WO2023287212A1 - 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents

조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 Download PDF

Info

Publication number
WO2023287212A1
WO2023287212A1 PCT/KR2022/010262 KR2022010262W WO2023287212A1 WO 2023287212 A1 WO2023287212 A1 WO 2023287212A1 KR 2022010262 W KR2022010262 W KR 2022010262W WO 2023287212 A1 WO2023287212 A1 WO 2023287212A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
disease
antibody
seq
present
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/010262
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김정호
김범석
Original Assignee
주식회사 굳티셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 굳티셀 filed Critical 주식회사 굳티셀
Priority to EP22842474.3A priority Critical patent/EP4375670A1/en
Priority to CN202280050296.0A priority patent/CN117716238A/zh
Publication of WO2023287212A1 publication Critical patent/WO2023287212A1/ko
Priority to US18/413,322 priority patent/US20240141036A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein, which is an antigen present on the surface of regulatory T cells, and an antibody or antigen-binding fragment specifically binding thereto.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • the most important characteristic of any normal organism is the ability to recognize and eliminate non-self antigens while not reacting detrimentally to antigenic substances that make up the self. .
  • Such unresponsiveness of the living body to self-antigens is referred to as immunologic unresponsiveness or tolerance.
  • Self-tolerance occurs by eliminating lymphocytes that may have specific receptors for self-antigens, or by inactivating self-reactive functions after encountering self-antigens. When a problem arises in inducing or maintaining self-tolerance, an immune response against self-antigens occurs, and a disease caused by this is called an autoimmune disease.
  • the regulatory T cells play an important role in naturally preventing the occurrence of excessive inflammation and immune response, but when autoimmune diseases and chronic inflammatory diseases occur, the function and number of regulatory T cells are significantly reduced. reported Therefore, in the case of patients with immune and inflammatory diseases, it is important that regulatory T cells are produced at normal levels, and this can be one of the treatments for these diseases.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the CDR mainly serves to bind to the epitope of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially starting from the N-terminus as CDR1, CDR2, and CDR3, and are also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • One object of the present invention is to provide an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein present on the surface of regulatory T cells (Treg cells).
  • Another object of the present invention is to provide an antibody or antigen-binding fragment capable of specifically binding to the epitope.
  • Another object of the present invention is a nucleic acid molecule encoding the epitope of the present invention; an expression vector into which the nucleic acid molecule is inserted; and a host cell line transfected with the expression vector.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating various diseases comprising an antibody or antigen-binding fragment capable of specifically binding to the epitope as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody-drug conjugate (ADC) in which the antibody according to the present invention is combined with a drug for preventing or treating various diseases.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • Another object of the present invention is to treat various diseases including antibody-drug conjugates as an active ingredient, for example, immune-related diseases;
  • various diseases including antibody-drug conjugates as an active ingredient, for example, immune-related diseases;
  • Another object of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment capable of specifically binding to the epitope; and methods for preventing or treating various diseases using antibody-drug conjugates.
  • the present invention relates to an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein or an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to the epitope.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • the "epitope” refers to a sequence of amino acids within an antigen in which amino acids (or a subset thereof) within the sequence are specifically recognized by an antibody or binding fragment, e.g., an antibody or binding fragment described herein. do.
  • An epitope may include one or more antigenic determinants. For example, antibodies raised against an isolated peptide corresponding to a conformational epitope recognize some or all of that epitope sequence.
  • the "Lrig-1 protein” is a transmembrane protein present on the surface of regulatory T cells, and includes an extracellular or lumenal leucine-rich repeat (LRR) and three immune-like domains. (immunoglobulin-like domains), transmembrane sequences, and cytoplasmic tails.
  • the LRIG gene family includes LRIG1, LRIG2 and LRIG3, and the amino acids constituting each family are highly conserved.
  • the LRIG1 gene is highly expressed in normal skin, and can regulate the proliferation of epithelial stem cells by expressing it in basal and hair follicle cells.
  • the Lrig-1 protein may be a protein derived from mammals or mice, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein may be Lrig-1 protein derived from mammals, such as humans, primates such as monkeys, and rodents such as mice and rats.
  • the Lrig-1 protein may be human-derived Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 1, which may be encoded by the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein may be mouse-derived Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3, which may be encoded by the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 protein may be an extracellular domain of the Lrig-1 protein, but is not limited thereto.
  • the Lrig-1 extracellular domain of the present invention may be an extracellular domain of the Lrig-1 protein derived from mammals, such as humans, primates such as monkeys, and rodents such as mice and rats.
  • the extracellular protein of the Lrig-1 protein may be an extracellular domain of the Lrig-1 protein derived from human or mouse, but is not limited thereto.
  • the extracellular domain of the Lrig-1 protein may be represented by SEQ ID NO: 5 corresponding to the 35th to 794th amino acid sequence of the human-derived Lrig-1 protein, but is not limited thereto.
  • the extracellular domain of the Lrig-1 protein may be represented by SEQ ID NO: 6 corresponding to the 35th to 794th amino acid sequence of the mouse-derived Lrig-1 protein, but is not limited thereto.
  • an epitope of the Lrig-1 protein comprising at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 35 to 45 is provided.
  • the epitope of the Lirg-1 protein may be an epitope comprising at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 35 to 40, but is not limited thereto not.
  • the epitope of the Lrig-1 protein may be an epitope comprising at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 41 to SEQ ID NO: 45. It is not limited.
  • the epitope of the Lrig-1 protein is located at positions 62 to 101, or 88 to 92, or 90 to 101, or 111 to 134, or 452 of the Lrig-1 protein. It may be a site corresponding to the 476th, or 472nd to 480th, or 542nd to 553rd base sequence.
  • the epitope of the Lrig-1 protein may be a region corresponding to the 95th to 101st base sequence or the 472nd to 476th base sequence of the Lrig-1 protein.
  • the epitope of the present invention may be a conformational epitope.
  • the "conformational epitope” of the present invention is composed of a discontinuous amino acid sequence. These conformational epitopes react with the three-dimensional structure of the antibody antigen-binding site.
  • nucleic acid molecule encoding the epitope provided in the present invention is provided.
  • Nucleic acid molecules of the present invention include all nucleic acid molecules in which the amino acid sequence of a polypeptide provided in the present invention is translated into a polynucleotide sequence as known to those skilled in the art. Therefore, various polynucleotide sequences by ORF (open reading frame) can be prepared, and all of them are also included in the nucleic acid molecule of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • an expression vector into which the isolated nucleic acid molecule provided in the present invention is inserted is provided.
  • the "vector” is a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which a nucleic acid molecule is linked.
  • a vector is a “plasmid,” which refers to a circular double-stranded DNA into which additional DNA segments can be ligated.
  • a phage vector refers to a viral vector, in which additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (e.g., bacterial vectors are episomal mammalian vectors having a bacterial origin of replication).
  • vectors may integrate into the host cell's genome as it enters the host cell, thereby replicating along with the host genome.
  • some vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operatively linked.
  • Such vectors are termed “recombinant expression vectors” or simply “expression vectors” herein.
  • expression vectors useful in recombinant DNA techniques often exist in the form of plasmids.
  • plasmid and vector may be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used form among vectors.
  • the expression vector in the present invention include commercially widely used pCDNA vectors, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, and Ti vectors; cosmid; phages such as lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, and T7; It may be selected from the group consisting of plant viruses, but is not limited thereto, and all expression vectors known to those skilled in the art as expression vectors can be used in the present invention, and when selecting an expression vector, it depends on the properties of the host cell of interest.
  • introducing a vector into a host cell it may be performed by calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-dextran controlled transfection, lipofectamine transfection or electroporation, but is not limited thereto.
  • An introduction method suitable for the expression vector and host cell can be selected and used.
  • the vector contains one or more selection markers, but is not limited thereto, and selection is possible depending on whether a product is produced using a vector that does not contain a selection marker. Selection of the selection marker is selected by the target host cell, and since this method is already known to those skilled in the art, the present invention is not limited thereto.
  • a tag sequence may be inserted into the expression vector and fused thereto.
  • the tag includes, but is not limited to, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, a myc tag, or a flag tag, and any tag that facilitates purification known to those skilled in the art can be used in the present invention.
  • a host cell line transformed with the expression vector provided in the present invention is provided.
  • the "host cell” includes an individual cell or cell culture that can be or has been a recipient of vector(s) for incorporation of a polypeptide insert.
  • a host cell includes the progeny of a single host cell, which may not necessarily be completely identical (morphologically or in genomic DNA complement) to the original parent cell because of natural, accidental or deliberate mutations.
  • Host cells include cells transformed in vivo with the polypeptide(s) of the present disclosure.
  • the host cell may include cells of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin, for example, bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, and Salmonella typhimurium; fungal cells such as yeast cells and Pichia pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; CHO (Chinese hamster ovary cells), SP2/0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, Bow melanoma cells, HT-1080, BHK (Baby Hamster Kidney cells), HEK (Human Embryonic Kidney cells) or PERC.6 (Human retinal cells) animal cells; Or it may be a plant cell, but is not limited thereto, and any cell that can be used as a host cell line known to those skilled in the art can be used.
  • bacterial cells such as Escherichia coli,
  • the transformation method of the present invention is any method of injecting a desired vector into the host cell, and may include any known method capable of injecting the vector into the host cell, for example, a method using CaCl 2 , electroporation, microinjection, calcium phosphate precipitation, electroporation, liposome-mediated transfection, DEAE-dextran treatment, gene bombardment, and transformation using viruses, etc. may be used, but are limited thereto. It is not.
  • a binding molecule specifically binding to the epitope of the present invention is provided.
  • binding molecule of the present invention may be either an antibody or an antigen-binding fragment, but is not limited thereto.
  • the "antibody” is a full-length antibody or a portion of an antibody that has the ability to bind to the Lrig-1 protein and competitively binds to the Lrig-1 antigenic determinant region with the binding molecule of the present invention. All inclusive.
  • the "antibody” refers to a protein molecule that acts as a receptor that specifically recognizes an antigen, including an immunoglobulin molecule that is immunologically reactive with a specific antigen.
  • the antigen may be Lrig-1 protein present on the surface of regulatory T cells. Preferably, it may specifically recognize the leucine rich region or immunoglobulin-like domain of the Lrig-1 protein, but is not limited thereto.
  • the "immunoglobulin” has a heavy chain and a light chain, each of which includes a constant region and a variable region.
  • the light chain and heavy chain variable regions include three variable regions called complementarity determining regions (hereinafter referred to as “CDRs”) and four framework regions.
  • CDRs complementarity determining regions
  • the CDR mainly serves to bind to the antigenic determinant (Epitope) of the antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to sequentially starting from the N-terminus as CDR1, CDR2, and CDR3, and are also identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises heavy chain CDRs and light chain CDRs selected from the CDRs provided herein, or includes conservative variants of the CDRs provided herein. It is a chimeric antibody or fragment that
  • variants of an amino acid sequence include amino acid insertion variants, amino acid addition variants, amino acid deletion variants and/or amino acid substitution variants.
  • Amino acid deletion variants comprising deletions at the N-terminus and/or C-terminus of a protein are also referred to as N-terminal and/or C-terminal truncation variants.
  • Amino acid insertion variants include insertions of single or two or more amino acids in a particular amino acid sequence.
  • amino acid sequence variants with insertions one or more amino acid residues are inserted at specific sites in the amino acid sequence, but random insertions with appropriate screening of the resulting product are also possible.
  • Amino acid addition variants include amino-terminal and/or carboxy-terminal fusions of one or more amino acids, such as 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, or more amino acids.
  • Amino acid deletion variants are characterized by the removal of one or more amino acids from the sequence, such as the removal of 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, or more amino acids. Deletions can be anywhere in the protein.
  • Amino acid substitution variants are characterized in that at least one residue in the sequence is removed and another residue is inserted in its place. It is preferred that the modification is at a position in the amino acid sequence that is not conserved between homologous proteins or peptides and/or replaces an amino acid with another amino acid having similar properties.
  • the amino acid changes in the protein variants are conservative amino acid changes, ie substitutions of similarly charged or uncharged amino acids. Conservative amino acid changes include substitution of one of the family of amino acids in which the side chain is related.
  • Naturally occurring amino acids generally fall into four families: acidic (aspartate, glutamate), basic (lysine, arginine, histidine), and non-polar (alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan). , and uncharged polar (glycine, asparagine, glutamine, cysteine, serine, threonine, tyrosine) amino acids. Phenylalanine, tryptophan, and tyrosine are sometimes grouped together as aromatic amino acids.
  • the degree of similarity, preferably identity, between a given amino acid sequence and an amino acid sequence that is a variant of the given amino acid sequence is at least about 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, will be 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% .
  • the degree of similarity or identity is preferably at least about 10%, at least about 20%, at least about 30%, at least about 40%, at least about 50%, at least about 60%, at least about 70% of the full length of the reference amino acid sequence, It is given for an amino acid region that is at least about 80%, at least about 90% or about 100%.
  • the degree of similarity or identity is at least about 20, at least about 40, at least about 60, at least about 80, preferably contiguous amino acids. , at least about 100, at least about 120, at least about 140, at least about 160, at least about 180, or about 200 amino acids.
  • the degree of similarity or identity is given over the full length of a reference amino acid sequence. Alignment to determine sequence similarity, preferably sequence identity, can be performed using tools known in the art, preferably best sequence alignment, for example using standard settings, preferably EMBOSS::needle, Matrix (Matrix). ): Align using Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.
  • Sequence similarity refers to the percentage of amino acids that are identical or exhibit conservative amino acid substitutions.
  • Sequence identity refers to the percentage of identical amino acids between the sequences.
  • percent identity is intended to denote the percentage of identical amino acid residues between two sequences to be compared, obtained after best alignment, this percentage is purely statistical and the differences between the two sequences are randomly distributed and over their full length.
  • Sequence comparison between two amino acid sequences is usually done by optimally aligning these sequences and then comparing them, the comparison being done segment by segment or by "comparison windows” to identify and compare local regions of sequence similarity.
  • Optimal alignment of sequences for comparison may be performed, in addition to manually, by local homology algorithms or by similarity search methods, or by computer programs using these algorithms (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Genetics Computer Group's Wisconsin Genetics Software Package (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA) of the Wisconsin Genetics Software Package).
  • Percent identity is calculated by determining the number of identical positions between the two sequences being compared, dividing this number by the number of positions compared, and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage identity between these two sequences.
  • Homologous amino acid sequences are according to the present invention at least 40%, in particular at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90% and preferably at least 95%, at least 98 or at least 99% of the amino acid residues. indicates identity.
  • Amino acid sequence variants described herein can be readily prepared by one skilled in the art, eg, by recombinant DNA manipulation. The manipulation of DNA sequences to produce proteins and peptides with substitutions, additions, insertions or deletions is well known.
  • the peptides and amino acid variants described herein can be readily prepared with the aid of known peptide synthesis techniques, such as, for example, by solid phase synthesis and similar methods.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises a heavy chain CDR and a light chain CDR selected from the CDRs provided herein, or a humanized antibody comprising conservative variants of the CDRs provided herein, or it's a snippet
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof provided herein comprises a light chain and/or heavy chain comprising a sequence provided herein or conservative variants thereof.
  • a conservative variant is at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% homologous to a reference sequence provided herein. have a sequence
  • conservative variants comprise 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10 or more amino acid substitutions, insertions or deletions. do.
  • an antibody that specifically binds to the Lrig-1 protein provided herein comprises a sequence provided herein or a conservative variant thereof.
  • conservative variants include conservative amino acid substitutions, insertions or deletions.
  • conservative amino acid substitutions are substitutions of one amino acid with another amino acid having similar structural or chemical properties, eg, similar side chains, while retaining the biological activity of the reference sequence. Exemplary conservative substitutions are well known in the art.
  • the "full-length antibody” has a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, each light chain connected to the heavy chain by a disulfide bond, and IgA, IgD, IgE, IgM, and IgG.
  • the IgG includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 as its subtype.
  • the "antigen-binding fragment” refers to a fragment having an antigen-binding function
  • examples of antigen-binding fragments include 1 light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) and light chain constants.
  • the antigen-binding fragment may be a Fab or F(ab') 2 fragment using a proteolytic enzyme, for example, papain or pepsin, and may be prepared through genetic recombination technology.
  • the antibodies and fragments thereof are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, bivalent ( bivalent), bispecific molecule, minibody, domain antibody, bispecific antibody, antibody mimetic, unibody, diabody, triabody, tetrabody ( tetrabody) or a fragment thereof, but is not limited thereto.
  • the "chimeric antibody” is an antibody in which the variable region of a mouse antibody and the constant region of a human antibody are recombined, and the immune response is greatly improved compared to the mouse antibody.
  • the "humanized antibody” refers to an antibody in which the protein sequence of an antibody derived from a non-human species is modified to resemble an antibody variant naturally produced in a human.
  • the humanized antibody may be prepared by recombination of a mouse-derived CDR with a human antibody-derived FR to prepare a humanized variable region, and then recombination with the constant region of a desired human antibody to prepare a humanized antibody.
  • the binding molecule may be provided as a bispecific antibody or a bispecific antigen-binding fragment capable of binding to Lrig-1 protein and other proteins.
  • the bispecific antibody and bispecific antigen-binding fragment may comprise a binding molecule according to the present invention.
  • the bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments include an antigen-binding domain capable of binding to Lrig-1 protein, wherein the antigen-binding domain capable of binding to Lrig-1 protein It may comprise or consist of a binding molecule according to the present invention.
  • Bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments provided by the present invention include an antigen-binding domain, which is a binding molecule capable of binding to the Lrig-1 protein according to the present invention, and an antigen-binding domain capable of binding to other target proteins.
  • the antigen-binding domain capable of binding to another target protein is a protein other than Lrig-1 protein, but is not limited thereto, and may be, for example, an antigen-binding domain capable of binding to PD-1 or a cell surface receptor. However, it is not limited thereto.
  • bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments according to the present invention may be provided in any suitable format, such as those described in documents incorporated herein by reference in their entirety.
  • a bispecific antibody or bispecific antigen-binding fragment may be a bispecific antibody conjugate (eg an IgG2, F(ab')2 or CovX-body), a bispecific IgG or IgG-like molecule (eg an IgG2, F(ab')2 or CovX-body).
  • Db diabodies
  • dsDb dsDb
  • DART scDb
  • tandAbs tandem scFv
  • tandem dAb/VHH triple body
  • Fab-scFv Fab-scFv
  • F(ab')2-scFv2 bispecific Fc and CH3 fusion proteins
  • taFv-Fc di-diabody, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, or scFv-kih-CH3), or a bispecific fusion protein such as scFv2-albumin , scDb-albumin, taFv-toxin, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-cytokine 2).
  • scFv2-albumin scDb-albumin
  • taFv-toxin DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-cytokine 2
  • the method for producing the bispecific antibody in the present invention includes chemical cross-linking of an antibody or antibody fragment with a reducing disulfide or non-reducing thioether bond.
  • a reducing disulfide or non-reducing thioether bond For example, N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-propionate (SPDP) is used to generate disulfide-linked bispecific F(ab)2 heterodimers, for example, It can be used to chemically cross-link Fab fragments via hinge region SH-groups.
  • SPDP N-succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)-propionate
  • another method for producing the bispecific antibody in the present invention is to fuse an antibody-producing hybridoma with, for example, polyethylene glycol to create a quadroma cell capable of secreting the bispecific antibody.
  • Bispecific antibodies and bispecific antigen-binding fragments according to the present invention can be produced recombinantly, for example by expression from a nucleic acid construct encoding a polypeptide for the antigen-binding molecule.
  • two antigen binding domains i.e., light and heavy chain variable domains for an antigen binding domain capable of binding PD-1, etc., and light and heavy chain variable domains for an antigen binding domain capable of binding other target proteins.
  • a DNA construct comprising sequences encoding the light and heavy chain variable domains for ) and a suitable linker between the antigen binding domains or a dimerization domain can be prepared by molecular cloning techniques.
  • Recombinant bispecific antibodies may then be produced by expression (eg in vitro) of the construct in a suitable host cell (eg mammalian host cell), and the expressed recombinant bispecific antibody may then optionally be purified.
  • An antibody may be produced by an affinity maturation process that results in a modified antibody with improved affinity of the antibody for an antigen compared to the unmodified parental antibody.
  • Affinity matured antibodies can be produced by procedures known in the art.
