WO2019045182A1 - 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2019045182A1
WO2019045182A1 PCT/KR2017/013706 KR2017013706W WO2019045182A1 WO 2019045182 A1 WO2019045182 A1 WO 2019045182A1 KR 2017013706 W KR2017013706 W KR 2017013706W WO 2019045182 A1 WO2019045182 A1 WO 2019045182A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
peptide
antibody
hzvsf
skin
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/013706
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김윤원
박성만
김민수
Original Assignee
주식회사 이뮨메드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 이뮨메드 filed Critical 주식회사 이뮨메드
Priority to CA3074437A priority Critical patent/CA3074437C/en
Priority to PCT/KR2018/010049 priority patent/WO2019045477A1/ko
Priority to US16/636,834 priority patent/US11649277B2/en
Priority to AU2018326106A priority patent/AU2018326106B2/en
Priority to JP2020511948A priority patent/JP7323197B2/ja
Priority to EP18850204.1A priority patent/EP3677274A4/en
Priority to RU2020109504A priority patent/RU2751486C1/ru
Priority to CN201880056565.8A priority patent/CN111148529A/zh
Publication of WO2019045182A1 publication Critical patent/WO2019045182A1/ko
Priority to JP2021181413A priority patent/JP2022023216A/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/35—Allergens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a skin disease comprising a substance specifically binding to a separated vimentin-derived peptide as an active ingredient, and more particularly to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of an antibody
  • a pharmaceutical composition, a quasi-drug composition, an external preparation for skin a method for the prevention or treatment of skin diseases, a therapeutic use, a medicament, a cosmetic, a quasi-drug or a skin external preparation for the prevention or treatment of a skin disease comprising the binding fragment of the peptide as an active ingredient And the like.
  • Skin diseases mean all abnormalities that appear in skin of animals including humans.
  • various skin diseases that have not occurred in the past due to various harmful substances are emerging.
  • the proliferation and metabolism of the skin cells are weakened and the natural elasticity of the skin tissue is reduced or wrinkles are aged.
  • long-term exposure to direct sunlight It also causes various skin lesions and causes harm to healthy skin.
  • Such natural skin aging or accidental skin lesions cause defective function of the skin in the outermost part of the human body and cause infections caused by viruses, microorganisms, bacteria, etc., resulting in various skin diseases .
  • Atopic dermatitis is a chronic inflammatory skin disease that recurs and recovers from infancy and childhood. It is caused by infection, mental stress, seasonal and climatic changes, irritation and allergens. . Although atopic dermatitis is thought to be a genetic disorder involving immunological abnormalities, specific pathology has not yet been elucidated, and other skin diseases such as psoriasis and chronic simple poisoning have not yet been identified.
  • Korean Patent Publication No. 10-1741281 discloses a pharmaceutical composition for treating psoriasis comprising an A3 adenosine receptor agonist (IB-MECA / CF-101),
  • the present inventors have found that a substance specifically binding to a vimentin-derived peptide in skin tissue of a patient with various dermatitis, the specific cause of which is unknown, The present inventors have completed the present invention by confirming that the above-described skin diseases can be effectively treated.
  • Yet another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for preventing or improving skin diseases, which comprises a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • Yet another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating skin diseases, which comprises administering to a subject a composition comprising as an active ingredient a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 .
  • compositions for preventing or treating skin diseases which comprises a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • It is still another object of the present invention to provide a use of a composition comprising as an active ingredient a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 for producing a medicament for preventing or treating skin diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a composition comprising, as an active ingredient, a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 for the production of a cosmetic preparation, quasi-drug, or skin external preparation for improving skin diseases .
  • a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention more specifically, an antibody specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1, or a binding fragment of the peptide may be used for a skin disease expressing a vimentin- It can be effectively used as a therapeutic agent for various skin diseases whose specific cause is unknown.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a vector for the production of a chimeric VSF.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a chimeric VSF.
  • FIG. 3 shows the expression of chimeric VSF.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of scFv of VSF cloned into a vector.
  • 6 is a view obtained by refining scFV of VSF.
  • FIG. 7 is a schematic diagram of a vector for the production of humanized antibody hzVSF.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of hzVSF, the humanized antibody of the present invention.
  • Fig. 9 shows the expression of hzVSF, a humanized antibody.
  • Fig. 10 shows the result of reduction and non-reduction SDS-PAGE in which the physical properties of the humanized antibody hzVSF_var13 were confirmed.
  • Fig. 11 is a diagram showing LC / MS results confirming the physical properties of hzVSF_var13, which is a humanized antibody.
  • Fig. 13 is an isoelectric focusing (IF) image showing the physical properties of the humanized antibody hzVSF_var13.
  • FIG. 14 is a graph showing the number of donors in which T cell proliferation in response to KLH, hzVSF_var12 and hzVSF_var13 among 51 blood donors occurred.
  • FIG. 15 is a graph showing the degree of 51 T cell proliferation responses to hzVSF_var12 and hzVSF_var13, which are representative mutants of hzVSF, a humanized antibody.
  • FIG. 16 is a graph showing the mean SI value of T cell proliferation induced by KLH, hzVSF_var12, and hzVSF_var13.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of the investigation of reactivity between VSF and normal tissue of a human.
  • Figure 18 It is a figure confirming VR expression in various skin diseases.
  • FIG. 19 shows VR expression in rose colorectal cancer, herpes zoster, chronic simplex poisoning, herpes simplex, protozoan eczema, and water wart skin disease.
