6, 4G4, 4H9, 1D4C4, 3B10H5, 6A3B4: 1 ㎍/㎖
Abnova Ab: 1:5,000 dilution
Novus Ab: 1:10,000 dilution
* 2차 항체 (상온, 1시간)
Anti human HRP (Genscript, A00166): 1:5,000 dilution : 4H9, 3B6, 4G4
Anti-mouse HRP (Millipore, AP181P): 1:10,000 dilution : Abnova, 1D4C3, 3B10H5, 6A3B4
Anti-rabbit HRP (Millipore, AP187P): 1:10,000 dilution : Novus
이에 대한 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 항체 6종은 모두 단일 밴드를 나타낸 반면에, 상용 항체 2종의 경우에는 여러 개의 밴드가 나타난 것으로 확인되었다.
즉, 본 발명에 따른 항체의 결합 특이도가 상용 항체들과 비교해 현저히 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 교차반응성 검증
상기 실시예 1 및 2에서 제조된 6종의 각 단일클론 항체가 WRS 외에 세포 밖으로 분비되는 또 다른 ARS(Aminoacyl-tRNA synthetase) 단백질인 CRS(Cysteinyl-tRNA synthetase), AIMP1(Aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 1), GRS(Glycyl tRNA synthetase) 및 KRS(Lysyl tRNA synthetase)에 교차반응성을 나타내는지 여부를 확인하고자 다음과 같은 방법에 따라 indirect ELISA assay를 수행하였다:
1) 항원 코팅: 1 ㎍/㎖ in PBS, 100 ㎕/well, 4 ℃, overnight coating
2) 세척: 0.05 % PBST (0.05% tween 20), 200 ㎕/well, 3 times
3) 블로킹: 0.5 % BSA in 0.05 % PBST, 200 ㎕/well, RT, 1hr
4) 1차 항체 결합: 500 ng/㎖ in 0.05 % PBST, 100 ㎕/well, RT, 1hr
5) 2차 항체 결합: anti-mouse HRP (AP160P) 1:10,000 in 0.05 % PBST, 100 ㎕/well, RT, 1hr
6) TMB 검출
7) 반응 중지 (2M H 2SO 4)
8) 흡광도 측정: 450 nm
이에 대한 결과를, 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 항체 6종은 WRS 외에 다른 ARS 단백질에는 결합하지 않는 것으로 확인되었다.
본 발명의 항체 또는 그 단편은 WRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 WRS 검출 및 억제가 가능하므로 WRS 검출 및 WRS가 관련된 질환인 암, 염증성 질환 또는 감염 질환의 진단에 효과적으로 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

Claims (18)

  1. WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 단백질에서 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은,
    (1) 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
    (2) 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
    (3) 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
    (4) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;
    (5) 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편; 및
    (6) 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L1, 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L2 및 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H1, 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H2 및 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR) H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체 또는 항체의 단편;으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항체의 단편은,
    (1) 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
    (2) 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
    (3) 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
    (4) 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편;
    (5) 서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 36으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편; 및
    (6) 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 및 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편; 으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체의 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 항체의 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  9. 제8항의 벡터로 형질 전환된 세포.
  10. 제9항의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 WRS에 결합하는 항체 또는 항체의 단편 생산방법.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편을 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 감염 질환은 감염성 염증 질환인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 감염성 염증 질환은 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  15. 암 진단용 제제를 제조하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편의 용도.
  16. a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
    b) 상기 시료에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 암인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 암 진단 방법.
  17. 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 제제를 제조하기 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편의 용도.
  18. a) 개체로부터 시료를 수득하는 단계;
    b) 상기 시료에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체의 단편으로 WRS 단백질 발현량을 측정하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 측정한 단백질 발현량이 증가하는 경우 감염 질환 또는 감염 합병증인 것으로 판단하는 단계를 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단 방법.
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US17/627,904 US20220252601A1 (en) 2019-07-18 2020-07-17 Antibody specifically binding to wrs protein, and use thereof
JP2022503793A JP7302092B2 (ja) 2019-07-18 2020-07-17 Ｗｒｓタンパク質に特異的に結合する抗体及びその用途

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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220268787A1 (en) * 2019-07-18 2022-08-25 Jw Bioscience Antibody specifically binding to wrs protein, and use thereof