  • the binding molecule provided in the present invention may include a variant of the amino acid sequence as long as it can specifically bind to the Lrig-1 protein.
  • changes may be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties. Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of residues in the amino acid sequence of the antibody.
  • amino acid variations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc.
  • Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substituents revealed that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine can be said to be biologically functional equivalents.
  • each amino acid is given a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: Isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine/cysteine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); glutamine (-3.5); aspartate (-3.5); asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in conferring the interactive biological function of proteins. It is a known fact that amino acids having similar hydrophobicity indexes should be substituted to retain similar biological activities. When a mutation is introduced with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids exhibiting a difference in hydrophobicity index, preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • Amino acid exchanges in proteins that do not entirely alter the activity of the molecule are known in the art.
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, and Gln/Glu.
  • the binding molecule of the present invention is construed to include sequences showing substantial identity with the sequences listed in the Sequence Listing.
  • the term "substantial identity” refers to a sequence of at least 61% when the sequence of the present invention and any other sequence are paralleled so as to correspond as much as possible, and the paralleled sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence exhibiting homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology.
  • Alignment methods for sequence comparison are known in the art. Various methods and algorithms for alignment can be accessed from NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), NBCI (National Center for Biological Information), etc. available. BLAST is accessible at this address (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A sequence homology comparison method using this program can be checked online (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html).
  • the binding molecule preferably the antibody
  • the binding molecule may be produced by a conventional method for producing antibodies, but may also be produced by affinity maturation.
  • the affinity maturation refers to a process in which activated B cells produce antibodies with increased affinity for an antigen during an immune response.
  • the affinity maturation may generate antibodies or antibody fragments produced by affinity maturation based on the principle of mutation and selection, just like a process that occurs in nature.
  • the "monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of a single molecular composition obtained from substantially the same antibody population, and exhibits a single binding specificity and affinity for a specific epitope.
  • the "binding" or “specific binding” refers to the affinity of the antibody or antibody composition for the antigen of the present application.
  • “Specific binding” in antigen-antibody binding can typically be distinguished from non-specific background binding if the dissociation constant (Kd) is less than 1x10 -5 M or less than 1x10 -6 M or less than 1x10 -7 M.
  • Specific binding can be detected by methods known in the art, such as ELISA, surface plasmon resonance (SPR), immunoprecipitation, coprecipitation, and the like, and non-specific binding and specific binding Include an appropriate control group that can be differentiated.
  • the antibody or antigen-binding fragment of the present invention may exist as a multimer, such as a dimer, a trimer, a tetramer, or a pentamer, including at least a portion of the antigen-binding ability of a monomer.
  • These multimers also include homomultimers or heteromultimers. Since antibody multimers contain multiple antigen-binding sites, they have superior antigen-binding ability compared to monomers. Multimers of antibodies are also easy to construct multifunctional (bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) antibodies.
  • multifunctional refers to an antibody or antigen-binding fragment having two or more activities or functions (eg, antigen-binding ability, enzyme activity, ligand or receptor binding ability).
  • the antibody of the present invention Polypeptides having enzymatic activity, for example, luciferase, acetyltransferase, galactosidase and the like can be coupled.
  • Multifunctional antibodies also include antibodies in the form of multivalent or multispecific (bispecific, trispecific, etc.).
  • the antibody or antigen-binding fragment according to the present invention specifically binds to an epitope comprising a polypeptide represented by any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35 to 45 present on regulatory T cells, thereby inhibiting the function of the regulatory T cells.
  • various diseases such as immune-related diseases; Alternatively, neurodegenerative diseases or neuroinflammatory diseases can be prevented or treated.
  • the “immune-related disease” of the present invention may be at least one selected from the group consisting of autoimmune disease, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, asthma, atopy, and acute or chronic inflammatory disease, but is limited thereto It is not.
  • the autoimmune disease of the present invention is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Behçetsi disease, Sjögren's syndrome, Guilla-Barré syndrome, chronic thyroiditis, multiple sclerosis , polymyositis, ankylosing spondylitis, fibromyalgia, and polyarteritis nodosa, but may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • “Cranial nervous system disease” for preventing, improving or treating the composition provided in the present invention may be a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • neurodegenerative disease and “neuroinflammatory disease” of the present invention include stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, Paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration, Select from the group consisting of systemic atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune disease of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy It may be, but is not limited thereto.
  • a binding molecule, antibody or antigen-binding fragment provided by the present invention and an antibody-drug conjugate (Antibody-Drug Conjugate, ADC) comprising a drug is provided.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • the "antibody-drug conjugate (ADC)" refers to a form in which a drug and an antibody are chemically linked without reducing the biological activity of the antibody and the drug.
  • the antibody-drug conjugate is a form in which a drug is bound to an amino acid residue at the N-terminus of the heavy and/or light chain of an antibody, specifically, a drug to an ⁇ -amine group at the N-terminus of the heavy and/or light chain of an antibody. refers to this combined form.
  • the "drug” may mean any substance having a specific biological activity in cells, which is a concept including DNA, RNA, or peptide.
  • the drug may be in a form containing a reactive group capable of reacting with an ⁇ -amine group and cross-linking, and also includes a form in which a linker including a reactive group capable of reacting with an ⁇ -amine group and cross-linking is connected.
  • the type is not particularly limited. It includes all types that react with known amine groups. Examples include Isothiocyanate, Isocyanates, Acyl Azide, NHS ester, Sulfonyl chloride, Aldehyde, Glyoxal, Epoxide, Oxirane, Carbonate, Aryl halide, Imidoester, Carbodiimide, Anhydride and Fluorophenyl ester), but is not limited thereto.
  • the antibody-drug conjugate is the antibody or antigen-binding fragment comprising the epitope of the present invention, that is, Lrig-1 protein; or an epitope comprising a polypeptide consisting of a partial amino acid sequence of an extracellular domain of Lrig-1 protein; or an antibody or antigen-binding fragment that specifically binds to an epitope comprising a polypeptide represented by any one of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7 to 17, wherein the drug is an antibody that specifically binds to Lrig-1 protein
  • Any drug capable of treating a disease targeted by may be included, for example, a drug capable of treating an immune-related disease; Alternatively, it may be a drug capable of treating neurodegenerative diseases or neuroinflammatory diseases, but is not limited thereto.
  • the antibody or antigen-binding fragment provided by the present invention or antibody-drug conjugates (Antibody-Drug Conjugate, ADC) as an active ingredient, including various diseases, for example, immune-related diseases; Or it provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of brain nervous system disease.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • a binding molecule, antibody or antigen-binding fragment included as an active ingredient in the pharmaceutical composition in the present invention specifically binds to an epitope comprising a polypeptide represented by any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35 to 45 to regulate the function of the regulatory T cells, and to effector T cells Through the process of regulating activity, various diseases can be treated very effectively.
  • the “immune-related disease” of the present invention may be at least one selected from the group consisting of autoimmune disease, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, asthma, atopy, and acute or chronic inflammatory disease, but is limited thereto It is not.
  • the autoimmune disease of the present invention is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Behçetsi disease, Sjögren's syndrome, Guilla-Barré syndrome, chronic thyroiditis, multiple sclerosis , polymyositis, ankylosing spondylitis, fibromyalgia, and polyarteritis nodosa, but may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • “Cranial nervous system disease” for preventing, improving or treating the composition provided in the present invention may be a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • neurodegenerative disease and “neuroinflammatory disease” of the present invention include stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, Paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration, Select from the group consisting of systemic atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune disease of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy It may be, but is not limited thereto.
  • an immune-related disease comprising, as an active ingredient, a Chimeric Antigen Receptor (CAR) comprising an antigen-specific binding domain, a linking domain, and a CD3 zeta ( ⁇ ) signaling domain, or Provided is a pharmaceutical composition for preventing or treating brain nervous system diseases.
  • CAR Chimeric Antigen Receptor
  • ⁇ CD3 zeta
  • chimeric antigen receptor means an engineered receptor comprising an extracellular antigen binding domain and an intracellular signaling domain.
  • CAR single chain variable fragment
  • the binding domain may include a single chain variable fragment (scFv) capable of specifically recognizing the Lrig-1 protein.
  • scFv single chain variable fragment
  • the "single chain variable fragment” or “scFv” refers to a fusion protein of a variable heavy chain (VH) and a variable light chain (VL) of an antibody by a peptide linker between VL and VH.
  • the VH domain and the VL domain may be connected through a flexible linker.
  • the flexible linker is about 10 to 30 amino acids (eg, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 or 5 amino acids), preferably 15 amino acids long.
  • the linker length can act as an important determining site for chimeric antigen receptors, so a linker shorter than the above range can increase affinity, but also cause intracellular multimer formation to impair CAR expression. On the other hand, linkers longer than this range may reduce antigen affinity by moving the VL and VH CDRs farther apart in space.
  • the chimeric antigen receptor of the present invention may further include at least one of a hinge region (or spacer) and a signaling domain.
  • the hinge region is a part connecting the antigen-binding domain and the transmembrane domain, and is also called a 'spacer', and has the purpose of extending the antigen-binding domain from the T cell membrane or the NK cell membrane.
  • the hinge region can be obtained from any suitable sequence from any genus, including, for example, human or parts thereof, or CD8, CD28, 4-1BB, OX40 commonly used in the art.
  • the hinge region may include one selected from immunoglobulins (eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, and IgD) without being limited to immunoglobulins, but is not limited thereto.
  • immunoglobulins eg, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, and IgD
  • the signaling domain refers to a part of a chimeric antigen receptor found or engineered to be found inside a T cell.
  • the signaling domain may or may not include a transmembrane domain that serves to fix the chimeric antigen receptor in the plasma membrane of T cells.
  • the transmembrane domain and the signaling domain may be derived from the same protein (eg, CD3 zeta ( ⁇ ) molecule), or the transmembrane domain and the signaling domain may be derived from different proteins (eg, CD3 zeta ( ⁇ ) molecule).
  • CD3 zeta ( ⁇ ) molecule the transmembrane domain of CD28 and the intracellular signaling domain of the CD3 zeta ( ⁇ ) molecule, or vice versa).
  • the transmembrane domain includes, for example, T cell receptor ⁇ or ⁇ chain, all or part of the CD3 zeta ( ⁇ ) chain, CD28, CD3 ⁇ , CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, functional derivatives thereof, or combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the costimulatory domain comprises 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; natural killer group 2 member C (NKG2C); natural killer group 2 member (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; ligands that bind to LFA-1 (CD11a/CD18) or ICOS; active fragments thereof; functional derivatives thereof; or a functional signaling domain derived from a polypeptide comprising a combination thereof, but is not limited thereto.
  • 4-1BB CD137
  • OX40 CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; natural killer group 2 member C (NKG2C); natural killer group 2 member (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; ligands that bind to LFA-1 (CD11a/CD18) or ICOS; active fragments thereof; functional derivatives thereof; or a
  • the signaling domain is all or part of CD3 zeta ( ⁇ ), common FcR gamma (FcER1G), FcgammaRIIIa, FcRbeta (Fc epsilon lip), CD3gamma, CD3delta, CD3 epsilon, CD79a, CD79b,
  • DAP10 DNAX-activating protein 10
  • DAP12 DNAX-activating protein 12
  • an active fragment thereof a functional derivative thereof, or a combination thereof
  • the “immune-related disease” of the present invention may be at least one selected from the group consisting of autoimmune disease, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, asthma, atopy, and acute or chronic inflammatory disease, but is limited thereto It is not.
  • the autoimmune disease of the present invention is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Behçetsi disease, Sjögren's syndrome, Guilla-Barré syndrome, chronic thyroiditis, multiple sclerosis , polymyositis, ankylosing spondylitis, fibromyalgia, and polyarteritis nodosa, but may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • “Cranial nervous system disease” for preventing, improving or treating the composition provided in the present invention may be a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • neurodegenerative disease and “neuroinflammatory disease” of the present invention include stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, Paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration, Select from the group consisting of systemic atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune disease of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy It may be, but is not limited thereto.
  • prevention may include without limitation any act of blocking or suppressing or delaying the symptoms of a disease by using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment may include without limitation any action that improves or benefits the symptoms of a disease by using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages, and the pharmaceutical composition may be intended for humans.
  • the pharmaceutical compositions are not limited thereto, but are formulated in the form of oral formulations such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavors, etc. for oral administration, and buffers, preservatives, and painless agents for injections.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention may be variously prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, for oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. there is.
  • it may be formulated into solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained-release preparations, and the like.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil, and the like can be used.
  • fillers, anti-agglomerating agents, lubricants, wetting agents, flavoring agents, emulsifiers, preservatives, and the like may be further included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition in the present invention is not limited to these, but oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, This includes sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be administered in the form of a suppository for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on various factors including the activity of the specific compound used, age, body weight, general health, sex, diet, administration time, route of administration, excretion rate, drug combination and severity of the specific disease to be prevented or treated. It can vary widely, and the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition, body weight, degree of disease, drug type, administration route and period, but can be appropriately selected by those skilled in the art, and is 0.0001 to 50 mg/kg per day. Alternatively, it may be administered at 0.001 to 50 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The dosage is not intended to limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated into a pill, dragee, capsule, liquid, gel, syrup, slurry, or suspension.
  • a binding molecule according to the present invention or antibody-drug conjugates (Antibody-Drug Conjugate, ADC); or administering a pharmaceutically effective amount of a Chimeric Antigen Receptor (CAR) to a subject, for example, immune-related diseases; Or it relates to a method for preventing or treating a brain nervous system disease.
  • ADC Antibody-Drug Conjugate
  • CAR Chimeric Antigen Receptor
  • the “immune-related disease” of the present invention may be at least one selected from the group consisting of autoimmune disease, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, asthma, atopy, and acute or chronic inflammatory disease, but is limited thereto It is not.
  • the autoimmune disease of the present invention is rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Behçetsi disease, Sjögren's syndrome, Guilla-Barré syndrome, chronic thyroiditis, multiple sclerosis , polymyositis, ankylosing spondylitis, fibromyalgia, and polyarteritis nodosa, but may be at least one selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • “Cranial nervous system disease” for preventing, improving or treating the composition provided in the present invention may be a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease.
  • neurodegenerative disease and “neuroinflammatory disease” of the present invention include stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, Paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration, Select from the group consisting of systemic atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune disease of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy It may be, but is not limited thereto.
  • the antibody-drug conjugate specifically binds to an epitope comprising a polypeptide represented by any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35 to 45 to regulate the function of the regulatory T cell and regulate the activity of the effector T cell, thereby producing various The disease can be treated very effectively.
  • the "individual” is an individual suspected of having an immune-related disease or a brain nervous system disease
  • the subject suspected of having an immune-related disease or a brain nervous system disease is a mouse, including a human who has or may develop the disease, It refers to mammals including livestock, etc., but subjects that can be treated with the antibody, antigen-binding fragment or antibody-drug conjugate of the present invention are included without limitation.
  • the method of the present invention may include administering a pharmaceutically effective amount of an antibody or antibody-drug conjugate.
  • An appropriate total daily amount can be determined by a treating physician within the scope of sound medical judgment, and can be administered once or divided into several times.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used as the case may be, the patient's age, weight, general state of health, It is preferable to apply differently according to various factors including gender and diet, administration time, administration route and secretion rate of the composition, treatment period, drugs used together with or concurrently used with a specific composition, and similar factors well known in the medical field.
  • the method for preventing or treating the disease may be a combination therapy further comprising administering a compound or substance having therapeutic activity for one or more diseases.
  • the "combination" should be understood to denote simultaneous, separate or sequential administration.
  • the interval between administrations of the second components should be such that the beneficial effects of the combination are not lost.
  • the administration dose of the antibody or antibody-drug conjugate may be about 0.0001 ⁇ g to 500 mg per 1 kg of patient body weight, but is not limited thereto.
  • Covalent Labeling MS CL-MS
  • XL-MS Cross-linking MS
  • the protein used in the screening method of the present invention may be a form displayed on the cell surface, a form displayed on the surface of a virus (eg, bacteriophage), an isolated form, or a purified form. there is.
  • a protein displayed on the surface of a cell or virus it is preferable to immobilize the cell or virus on a solid substrate for expedited or automated screening.
  • immobilize the protein in an isolated or purified form on a solid substrate Any material commonly used in the art may be used as the substrate, and examples thereof include, but are not limited to, hydrocarbon polymers such as polystyrene and polypropylene, glass, metal, and gel.
  • Solid phase substrates can be provided in the form of dipsticks, microtiter plates, particles (eg beads), affinity columns and immunoblot membranes (eg polyvinylidene fluoride membranes). Most preferably, the solid substrate is a microtiter plate.
  • the screening method of the present invention can be carried out in various ways, and in particular, it can be carried out in a high throughput manner according to various binding assays known in the art.
  • the test substance or the proteins may be labeled with a detectable label.
  • the detectable label may be a chemical label (e.g., biotin), an enzyme label (e.g., horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, peroxidase, luciferase, ⁇ -galacto) sidase and ⁇ -glucosidase), radioactive labels (e.g., C14, I125, P32 and S35), fluorescent labels (e.g., coumarin, fluorescein, fluoresein isothiocyanate (FITC), rhodamine 6G, rhoda Min B (rhodamine B), TAMRA (6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI (4,6-diamidino-2phenylindole), HEX, TET, Dabsyl and FAM
  • a chemical label e.g
  • the occurrence of binding between the protein and the test substance can be analyzed by detecting a signal from the label.
  • alkaline phosphatase bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol-AS-B1-phosphate ) and chromogenic substrates such as ECF (enhanced chemifluorescence) to detect signals.
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • naphthol-AS-B1-phosphate naphthol-AS-B1-phosphate
  • chromogenic substrates such as ECF (enhanced chemifluorescence)
  • an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein at least one selected from the group consisting of polypeptides consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45 Provides an epitope comprising a polypeptide of
  • polypeptide provides an epitope, consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 44.
  • the polypeptide provides an epitope consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 35 to 37, 39 to 43, and 45.
  • Another embodiment of the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the epitope.
  • Another embodiment of the present invention provides an expression vector into which the nucleic acid molecule is inserted.
  • the expression vector provides a host cell line transfected
  • One embodiment of the present invention provides a binding molecule that specifically binds to an epitope containing at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45.
  • Another embodiment of the present invention provides a binding molecule, wherein the binding molecule is an antibody or a fragment thereof.
  • the antibody is a chimeric antibody, a humanized antibody, a bivalent, a bispecific molecule, a minibody, a domain antibody, a bispecific antibody, or an antibody mimetic. , a diabody, a triabody, a tetrabody, or a fragment thereof, to provide a binding molecule.
  • the antigen-specific binding domains are SEQ ID NOs: 35 to 45
  • An antigen-specific binding domain that specifically binds to an epitope comprising at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequence shown; and a chimeric antigen receptor which is a fusion protein comprising an immunoglobulin Fc region.
  • Another embodiment of the present invention provides an antibody-drug conjugate comprising the above binding molecule and drug.
  • Another embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune-related diseases comprising any one of the binding molecule, chimeric antigen receptor, and antibody-drug conjugate as an active ingredient.
  • the immune-related disease is at least one selected from the group consisting of autoimmune disease, graft-versus-host disease, organ transplant rejection, asthma, atopy, and acute or chronic inflammatory disease. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating related diseases.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating brain nervous system diseases comprising any one of the binding molecule, the chimeric antigen receptor, and the antibody-drug conjugate as an active ingredient.
  • the brain nervous system disease is a neurodegenerative disease or a neuroinflammatory disease, provides a pharmaceutical composition.