  • FIG. 20 shows VR expression in psoriasis, warts, atopic dermatitis and contact dermatitis skin diseases.
  • FIG. 21 is a chart for confirming the therapeutic efficacy of VSF against No. 1 psoriasis patient.
  • FIG. 22 is a chart for confirming the therapeutic efficacy of VSF for patients with psoriasis 2.
  • FIG. 23 is a chart for confirming the therapeutic efficacy of VSF for a patient with chronic simple phlegm.
  • FIG. 24 is a chart showing the therapeutic efficacy of VSF for a patient with chronic simple poisons of No. 2.
  • FIG. 25 is a chart showing the therapeutic efficacy of VSF for a patient suffering from chronic simple poisons of No. 3.
  • FIG. 25 is a chart showing the therapeutic efficacy of VSF for a patient suffering from chronic simple poisons of No. 3.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases, which comprises a substance that specifically binds to a vimentin-derived peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases, comprising a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • visentin is a protein encoded by the VIM gene, which functions to support and fix an organelle in a cell, and is mainly involved in cell skeleton, protein migration, and cell signal transduction.
  • VIM gene a protein encoded by the VIM gene
  • the visemen is expressed outside the cells in the skin tissue of various skin diseases which are not expressed outside the cells in the normal cells, but the specific cause is unknown, and the antibody specific to the vimentin-derived peptide It has been confirmed that treatment of a substance capable of binding thereto can effectively treat various skin diseases.
  • vimentin-derived peptide may be the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the " substance specifically binding to the vimentin-derived peptide” is a substance capable of binding to the vimentin-derived peptide, specifically, a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the isolated peptide of SEQ ID NO: 1 corresponds to amino acid 142 to 294 of Vimentin.
  • the antibody or fragment thereof of the present invention can bind, Or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 97% or more.
  • the substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 may be an antibody that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 or a binding fragment, a compound, a peptide, or an eptamer of the peptide, More specifically, an antibody that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 or a binding fragment of the peptide, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin diseases, which comprises an antibody or a binding fragment of the peptide specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • Such an antibody is not limited thereto, but may be, for example, a mouse antibody, a chimeric antibody or a humanized antibody.
  • the humanized antibody or the binding fragment of the peptide of the present invention may be prepared by grafting a complementary crystal region of a mouse monoclonal or monoclonal antibody directly binding to an antigen to a human antibody backbone to obtain affinity and specificity (Human anti-mouse antibody) reaction in the human body. Furthermore, as a humanized antibody with reduced immunogenicity using a de-immunization method, it can be used as a safe preparation by remarkably lowering immunogenicity upon administration to humans.
  • the peptide region of SEQ ID NO: 1 interacts better with the human immune system, while affecting externally exposed cells, for example complement-dependent cytotoxicity (CDC) -Independent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), thereby making it possible to treat target cells more efficiently.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • ADCC Independent cell-mediated cytotoxicity
  • the human immune system does not recognize the antibody as foreign by the reduction of immunogenicity.
  • the half-life in the human circulatory system is similar to that of naturally occurring antibodies even when administering lesser, less frequent drugs.
  • the mouse antibody specifically binding to the isolated peptide of SEQ ID NO: 1 may be referred to as " mVSF (mouse Virus Suppressing Factor) ", and the chimeric antibody may be referred to as " chVSF And the humanized antibody may be referred to as " hzVSF (cultivatedzed Virus Suppressing Factor) ".
  • mVSF mae Virus Suppressing Factor
  • hzVSF serum Virus Suppressing Factor
  • the term humanized antibody hzVSF or mutants thereof can be used interchangeably, and hzVSF can be mixed with mutants of hzVSF wild type (hzVSF_wt) and hzVSF (for example, hzVSF_var1, hzVSF_v1 or hzVSF_1 etc.).
  • the isolated peptide of SEQ ID NO: 1 is an epitope-containing antigenic region, and as long as it is capable of exhibiting a function similar to the present invention by binding to an antibody or fragment thereof, the peptidomimetric amino acids 142 to 211 or 211 to 294 . It is also apparent that amino acid sequences having deletion, modification, substitution or addition of a part of the sequences are also included within the scope of the present invention, provided that they have such homology.
  • Vimentin is a protein encoded by the VIM gene, which functions to support and fix an organelle in the cell. It is known to be mainly involved in cell skeleton, protein migration, and cell signaling. However, it is not known that an antibody capable of binding to a marker has a therapeutic use for skin diseases.
  • the antibody or the binding fragment of the peptide specifically binding to the isolated peptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention specifically reacts to the skin cells of a patient suffering from a skin disease, In the tissues or skin cells, the receptor of virus suppressing factor (VSF), that is, VR, externally appears and binds to it.
  • VSF virus suppressing factor
  • the antibody or the binding fragment of the peptide of the present invention can be usefully used in the field of prevention or treatment of various skin diseases for which the specific cause of the onset is not known.
  • the antibody or the binding fragment of the peptide may specifically bind to the 9th, 45th, 54th, 76th, 94th or 129th amino acid residue of the peptide of SEQ ID NO: 1, And may specifically bind to the 9th, 45th, 54th, 76th, 94th and 129th amino acid residues of the peptide of SEQ ID NO: 1, but as long as the peptide specifically binds to the isolated peptide of SEQ ID NO: 1, But is not limited thereto.