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US6174713B1 (en) * 1997-06-16 2001-01-16 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Candida cytoplasmic tryptophanyl-tRNA synthetase proteins, nucleic acids and strains comprising same
WO2012048125A2 (en) * 2010-10-06 2012-04-12 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related protein fragments of tryptophanyl trna synthetases
KR20150077891A (ko) * 2013-12-30 2015-07-08 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 항 wrs 모노클로날 항체 및 이의 용도
KR20170027258A (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 제이더블유바이오사이언스 주식회사 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 패혈증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR20170027313A (ko) 2015-09-01 2017-03-09 제이더블유바이오사이언스 주식회사 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR20180004674A (ko) * 2016-07-01 2018-01-12 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 아미노아실 티알엔에이 중합효소 관련 단백질 발현 수준을 이용한 갑상선 여포암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR20190087230A (ko) 2018-01-16 2019-07-24 삼성전자주식회사 복수의 카메라를 이용하여 영상 데이터를 생성하는 방법 및 서버

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7667004B2 (en) * 2001-04-17 2010-02-23 Abmaxis, Inc. Humanized antibodies against vascular endothelial growth factor
WO2016187514A1 (en) * 2015-05-21 2016-11-24 Actinium Pharmaceueuticals, Inc. Infusion administration of conjugated monoclonal antibodies
EP3507304B1 (en) * 2016-09-02 2024-04-03 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with duocars

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US6174713B1 (en) * 1997-06-16 2001-01-16 Cubist Pharmaceuticals, Inc. Candida cytoplasmic tryptophanyl-tRNA synthetase proteins, nucleic acids and strains comprising same
WO2012048125A2 (en) * 2010-10-06 2012-04-12 Atyr Pharma, Inc. Innovative discovery of therapeutic, diagnostic, and antibody compositions related protein fragments of tryptophanyl trna synthetases
KR20150077891A (ko) * 2013-12-30 2015-07-08 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 항 wrs 모노클로날 항체 및 이의 용도
KR20170027258A (ko) * 2015-09-01 2017-03-09 제이더블유바이오사이언스 주식회사 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 패혈증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR20170027313A (ko) 2015-09-01 2017-03-09 제이더블유바이오사이언스 주식회사 트립토파닐 티알엔에이 합성효소를 이용한 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR20180004674A (ko) * 2016-07-01 2018-01-12 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단 아미노아실 티알엔에이 중합효소 관련 단백질 발현 수준을 이용한 갑상선 여포암 진단용 조성물과 진단 마커 검출 방법
KR20190087230A (ko) 2018-01-16 2019-07-24 삼성전자주식회사 복수의 카메라를 이용하여 영상 데이터를 생성하는 방법 및 서버

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current Protocols in Immunology", vol. 1, 2, 1991, WILEY-INTERSCIENCE
"GenBank", Database accession no. NM -004184.3
CLACKSON ET AL., NATURE, vol. 352, 1991, pages 624 - 628
GHANIPOUR A. ET AL.: "The prognostic significance of tryptophanyl-tRNA synthetase in colorectal cancer (2009) Cancer Epidemiol", BIOMARKERS PREV, vol. 18, no. 11, pages 2949 - 2955
GHANIPOUR A. ET AL.: "The prognostic significance of tryptophanyl-tRNA synthetase in colorectal cancer", CANCER EPIDEMIOL BIOMARKERS PREV., vol. 18, no. 11, 2009, pages 2949 - 2955, XP055224418, DOI: 10.1158/1055-9965.EPI-09-0456
GRIFFITH ET AL., EMBO J., vol. 12, 1993, pages 725 - 734
JOHNSON, KEVIN SCHISWELL, DAVID J., CURRENT OPINIONS IN STRUCTURAL BIOLOGY, vol. 3, 1993, pages 564 - 571
KOHLER ET AL., NATURE, vol. 256, 1975, pages 495
MARKS ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 222, 1991, pages 581 - 597
MCCAFFERTY ET AL., NATURE, vol. 348, 1990, pages 552 - 553
MORRISON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 6851 - 6855
O'SULLIVAN ET AL.: "Methods in Enzym.", vol. 73, 1981, ACADEMIC PRESS, article "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", pages: 147 - 166
PRESTA, J. ALLERGY CLIN. IMMUNOL., vol. 116, 2005, pages 731

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