  • the neurodegenerative disease or neuroinflammatory disease is stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease , prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontotemporal dementia, Lewy dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, Paraneoplastic syndrome, corticobasal degeneration, Selected from the group consisting of systemic atrophy, progressive supranuclear palsy, autoimmune disease of the nervous system, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of at least one, neurodegenerative disease or neuroinflammatory disease.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for screening a protein epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) comprising the following steps.
  • (a) preparing an antibody comprising the heavy chain region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 and the light chain region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 or the heavy chain region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 Preparing an antibody comprising a light chain region represented by the amino acid sequence of or preparing an antibody comprising a heavy chain region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 and a light chain region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22
  • Another embodiment of the present invention provides a method for screening an epitope of Lrig-1 protein using the antibody.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for screening a binding molecule that is an antibody or a fragment thereof using the epitope.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for binding the epitope with a binding molecule that is an antibody or a fragment thereof.
  • a binding molecule that is an antibody or a fragment thereof that specifically binds to Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein,
  • the heavy chain variable region (VH) of the binding molecule comprises: the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82 and 88; Heavy chain variable region (VH) CDR1 selected from the group consisting of; a heavy chain variable region (VH) CDR2 selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83 and 89; and a heavy chain variable region (VH) CDR3 selected from the group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84 and 90; and
  • VL light chain variable region
  • VL light chain variable region
  • Heavy chain variable region (VL) CDR1 selected from the group consisting of; a heavy chain variable region (VL) CDR2 selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86 and 92; and a heavy chain variable region (VL) CDR3 selected from the group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87 and 93; ego
  • the binding molecule provides a binding molecule that specifically binds to an epitope containing at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45.
  • the antibody or antigen-binding fragment specifically binding to the epitope of Lrig-1 protein according to the present invention inhibits the function of regulatory T cells by specifically binding to the epitope of the present invention present on regulatory T cells, and By maintaining or increasing the activity of T cells, it can be used very efficiently for the prevention, improvement or treatment of various diseases.
  • FIG 1 shows the structure of Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the structure of Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows the expression levels of Lrig-1, Lrig-2 and Lrig-3 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 shows results of comparing the expression level of Lrig-1 protein in regulatory T cells and non-regulatory T cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 8 shows the expression of Lrig-1 protein on the surface of regulatory T cells according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing antibodies (GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 and GTC110-04) and Lrig-1 protein in one embodiment of the present invention. It shows the result of analyzing the binding force for .
  • FIG. 10 shows monoclonal antibodies (GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 and GTC110) specific for the Lrig-1 protein in an embodiment of the present invention. -04) and the regulatory mechanism of Lrig-1 protein-induced Stat3 phosphorylation in regulatory T cells.
  • FIG. 11 shows the result of confirming the weight loss after intraperitoneal injection of the monoclonal antibody according to the present invention to the inflammatory bowel disease animal model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 shows an experimental design diagram for producing a multiple sclerosis animal model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the treatment effect evaluation score after injecting the monoclonal antibody according to the present invention into an animal model of multiple sclerosis according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing the treatment effect evaluation score after injecting the monoclonal antibody according to the present invention into an animal model for multiple sclerosis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 15 shows that it was confirmed that demyelination was remarkably reduced when the antibody according to an embodiment of the present invention was administered.
  • helper T cell 1 CD4+ T-bet+
  • helper T cell 17 CD4+ RoR ⁇ t+
  • regulatory T cell CD4+ Foxp3+
  • various inflammatory cytokines IFN-gamma, IL-17A
  • anti-inflammatory cytokine IL-10 increased expression.
  • FIG. 17 to 20 are Y-maze test (FIG. 17), novel object, treatment effect by injection of monoclonal antibody according to the present invention in each group (G1 to G4) of Alzheimer's animal model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 21 to 23 show peptides degraded by treatment with proteases (chymotrypsin (FIG. 21), trypsin (FIG. 22) and Asp-N/Lys-C (FIG. 23)) according to an embodiment of the present invention. It shows the results confirmed through the labeling analysis.
  • proteases chymotrypsin (FIG. 21), trypsin (FIG. 22) and Asp-N/Lys-C (FIG. 23)
  • 24 and 25 show the results of aligning and comparing peptides degraded by each protease according to an embodiment of the present invention based on sequences identified by covalant labeling analysis.
  • FIG. 26 and 27 show the results of cross-linking analysis of peptides digested by treatment with proteases (chymotrypsin (FIG. 26) and trypsin (FIG. 27)) according to an embodiment of the present invention.
  • 28 and 29 show the results of aligning and comparing peptides degraded by each protease according to an embodiment of the present invention based on sequences identified by cross-linking analysis.
  • FIG. 30 shows the results of aligning and analyzing epitopes identified by covalant labeling and cross-linking analysis according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to an epitope of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein, which is an antigen present on the surface of regulatory T cells, and an antibody or antigen-binding fragment specifically binding thereto.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • an epitope of the Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 38, 39, 41, 42, 44 and 45
  • An epitope selected from the group consisting of polypeptides is provided.
  • a binding molecule that specifically binds to an epitope containing at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45 is provided. .
  • the antigen-specific binding domain is SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 35
  • An antigen-specific binding domain that specifically binds to an epitope comprising at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequence represented by 45; and a chimeric antigen receptor which is a fusion protein comprising an immunoglobulin Fc region.
  • binding molecule that is an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein
  • the heavy chain variable region (VH) of the binding molecule comprises: the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82 and 88; Heavy chain variable region (VH) CDR1 selected from the group consisting of; a heavy chain variable region (VH) CDR2 selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83 and 89; and a heavy chain variable region (VH) CDR3 selected from the group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84 and 90; and
  • VL light chain variable region
  • VL light chain variable region
  • Heavy chain variable region (VL) CDR1 selected from the group consisting of; a heavy chain variable region (VL) CDR2 selected from the group consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86 and 92; and a heavy chain variable region (VL) CDR3 selected from the group consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87 and 93; ego
  • the binding molecule provides a binding molecule that specifically binds to an epitope containing at least one polypeptide selected from the group consisting of polypeptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45.
  • T cell subsets such as Th0, Th1, Th2, Th17 and iTreg were prepared.
  • the iTreg refers to cells artificially induced to differentiate in a medium containing the following composition.
  • T cells As for the subtype of T cells, first, naive T cells obtained from the spleen of mice were isolated, and RPMI1640 (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) containing 10% fetal bovine serum (FBS; hyclone, logan, UT) was used. Differentiation was induced into each cell through 72-hour culture in a 37°C, 5% CO 2 incubator by further including the components of Table 1 below in the nutrient medium, respectively.
  • FBS fetal bovine serum
  • LRR1 to LRR15 were present in the Lrig-LRR domain (amino acid sequences 41 to 494) among the extracellular domains of the Lrig-1 protein.
  • LRR domains consisted of 23 to 27 amino acids, and 3 to 5 leucines were present.
  • Lrig-1 protein could act as a biomarker specific to regulatory T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from the spleen of mice using CD4 beads using magnet-activated cell sorting (MACS). Thereafter, regulatory T (CD4 + CD25 + T) cells and non-regulatory T (CD4 + CD25 - T) cells were isolated using a fluorescence-activated cell sorter (FACS) using the CD25 antibody.
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • mRNA was extracted from each cell and the cells differentiated in Preparation Example 1 using Trizol, and gDNA was removed from genomic RNA using a gDNA extraction kit (Qiagen) according to the protocol provided by the company. .
  • mRNA from which gDNA was removed was synthesized into cDNA using the BDsprint cDNA synthesis kit (Clonetech).
  • the real-time polymerase chain reaction was carried out using SYBR Green (Molecular Probes) under the conditions of 40 cycles of 3 minutes at 95 ° C, 15 seconds at 61 ° C, and 30 seconds at 72 ° C according to the protocol provided by the company. It was performed using primers, and the relative gene expression level was calculated using the ⁇ CT method, and normalized using HPRT, and the results are shown in FIGS. 3 to 6.
  • Lrig-1 is 18.1 times higher in regulatory T (CD4 + CD25 + T) cells than in non-regulatory T (CD4 + CD25 - T) cells. This level was about 10 times higher than that of Lag3 and Ikzf4, which are known markers of regulatory T cells.
  • regulatory T cells are higher than those of other types of immune cells. Expression of Lrig-1 mRNA was significantly higher in cells, especially in naturally isolated regulatory T cells (nTreg) compared to induced regulatory T cells (iTreg).
  • Lrig-1 was the highest among Lrig-1, Lrig-2, and Lrig-3 corresponding to the Lrig family.
  • the Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells, particularly in naturally occurring regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein expressed from Lrig-1 mRNA was specifically expressed only in regulatory T cells.
  • non-regulatory T cells indicated by dotted lines showed almost the same level of Lrig-1 as that of the negative control group, but many regulatory T cells showed high levels of Lrig-1.
  • the Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein In order for Lrig-1 protein to be a target for cell therapy, it must be expressed on the surface of regulatory T cells for more effective targeted therapy. Therefore, whether Lrig-1 protein was expressed on the surface was checked.
  • Each differentiated T cell subtype of Preparation Example 1 was stained with anti-CD4-APC and anti-Lrig-1-PE antibodies, and each cell surface was stained using a fluorescence-activated cell sorter (FACS). The expression level of Lrig-1 was measured in , and the results are shown in FIG. 8 .
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • Lrig-1 was expressed in an amount of 0.77 to 15.3 in activated T cells, Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells, and Naive T cells, whereas differentiation was expressed as high as 83.9 in induced T cells (iTreg).
  • the Lrig-1 protein according to the present invention is not only specifically expressed in regulatory T cells (Treg) cells, but also has a higher level of expression, particularly on the surface of regulatory T cells.
  • An antibody specific to the Lrig-1 protein according to the present invention was prepared. This antibody was not produced by specifying a specific antigenic determinant, but an antibody capable of binding to any site on the Lrig-1 protein was produced.
  • the antibody cells expressing the Lrig-1 protein were prepared. More specifically, the DNA fragment corresponding to SEQ ID NO: 2 and pcDNA (hygro) are cut with a cutting enzyme, incubated at 37 ° C., and then ligated to insert the DNA sequence of the Lrig-1 protein The prepared pcDNA was prepared. The prepared pcDNA into which SEQ ID NO: 2 was inserted was introduced into L cells through transfection so that Lrig-1 protein could be expressed on the surface of L cells.
  • Light chain and heavy chain amino acid sequences capable of binding to Lrig-1 expressed on the cell surface were selected from the Human scFv library, and a total of 8 heavy and light chains were selected.
  • a monoclonal antibody was prepared by fusing the selected heavy and light chain amino acid sequences with the mlgG2a Fc region or the human IgG1 Fc region.
  • the sequences of the monoclonal antibodies are shown in Table 3 below.
  • Preparation Examples 1 to 9 recognize Lrig-1 well, the antibodies of Preparation Examples 1 to 9 are bound to L cells stably expressing Lrig-1. After that, a secondary antibody capable of recognizing the mouse antibody and conjugated to eFlour 670 was added, and then the binding ability of the above preparations to the Lrig-1 protein was analyzed using FACS to help the result. 9.
  • Preparation Examples 1 to 9 affect the signal transduction pathway in regulatory T cells through the Lrig-1 protein
  • the monoclonal antibodies corresponding to Preparation Examples 1 to 9 After treating regulatory T cells with antibodies to stimulate Lrig-1 present on the surface of regulatory T cells, tyrosine phosphorylation of Stat3 protein present in stimulated regulatory T cells was performed by phosphotyrosine immunoblot ( tyrosine phosphorylation) was analyzed, and the results are shown in FIG. 10 .
  • the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibodies (GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03 and GTC210-04) according to the present invention showed the same level of phosphorylation of Stat3 as that of Th17 cells. It was confirmed that an increase in On the other hand, Lrig-1 protein-specific monoclonal antibodies (GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 and GTC110-04) according to the present invention continuously maintain Stat3 phosphorylation at the same level as iTreg cells and reduction was observed.
  • autoimmune diseases of Preparation Examples 1 to 4 which are monoclonal antibodies according to the present invention
  • CD45RB (high) cells were adoptively transplanted into RAG-1 -/- mice to autoimmune diseases.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • the antibodies of Preparation Examples 1 to 4 were intraperitoneally injected in an amount of 200 ⁇ g/mouse, and then the treatment effect of autoimmune disease was analyzed, and the results are shown in FIG. 11 shown in
  • the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibodies (GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03 and GTC210-04) according to the present invention significantly reduce body weight in inflammatory bowel disease-induced mice. inhibition could be confirmed.
  • the Lrig-1 protein-specific monoclonal antibody according to the present invention can treat autoimmune diseases, graft-versus-host diseases, organ transplant rejection, asthma, It can be seen that immune-related diseases such as atopy or acute or chronic inflammatory diseases can be effectively prevented, improved or treated.
  • mice were subcutaneously injected with MOG peptide and intraperitoneally injected with Mycobacterium tuberculosis toxin.
  • MOG peptide intraperitoneally injected with Mycobacterium tuberculosis toxin.
  • another injection of Mycobacterium tuberculosis toxin was given to boost the immune system of the mice.
  • mice were administered the GTC210-01 antibody prepared in Preparation Example 1, and anti-IL-17a antibody was administered as a positive control.
  • mice is immobile, but one forelimb is responsive to stimulation
  • mice were subcutaneously injected with MOG peptide and intraperitoneally injected with Mycobacterium tuberculosis toxin.
  • MOG peptide intraperitoneally injected with Mycobacterium tuberculosis toxin.
  • another injection of Mycobacterium tuberculosis toxin was given to boost the immune system of the mice.
  • mice On the 2nd, 4th, and 6th day, it was administered to mice at a concentration of 5mg/kg of the GTC210-03 antibody prepared in Preparation Example 3.
  • mice is immobile, but one forelimb is responsive to stimulation
  • Roxol Fast Blue was also put in xylene to deparaffinize, and then xylene was removed using 100% alcohol, followed by Roxol Fast Blue for the nerve tissue of the mouse. After staining with blue (Luxol Fast Blue) at 60° C. for 16 to 24 hours, followed by differential discoloration (differentiator), the results are shown in FIG. 15 .
  • an immune-related disease that is, an autoimmune disease
  • an experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mouse disease model was used.
  • Splenocytes of mice treated with the GTC210-03 antibody of Preparation Example 3 were isolated and CD4 T cells were reactivated.
  • the mouse since the mouse has already been exposed to the antigen in the body, when stimulated again outside the body, stronger activity occurs, and the differentiated CD4 T cells secrete their own representative cytokines.
  • cells were obtained on the 10th day after disease induction and reactivated for 48 hours with 40 ⁇ g/ml of MOG peptide. Then, the amount of cytokines present in the culture medium was confirmed by ELISA.
  • helper T cell 1 CD4+ T-bet+
  • helper T cell 17 CD4+ RoR ⁇ t+
  • regulatory T cells CD4+ Foxp3+
  • various inflammatory cytokines IFN-gamma, IL-17A
  • anti-inflammatory cytokines IL-10 increased expression.
  • the GTC210-03 antibody of Preparation Example 3 that specifically binds to the epitope according to the present invention when administered, it suppresses the expression of “inflammatory” cytokines as well as the expression of IL-10, an “anti-inflammatory” cytokine It was confirmed that the inflammatory response was eventually suppressed by increasing
  • mice 7-month-old Alzheimer's-induced 5xFAD mice (known to exhibit amyloid deposits, gliosis, and progressive neuronal loss with cognitive and motor deficits) were injected with GTC110-04 mouse antibody and GTC210-01 antibody at an amount of 10 mpk each. Injected intravenously for 1 month.
  • GTC110-04 mouse antibody As a positive control, 8-month-old Alzheimer's mice were subcutaneously injected with 100 ⁇ g of glatiramer acetate (GA, Copaxone®) for 3 weeks.
  • GA glatiramer acetate
  • mice of the group were treated with a Y-maze test, a Novel Object Recognition test, and a Water maze test.
  • a maze frame made by arranging the same three arms with a length of 40 cm (height of the wall 15 cm) at an angle of 120 degrees was used.
  • This experiment was a behavioral experiment using rodents' instinctive search habits, and it was a method that focused on the high possibility of exploring new areas.
  • the arm that was searched just before was memorized, and the higher the level of memory was displayed, the more they did not enter the same arm.
  • a search time of 8 minutes was provided per subject, and the final result was expressed as a spontaneous alteration (%) value in FIG. 17 .
  • the spontaneous alteration (%) value was calculated by Equation 1 below.
  • the behavioral pattern analysis was performed using SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA), and the results are shown in FIG. 17 .
  • Alzheimer's-induced mice were treated with the antibodies according to the present invention (GTC210-01 and GTC110-04 antibodies). When administered, it was confirmed that the spontaneous shift value was similar to that of the normal control group.
  • the normal control group (G1) was 0.51 ⁇ 0.06
  • the G2 group (vehicle) was measured as 0.42 ⁇ 0.04
  • the Alzheimer's induced group (G2) was measured as a normal control group.
  • the preference value was observed to be lower.
  • the antibodies according to the present invention GTC210-01 and GTC110-04 antibodies
  • a probe test was conducted on the 6th day after swimming practice, and as spatial perception ability, the value calculated as a percentage of the total swimming time of the time spent in the quadrant where the platform was located (Percentage of time in SW area, %) , The time taken to reach the position where the platform was (Latency to target, sec) was measured, and the results are shown in FIGS. 19 and 20.
  • analysis was performed using SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA). The criterion to exclude from the interpretation of the results was set as an individual turning only a specific part without searching through swimming.
  • the time spent in the quadrant where the platform was located was calculated as a percentage of the total swimming time (Percentage of time in SW area, %) was significantly increased, and the time taken to reach the position where the platform was located (Latency to target, sec) significantly decreased to a level similar to that of the normal control group.
  • IAA Iodoacetamide
  • Syringe filter 0.2um (Sartorius stedim, 16534)
  • the ratio of antigen and antibody was set to 2:1, and antigen samples were prepared. Then, DEPC was added so as not to exceed 1%, followed by reaction at 37 ° C. for 1 minute, and imidazole was added to complete the reaction. Then, after performing the precipitation reaction by adding acetone, the supernatant was removed by centrifugation, and the precipitate was well released using 0.1% PM. Trypsin, chymotrypsin, or Asp-N/Lys-C was added to the precipitate released in this manner to undergo degradation, and then sugar chains attached to proteins were removed using PNGase-F. Finally, disulfide bonds between cysteines of proteins were cleaved using DTT and IAA, and LC-MS and MS2 analysis were performed.
  • the ratio of antigen and antibody was set to 2:1, and two antigen samples were prepared. Then, the cross linker (CSBU) was sufficiently dissolved in DMSO. Thereafter, the ratio of the sample and DSG was added to be 1:100, and only DMSO was added to the other, followed by reaction at 25 °C for 1 hour. After the reaction was completed, the protein was decomposed using trypsin or chymotrypsin, and sugar chains attached to the protein were removed using PNGase-F. Finally, disulfide bonds between cysteines of proteins were cleaved using DTT and IAA, and LC-MS and MS2 analysis were performed.
  • CSBU cross linker
  • Step total time (min) Flow rate ( ⁇ L/min) A(%) B(%) 0 0.00 100.00 95.0 5.0
  • Control group huTregL1-his (Ag, Control) and test group huTregL1-his/E7-mlgG2a (Ag+Ab, Test) samples were treated with DEPC and then treated with trypsin, chymotrypsin or Asp-N/Lys-C to digest Each sample was analyzed three times repeatedly (see FIGS. 21 to 23).
  • the MS analysis results of the control group (Control 1) and the test group (Test 1) shown in the above analysis results were matched with the sequence of the control group (huTregL1-his) using the BioPhama finder program, and the labeled peptides were compared.
  • sequences E62-L101, D111-L134, and Q542-Y553 were 13.2%, 15.3%, and 14.7%, respectively, with a labeling decrease (%) of 10% or more.
  • the E62-L101 sequence the E62-K92 part (AL) showed 65.9%, L65-F87 part (Y) 48.7%, and the L88-L101 part showed labeling (%) of 88.6%. From this result, it can be considered that the L88-L101 portion with labeling (%) of 50% or more among the E62-L101 sequences is exposed to the outside.
  • the chymotrypsin-treated group showed a 15.3% labeling decrease (%), but it was confirmed that the control RSD was 62.4%.
  • the Q542-Y553 sequence also showed a 14.7% labeling decrease (%) in the chymotrypsin-treated group, and the labeling (%) of the control antigen was 50% or more, which was judged to be an externally exposed portion in terms of protein structure.
  • test group (huTregL1-his/E7-mlgG2a) mixture sample was prepared, the test group sample was treated with a cross-linker, disuccinimidyl dibutyric urea (DSBU), and the test group was treated with a protease (chymotrypsin or trypsin). Samples were disaggregated (FIGS. 27 and 28). Then, peptide sequences in which peptides digested with chymotrypsin and trypsin were not detected in the test tube (including 2% or less) were identified in comparison with the control group.
  • DSBU disuccinimidyl dibutyric urea
  • the peptide sequences not detected in the test group samples were combined and determined as the epitope site.
  • the peptide ratio (T%) of the same sequence detected in the test group sample compared to the control group was confirmed to be 2% or less in both chymotrypsin or trypsin. .
  • T158-F174 and G442-K476 were decreased in Chymotrypsin (Y) and Trypsin (T), respectively.
  • S362-K365 of the Trypsin (T) treated group was the only sequence where T% was not detected (0%).
  • T% was not detected (0%).
  • the epitope was predicted by synthesizing the previous results. Specifically, two sequences of huTregL1-his (Ag), including E62-L101 and G452-K476, were identified as identical positions in CL-MS and XL-MS analysis results. Among the L62-L101, the L88-K92 part showed a labeling decrease (%) in the two protease treatment groups (Chymotrypsin, Asp-N/Lys-C) as a result of CL-MS, and in the XL-MS analysis, the two protease treatment groups ( Chymotrypsin, Trypsin) were significantly reduced.
  • the S95-L101 portion In the case of the S95-L101 portion, it was an epitope overlappingly identified in chymotrypsin and trypsin in XL-MS. In addition, as a result of CL-MS, the L88-L101 portion with labeling (%) of 50% or more was exposed to the outside. In particular, in the case of L88-L101, the amino acid sequence in the sequence was composed of hydrophilic amino acids (Q89-S95) consecutively.
  • the antibody or antigen-binding fragment specifically binding to the epitope of Lrig-1 protein according to the present invention inhibits the function of regulatory T cells by specifically binding to the epitope of the present invention present on regulatory T cells, and By maintaining or increasing the activity of T cells, it can be used very efficiently for the prevention, improvement or treatment of various diseases.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Abstract