  • antibody means a protein molecule that acts as a ligand that specifically recognizes an antigen, including immunoglobulin molecules immunologically reactive with specific antigens, and includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Whole antibody and antibody fragments are all included.
  • the term also includes chimeric antibodies (e. G., Humanized murine antibodies) and bivalent or bispecific molecules (e. G., Bispecific antibodies), diabodies, triabodies and tetrabodies.
  • the term further encompasses a single chain antibody having a binding function to FcRn, a derivative of the antibody constant region, and an artificial antibody based on a protein scaffold.
  • the whole antibody is a structure having two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is linked to a heavy chain by a disulfide bond.
  • the whole antibody includes IgA, IgD, IgE, IgM and IgG, and IgG is a subtype and includes IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • fragment binding fragment of peptide
  • antibody fragment are used interchangeably to refer to any fragment of an antibody of the invention that retains the antigen-binding activity of the antibody.
  • Exemplary antibody fragments include, but are not limited to, single chain antibodies, Fd, Fab, Fab ', F (ab') 2 , dsFv or scFv.
  • the Fd means the heavy chain portion contained in the Fab fragment.
  • the Fab has one antigen-binding site in a structure having a variable region of a light chain and a heavy chain, a constant region of a light chain, and a first constant region (CH1 domain) of a heavy chain.
  • the F (ab ') 2 antibody is produced when the cysteine residue of the hinge region of the Fab' forms a disulfide bond.
  • Fv (variable fragment) refers to the smallest antibody fragment that has only a heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • the double disulfide Fv (dsFv) is linked by a disulfide bond to a light chain variable region and a light chain variable region.
  • a short chain Fv (scFv) is generally linked to a variable region of a heavy chain and a variable region of a light chain through a peptide linker through a covalent bond .
  • Such an antibody fragment can be obtained using a protein hydrolyzing enzyme (for example, an F (ab ') 2 fragment can be obtained by cutting a whole antibody into papain and obtaining a Fab and digesting with pepsin) Can be produced through recombinant DNA technology.
  • a protein hydrolyzing enzyme for example, an F (ab ') 2 fragment can be obtained by cutting a whole antibody into papain and obtaining a Fab and digesting with pepsin
  • the binding fragments of the peptides include Fab, Fab ', F (ab') 2 , scFv, dsFv, ds-scFv, dimers, minibodies, diabodies, and multimers thereof ) Or a bispecific antibody fragment.
  • monoclonal antibody refers to a single molecule composition of antibody molecules obtained in a substantially identical population of antibodies, which monoclonal antibodies exhibit a single binding specificity and affinity for a particular epitope.
  • immunoglobulins have a heavy chain and a light chain, and each heavy and light chain comprises a constant region and a variable region, which region is also known as a domain.
  • the variable region of the light chain and the heavy chain includes three multibranched regions called a complementarity determining region (hereinafter referred to as " CDR ”) and four framework regions .
  • the CDRs mainly serve to bind to an epitope of an antigen.
  • the CDRs of each chain are typically referred to as CDR1, CDR2, CDR3, starting from the N-terminus and sequentially identified by the chain in which the particular CDR is located.
  • the antibody of the present invention when the antibody of the present invention includes a constant region as described above, it may include a constant region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM or a combination thereof or a hybrid thereof .
  • dimers or multimers in the present invention means that, when a dimer or a multimer is formed, a polypeptide encoding a homologous short chain immunoglobulin constant region forms a bond with a short chain polypeptide of different origin.
  • dimers or multimers can be formed from two or more constant regions selected from the group consisting of constant regions of IgG, IgA, IgD, IgE and IgM.
  • hybrid means that a sequence corresponding to two or more immunoglobulin heavy chain constant regions of two or more different origins is present in the short chain immunoglobulin heavy chain constant region, including IgG, IgA, IgD, IgE And a domain consisting of one to four domains selected from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgM.
  • the humanized antibody of the present invention may be humanized on the basis of human immunoglobulin gamma 4, but not complement binding, and may not have CDC.
  • said humanized antibody or said binding fragment of said peptide comprises a heavy chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 2; A heavy chain CDR2 described in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 14 (the threonine being the ninth amino acid of SEQ ID NO: 3 substituted by aspartic acid); And a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 as described in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 15 (the fourth amino acid of SEQ ID NO: 4 substituted by arrapegin as a threonine), and light chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16 (the third amino acid of SEQ ID NO: 6 is replaced by aspartic acid), SEQ ID NO: 17 (the third amino acid of SEQ ID NO: 6 is aspartic acid, (Wherein alanine is replaced by glycine), or SEQ ID NO: 18 (in which the third amino acid of SEQ ID NO: 6 is aspart
  • the humanized antibody or the binding fragment of the peptide may be a human immunoglobulin gamma as set forth in SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, including, but not limited to, a human framework region Or framework region 1 (FR1) as set forth in SEQ ID NO: 20; A heavy chain FR2 represented by SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 28 (the eighth amino acid of SEQ ID NO: 22 is replaced by threonine and the tenth amino acid is replaced by alanine); And a heavy chain variable region comprising the heavy chain FR4 as set forth in SEQ ID NO: 23, and a light chain FR1 as set forth in SEQ ID NO: 24; A light chain FR2 represented by SEQ ID NO: 25; A light chain FR3 represented by SEQ ID NO: 26; And a light chain FR4 as set forth in SEQ ID NO: 27.
  • FR1 human framework region Or framework region 1
  • the antibody (a) is hzVSF_WT, the antibody (b) is hzVSF_var1, and the antibody (h) is hzVSF_var2.