본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

Description

조절 T 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체
본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성은, 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비-자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 제거할 수 있는 능력을 갖는 것이다. 이처럼 자기 항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다. 자기 관용은 자기 항원의 특이적인 수용체를 가지고 있을지 모르는 림프구를 제거함으로써, 또는 자기 항원에 접한 후 스스로 반응하는 기능이 불활성화됨으로써 발생한다. 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기 항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 초래되는 질환을 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다.
상기 자가면역질환의 치료를 위하여, 1970년 대 초 Gershon에 의해 고식적 T 세포(conventional T cells)의 효과 기능(effector function)을 제어 및 억제할 수 있는 T 세포의 존재 가능성이 있는 억제 T 세포라는 개념을 도입하여, 처음으로 제시된 이래, 면역학의 많은 분야에서 조절 T 세포의 생물학적 특성 및 기능을 규명하기 위한 연구가 이루어져 왔다.
이에, 상기 조절 T 세포(Treg)는 과다한 염증과 면역반응의 발생을 자연적으로 방지하는 중요한 역할을 하지만, 자가면역질환과 만성염증질환이 발생하는 경우 조절 T 세포의 기능과 숫자가 현저하게 줄어드는 것이 보고되었다. 따라서, 면역 질환과 염증 질환이 있는 환자의 경우, 조절 T 세포가 정상적인 수준으로 생성되는 것이 중요하며, 이는 상기 질환의 치료법 중 하나가 될 수 있다.
현재까지 조절 T 세포에 특이적으로 존재하는 유전자 및 단백질에 대한 연구가 진행되어, CD25, CTLA4, CD62L, CD38, CD103, GITR 및 CD45RB 등의 물질이 표지 물질에 해당할 수 있음이 제시되어 왔지만, 아직 조절 T 세포만을 단독으로 표적화 할 수 있는 유전자 및 단백질은 존재하지 않는다.
한편, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 일 목적은 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 상기 에피토프를 코딩하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터; 및 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 다양한 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 항체와 다양한 질환의 예방 또는 치료 약물이 결합된 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체-약물 결합체를 유효성분으로 포함하는 다양한 질환, 예를 들면 면역 관련 질환; 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편; 및 항체-약물 결합체를 이용하여 다양한 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프 또는 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 "에피토프"는 서열 내의 아미노산(또는 이의 서브세트)이 항체 또는 결합 단편, 예를 들어 본 명세서에 기술된 항체 또는 결합 단편에 의해 특이적으로 인식되는 항원 내 아미노산의 서열을 의미한다. 에피토프는 하나 이상의 항원 결정기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 형태적 에피토프에 상응하는 분리된 펩티드에 대해 출현된 항체는 상기 에피토프 서열의 일부 또는 전부를 인식한다.
본 발명에서, 상기 "Lrig-1 단백질"은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역 체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 각각의 패밀리를 구성하는 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다. 따라서, 표피의 항상성 유지에 중요한 역할을 하며, 부존재시 건선이나 피부암으로 발전할 수 있다. LRIG1이 위치한 염색체 3p14.3 부분이 잘리는 경우에는 암세포로 발전할 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있으며, 실제로 신장암(renal cell carcinoma)과 편평상피암(cutaneous squamous cell carcinoma)에서는 LRIG1의 발현이 매우 감소되어 있는 것으로 확인되었다. 그런데 최근에는 상기 Lrig-1 단백질을 발현하는 암은 20~30% 정도에 불과하다고 밝혀지기도 하였다. 한편, 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질은 포유류 또는 마우스로부터 유래된 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 포유류, 예를 들면, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등으로부터 유래된 Lrig-1 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 Lrig-1 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 마우스 유래 Lrig-1 단백질일 수 있고, 이는 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질은 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 Lrig-1 세포 외 도메인은 포유류, 예를 들면, 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등으로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 단백질은 인간 또는 마우스로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 인간 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 5로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 마우스 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 6으로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명에 대해 보다 자세히 설명한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프로서, 상기 서열번호 35 내지 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 Lirg-1 단백질의 에피토프는 서열번호 35 내지 40으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 예시로서, 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프는 서열번호 41 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프는 Lrig-1 단백질의 62번째에서 101번째, 또는 88번째에서 92번째, 또는 90번째에서 101번째, 또는 111번째에서 134번째, 또는 452번째에서 476번째, 또는 472번째에서 480번째, 또는 542번째에서 553번째 염기서열에 해당하는 부위일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면 상기 Lrig-1 단백질의 에피토프는 Lrig-1 단백질의 95번째에서 101번째, 또는 472번째에서 476번째 염기서열에 해당하는 부위일 수 있다.
본 발명의 상기 에피토프는 입체구조 에피토프(conformational epitope)일 수 있다.
본 발명의 상기 "입체구조 에피토프"는 연속적인 서열로 이루어지는 1차원적인 선형 에피토프와는 달리, 불연속적인 아미노산 배열로 구성된다. 이러한 입체구조 에피토프는 항체 항원결합부위의 3차원적인 구조와 반응한다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 이를 통해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는 벡터 중에서 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자가 코딩하는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 태그(Tag) 서열을 상기 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 다르면, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주 세포주를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질 전환된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 상기 형질 전환 방법은 상기 숙주 세포에 목적하는 벡터를 주입시키는 임의의 방법으로서, 숙주 세포에 벡터를 주입시킬 수 있는 공지의 방법이라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면, CaCl2를 이용한 방법, 전기천공법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 유전자 밤바드먼트 및 바이러스를 이용한 형질 전환 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 상기 "결합 분자"는 항체 또는 항원 결합 단편 중 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "항체"는 전장 항체(full-length antibody) 또는 항체의 일부분으로써 Lrig-1 단백질에 결합할 능력을 가지며 본 발명의 결합 분자와 경쟁적으로 Lrig-1 항원 결정 부위에 결합하는 항체 단편 모두를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로블린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항원은 조절 T 세포(regulatory T cell)의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질일 수 있다. 바람직하게는 상기 Lrig-1 단백질의 류신 리치 구역(Leucine Rich Region) 또는 면역글로블린 유사 도메인을 특이적으로 인식하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 아니한다.
본 발명에서 상기 "면역글로불린"은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(Framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 항원 결정기(Epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2 및 CDR3로 지칭하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에 제공되는 CDR로부터 선택되는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR를 포함하거나, 본 발명에 제공되는 CDR의 보존적 변이체(conservative variants)를 포함하는 키메라 항체 또는 단편이다.
본 발명의 목적상, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 부가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서의 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 트렁케이션(truncation) 변이체로도 일컬어진다.
아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서의 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 생성된 생성물의 적절한 스크리닝을 수반하는 무작위 삽입도 가능하다.
아미노산 부가 변이체는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개, 또는 그 초과의 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합체를 포함한다.
아미노산 결실 변이체는 서열로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 1개, 2개, 3개, 5개, 10개, 20개, 30개, 50개, 또는 그 초과의 아미노산의 제거를 특징으로 한다. 결실은 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다.
아미노산 치환 변이체는 서열 내의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 또 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다. 변형이 상동성 단백질들 또는 펩티드들 사이에 보존되지 않는 아미노산 서열의 위치에 존재하는 것 및/또는 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체에서의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉, 유사하게 하전되거나 하전되지 않은 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 측쇄가 관련된 아미노산 패밀리 중 하나의 치환을 포함한다. 자연 발생 아미노산은 일반적으로 4가지 패밀리, 즉, 산성(아스파르테이트, 글루타메이트), 염기성(라이신, 아르기닌, 히스티딘), 비-극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 및 하전되지 않은 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산으로 나뉜다. 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 함께 분류된다.
바람직하게는, 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 사이의 유사성, 바람직하게는 동일성 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성 정도는 바람직하게는, 기준 아미노산 서열의 전장의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대해 주어진다. 예를 들어, 기준 아미노산 서열이 200개의 아미노산으로 이루어진 경우, 바람직하게는 유사성 또는 동일성 정도는, 바람직하게는 연속 아미노산인, 적어도 약 20개, 적어도 약 40개, 적어도 약 60개, 적어도 약 80개, 적어도 약 100개, 적어도 약 120개, 적어도 약 140개, 적어도 약 160개, 적어도 약 180개, 또는 약 200개의 아미노산에 대해 주어진다. 바람직한 구현예들에서, 유사성 또는 동일성 정도는 기준 아미노산 서열의 전장에 대해 주어진다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 업계에 알려진 도구, 바람직하게는 최상의 서열 정렬을 사용하여, 예를 들어, 표준 설정, 바람직하게는 EMBOSS::니들(needle), 매트릭스(Matrix): Blosum62, 갭 오픈(Gap Open) 10.0, 갭 익스텐드(Gap Extend) 0.5를 사용하는 Align을 사용하여 수행될 수 있다.
"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열들 사이의 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.
용어 "동일성 백분율"은, 최상의 정렬 후에 수득되는, 비교될 두 서열 사이의 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내도록 의도되며, 이 백분율은 순전히 통계적이며 두 서열 사이의 차이는 무작위로 및 그들의 전장에 걸쳐 분포된다. 두 아미노산 서열 사이의 서열 비교는, 통상적으로, 이들 서열을 최적으로 정렬한 후 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위해 세그먼트에 의해 또는 "비교 윈도우"에 의해 수행된다. 비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 수동에 의한 것 외에도, 국소 상동성 알고리즘에 의해 또는 유사성 검색 방법에 의해, 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 프로그램(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA)에 의해 생성될 수 있다.
동일성 백분율은 비교되는 두 서열 사이의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 사이의 동일성 백분율을 얻음으로써 계산된다.
상동성 아미노산 서열은 본 발명에 따르면 아미노산 잔기의 적어도 40%, 특히 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 바람직하게는 적어도 95%, 적어도 98 또는 적어도 99% 동일성을 나타낸다.
본원에 기재된 아미노산 서열 변이체는 당업자에 의해, 예를 들어, 재조합 DNA 조작에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 치환, 부가, 삽입 또는 결실을 갖는 단백질 및 펩티드를 제조하기 위한 DNA 서열의 조작은 잘 알려져 있다. 또한, 본원에 기재된 펩티드 및 아미노산 변이체는, 예를 들어, 고상 합성 및 유사한 방법에 의해서와 같은 알려진 펩티드 합성 기법의 도움으로 쉽게 제조될 수 있다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에 제공되는 CDR로부터 선택되는 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR를 포함하거나, 본 발명에 제공되는 CDR의 보존적 변이체를 포함하는 인간화 항체 또는 단편이다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명에 제공되는 서열을 포함하는 경쇄 및/또는 중쇄 또는 이들의 보존적 변이체를 포함한다. 일 구현예에서, 보존적 변이체는 본 발명에 제공되는 참조 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 상동하는 서열을 갖는다. 일 구현예에서, 보존적 변이체는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다.
본 발명에서, 본 발명에 제공되는 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 본원에 제공되는 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 "보존적 변이체"는 보존적 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다. 당업자는 보존적 아미노산 치환은 예를 들어, 유사한 측쇄와 같은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산과 하나의 아미노산의 치환이며, 참조 서열의 생물학적 활성을 유지한다는 것을 인식할 것이다. 예시적인 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 상기 "전장 항체"는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드(Disulfide) 결합으로 연결되어 있으며, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 IgG를 포함한다. 상기 IgG는 그 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다.
또한, 본 발명에서 상기 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 항원 결합 단편의 예는 ① 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변영역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; ② VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; ③ 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; ④ VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; ⑤ 분리된 CDR 영역; ⑥ 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; ⑦ VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); ⑧ 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 ⑨ 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함한다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소, 예를 들면 파파인 또는 펩신을 이용하는 경우 Fab 또는 F(ab')2의 단편을 얻을 수 있으며, 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 항체 및 이의 단편은 단일클론항체(monoclonal antibody), 다클론항체(polyclonal antibody), 키메라 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 유니바디(unibody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "키메라 항체"는, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 재조합 시킨 항체로서, 생쥐 항체에 비하여 면역 반응이 크게 개선된 항체이다.
또한, 본 발명에서 상기 "인간화 항체"는 인간이 아닌 종에서 유래한 항체의 단백질 서열을 인간에서 자연적으로 생산된 항체 변이체와 유사하도록 변형시킨 항체를 의미한다. 그 예로 상기 인간화 항체는 생쥐 유래의 CDR을 인간 항체 유래의 FR과 재조합시켜 인간화 가변 영역을 제조하고, 이를 바람직한 인간 항체의 불변 영역과 재조합시켜 인간화 항체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자는 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있고, 그 외의 다른 단백질에도 결합할 수 있는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편으로도 제공될 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 일 예시로, 상기 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함하고, 여기서 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 본 발명에 따르는 결합 분자를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 결합할 수 있는 결합 분자인 항원 결합 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 포함한다. 여기서, 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인은 Lrig-1 단백질 이외의 다른 단백질로, 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, PD-1 또는 세포 표면 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 임의의 적합한 포맷, 예를 들면, 전문이 본원에 참조로 인용된 문헌에 기재된 포맷으로 제공될 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원 결합 단편은 이중특이적 항체 접합체(예: IgG2, F(ab')2 또는 CovX-바디), 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 또는 2 인(in) 1-IgG, mAb2, 또는 Tandemab common LC), 비대칭성 이중특이적 IgG 또는 IgG-형 분자(예: kih IgG, kih IgG common LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍 또는 SEED-바디), 소형 이중특이적 항체 분자(예: 디아바디(Db), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv (taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디, 트리플 헤드, Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질(예: taFv-Fc, 디-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질(예: scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 당업자는 본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편을 설계하고 제조할 수 있다.
본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하는 방법은, 환원성 디설파이드 또는 비환원성 티오에테르 결합과 항체 또는 항체 단편의 화학적 가교결합을 포함한다. 예를 들면, N-석신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)는 디설파이드 연결된 이중특이적 F(ab)2 헤테로다이머를 생성하기 위해, 예를 들면, 힌지 영역 SH- 그룹을 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교결합시키는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 이중특이적 항체를 생산하기 위한 다른 방법은 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마 세포를 생성하기 위해 항체-생산 하이브리도마를, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시킴을 포함한다.