  • (d) antibody is hzVSF_var3,
  • (e) antibody is hzVSF_var4,
  • (f) antibody is hzVSF_var5,
  • (g) antibody is hzVSF_var6,
  • (h) antibody is hzVSF_var7 antibody is hzVSF_var8 antibody is hzVSF_var9
  • antibody may include hzVSF_var10, (1) antibody may include hzVSF_var11, (m) antibody may include hzVSF_var12, and (n) antibody may include hzVSF_var13.
  • the humanized antibody and the binding fragment of the peptide include, but are not limited to, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40 and SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44 and SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48 and SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52 and SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56 and SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 70; SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO: 74; SEQ ID NO: 76 and SEQ ID NO: 78; Or a heavy chain and light chain variable region as set forth in SEQ ID NO: 80 and SEQ ID NO: 82, or a binding fragment of said peptide.
  • the mouse antibody specifically includes a heavy chain CDR1 as shown in SEQ ID NO: 137; A heavy chain CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 138; And a heavy chain variable region comprising heavy chain CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 139, and light chain CDR1 as set forth in SEQ ID NO: 134; A light chain CDR2 as set forth in SEQ ID NO: 135; May comprise a light chain variable region comprising light chain CDR3 as set forth in SEQ ID NO: 136, and more specifically may comprise a heavy chain variable region as set forth in SEQ ID NO: 9 and a light chain variable region as set forth in SEQ ID NO: 8, It is not.
  • the chimeric antibody may specifically comprise a heavy chain variable region as set forth in SEQ ID NO: 141 or SEQ ID NO: 142 and a light chain variable region as set forth in SEQ ID NO: 140, and more specifically, a heavy chain and sequence as set forth in SEQ ID NO: 146 or SEQ ID NO: But it is not limited thereto.
  • Such scFvs may include, but are not limited to, scFvs produced for safety purposes by mVSF.
  • it may be an scFv prepared by the sequence described in FIG.
  • the light chain variable region described in SEQ ID NO: 131 and the light chain variable region described in SEQ ID NO: 133 may be linked to each other through a linker.
  • the heavy chain variable region encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 130 and the light chain variable region encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 132 may be linked to each other by a linker.
  • Such an scFv may be cloned into the E. coli expression vector with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 150.
  • hzVSF_wt three alternative and 13 variants thereof, humanized antibodies (Example 5).
  • a comparison of immunogenicity with commercially available medicines under FDA approval confirmed that the immunogenicity was similar to that of Humira, which is the lowest human antibody, (Table 7).
  • Humira which is the lowest human antibody
  • the above-mentioned skin diseases may be rose psoriasis, herpes zoster, chronic simplex poison, simple herpes zoster, circular eczema, water wart, psoriasis, wart, atopic dermatitis or contact dermatitis.
  • the skin disease of the present invention can be included without limitation as long as VR is expressed in skin tissue or skin cells.
  • the vimentin-derived peptide of SEQ ID NO: 1 was expressed in skin tissues in which various skin diseases occurred but not expressed in normal cells (FIG. 17).
  • a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention exhibits excellent therapeutic efficacy against skin diseases even in patients who have actually developed psoriasis or chronic simple poisons (Figs. 21 to 25) And can be used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of various skin diseases whose cause is unknown.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term " pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not irritate the organism and does not interfere with the biological activity and properties of the administered compound.
  • the pharmaceutical carrier that is acceptable for the composition to be formulated into a liquid solution include sterilized and sterile water, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, One or more of these components may be mixed and used. If necessary, other conventional additives such as an antioxidant, a buffer, and a bacteriostatic agent may be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants can be additionally added and formulated into injectable solutions, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • the pharmaceutical composition may be of various oral or parenteral formulations.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used.
  • Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • examples of the non-aqueous solvent and the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories It can have one formulation.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And can be administered singly or multiply. It is important to take into account all of the above factors and to administer the amount in which the maximum effect can be obtained in a minimal amount without adverse effect, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the other therapeutic agent may be interferon, but is not limited thereto.
  • prevention may mean all actions that inhibit or delay the onset of a disease by administration of the composition.
  • treatment It can mean all the acts that are done.
  • a cosmetic composition for preventing or improving skin diseases comprising a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for preventing or ameliorating skin diseases, which comprises an antibody or a binding fragment of the peptide specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1, the peptide of SEQ ID NO: 1, the antibody, the peptide binding fragment, the skin disease and the prevention are as described above.
  • a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 of the present invention exhibits excellent therapeutic efficacy even in patients suffering from actual psoriasis or chronic mononeuropathy (FIG. 21 to FIG. 25), it was confirmed that the composition could be used as a cosmetic composition for prevention and improvement of various skin diseases whose cause is unknown.
  • the cosmetic composition according to the present invention can be used as a cosmetic composition in the form of a solution, an ointment for external use, a cream, a foam, a nutritional lotion, a softening water, a pack, a soft water, an emulsion, a makeup base, But are not limited to, emulsions, emulsions, pastes, gels, lotions, powders, soaps, surfactant-containing cleansing, oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations, patches and sprays It is not.
  • the cosmetic composition of the present invention may further comprise at least one cosmetically acceptable carrier to be incorporated in a general skin cosmetic composition, and examples thereof include oil, water, a surfactant, a moisturizer, A thickening agent, a chelating agent, a coloring matter, an antiseptic, a perfume, and the like may be appropriately compounded, but the present invention is not limited thereto.