본 발명에 따르는 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원 결합 단편은 예를 들면, 항원 결합 분자를 위한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 작제물로부터 발현에 의해 재조합으로 생산될 수 있다.
예를 들면, 2개의 항원 결합 도메인(즉, PD-1 등에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 위한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 코딩하고, 항원 결합 도메인 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 이중특이적 항체는 이후 적합한 숙주 세포(예: 포유류 숙주 세포) 중에서 작제물의 발현(예: 시험관 내)에 의해 생산될 수 있고, 이어서 발현된 재조합 이중특이적 항체는 임의로 정제될 수 있다.
항체는, 비변형된 부모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선된 변형된 항체가 생성되는 친화도 성숙 공정에 의해 생성될 수 있다. 친화도 성숙 항체는 당해 기술 분야에 공지된 절차로 생산될 수 있다.
아울러, 본 발명에서 제공하는 결합 분자는, Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 한, 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신 및 히스티딘; 알라닌, 글라이신 및 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). 단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 수행할 수 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Gln/Glu 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 결합 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다.
본 발명에서 용어 "실질적인 동일성"이란, 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 병렬하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 병렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), NBCI (National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn and tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 이 주소에서 접속 가능하다(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 온라인(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ blast_help.html)을 통해 확인할 있다.
본 발명에서 상기 결합 분자, 바람직하게 상기 항체는, 항체를 생산하는 통상의 방법에 의해 생성될 수 있지만, 친화도 성숙(Affinity maturation)에 의해 생성될 수 있다.
본 발명에서 상기 "친화도 성숙(Affinity maturation)"은, 활성화된 B 세포가 면역 반응 과정에서 항원에 대한 친화도가 증가된 항체를 생산하는 과정을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 친화도 성숙은 자연에서 일어나는 과정과 동일하게, 돌연변이와 선택의 원리에 기초하여 친화도 성숙으로 인해 생성된 항체 또는 항체 단편을 생성할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 "단일클론항체"는, 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 일컫는 말로, 특정 항원 결정기(Epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
본 발명에서 상기 "결합" 또는 "특이적 결합"은 본원 항체 또는 항체 조성물의 항원에 대한 친화도를 나타내는 것이다. 항원 항체 결합에서 "특이적 결합"은 전형적으로 해리상수(dissociation constant, Kd)가 1x10-5M 미만 또는 1x10-6M 미만 또는 1x10-7M 미만인 경우 비특이적인 배경 결합과 구분될 수 있다. 특이적 결합은 당업계의 공지된 방법, 예를 들면 ELISA, SPR(Surface plasmon resonance), 면역침전(immunoprecipitation), 공침전(coprecipitation) 등의 방법으로 검출될 수 있으며, 비특이적 결합과 특이적 결합을 구분할 수 있는 적절한 대조군을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 단량체의 항원 결합능의 적어도 일부를 포함하는 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 등의 다량체로 존재할 수 있다. 이러한 다량체는 또한 동종다량체, 또는 이종다량체를 포함하는 것이다. 항체 다량체는 다수의 항원 결합 부위를 포함하기 때문에 단량체와 비교하여 항원에 대한 결합능이 우수하다. 항체의 다량체는 또한 다기능성(bifunctional, trifunctional, tetrafunctional) 항체 제작에도 용이하다.
본 발명에서 상기 "다기능성"이란, 두 가지 이상의 활성 또는 기능 (예를 들면 항원결합능, 효소 활성, 리간드 또는 수용체 결합능)을 갖는 항체 또는 항원 결합 단편을 일컫는 것으로, 예를 들면 본 발명의 항체는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드 예를 들면 루시퍼라제, 아세틸트랜스퍼라제, 갈락토시다제 등과 결합될 수 있다. 다기능성 항체는 또한 다가성(multivalent) 또는 다특이성(bispecific, trispecific, 등) 형태의 항체를 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포 상에 존재하는 서열번호 35 내지 45 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하여, 이펙터 T 세포의 활성을 조절함으로써 다양한 질환, 예를 들면 면역 관련 질환; 또는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 “면역 관련 질환”은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 및 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 조성물이 예방, 개선 또는 치료하기 위한 "뇌신경계 질환"은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 상기 “신경 퇴행성 질환”및 “신경 염증성 질환”은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 결합 분자, 항체 또는 항원 결합 단편; 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 제공한다.
본 발명에서 상기 "항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)"란, 항체와 약물의 생물학적 활성을 저하시키지 않으면서 약물과 항체를 화학적으로 연결한 형태를 지칭한다. 본 발명에서 상기 항체-약물 결합체는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단의 아미노산 잔기에 약물이 결합된 형태, 구체적으로는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 N-말단, α-아민기에 약물이 결합된 형태를 말한다.
본 발명에서 상기 "약물"은 세포에 특정 생물학적 활성을 가지는 임의의 물질을 의미할 수 있으며, 이는 DNA, RNA 또는 펩타이드(Peptide)를 포함하는 개념이다. 상기 약물은 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 형태일 수 있으며, α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기를 포함하는 링커가 연결되어 있는 형태 역시 포함한다.
본 발명에서 상기 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있는 반응기의 예로는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단의 α-아민기와 반응하여 가교할 수 있다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 아민기와 반응하는 종류를 모두 포함한다. 그 예로 아이소티오시아네이트(Isothiocyanate), 아이소시아네이트(Isocyanates), 아실 아자이드(Acyl azide), NHS 에스터(NHS ester), 설포닐 클로라이드(Sulfonyl chloride), 알데하이드(Aldehyde), 글리옥살(Glyoxal), 에폭사이드(Epoxide), 옥시레인(Oxirane), 칼보네이트(Carbonate), 아릴 할라이드(Aryl halide), 이미도에스터(Imidoester), 카보이미드(Carbodiimide), 안하이드라이드(Anhydride) 및 플루오로페닐 에스터(Fluorophenyl ester) 중 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 항체-약물 결합체는 상기 항체 또는 항원 결합 단편으로 본 발명의 에피토프, 즉 Lrig-1 단백질; 또는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인의 일부 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프; 또는 서열번호 7 내지 17 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하고, 이때 상기 약물은 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 표적으로 하는 질환을 치료할 수 있는 약물이라면 모두 포함될 수 있고, 예를 들면 면역 관련 질환을 치료할 수 있는 약물; 또는 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환을 치료할 수 있는 약물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC)를 유효 성분으로 포함하는 다양한 질환, 예를 들면 면역 관련 질환; 또는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 약학 조성물에서 유효 성분으로 포함하는 결합 분자, 항체 또는 항원 결합 단편; 또는 이에 약물이 결합된 항체-약물 결합체는 서열번호 35 내지 45 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 조절하고, 이펙터 T 세포의 활성을 조절하는 과정을 통해 다양한 질환을 매우 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명의 상기 “면역 관련 질환”은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 및 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 조성물이 예방, 개선 또는 치료하기 위한 "뇌신경계 질환"은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 상기 “신경 퇴행성 질환” 및 “신경 염증성 질환”은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor: CAR)를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환 또는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"이란 세포외 항원 결합 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 수용체를 의미한다. CAR의 가장 흔한 유형이 CD3 제타(ζ) 사슬과 같은 T 세포 동시수용체의 막통과 및 세포내 도메인에 융합된 단일 클론 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하지만, 본 명세서에 기재된 본 발명은 이들 도메인으로 제한되지 않는다. 오히려, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 임의의 세포 내 신호전달 분자를 발현하도록 조작된 임의의 수용체 및 이들에 융합되거나 연결된 세포외 항원 결합 도메인을 의미한다. 본 발명에서 상기 결합 도메인은 Lrig-1 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 단쇄 가변 단편(scFv)를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 "단쇄 가변 단편" 또는 "scFv"란, VL과 VH 사이의 펩타이드 링커에 의한, 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)의 융합 단백질을 의미한다.
또한, 본 발명에서 상기 VH 도메인과 VL 도메인은 가요성 링커를 통해 연결될 수 있다. 본 발명에서 상기 가요성 링커는 약 10개 내지 30개의 아미노산(예를 들어, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개 또는 5개의 아미노산)의 글라이신/세린 링커일 수 있고, 바람직하게는 15개의 아미노산 길이일 수 있다. 본 발명에서 상기 링커 길이는 키메라 항원 수용체의 중요한 결정부위로 작용할 수 있어, 상기 범위보다 더 짧은 링커는 친화도를 증대시킬 수 있지만, 또한 세포내 다합체 형성을 발생시켜 CAR의 발현을 손상시킬 수 있는 반면, 상기 범위보다 더 긴 링커는 VL 및 VH CDR을 공간상 더 멀리 이동시킴으로써 항원 친화도를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 힌지 영역 (또는 스페이서) 및 신호전달 도메인 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 힌지 영역은 항원 결합 도메인과 막통과 도메인을 연결하는 부분으로 '스페이서'라고도 불리우는데, T 세포막 또는 NK 세포막으로부터 항원 결합 도메인을 확장하기 위한 목적을 갖는다. 본 발명에서 상기 힌지 영역은 예를 들어 인간 또는 그의 일부를 포함하는 임의의 속으로부터의 임의의 적합한 서열로부터 얻어질 수 있으며, 혹은 본 기술분야에서 통상적으로 사용하는 CD8, CD28, 4-1BB, OX40, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함한 인간 단백질의 힌지 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 힌지 영역은 면역글로불린에 제한하지 않으면서 면역글로불린 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgD)으로부터 선택되는 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포 내부에서 발견되거나 발견되도록 조작된 키메라 항원 수용체의 부분을 의미한다. 본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 T 세포의 혈장 막에서 키메라 항원 수용체를 고정하는 역할을 하는 막통과 도메인을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 본 발명에서 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 동일한 단백질(예를 들어, CD3 제타(ζ) 분자)로부터 유래할 수 있고, 혹은 상기 막통과 도메인과 상기 신호전달 도메인은 상이한 단백질(예를 들어, CD28의 막관통 도메인 및 CD3 제타(ζ) 분자의 세포 내 신호전달 도메인, 또는 그 반대)로부터 유래할 수 있다.
본 발명에서 상기 막통과 도메인으로는, 예를 들면 T 세포 수용체 α 또는 β 사슬, CD3 제타(ζ) 사슬의 전부 또는 일부, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 이들의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 보조자극 도메인은 상기 보조자극 도메인은 4-1BB (CD137); OX40; CD27; CD28; CD30; CD40; PD-1; CD2; CD7; CD258; 자연살해 그룹 2 멤버 C (NKG2C); 자연살해 그룹 2 멤버 (NKG2D); B7-H3; CD83; ICAM-1; LFA-1 (CD11a/CD18) 또는 ICOS에 결합하는 리간드; 이들의 활성 단편; 이들의 기능 유도체; 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 신호전달 도메인은 CD3 제타(ζ)의 전부 또는 일부, 공통 FcR 감마 (FcER1G), Fc감마RIIIa, FcR베타 (Fc 엡실론 립), CD3감마, CD3델타, CD3 엡실론, CD79a, CD79b, DNAX- 활성화 단백질 10 (DAP10), DNAX- 활성화 단백질 12 (DAP12), 이의 활성 단편, 이의 기능적 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드로부터 유래한 기능 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 상기 “면역 관련 질환”은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 및 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 조성물이 예방, 개선 또는 치료하기 위한 "뇌신경계 질환"은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 상기 “신경 퇴행성 질환”및 “신경 염증성 질환”은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 결합 분자; 또는 항체-약물 결합체(Antibody-Drug Conjugate, ADC); 또는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor: CAR)를 약학적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는 예를 들면 면역 관련 질환; 또는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 “면역 관련 질환”은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 및 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 조성물이 예방, 개선 또는 치료하기 위한 "뇌신경계 질환"은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다.
본 발명의 상기 “신경 퇴행성 질환” 및 “신경 염증성 질환”은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 항체-약물 결합체는 서열번호 35 내지 45 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 조절하고, 이펙터 T 세포의 활성을 조절함으로써 다양한 질환을 매우 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "개체"는 면역 관련 질환 또는 뇌 신경계 질환의 발병이 의심되는 개체로서, 상기 면역 관련 질환 또는 뇌 신경계 질환 발병의 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명의 항체, 항원 결합 단편 또는 항체-약물 결합체로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 항체 또는 항체-약물 결합체를 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 질환의 예방 또는 치료 방법은 하나 이상의 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 항체 또는 항체-약물 결합체의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 μg 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03, GTC110-03 마우스 항체, GTC110-03 인간화 항체가 결합할 수 있는 부위인 에피토프를 발굴하기 위하여, 코발란트 라벨링 MS(Covalent Labelling MS; CL-MS), 크로스-링킹 MS(Cross-linking MS, XL-MS) 실험을 진행하여 두 실험에서 서열이 일치하거나, 외부로 노출되어 있는 부분(labeling (%)이 50% 이상) 등이 Lrig-1 단백질의 에피토프로서 스크리닝 할 수 있었다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 이용되는 단백질은 세포 표면에 전시(displaying)되어 있는 형태, 바이러스(예컨대, 박테리오파아지) 표면에 전시되어 있는 형태, 분리된(isolated) 형태 또는 정제된(purified) 형태일 수 있다. 세포 표면 또는 바이러스 표면에 전시되어 있는 단백질을 이용하는 경우, 스크리닝의 신속화 또는 자동화를 위하여 상기 세포 또는 바이러스는 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 또한, 분리된(isolated) 또는 정제된(purified) 형태의 단백질도 고상의 기질에 고정화시키는 것이 바람직하다. 기질로서 이용 가능한 것은, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하며, 예를 들어, 폴리스틸렌과 폴리프로필렌과 같은 탄화수소 폴리머, 유리, 금속 및 젤을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고상의 기질은 딥스틱, 마이크로타이터 플레이트, 입자(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 면역블롯 막(예컨대, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막)의 형태로 제공될 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 고상 기질은 마이크로타이터 플레이트이다.
본 발명의 스크리닝 방법은 다양한 방식으로 실시할 수 있으며, 특히 당업계에 공지된 다양한 결합 분석(binding assay)에 따라 고속(high throughput) 방식으로 실시할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 시험물질 또는 상기 단백질들은 검출가능한 표지(detectable label)로 레이블링 될 수 있다. 예를 들어, 상기 검출가능한 표지(detectable label)는, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광 표지[예컨대, 쿠마린, 플루오레세인, FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, Texas Red, Alexa Fluor, DAPI(4,6-diamidino-2phenylindole), HEX, TET, Dabsyl 및 FAM], 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 또는 금속 표지(예컨대, 금 및 은)이다.
검출가능한 표지가 레이블링된 단백질 또는 시험물질을 이용하는 경우, 단백질과 시험물질 사이의 결합 발생 여부는 표지로부터 나오는 시그널을 검출하여 분석할 수 있다. 예를 들어, 표지로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질을 이용하여 시그널을 검출한다. 표지로서 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌와 같은 기질을 이용하여 시그널을 검출한다.
본 발명의 일 구체예에서는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프로서, 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 폴리펩티드는 서열번호 38 또는 44로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 에피토프를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 폴리펩티드는 서열번호 35 내지 37, 39 내지 43, 및 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 에피토프를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 에피토프를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주를 제공한다,
본 발명의 일 구체예에서는 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합분자를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 결합 분자는 항체 또는 그 단편인, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 결합 분자를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서는 항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에서, 상기 항원 특이적인 결합 도메인은 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 특이적인 결합 도메인; 및 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질인 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 결합분자 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 결합분자, 키메라 항원 수용체, 항체-약물 결합체 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 및 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 결합분자, 상기 키메라 항원 수용체, 상기 항체-약물 결합체 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