  • the cosmetically acceptable carrier to be contained in the cosmetic composition of the present invention varies depending on the formulations.
  • the carrier component may be an animal oil, a vegetable oil, a wax, a paraffin, a starch, a tracer, a cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide Mixtures of these may be used.
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder or a mixture thereof may be used as the carrier component, Propellants such as fluorohydrocarbons, propane / butane or dimethyl ether.
  • a solvent, a dissolving agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, 1,3-butyl glycol oil may be used, in particular fatty acid esters of cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or sorbitan may be used have.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspension such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracant, etc. may be used.
  • the formulation of the present invention is a soap, an alkali metal salt of a fatty acid, a fatty acid hemiester salt, a fatty acid protein hydrolizate, isethionate, a lanolin derivative, an aliphatic alcohol, a vegetable oil, glycerol, .
  • a quasi-drug composition for preventing or ameliorating skin diseases comprising a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a quasi-drug composition for preventing or ameliorating skin diseases, which comprises an antibody or a binding fragment of the peptide specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1, the peptide of SEQ ID NO: 1, the antibody, the peptide binding fragment, the skin disease and the prevention are as described above.
  • the quasi-drug composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent as necessary in addition to the above components.
  • a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent is not limited as long as the effect of the present invention is not impaired, and examples thereof include fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, sweeteners, .
  • the quasi-drug composition of the present invention can be exemplified by a disinfectant cleaner, a shower foam, a softener solution, a wet tissue, a coating agent, and the like.
  • a disinfectant cleaner a shower foam
  • a softener solution a wet tissue
  • a coating agent a coating agent
  • the present invention provides an external preparation for skin for preventing or ameliorating a skin disease, which comprises, as an active ingredient, a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides an external preparation for skin for preventing or ameliorating skin diseases, which comprises an antibody or a binding fragment of the peptide specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1, the peptide of SEQ ID NO: 1, the antibody, the peptide binding fragment, the skin disease and the prevention are as described above.
  • external preparation for skin of the present invention is a comprehensive concept that generally includes the materials used for external skin application.
  • formulations containing the above pharmaceutical composition include PLASTERS, LOTIONS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, AEROSOLS, EXTRACTS, OINTMENTS, FLUIDEXTRACTS, EMULSIONS, SUSPENSIONS, LIQUIDS AND SOLUTIONS, CAPSULES, CREAMS, soft, hard gelatin capsules, pastes, or sustained release preparations.
  • the external preparation for skin may be a parenteral dosage form which is formulated in solid, semi-solid or liquid form by adding a compatible inorganic or organic carrier, excipient and diluent.
  • the preparation for parenteral administration may be a transdermal dosage form selected from the group consisting of drops, ointments, lotions, gels, creams, patches, sprays, suspensions, and emulsions.
  • Examples of the carrier, excipient and diluent which can be contained in the external preparation include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • components other than the composition of the present invention may be mixed and selected without difficulty by those skilled in the art depending on the formulation or use purpose of other external preparation for skin, etc. In this case, A synergistic effect can occur.
  • Another aspect of the present invention is a method for preventing or treating a skin disease, comprising the step of applying a composition comprising a substance specifically binding to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient to a subject in need thereof .
  • the present invention relates to a method for preventing skin diseases, which comprises applying to a subject in need thereof a composition comprising an antibody or a binding fragment of the peptide as an active ingredient, which specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 Or a method of treatment.
  • the method for treating the skin disease may be a method comprising the step of administering a pharmaceutical composition further comprising an antibody and a pharmaceutically acceptable carrier to a subject susceptible to or susceptible to the skin disease,
  • the acceptable carrier is the same as described above.
  • the subject includes mammals, birds, and the like, including cattle, pigs, sheep, chickens, dogs, humans, and the like, and includes individuals to which a skin disease is treated by administration of the composition of the present invention.
  • the composition may be administered in single or multiple doses in a pharmaceutically effective amount.
  • the composition may be administered in the form of a liquid preparation, a powder, an aerosol, a capsule, an intravaginal tablet, a capsule, or a suppository.
  • Routes of administration include, but are not limited to, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, endothelial, oral, topical, intranasal, intrarectal, rectal, and the like.
  • the peptide upon oral administration, the peptide will be digested and the oral composition should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation from above.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device capable of transferring the active substance to the target cell.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating skin diseases, comprising a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of a composition comprising, as an active ingredient, a substance that specifically binds to the peptide of SEQ ID NO: 1 for the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of skin diseases.
  • the present invention relates to the use of a composition
  • a composition comprising, as an active ingredient, a substance specifically binding to a peptide of SEQ ID NO: 1 for producing a cosmetic preparation, quasi-drug, Lt; / RTI >
  • Example 1-1 Preparation of chVSF (chimeric VSF)
  • mouse VSF mouse VSF
  • chAb mouse / human hybrid antibody
  • chVSF was constructed by using the pCAGGS vector as a template (Fig. 1).
  • the variable heavy chain of mVSF (mVH) (SEQ ID NO: 9) was amplified by PCR, including Sac I and Kpn I restriction enzyme sites.
  • the variable light chain (mVL) (SEQ ID NO: 8) was amplified by PCR using Cla I and Xho I restriction sites.
  • the primers used in PCR were the primers shown in Table 1.
  • the PCR conditions were 35 cycles at 94 ° C for 45 seconds, 60 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 45 seconds, and 72 ° C for 10 minutes.