*본 발명의 다른 구체예에서는 상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 다음 단계를 포함하는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질 에피토프의 스크리닝 방법을 제공한다. (a) 서열번호 17의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 20의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 21의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 22의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 23의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 24의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 25의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 26의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 28의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 29의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 30의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 31의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 32의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계 또는 서열번호 33의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 영역, 서열번호 34의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 영역을 포함하는 항체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 항체를 이용하여 코발란트 라벨링 MS(Covalent Labelling MS; CL-MS) 또는 크로스-링킹 MS(Cross-linking MS, XL-MS) 실험을 통하여 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질 에피토프를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 항체를 이용하여 Lrig-1 단백질의 에피토프를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 에피토프를 이용하여 항체 또는 그 단편인 결합 분자를 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서는 상기 에피토프와 항체 또는 그 단편인 결합 분자를 결합하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서는 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편인 결합 분자로서,
(a) 상기 결합 분자의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 결합 분자의 중쇄 가변 영역(VH): 서열번호 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82 및 88로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1; 서열번호 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83 및 89로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및 서열번호 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84 및 90으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3; 및
(b) 상기 결합 분자의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 결합 분자의 경쇄 가변 영역(VL): 서열번호 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85 및 91로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR1; 서열번호 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86 및 92로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및 서열번호 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87 및 93으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR3; 이고
상기 결합 분자는 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포 상에 존재하는 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 다양한 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 효율적으로 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비 조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현량 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포의 표면에 Lrig-1 단백질의 발현을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서 항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)와 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서 Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03, GTC210-04, GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)와 조절 T 세포 내에서 Lrig-1 단백질 유도 Stat3 인산화 조절 기작을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 염증성 장 질환 동물 모델에 본 발명에 따른 단일클론 항체를 복강 내 주사한 뒤, 몸무게 감소를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 다발성 경화증 동물 모델을 제작하기 위한 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 다발성 경화증 동물 모델에 본 발명에 따른 단일 클론 항체를 주입하고, 치료 효과 평가 점수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 다발성 경화증 동물 모델에 본 발명에 따른 단일 클론 항체를 주입하고, 치료 효과 평가 점수를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 항체를 투여한 경우, 탈수초화가 눈에 띄게 감소하는 것을 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 16는 도움 T 세포 1(CD4+ T-bet+)과 도움 T 세포 2는 감소, 도움 T세포 17(CD4+ RoRγt+), 조절 T 세포(CD4+ Foxp3+)는 증가하였으며, 각종 염증성 사이토카인(IFN-gamma, IL-17A)은 감소하고 항염증성 사이토카인(IL-10)은 발현이 증가하는 것을 나타낸 것이다.
도 17 내지 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 알츠하이머 동물 모델의 각 그룹(G1 내지 G4)에서 본 발명에 따른 단일 클론 항체의 주입에 의한 치료 효과를 Y자 미로 시험(도 17), 신규 물체 인식 시험(도 18) 및 수중 미로 시험(도 19 및 도 20)을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 21 내지 도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 프로테아제(키모트립신(도 21), 트립신(도 22) 및 Asp-N/Lys-C(도 23))를 처리하여 분해시킨 펩타이드를 코발란트 라벨링 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 24 및 도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 프로테아제에 의해 분해된 펩타이드를 코발란트 라벨링 분석에 의해 확인한 서열을 기준으로 정렬하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 26 및 도 27는 본 발명의 일 실시예에 따른 프로테아제(키모트립신(도 26) 및 트립신(도 27))를 처리하여 분해시킨 펩타이드를 크로스 링킹 분석 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 28 및 29은 본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 프로테아제에 의해 분해된 펩타이드를 크로스 링킹 분석에 의해 확인한 서열을 기준으로 정렬하여 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 30는 본 발명의 일 실시예에 따른 코발란트 라벨링 및 크로스 링킹 분석에 의해 확인된 에피토프를 정렬하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 조절 T 세포의 표면에 존재하는 항원인 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프와 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프로서, 서열번호 38, 39, 41, 42, 44 및 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 에피토프를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합분자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에서, 상기 항원 특이적인 결합 도메인은 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 특이적인 결합 도메인; 및 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질인 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편인 결합 분자로서,
(a) 상기 결합 분자의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 결합 분자의 중쇄 가변 영역(VH): 서열번호 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82 및 88로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1; 서열번호 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83 및 89로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및 서열번호 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84 및 90으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3; 및
(b) 상기 결합 분자의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 결합 분자의 경쇄 가변 영역(VL): 서열번호 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85 및 91로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR1; 서열번호 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86 및 92로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및 서열번호 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87 및 93으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR3; 이고
상기 결합 분자는 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 1의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNβ
Th17 IL-6, TGFβ, anti-IFNβ, anti-IL-4
iTreg IL-2, TGFβ
[실시예 1] Lrig-1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로블린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61℃에서 15초, 72℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 △CT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 3 내지 6에 나타내었다.
프라이머 방향 서열번호
마우스 Lrig-1 Forward 서열번호 7
Reverse 서열번호 8
마우스 Lrig-2 Forward 서열번호 9
Reverse 서열번호 10
마우스 Lrig-3 Forward 서열번호 11
Reverse 서열번호 12
마우스 FOXP3 Forward 서열번호 13
Reverse 서열번호 14
ACTG1 Forward 서열번호 15
reverse 서열번호 16
도 3에서 보는 바와 같이, 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포에 비하여 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다.또한, 도 4 및 5에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.
또한, 도 6에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T (CD4+RFP+ T) 세포 및 비 조절 T(CD4+RFP- T) 세포를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비 조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
*Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에 발현되어야 더욱 효과적으로 타겟 치료를 할 수 있으므로, Lrig-1 단백질이 표면에서의 발현 여부를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 조절 T 세포의 표면에서 더욱 높게 발현되는 것을 알 수 있다.
[제조예 1 내지 8] Lrig-1 단백질에 특이적인 단일클론항체의 제작
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질에 특이적인 항체를 제작하였다. 본 항체는 특정 항원 결정기를 정하여 생산하지 않고, Lrig-1 단백질에 어느 부위든지 결합할 수 있는 항체를 생산하였다.
상기 항체를 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질이 발현되는 세포를 제작하였다. 보다 상세하게는, 서열번호 2에 해당하는 DNA 단편 및 pcDNA(hygro)를 절단 효소로 절단한 뒤, 37 ℃에서 배양하여 라이게이션(Lrigation) 하여, Lrig-1 단백질의 DNA 서열이 삽입(insert) 되어 있는 pcDNA를 제작하였다. 상기 제작된 서열번호 2가 삽입된 pcDNA는 L세포에 형질주입(transfection)을 통해 도입되어 L 세포의 표면에 Lrig-1 단백질이 발현될 수 있도록 하였다.
상기 세포 표면에 발현되는 Lrig-1에 결합할 수 있는 경쇄(Light chain) 및 중쇄(heavy chain) 아미노산의 서열을 Human scFv library에서 선별하여, 총 8개의 중쇄 및 경쇄를 선별하였다.
상기 선별된 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 mlgG2a Fc 영역 또는 인간 IgG1 Fc 영역과 융합하여 단일클론항체(monoclonal antibody)를 제작하였다. 상기 단일클론항체의 서열은 하기 표 3과 같다.
구분 클론 위치 서열정보
제조예 1 GTC210-01 clone 중쇄 서열번호 17
중쇄 CDR1 서열번호 46
중쇄 CDR2 서열번호 47
중쇄 CDR3 서열번호 48
경쇄 서열번호 18
경쇄 CDR1 서열번호 49
경쇄 CDR2 서열번호 50
경쇄 CDR3 서열번호 51
제조예 2 GTC210-02 clone 중쇄 서열번호 19
중쇄 CDR1 서열번호 52
중쇄 CDR2 서열번호 53
중쇄 CDR3 서열번호 54
경쇄 서열번호 20
경쇄 CDR1 서열번호 55
경쇄 CDR2 서열번호 56
경쇄 CDR3 서열번호 57
제조예 3 GTC210-03 clone 중쇄 서열번호 21
중쇄 CDR1 서열번호 58
중쇄 CDR2 서열번호 59
중쇄 CDR3 서열번호 60
경쇄 서열번호 22
경쇄 CDR1 서열번호 61
경쇄 CDR2 서열번호 62
경쇄 CDR3 서열번호 63
제조예 4 GTC210-04 clone 중쇄 서열번호 23
중쇄 CDR1 서열번호 64
중쇄 CDR2 서열번호 65
중쇄 CDR3 서열번호 66
경쇄 서열번호 24
경쇄 CDR1 서열번호 67
경쇄 CDR2 서열번호 68
경쇄 CDR3 서열번호 69
제조예 5 GTC110-01 clone 중쇄 서열번호 25
중쇄 CDR1 서열번호 70
중쇄 CDR2 서열번호 71
중쇄 CDR3 서열번호 72
경쇄 서열번호 26
경쇄 CDR1 서열번호 73
경쇄 CDR2 서열번호 74
경쇄 CDR3 서열번호 75
제조예 6 GTC110-02 clone 중쇄 서열번호 27
중쇄 CDR1 서열번호 76
중쇄 CDR2 서열번호 77
중쇄 CDR3 서열번호 78
경쇄 서열번호 28
경쇄 CDR1 서열번호 79
경쇄 CDR2 서열번호 80
경쇄 CDR3 서열번호 81
제조예 7 GTC110-03 clone 중쇄 서열번호 29
중쇄 CDR1 서열번호 82
중쇄 CDR2 서열번호 83
중쇄 CDR3 서열번호 84
경쇄 서열번호 30
경쇄 CDR1 서열번호 85
경쇄 CDR2 서열번호 86
경쇄 CDR3 서열번호 87
제조예 8 GTC110-04 마우스 항체 중쇄 서열번호 31
중쇄 CDR1 서열번호 88
중쇄 CDR2 서열번호 89
중쇄 CDR3 서열번호 90
경쇄 서열번호 32
경쇄 CDR1 서열번호 91
경쇄 CDR2 서열번호 92
경쇄 CDR3 서열번호 93
제조예 9 GTC110-04
인간화 항체		 중쇄 서열번호 33
중쇄 CDR1 서열번호 88
중쇄 CDR2 서열번호 89
중쇄 CDR3 서열번호 90
경쇄 서열번호 34
경쇄 CDR1 서열번호 91
경쇄 CDR2 서열번호 92
경쇄 CDR3 서열번호 93
[실시예 5] 본 발명에 따른 항체의 Lrig-1 단백질에 대한 결합능 평가
본 발명에 따른 단일클론항체인 제조예 1 내지 제조예 9이 Lrig-1을 잘 인식하는 지를 확인하기 위하여, Lrig-1을 안정하게 발현하는 L 세포에 상기 제조예 1 내지 9의 항체 각각을 결합시킨 뒤 마우스 항체를 인식할 수 있으면서 eFlour 670이 컨쥬게이션(conjugation)된 2차 항체(secondary antibody)를 넣은 후 FACS를 이용하여 상기 제조예들의 Lrig-1 단백질에 대한 결합력을 분석하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체 모두 L 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1 단백질을 효과적으로 인식하여 결합한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] 본 발명에 따른 항체의 허용가능한 CDR의 변화
각 CDR에서 각각의 아미노산 위치의 역할을 조사하기 위해서, 제조예 1 내지 9의 Lrig-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 CDR을 GTC210-03을 기준으로 나열하여 분석하였다.
허용가능한 항체의 CDR 변화를 분석한 결과, 대조군과 비교하여 Lrig-1의 에피토프에 특이적으로 결합하고 조절 T 세포 내 신호전달경로를 조절하며 면역관련질환에 효과가 있는 항체의 허용가능한 CDR의 변화를 표 4에 요약하였고 그 구체적인 서열을 표 5에 나타내었다.
허용가능한 CDR의 변화 요약
CDR 위치 허용 변경
VH CDR1 S1 G, N, D
D3 Y, A
VH CDR2 G1 L, S, W, A, V
S3 Y
P4 H
D5 G, S
G6 S, D,
S7 G
N8 S
I9 K, T
VH CDR3 V1 G, D
G2 L, I
L3 G, S
R4 L, P, N
R6 K, P, H
Y7 T, W, L
E8 G
A9 L, R, V
S11 Y
A12 Y, D, S
Y13 D, N
G14 A
VL CDR1 S1 T
G2 D
S9 N
Y11 N, S, T, D
S13 T, N, Y
VL CDR2 S1 D, A
D2 N
S3 N
H4 Q, N
VL CDR3 A1 G
T2 S, A
S5 Y, D
N8 S
G9 A
허용가능한 CDR의 서열
CDR 서열 바뀐 서열 서열번호
VH CDR1 SYDMS - 58
GYDMS S1→G 46
NYYMS S1→N, D3→Y 52
NYDMS S1→N 64
DYDMS S1→D 70
DYYMS S1→D 76
NYAMS S1→N, D3→A 82
NYAMS S1→N, D3→A 88
VH CDR2 GISPDGSNIYYADSVKG - 59
LIYPDSGNKYYADSVKG G1→L, S3→Y, G6→S, S7→G, I9→K 47
GISPGDSSTYYADSVKG D5→G, G6→D, N8→S, I9→T 53
SISPSSGSIYYADSVKG G1→S, D5→S, G6→S, S7→G, N8→S 65
WISHGGGSIYYADSVKG G1→W, P4→H, D5→G, S7→G, N8→S 71
GISHDSGSKYYADSVKG P4→H, G6→S, S7→G, N8→S, I9→K 77
AIYPGGGSIYYADSVKG G1→A, S3→Y, D5→G, S7→G, N8→S 83
VISHGGGSTYYADSVKG G1→V, P4→H, D5→G, S7→G, N8→S, I9→T 89
VH CDR3 VGLRCRYEACSYAYGMDV - 60
GLGLCKTGLCYYYDAMDV V1→G, G2→L, L3→G, R4→L, R6→K, Y7→T, E8→G, A9→L, S11→Y, A13→Y, Y14→D, G15→A 72
DILPCPWGRCYYDYAMDV V1→D, G2→I, R4→P, Y7→W, E8→G, A9→R, S11→Y, A13→D, G15→A 84
VISNCHLGVCYYSNGMDV G2→I, L3→S, R4→N, R6→H, Y7→L, E8→G, A9→V, S11→Y, A13→S, Y14→N 90
HWTTFDY - 78
DAGLSWAGAFDY - 48
GLYSNPNEPFDY D1→G, A2→L, G3→Y, L4→S, S5→N, W6→P, A7→N, G8→E, A9→P 54
DLDAFWRPSFDY A2→L, G3→D, L4→A, S5→F, A7→R, G8→P, A9→S 66
VL CDR1 SGSSSNIGSNYVS - 61
SGSSSNIGSNYVT S13→T 49
TGSSSNIGSNYVS S1→T 55
TGSSSNIGNNNVN S1→T, S9→N, Y11→N, S13→N 67
TGSSSNIGNNSVT S1→T, S9→N, Y11→S, S13→T 73
SGSSSNIGSNNVT Y11→N, S13→T 79
SDSSSNIGSNTVS G2→D, Y11→T 85
SGSSSNIGNNDVY S9→N, Y11→D, S13→Y 91
VL CDR2 SDSHRPS - 62
SDSHRPS - 50
DDSQRPS S1→D, H4→Q 56
SDSHRPS - 68
ADNNRPS S1→A, S3→N, H4→N 74
ANSNRPS S1→A, D2→N, H4→N 80
ADNNRPS S1→A, S3→N, H4→N 86
SDSQRPS H4→Q 92
VL CDR3 ATWDSSLNGYV - 63
GSWDYSLSAYV A1→G, T2→S, S5→Y, N8→S, G9→A 51
GTWDYSLNGYV A1→G, S5→Y 57
GSWDDSLSAYV A1→G, T2→S, S5→D, N8→S, G9→A 69
AAWDSSLSAYV T2→A, N8→S, G9→A 75
GAWDYSLSAYV A1→G, T2→A, S5→Y, N8→S, G9→A 81
GTWDYSLSGYV A1→G, S5→Y, N8→S 87
GTWDYSLSGYV A1→G, S5→Y, N8→S 93
[실시예 7] 본 발명에 따른 항체의 조절 T 세포 내 신호전달경로의 조절
본 발명에 따른 단일클론항체인 제조예 1 내지 제조예 9이 Lrig-1 단백질을 통하여 조절 T 세포 내의 신호전달경로에 어떠한 영향을 미치는 지를 분석하기 위하여, 상기 제조예 1 내지 9에 해당하는 단일클론항체를 조절 T 세포에 처리하여 상기 조절 T 세포의 표면에 존재하는 Lrig-1를 자극한 뒤, 포스포티로신 면역 블롯(phosphotyrosine immunoblot)을 통하여 자극받은 조절 T 세포 내에 존재하는 Stat3 단백질의 티로신 인산화(tyrosine phosphorylation) 정도를 분석하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03 및 GTC210-04)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 Th17 세포와 같은 수준으로 증가를 시키는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC110-01, GTC110-02, GTC110-03 및 GTC110-04)는 Stat3의 인산화(phosphorylation)를 iTreg 세포와 같은 수준으로 계속하여 유지 및 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 8] 제조예 1 내지 4의 치료 효과 확인
[8-1] 면역 관련 질환의 치료 효과 확인
본 발명에 따른 단일클론항체인 제조예 1 내지 4의 자가면역질환에 대한 치료 효과를 확인하기 위하여, RAG-1-/- 마우스에 CD45RB(high) 세포들을 입양 이식(adoptive transfer)하여 자가면역질환인 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)을 유도한 뒤 상기 제조예 1 내지 4의 항체를 200㎍/mouse의 양으로 복강 내 주사한 뒤 자가면역질환의 치료 효과를 분석하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체(GTC210-01, GTC210-02, GTC210-03 및 GTC210-04)는 염증성 장 질환 유도 마우스에서 몸무게 감소 효과를 현저하게 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여, 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질 특이적인 단일클론항체는 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등의 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 것을 알 수 있다.
[8-2] 다발성 경화증 치료 효과 확인
1. GTC210-01 항체의 다발성 경화증 치료 효과 확인
다발성 경화증 마우스 모델을 제작하기 위하여 도 12에 나타낸 실험 설계도에 따라 실험을 수행하였다. 0 일째에 7 주령 C57BL/6 마우스에 MOG 펩타이드를 피하 주사하고, 결핵균 독소를 복강 내에 주사하였다. 2 일째에 마우스의 면역 시스템을 증강하기 위하여 결핵균 독소를 한번 더 주사하였다. 9 일째에 마우스에 제조예 1에서 제작된 GTC210-01 항체를 투여하였고, 양성 대조군으로는 항-IL-17a 항체를 투여하였다.
그런 다음, 7 일째부터 아래의 평가 기준에 따라 임상적 점수를 계산하여 마우스의 다발성 경화증 치료 효과를 평가하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
<평가 기준>
0점: 아무 증상이 없으며 정상적으로 움직임
1점: 꼬리의 끝부분 일부가 마비되어 아래로 쳐져 있음
2점: 꼬리의 전체가 마비되어 꼬리 전체가 쳐져 있음
3점: 뒷다리 한쪽이 일부 마비되었으나 자극에 반응을 할 수 있음
4점: 뒷다리 한쪽이 완전히 마비되어 자극에 반응하지 않으며 다리를 끌고 다님
5점: 뒷다리가 모두 마비되어 앞다리로 몸을 끌고 다님
6점: 앞다리로 몸을 끄는 것이 힘들어지지만 아직 앞다리는 자극에 반응이 있음
7점: 마우스가 움직이지 못하지만 한쪽 앞다리는 자극에 반응이 있음
8점: 마우스가 움직이지 못하며 양쪽 앞다리 모두 자극에 반응이 없음
9점: 마우스가 움직이지 못하며 호흡이 불규칙함
10점: 마우스가 죽음
도 13에서 보는 바와 같이, 다발성 경화증 유도 모델에 본 발명에 따른 항체를 투여한 경우 다발성 경화증이 현저히 치료되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 22 일 및 23일째에는 정상 마우스와 유사한 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
2. GTC210-03 항체의 다발성 경화증 치료 효과 확인
다발성 경화증 마우스 모델을 제작하기 위하여 도 12에 나타낸 실험 설계도에 따라 실험을 수행하였다. 0 일째에 7 주령 C57BL/6 마우스에 MOG 펩타이드를 피하 주사하고, 결핵균 독소를 복강 내에 주사하였다. 2 일째에 마우스의 면역 시스템을 증강하기 위하여 결핵균 독소를 한번 더 주사하였다. 이어서 2, 4, 6일차에 마우스에 제조예 3에서 제작된 GTC210-03 항체 5mg/kg 농도로 투여하였다.
그런 다음, 10 일째부터 아래의 평가 기준에 따라 임상적 점수를 계산하여 마우스의 다발성 경화증 치료 효과를 평가하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
<평가 기준>
0점: 아무 증상이 없으며 정상적으로 움직임
1점: 꼬리의 끝부분 일부가 마비되어 아래로 쳐져 있음
2점: 꼬리의 전체가 마비되어 꼬리 전체가 쳐져 있음
3점: 뒷다리 한쪽이 일부 마비되었으나 자극에 반응을 할 수 있음
4점: 뒷다리 한쪽이 완전히 마비되어 자극에 반응하지 않으며 다리를 끌고 다님
5점: 뒷다리가 모두 마비되어 앞다리로 몸을 끌고 다님
6점: 앞다리로 몸을 끄는 것이 힘들어지지만 아직 앞다리는 자극에 반응이 있음
7점: 마우스가 움직이지 못하지만 한쪽 앞다리는 자극에 반응이 있음
8점: 마우스가 움직이지 못하며 양쪽 앞다리 모두 자극에 반응이 없음
9점: 마우스가 움직이지 못하며 호흡이 불규칙함
10점: 마우스가 죽음
도 14에서 보는 바와 같이, 다발성 경화증 유도 모델에 본 발명에 따른 항체를 투여한 경우 다발성 경화증이 현저히 치료되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 점점 상태가 악화되는 양성 대조군과 달리 제조예 3의 GTC210-03 항체를 투여한 경우, 약 18일 경부터 호전되기 시작하는 것을 알 수 있었다.
3. GTC210-03 항체의 탈수초화(demyelination) 감소 확인
상기 제조예 3의 GTC210-03 항체 투여한 경우 탈수초화가 감소되는지 확인하기 위하여 면역조직화학적 분석(Immunohistochemical Analysis) 방법을 통하여 이를 검증하였다. 질환 유도 후 가장 쥐의 상태가 좋지 않은 21일째에 쥐의 척수를 얻어 수초의 파괴 정도와 염증 세포들의 침투 정도를 확인하였다.
먼저 H&E 염색을 위하여 PBS 세척을 통해 적혈구가 제거된 동물 모델의 폐와 기관지를 24시간동안 포름 알데하이드에 보관한 뒤 파라핀 조직 섹션을 제작하였다. 이어서 염색약을 자일렌(xylene)에 넣어 탈파라핀(deparaffin)을 한 후, 100% 알코올을 이용하여 자일렌(xylene)을 제거한 다음에 마우스의 신경 조직에 대하여 헤마톡실린(Hematoxylin stain) 염색을 수행한 다음, 감별 탈색(differentiator)을 하였다. 이후에 중화 현색(Blueing)을 한 후, 에오신(Eosin stain) 염색을 하여 대조염색하였다. 또한, 수초의 파괴정도를 확인하기 위하여 록솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue) 염색제를 사용하였다. 이는 수초부위를 염색해 주는 염색제로 질환이 많이 진행된 경우 염색이 제대로 이루어 지지 않는다. 구체적으로 록솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue)도 자일렌(xylene)에 넣어 탈파라핀(deparaffin)을 한 후, 100% 알코올을 이용하여 자일렌(xylene)을 제거한 다음에 마우스의 신경 조직에 대하여 록솔 패스트 블루(Luxol Fast Blue)에서 60℃에서 16~24시간 염색한 다음, 감별 탈색(differentiator)을 한 후, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
그 결과 도 15에서 각각 H&E 염색과 루솔 염색(Luxol fast bule) 결과, 대조군에 비하여 상기 제조예 3의 GTC210-03 항체 투여한 경우, 탈수초화가 눈에 띄게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
4. EAE(Experimental autoimmune encephalomyelitis) 마우스 질병 모델에서 염증 반응 감소 확인
면역 관련 질환, 즉 자가면역질환에서 염증반응 감소를 확인하기 위하여 대표적인 동물 모델인 자가면역 뇌척수염(Experimental autoimmune encephalomyelitis, 이하 EAE) 마우스 질병 모델을 사용하였다. 상기 제조예 3의 GTC210-03 항체 투여하여 치료된 쥐의 비장세포를 분리하고 CD4 T 세포들을 재활성화시켰다. 이 경우 쥐의 체내에서 이미 항원에 노출되었기 때문에 체외에서 다시 자극을 주면 더 강한 활성이 일어나 분화를 마친 CD4 T세포들이 각자의 대표 싸이토카인을 분비하게 된다. 쥐의 경우 질환 유도 후 10일째 되는 날에 세포를 얻어내어 40μg/ml의 MOG 펩타이드로 48시간 동안 재활성화시켰다. 이후 배양액에 존재하는 싸이토카인의 양을 ELISA를 통하여 확인해보았다.
그 결과 도 16에서 보는 것과 같이, 상기 제조예 3의 GTC210-03 항체를 투여한 경우 도움 T 세포 1(CD4+ T-bet+)과, 도움 T세포 17(CD4+ RoRγt+)은 감소하고, 조절 T 세포(CD4+ Foxp3+)는 증가하였으며, 각종 염증성 사이토카인(IFN-gamma, IL-17A)은 감소하고 항염증성 사이토카인(IL-10)은 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러므로 본원발명에 따른 에피토프에 특이적으로 결합하는 상기 제조예 3의 GTC210-03 항체를 투여한 경우, “염증성”사이토카인의 발현을 억제할 뿐만 아니라 "항염증성" 사이토카인인 IL-10의 발현을 증가시켜 결국 염증 반응을 억제시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
[8-3] 알츠하이머 치료 효과 확인
본 발명에 따른 항체의 알츠하이머 치료능을 평가하기 위하여, 하기 표 6와 같이 군을 설계하였다. 구체적으로, 7 개월 된 알츠하이머 유도 5xFAD 마우스(인지 및 운동 결핍을 동반한 아밀로이드 침착, 신경교증 및 진행성 신경 손실을 나타내는 것으로 알려짐)에 GTC110-04 마우스 항체와 GTC210-01 항체를 각각 10 mpk의 양으로 1 개월 동안 정맥에 주사하였다. 8 개월된 알츠하이머 마우스에 양성 대조군으로 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate, GA, Copaxone®)을 100 ug의 양으로 3 주 동안 피하 주사하였다.
그룹 n/그룹 투여경로 용량
G1 WT 대조군 14 - -
G2 5xFAD 대조군 13 - -
G3 GTC110-04 항체 11 IV 10 mpk
G4 GTC210-01 항체 11 IV 10 mpk
G5 GA(양성 대조군) 11 SC 100 ㎍
그런 다음, 상기 그룹의 마우스에서 Y자 미로 시험(Y-maze test), 신규 물체 인식 시험(Novel Object Recognition) 및 수중 미로 시험(Water maze test)을 수행하였다.
1. Y자 미로 시험(Y-maze test)
구체적으로, Y자 미로 시험의 경우 40 cm의 길이(벽의 높이 15cm)의 동일한 3개의 암(arm)을 120도의 각도로 배치하여 만든 미로 틀을 이용하였다. 이 실험은 설치류의 본능적인 탐색 습성을 이용한 행동 실험이며, 새로운 영역을 탐색할 가능성이 높은 것에 착안한 방법이었다. 바로 전에 탐색한 암(arm)을 기억하여 동일한 암(arm)에 들어가지 않을 수록 높은 기억력의 수치를 나타내었다. 개체당 8분의 탐색 시간을 제공하며, 최종 결과는 도 17에 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값으로 표현하였다. 자발적 교대(spontaneous alteration)(%) 값은 다음과 같은 식 1로 계산하였다. 여기서 행동 패턴의 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하여, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
[식 1]
Spontaneous alternation (%) = The number of triplet / (total arm entry-2)
도 17에서 보는 바와 같이, 실험동물이 주변의 단서를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 본 실험에 있어서, 알츠하이머 유도 마우스에 본 발명에 따른 항체(GTC210-01 및 GTC110-04 항체)를 투여한 경우 정상 대조군과 유사한 수준으로 자발적 교대 값을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
2. 신규 물체 인식 시험(Novel Object Recognition)
신규 물체 인식 시험의 경우, 40 cm x 40 cm의 아크릴 케이지에 상이한 2개의 물체를 이용하여 기억력을 평가하였다. 아크릴 케이지 내를 익숙하게 한 후, 2개의 물체를 일정한 위치에 위치하여 자유롭게 인지하게 한 후, 각 물체를 탐색한 시간을 측정하였다. 24 시간의 지연 시간을 개체별로 주고 다시 동일한 위치에 한가지 물체만 다른 물체로 변경하였다. 이 때 변경한 물체를 신규 물체로 인식하여 탐색 시간이 길수록 기억력이 좋은 것으로 판단할 수 있다. 24 시간 전의 물체를 기억하지 못한다면 신규 물체와 기존 물체를 구분하지 못하고 양쪽 물체 모두 균일하게 탐색할 가능성이 있다. 총 10분간 자유롭게 탐색하도록 하며, 결과는 선호도 수치(preference index = Novel object exploring time/total exploring time)로 도 18에 나타내었다. 이때 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다.
도 18에서 보는 바와 같이, 신규 물체에 대한 선호도 수치(Preference Index)에서 정상 대조군(G1)은 0.51 ± 0.06, G2군(vehicle)은 0.42 ± 0.04 로 측정되었고, 알츠하이머 유도 군(G2)은 정상 대조군(G1)에 비해 선호도 수치가 낮게 관찰되었다. 그런데 본 발명에 따른 항체(GTC210-01 및 GTC110-04 항체)를 투여한 경우 정상 대조군 이상으로 선호도 수치가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
3. 수중 미로 시험(Water maze test)
수중 미로 시험의 경우, Morris에 의해 고안된 방법을 기초로 하여 실시하였다. 스테인레스 풀(pool)(직경 90cm, 높이 50 cm)에 물(22 ± 1 ℃)을 채워 수면 높이를 30 cm가 되도록 하였다. 숨겨진 플랫폼(platform)(직경 5cm)은 수면 아래 1cm 지점에 위치하도록 하였다. 평가 첫 날 3 번 ~ 4 번의 훈련을 실시하였다. 한 개체 당 전체 수영 시간은 60 초로 설정하였으며, 60 초 이내에 플랫폼을 찾은 개체는 10 초간 플랫폼 위에서 머무르도록 하여 기억을 유도하였다. 60 초가 지나도 플랫폼을 찾지 못하는 개체는 인위적으로 플랫폼으로 안내하여 플랫폼 위에서 10 초간 머무르도록 하며 이때의 탈출 시간은 60 초로 하였다. 수영 연습을 시킨 후 6 일차에 프로브 테스트(probe test)를 실시하여 공간지각능력으로, 플랫폼이 있던 사 분면 내 머물렀던 시간을 전체 수영 시간 중 비율로 계산한 값(Percentage of time in SW area, %), 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간(Latency to target, sec)을 측정하고, 그 결과는 도 19 및 20에 나타내었다. 이때 분석은 SMART VIDEO TRACKING Software (Panlab, USA)을 이용하여 실시하였다. 결과 해석에서 제외시키는 기준은 수영을 통한 탐색을 하지 않고 특정 부위만 선회하는 개체로 설정하였다.
도 19 및 도 20에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 항체(GTC210-01 및 GTC110-04 항체)를 투여한 경우 플랫폼이 있던 사 분면 내 머물렀던 시간을 전체 수영 시간 중 비율로 계산한 값(Percentage of time in SW area, %)이 현저히 증가하였고, 플랫폼이 있던 위치에 도달하는데 걸린 시간(Latency to target, sec)은 정상 대조군과 유사한 수준으로 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 9] Lrig-1 단백질의 에피토프 확인
Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인에서 상기 제조예 3의 GTC210-03 항체가 결합할 수 있는 부위인 구조 에피토프를 발굴하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
[9-1] 시약 및 재료
CNBr 활성화 세파로스 4B(CNBr-activated sepharose쪠 4B) (GE, 17-0430-01)
디에틸피로카보네트(Diehtylpyrocarbonate) (DEPC, Sigma, 159220)
이미다졸(Imidazole) (Acros, 301870010)
시퀀싱 등급 수정 트립신(Sequencing grade modified trypsin) (promega, V5117)
카이모트립신(Chymotrypsin), Sequencing grade (Promega, V1062)
Asp-N, Sequencing grade (Promega, V1621)
rLyc-C, Mass spec grade (Promega, V1671)
disuccinimidyl dibutyric urea (DSBU; Thermo, A35459)
다이메틸 설폭사이드(Dimethyl sulfoxide) (DMSO, Sigma, D5879)
탄산수소나트륨(Sodium bicarbonate) (NaHCO3, Sigma, 792519)
염화나트륨(Sodium chloride) (NaCl, Sigma, S3014)
아세트산 나트륨(Sodium acetate) (NaOAc, Sigma, S2889)
트리스(Tris) (GE, 17-1321-01), 글라이신(Glycine) (GE, 17-1323-01)
ProteaseMAX쪠 Surfactant, Trypsin Enhancer (Promega, V207A)
아세톤(Acetone) (Merck, 1.07021.2521)
디티오트레이톨(Dithiothreitol) (DTT; GE, 17-1318-02)
요오드아세트아마이드(Iodoacetamide) (IAA; sigma, I-6125)
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4, Sigma, 71505)
Sodium phosphate dibasic hepta-hydrate (Na2HPO4, Sigma, S9390)
시린지 필터(Syringe filter) 0.2um (Sartorius stedim, 16534)
아세토니트릴(Acetonitrile), 메탄올(Methanol), 물 (HPLC grade, J.T baker)
포름산(Formic acid) (Sigma, 33015)
[9-2] 실험 방법
[9-2-1] 코발란트 라벨링 MS(Covalent Labelling MS; CL-MS)
항원 및 항체의 비율이 2:1이 되도록 하고, 항원 샘플을 준비하였다. 그런 다음, DEPC가 1%가 넘지 않도록 첨가한 뒤에 37 ℃에서 1분 동안 반응시키고, 이미다졸을 첨가하여 반응이 종료되도록 하였다. 이후에 아세톤을 첨가하여 침전 반응을 수행한 뒤에 원심분리를 통해 상등액을 제거하고, 0.1%의 PM을 이용하여 침전물을 잘 풀어주었다. 이렇게 풀어진 침전물에 트립신, 키모트립신 또는 Asp-N/Lys-C를 넣어 분해하는 과정을 거친 뒤, PNGase-F를 이용하여 단백질에 붙은 당사슬 제거하였다. 마지막으로 DTT 및 IAA를 이용하여 단백질의 시스테인 간에 존재하는 이황화 결합을 절단하고 LC-MS, MS2 분석을 수행하였다.
[9-2-2] 크로스-링킹 MS(Cross-linking MS, XL-MS)
항원 및 항체의 비율이 2:1이 되도록 하고, 항원 샘플을 2개 준비하였다. 그런 다음, 크로스 링커(CSBU)를 DMSO를 통해 충분히 녹였다. 이후, 샘플 및 DSG의 비율이 1:100이 되도록 첨가하고, 다른 하나에는 DMSO만을 첨가한 뒤에 25 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 뒤, 트립신 또는 키모트립신을 이용하여 분해하는 과정을 거친 뒤, PNGase-F를 이용하여 단백질에 붙은 당사슬 제거하였다. 마지막으로 DTT 및 IAA를 이용하여 단백질의 시스테인 간에 존재하는 이황화 결합을 절단하고 LC-MS, MS2 분석을 수행하였다.
[9-2-3] LC-MS, MS 분석 조건
1. 액체 크로마토크래피(Liquid chromatography, LC) 조건
컬럼(Column): Hypersil GOLD쪠 (1.9 ㎛, 1 X 100 ㎜)
유속(Flow rate): 100 ㎕/min
이동상 A(Mobile phase A): D.W / 0.2% Formic acid
이동상 B(Mobile phase B): ACN / 0.2% Formic acid
온도(Temperature): 30 ℃
LC condition (gradient)
단계(Step) 전체 시간(min) 유속(㎕/min) A(%) B(%)
0 0.00 100.00 95.0 5.0
1 5.00 100.00 95.0 5.0
8 7.00 100.00 90.0 10.0
3 48.00 100.00 70.0 30.0
4 55.00 100.00 5.0 95.0
5 65.00 100.00 5.0 95.0
6 66.00 100.00 95.00 5.0
7 71.00 100.00 95.00 5.0
2. MS, MS2 condition
HESI Source
시스가스 유량(Sheath gas flow rate) 35
보조가스 유량(Aux gas flow rate) 10
스윕가스 유량(Sweep gas flow rate) 1
스프레이 전압(Spray voltage)(kV) 3.5
스프레이 전류(Spray current)(μA) -
모세관 온도(Capillary temp.(℃) 250
S-lens RF level 50
보조가스 히터온도(Aux gas heater temp.(℃) 200
General
실행시간(Runtime) 0에서 71분
극성(Polarity) 양성
기본충전상태(Default charge state) 2
Full MS
해상도(Resolution) 70,000
AGC target 3.00E+06
Maximum IT 100 ms
스캔 범위(Scan range) 200 to 2,000 m/z
dd-MS2 / dd-SIM
해상도(Resolution) 17,500
AGC targe 1.00E+05
Maximum IT 54 ms
반복 횟수(Loop count) 10
TopN 10
Isolation window 1.6 m/z
(N)CE / stepped (N)CE nce: 27
dd Settings
Minimum AGC target 8.00E+04
강도 임계값(Intensity threshold) 1.50E+05
Charge exclusion Unassigned, 7, 8, >8
Peptide match Preferred
동위원소 제외(Exclude isotopes) On
Dynamic exclusion 5.0 s
[9-3] 코발란트 라벨링 MS(Covalent labeling MS; CL-MS)
대조군인 huTregL1-his (Ag, Control)과 시험군인 huTregL1-his/E7-mlgG2a (Ag+Ab, Test) 샘플에 DEPC 처리 후 트립신, 키모티립신 또는 Asp-N/Lys-C를 처리하여 분해시킨 시료를 각각 3회 반복하여 분석하였다(도 21 내지 도 23 참고). 상기 분석 결과에 나와 있는 대조군(Control 1) 및 시험군(Test 1)의 MS 분석결과를 BioPhama finder 프로그램을 이용하여 대조군(huTregL1-his)의 서열과 매치하고, 표지된 펩타이드(labeling peptides)를 비교하였다. 또한, 키모트립신, 트립신 또는 Asp-N/Lys-C를 처리한 대조군 및 시험군 시료에서 비 표지된 펩타이드 및 표지된 펩타이드를 확인하는 과정을 수행하였다. 반복 시험 결과를 종합하여 대조군 및 시험군의 라벨링(%)을 비교(decrease ≥ 5%)한 결과를 아미노산 서열을 기준(Res#)으로 정리하여, 도 21 및 도 22에 나타내었다. 이렇게 정리된 결과를 바탕으로 huTregL1-his 서열에 대입한 뒤, 그 중 2개의 프로테아제 시험 결과에서 일치되는 서열을 찾아내었다.
결과 상에서, Labeling decrease (%)가 5% 이상인 서열들 중 서열 E62-L101, D111-L134, Q542-Y553이 각각 13.2%, 15.3%, 14.7%로 10% 이상의 labeling decrease (%)로 확인되었다. E62-L101 서열에서 E62-K92 부분(AL)이 65.9%, L65-F87 부분(Y)이 48.7%, L88-L101 부분이 88.6%의 labeling (%)을 나타냈다. 이 결과를 통해 E62-L101 서열 중 labeling (%)이 50% 이상인 L88-L101 부분이 외부로 노출되어 있다고 생각할 수 있다. D111-L134 서열의 경우, 키모트립신 처리군에서 15.3% labeling decrease (%)를 나타내었으나 Control의 RSD가 62.4%임을 확인하였다. Q542-Y553 서열도 키모트립신 처리군에서 14.7% labeling decrease (%)를 나타내었으며, 대조군인 항원의 labeling (%)이 50% 이상으로 단백질 구조상 외부로 노출된 부분으로 판단되었다.
시험군(huTregL1-his/E7-mlgG2a)의 CL-MS 분석 결과들을 통해 도출된 본 서열들 중 2개 이상의 프로테아제 처리군에서 5% 이상의 labeling decrease (%)가 나왔을 뿐만 아니라 외부로 노출되어 있는 것으로 판단되는 서열인 E62-L101 서열이 에피토프 사이트에 해당하는 것을 최종적으로 파악하였다.
[9-4] 크로스 링킹 MS(XL-MS)
시험군(huTregL1-his/E7-mlgG2a) 혼합물 샘플을 준비하고, 시험군 시료에 크로스-링커(cross-linker)인 DSBU(disuccinimidyl dibutyric urea)를 처리하고 프로테아제(키모트립신 또는 트립신)으로 상기 시험군 시료를 분해시켰다(도 27 및 도 28). 그런 다음, 키모트립신 및 트립신으로 분해된 펩타이드가 대조군과 대비하여 시험관에서 검출되지 않은(2% 이하 포함) 펩타이드 서열을 확인하였다. 또한, 해당 펩타이드에서 크로스-링커만 결합되는 형태(mono)를 조사하여 재확인한(M%) 뒤, 최종적으로 시험군 샘플에서는 검출되지 않은 펩타이드 서열을 종합하여 에피토프 사이트로 결정하였다. L88-K92, S90-L101, N211-W222 등 3개의 서열의 경우, 키모트립신 또는 트립신 모두에서 대조군과 비교하여 시험군 샘플에서 검출된 동일한 서열의 펩타이드 비율 (T%)이 2% 이하로 확인되었다. T158-F174, G442-K476은 Chymotrypsin (Y)과 Trypsin (T)에서 각각 감소되었다. T%가 미검출(0%)된 서열은 Trypsin (T) 처리군의 S362-K365가 유일했다. Cross-linking 분석을 통해 두 개의 protease 처리군에서 유의미하게 중복으로 감소된 L88-K92, S90-L101 및 N211-W222인 3개의 서열이 에피토프 사이트로 결정되었다.
[9-5] 결론
도 29 및 도 30에서 보는 바와 같이, 앞선 결과를 종합하여 에피토프를 예측하였다. 구체적으로, huTregL1-his (Ag)의 E62-L101, G452-K476 등 2개의 서열들이 CL-MS, XL-MS 분석 결과에서 일치하는 위치로 확인되었다. L62-L101 중에서 L88-K92 부분은 CL-MS 결과 2개의 프로테아제 처리군(Chymotrypsin, Asp-N/Lys-C)에서 labeling decrease (%)가 확인되고, XL-MS 분석에서도 2개의 프로테아제 처리군(Chymotrypsin, Trypsin)에서 유의미하게 감소되었다. S95-L101 부분의 경우, XL-MS에서 키모트립신 및 트립신에서 중복적으로 확인되는 에피토프였다. 또한, CL-MS의 결과에서 라벨링(%)이 50% 이상인 L88-L101 부분이 외부로 노출되어 있었다. 특히, L88-L101의 경우, 서열 내 아미노산 서열이 친수성 아미노산(Q89-S95)으로 연속적으로 구성되어 있었다.
또한, G452-K476의 경우 CL-MS 분석을 통해 확인한 결과 A472-F480 부분이 외부로 노출되어 있었고, 그 중 A472-K476 부분이 에피토프에 해당한다고 판단하였다. N211-W222의 경우, XL-MS에서는 에피토프 사이트로 선정되었으나, CL-MS 분석에서와 중복되지 않았으며, 나아가 해당 서열의 부분의 labeling (%)이 50% 이하로 구조상 내부에 위치하여 에피토프에서 제외하였다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명에 따른 Lrig-1 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 조절 T 세포 상에 존재하는 본 발명의 에피토프에 특이적으로 결합하여 상기 조절 T 세포의 기능을 억제하고, 이펙터 T 세포의 활성은 유지 혹은 상승시켜 다양한 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 효율적으로 사용할 수 있다.