  • Kpn I and Sph I restriction enzyme sites were used for the human heavy chain (SEQ ID NO: 11), and light chains (SEQ ID NO: 13) were cloned using Xho I and Bgl I restriction enzymes.
  • IRES internal ribosome entry site
  • the selection marker was inserted into the Sal I restriction enzyme site. In this manner, chVSFs as described in the schematic diagram of FIG. 2 were prepared.
  • Example 1-2 Expression of chVSF using a two vector expression system
  • chVSF of Example 1-1 was transfected into HEK 293T cells, and after 6 hours, the medium was replaced with medium containing 2% FBS. The cell culture solution was collected every 3 days and the impurities were removed by using a 0.45 ⁇ filter. ChVSF was purified using protein A sepharose beads. chVSF was eluted with 0.2 M glycine / HCl buffer (pH 2.5) and a 1 M Tris-Cl buffer (pH 9.0) was used as the neutralization buffer.
  • the resin was homogenized using 1 M Tris-Cl buffer (pH 8.0) at 10 times the volume of the resin, and then the VSF culture was passed through the column. 0.1 M Tris-Cl buffer (pH 8.0) was washed over 5 times the column volume. Elution was carried out by flowing 0.2 M Glycine / HCl buffer (pH 2.5) 5 times the resin volume and obtaining purified VSF in tubes pre-loaded with neutralization buffer. The purified VSF was then confirmed by SDS-PAGE.
  • chVSF was composed of a heavy chain of 50 kDa and a light chain of 25 kDa having immunoglobulin characteristics.
  • the scFv was prepared using the variable region of VSF.
  • the scFv had the DNA sequence of SEQ ID NO: 150, and the DNA was cloned into E. coli expression vector pET-22b (+) to prepare scFv (FIGS. 4 and 5).
  • scFv was constructed by linking VH and VL of mVSF with a linker, inserted into bacterial expression vector pET22b (+), and then IPTG was added to induce expression, followed by purification using Ni-NTA column 6).
  • hzVSF humanized VSF
  • chVSF humanized antibody
  • a pdCMV-dhfr-vector (Fig. 7) corresponding to a two gene expression vector, one of the expression systems used to express two kinds of recombinant proteins using eukaryotic cells, was used.
  • the vector is a vector system using CMV (cytomegalovirus) promoter which is composed of two different kinds of transcription units in one vector and expresses them by using its own promoter and polyA signal, which is a powerful mammalian expression promoter .
  • CMV cytomegalovirus
  • amino acid sequence of the heavy chain variable region, the heavy chain region, the light chain variable region and the light chain region of hzVSF are shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13, respectively.
  • pCAGGS-GFP 15 ⁇ of pCAGGS-GFP was transfected into HEK 293T cells using 1 mg / ml of PEI (Polyethyleneimine) to confirm transfection degree and expression level.
  • PEI Polyethyleneimine
  • the medium was replaced with medium containing 2% FBS.
  • the cell culture solution was collected every 3 days and the impurities were removed by using a 0.45 ⁇ filter. ChVSF and hzVSF were purified using protein A sepharose beads.
  • chVSF and hzVSF were eluted with 0.2 M glycine / hydrochloric acid buffer (Glycine / HCl) (pH 2.5) and 1 M Tris-Cl buffer (pH 9.0) was used as the neutralization buffer.
  • the resin was homogenized using 1 M Tris-Cl buffer (pH 8.0) at 10 times the resin volume, and then the VSF culture was passed through the column.
  • 0.1 M Tris-Cl buffer (pH 8.0) was washed over 5 times the column volume. Elution was carried out by flowing 0.2 M Glycine / HCl buffer (pH 2.5) 5 times the resin volume and obtaining purified VSF in tubes pre-loaded with neutralization buffer.
  • the purified VSF was confirmed by SDS-PAGE and the activity was confirmed by MVIT assay.
  • VSF used in the experiment is shown in Table 2 below.
  • VSF type Expressing cell mg / l (harvested sup.) mVSF Mouse Hybridoma 4.14 * rmVSF HEK293T 5.71 chVSF? 2 HEK293T 5.15 chVSF? 4 HEK293T 7.32 hzVSF? 2 HEK293T 5.01 hzVSF? 4 HEK293T 9.38
  • chVSF ⁇ 2 and chVSF ⁇ 4, hzVSF ⁇ 2 and hzVSF ⁇ 4 consisted of a heavy chain of 50 kDa and a light chain of 25 kDa having immunoglobulin characteristics.
  • Example 4 Physical properties of VSF, a humanized antibody
  • Example 4-1 Determination of basic molecular weight pattern and purity
  • hzVSF_v13 was stained with Coomassie staining according to molecular weight by SDS-PAGE to confirm the molecular weight and purity of hzVSF_v13.
  • 1 lane was a non-reducing gel, and a major band was observed at a position predicted from an IgG antibody (150 kDa), and 2 lanes were detected with a heavy chain of a reducing gel (about 50 kDa) The band was observed at the corresponding position in the light chain (about 25 kDa), and it was confirmed that hzVSF_v13 exhibited a general IgG antibody pattern.
  • Example 4-2 Confirmation of molecular weight, sugar pattern and size variation and the like
  • Liquid chromatography / mass spectrometry was performed to confirm the molecular weight, sugar pattern and size variation of hzVSF_v13. A small amount of hzVSF_v13 was injected into the HPLC to observe the peaks.
  • hzVSF_v13 exhibited immunoglobulin G (IgG) characteristics (FIG. 11).
  • IgG immunoglobulin G
  • the total molecular weight about 140 kDa was observed, and a corresponding pattern of peaks was observed in general glycated IgG such as G0 / G0, G0F / G1 and G1 / G1.
  • heavy chains about 49 kDa
  • light chains about 23 kDa
  • Glycan pattern of common IgG (G0F, G1F, G2F) was confirmed when the molecular weight of the heavy chain from which sugar chain was removed by PNGase F treatment and the heavy chain from which PNGase F was not treated was synthesized.
  • the pI of hzVS_v13 was analyzed to be 7.7, and acidic and basic isoform (acid isoform) was observed in addition to the main band. This corresponds to the isomer (eg, deamination of the C-terminal region) commonly observed in IgG antibodies.
  • Example 5 Preparation of mutants of hzVSF, a humanized antibody with reduced immunogenicity
  • Example 3 Based on the hzVSF prepared in Example 3 above, three alternatives were prepared. The activity of each alternative was similar to or less than that of the wild-type (0.5 ⁇ ⁇ 1 U ⁇ 1 mg / ml) (Table 3 and Table 4). The amino acid sequences of the CDRs 1 to 3 of each alternative are shown in Table 3, and the amino acid sequences of FR1 to FR4 of each variant are shown in Table 4.
  • Antibody CDR1 CDR2 CDR3 hzVSF_WT Heavy chain GYNMN (SEQ ID NO: 2) NIDPYYGSTTY A QKF Q G (SEQ ID NO: 3) ETGTRAMDY (SEQ ID NO: 4) Light chain RASENIYSNLA (SEQ ID NO: 5) VATNLAD (SEQ ID NO: 6) QHFYGSPRT (SEQ ID NO: 7) hzVSF_a1 Heavy chain GYNMN (SEQ ID NO: 2) NIDPYYGSTTY A QKF Q G (SEQ ID NO: 3) ETGTRAMDY (SEQ ID NO: 4) Light chain RASENIYSNLA (SEQ ID NO: 5) VATNLAD (SEQ ID NO: 6) QHFYGSPRT (SEQ ID NO: 7) hzVSF_a2 Heavy chain GYNMN (SEQ ID NO: 2) NIDPYYGSTTY A QKF Q G (SEQ ID NO: 3) ETGTRAMDY (SEQ ID
  • hzVSF variants were prepared by immunogenicity reduction and affinity maturation for practical use in vivo.
  • 13 mutants were prepared (Table 5 and Table 6).
  • the amino acid sequences of CDRs 1 to 3 of each mutant are shown in Table 5, and the amino acid sequences of FR1 to FR4 of each mutant are shown in Table 6.
  • hzVSF_var7 Heavy chain GYNMN (SEQ ID NO: 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG (SEQ ID NO: 14) ETGTRAMDY (SEQ ID NO: 4) Light chain RASENIYSNLA (SEQ ID NO: 5) VATNLAD (SEQ ID NO: 6) QHFYGSPRT (SEQ ID NO: 7) hzVSF_var8 Heavy chain GYNMN (SEQ ID NO: 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG (SEQ ID NO: 14) ETG N RAMD (SEQ ID NO: 15) Light chain RASENIYSNLA (SEQ ID NO: 5) VATNLAD (SEQ ID NO: 6) QHFYGSPRT (SEQ ID NO: 7) hzVSF_var9 Heavy chain GYNMN (SEQ ID NO: 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG (SEQ ID NO: 14) ETGTRAMDY (SEQ ID NO: 4) Light chain RASENIY
  • Example 5-3 Identification of epitope count of hzVSF wild type and its mutants
  • hzVSF_var12 and hzVSF_var13 which are representative variants of the above-mentioned mutants that reduced hzVSF wild type and its immunogenicity, and the epitope counts of four kinds of blockbuster drugs in the pharmaceutical market as a current antibody drug were compared. As shown in Table 7, The possibility of relative immunogenicity was confirmed in the HLA class.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • KLH Keyhole limpet hemocyanin
  • the percentage of T cells stained with CD3 + CD4 + Edu + was then measured. As a result, KLH reacted with 88% of T cells in 45 blood donors. However, only 5.8% responded to hzVSF_var12 or hzVSF_var13 in response to hsVSF_var13. (Fig. 14).
  • the stimulation index (SI) of T cell proliferation induced by KLH, hzVSF_v12 or hzVSF_v13 was calculated using PBMC cultured for 7 days as a control group. If the SI value is greater than 2, the immunogenicity is expected to be greater when applied to humans. If the SI value is less than 0.5, it is expected to inhibit T cell proliferation. As a result, it was confirmed that hzVSF_v12 and hzVSF_v13 are SI values of low values of 1.12 and 1.03, and SI values of 0.6 to 2 in most individuals are shown. On the other hand, the KLH used as a positive control showed a high SI value of 3.91 (FIG. 15, FIG. 16, and Table 8).
  • hzVSF_v12 and hzVSF_v13 are expected to have low immunogenicity when administered to patients who actually have skin diseases, and the side effects thereof are expected to be low.
  • VSF hzVSF
  • TMA tissue microarray
  • Example 6 it was confirmed that VR was not expressed in normal tissues (normal cells). In order to confirm whether or not VR was expressed in skin tissues in which skin diseases occurred.