Claims (20)

  1. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 에피토프로서,
    서열번호 38, 39, 41, 42, 44 및 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 에피토프.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 서열번호 35, 36, 37, 40, 43으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 에피토프.
  3. 제1항의 에피토프를 코딩하는 핵산 분자.
  4. 제3항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  5. 제4항의 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포주.
  6. 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합분자.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 결합 분자는 항체 또는 그 단편인, 결합 분자.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 항체는 키메라 항체, 인간화 항체(humanized antibody), 이가(bivalent), 양특이성 분자, 미니바디(minibody), 도메인 항체, 이중특이적 항체(bispecific antibody), 항체 모방체, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody) 또는 이의 단편인, 결합 분자.
  9. 항원 특이적 결합 도메인, 연결 도메인 및 CD3 제타(ζ) 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에서,
    상기 항원 특이적인 결합 도메인은 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 특이적인 결합 도메인; 및 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질인 키메라 항원 수용체.
  10. 제 6항의 결합분자 및 약물을 포함하는 항체-약물 결합체.
  11. 제 6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합분자, 제 9항의 키메라 항원 수용체, 제 10항의 항체-약물 결합체 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환, 이식편대숙주 질환, 장기이식거부반응, 천식, 아토피, 및 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 결합분자, 제 9항의 키메라 항원 수용체, 제 10항의 항체-약물 결합체 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 뇌신경계 질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인, 약학 조성물.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제 1항 또는 제 2항의 에피토프를 이용하여 항체 또는 그 단편인 결합 분자를 스크리닝 하는 방법.
  18. 제 6항의 항체를 이용하여 Lrig-1 단백질의 에피토프를 스크리닝 하는 방법.
  19. 제 1항 또는 제 2항의 에피토프와 항체 또는 그 단편인 결합 분자를 결합하는 방법.
  20. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편인 결합 분자로서,
    (a) 상기 결합 분자의 중쇄 가변 영역(VH)은 다음을 포함하는 결합 분자의 중쇄 가변 영역(VH):
    서열번호 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82 및 88로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR1;
    서열번호 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83 및 89로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR2; 및
    서열번호 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84 및 90으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VH) CDR3; 및
    (b) 상기 결합 분자의 경쇄 가변 영역(VL)은 다음을 포함하는 결합 분자의 경쇄 가변 영역(VL):
    서열번호 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85 및 91로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR1;
    서열번호 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86 및 92로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR2; 및
    서열번호 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87 및 93으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역(VL) CDR3; 이고
    상기 결합 분자는 서열번호 35 내지 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 폴리펩티드를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
PCT/KR2022/010262 2021-07-16 2022-07-14 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 WO2023287212A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22842474.3A EP4375670A1 (en) 2021-07-16 2022-07-14 Epitope of regulatory t cell surface antigen, and antibody specifically binding thereto
CN202280050296.0A CN117716238A (zh) 2021-07-16 2022-07-14 调节性t细胞表面抗原的表位及其特异性结合的抗体
US18/413,322 US20240141036A1 (en) 2021-07-16 2024-01-16 Epitope of Regulatory T Cell Surface Antigen, and Antibody Specifically Binding Thereto

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0093657 2021-07-16
KR20210093657 2021-07-16

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US18/413,322 Continuation-In-Part US20240141036A1 (en) 2021-07-16 2024-01-16 Epitope of Regulatory T Cell Surface Antigen, and Antibody Specifically Binding Thereto

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023287212A1 true WO2023287212A1 (ko) 2023-01-19

Family

ID=84920240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/010262 WO2023287212A1 (ko) 2021-07-16 2022-07-14 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240141036A1 (ko)
EP (1) EP4375670A1 (ko)
KR (1) KR20230016148A (ko)
CN (1) CN117716238A (ko)
WO (1) WO2023287212A1 (ko)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
KR20180117066A (ko) * 2017-04-18 2018-10-26 주식회사 굳티셀 Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
KR20190027808A (ko) * 2019-03-08 2019-03-15 주식회사 굳티셀 조절자 Ｔ 세포에 특이적으로 존재하는 새로운 표면단백질 Ｌｒｉｇ-1의 용도
KR20200112745A (ko) * 2019-03-20 2020-10-05 주식회사 굳티셀 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20210056280A (ko) * 2019-11-08 2021-05-18 주식회사 굳티셀 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체
KR20210075117A (ko) * 2018-10-05 2021-06-22 세인트 안나 킨더크렙스포르슝 키메라 항원 수용체(car) 그룹

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
KR20180117066A (ko) * 2017-04-18 2018-10-26 주식회사 굳티셀 Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
KR20210075117A (ko) * 2018-10-05 2021-06-22 세인트 안나 킨더크렙스포르슝 키메라 항원 수용체(car) 그룹
KR20190027808A (ko) * 2019-03-08 2019-03-15 주식회사 굳티셀 조절자 Ｔ 세포에 특이적으로 존재하는 새로운 표면단백질 Ｌｒｉｇ-1의 용도
KR20200112745A (ko) * 2019-03-20 2020-10-05 주식회사 굳티셀 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물
KR20210056280A (ko) * 2019-11-08 2021-05-18 주식회사 굳티셀 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체

Also Published As

Publication number Publication date
US20240141036A1 (en) 2024-05-02
CN117716238A (zh) 2024-03-15
KR20230016148A (ko) 2023-02-01
EP4375670A1 (en) 2024-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019225777A1 (ko) 항-ror1 항체 및 그 용도
WO2015133817A1 (ko) B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
WO2019225787A1 (ko) 항-b7-h3 항체 및 그 용도
WO2018194380A2 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2015058573A1 (zh) 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2016137108A1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
WO2014077648A1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2018030806A1 (ko) 항체 중쇄불변부위 이종이중체에 융합된 사이토카인 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
WO2022039490A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2018128454A1 (ko) 항 α-SYN 항체 및 그 용도
WO2018222019A1 (ko) 신규한 항-ｃｄ40 항체 및 이의 용도
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2021235696A1 (ko) Cd22에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2023277361A1 (ko) 메소텔린 특이적 항체 및 이의 용도
WO2020080853A1 (ko) Lrig-1 단백질에 특이적인 결합 분자 및 이의 용도
WO2022177394A1 (ko) Pd-l1 및 cd47에 대한 이중특이적 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2020101365A1 (ko) 안정성이 향상된 항 c-met 항체 또는 그의 항원 결합 단편
WO2022103245A1 (ko) Sars-cov-2에 대한 단일 도메인 항체 및 이의 용도
WO2016199964A1 (ko) 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
WO2021101346A1 (en) Anti-ror1/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
WO2019045182A1 (ko) 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
WO2023287212A1 (ko) 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체
WO2020022782A1 (ko) 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2019216675A1 (ko) 조절 t 세포 표면 항원의 에피토프 및 이에 특이적으로 결합하는 항체
WO2022145739A1 (en) Humanized antibody specific for cd22 and chimeric antigen receptor using the same

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22842474

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202280050296.0

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022842474

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022842474

Country of ref document: EP

Effective date: 20240216