  • NBF Neutral buffered formalin
  • the fixative (10% NBF) was removed from the fixed skin specimens and washed with 1X PBS for 30 minutes using an agitator. After 1X PBS was removed, dehydration was performed in a 70%, 90%, and 100% alcohol for 1 hour. Pretreatment was carried out for 1 hour in a solution of Xylene: 100% alcohol (1: 1) in the vitrification process. After that, the xylene was subjected to three times of transparentization for 1 hour, and the permeation process was performed twice for 1 hour using paraffin dissolved at 60 ° C.
  • paraffin dissolved in an oven at 60 ° C was treated with the skin specimen for 12 hours to carry out the infiltration process.
  • Paraffin melted at 60 °C in a paraffin carving machine was filled with 50% of the mold, and the skin specimens were placed in the mold, and 50% of dissolved paraffin was added.
  • the paraffin mold was then dried for one hour on a cold pad and for six hours on an experimental table.
  • the mold was removed to obtain a paraffin block, which was refrigerated (4 ° C). Specifically, the ice box was filled with 80% of ice, an appropriate amount of tap water was added to make a cold state, and the refrigerated paraffin block was placed in the ice box in the direction of the specimen. This is because, if the block state is not cold, the tissue is divided and the correct tissue can not be obtained.
  • tissue was dissected at 4 ⁇ m using a tissue breaker, which was immersed in 50% alcohol and placed in a constant temperature water bath at 43 ⁇ .
  • the cut tissue was attached to the slide using a slide.
  • the slide was placed on a heating pad heated to 43 ° C, dried for 1 hour, and stored in a refrigerator (4 ° C).
  • the slide of the skin specimen was placed in the xylene for 10 minutes.
  • the new Xylene was filled and the slide was allowed to stand for 10 minutes and then left in Xylene: 100% alcohol (1: 1) for 3 minutes.
  • the de-paraffin treatment was carried out by standing at 100%, 95%, 90%, 70%, and 50% alcohol for 3 minutes, respectively.
  • Harris Hematoxylin was allowed to stand for 3 minutes to stain the nuclei first. The hydration process was then carried out in running tap water for 5 minutes.
  • the slide of the skin specimen was placed in the xylene for 10 minutes.
  • the new Xylene was filled and the slide was allowed to stand for 10 minutes and then left in Xylene: 100% alcohol (1: 1) for 3 minutes.
  • the de-paraffin treatment was carried out by standing at 100%, 95%, 90%, 70%, and 50% alcohol for 3 minutes, respectively. It was hydrated in flowing tap water for 10 minutes, allowed to stand in 3% hydrogen peroxide for 5 minutes, and then rinsed twice with PBS for 3 minutes.
  • the slides were placed in a retrieval buffer and boiled for 10 minutes at 95 ° C in a microwave oven. The buffer was allowed to cool for 30 minutes at room temperature. This was washed twice with PBS for 3 minutes each.
  • 1% BSA Bovine Serum Albumin
  • 1xTBST 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20
  • mVSF 1:50
  • HRP horseradish peroxidase conjugated anti-mouse IgG antibody (1: 2000;) for 30 minutes at room temperature.
  • chromogen was detected by standing in a solution of DAB (diaminobenzidine): hydrogen peroxide (1:20) for 5 minutes. Harris Hematoxylin was allowed to stand for 30 seconds to stain nuclei, . Finally, they were sealed using a water-soluble sealant.
  • Example 7-4 Verification of VR expression in skin tissue of a skin disease patient
  • VR a biomarker that is expressed only in skin cells of VSF receptor and skin disease, in skin tissues of various skin diseases was confirmed by immunohistochemical staining.
  • VR was expressed in all the skin tissues of ten rose-colored nasal passages, and the expression of VR in the skin tissues of herpes zoster, chronic simplex poisoning, .
  • the incidence of VR in skin tissues of patients with round eczema, water warts, psoriasis, warts, atopic dermatitis, and contact dermatitis was 67% or more.
  • the expression level of VR was confirmed to be expressed.
  • Example 8 Evaluation of therapeutic efficacy of VSF in patients with psoriasis and chronic simple phlegm
  • This evaluation was conducted under the direction of a dermatologist for more objective evaluation of efficacy and applied to patients who voluntarily applied hzVSF.
  • Example 8-1 Determination of the therapeutic efficacy of VSF for psoriasis patients
  • the hzVSF prepared in Example 5 has an excellent therapeutic effect on skin diseases expressing VR like psoriasis.
  • Example 8-2 Determination of the efficacy of VSF treatment for patients with chronic simple phlegm
  • Patient 1 had a lesion on the right leg. On the first day (Aug. 7, 2016), hzVSF was applied to the lesion of the stomach, and was applied once every 5 days. After 3 doses, on August 22, 2016 , It was confirmed that the degree of keratin production and the degree of redness were inhibited by 70% or more (FIG. 23).
  • the lesion was applied to the ankle side. Specifically, the shank area was applied 6 times in total until September 2, 2016, and after one month, October 2, 2016, it was confirmed that the treatment effect was maintained without recurrence of the disease.
  • the ankle side was administered 3 times in total until September 2, 2016, and it was observed on October 2, 2016, a month later, that the lesion area was reduced by 50% or more (FIG. 23).
  • Patient 2 had a lesion on the ankle of both legs and applied hzVSF on the lesion at the initial stage (August 7, 2016). After a second application on August 19, 2016, and about 6 weeks later on September 30, 2016, the treatment was nearly complete. Particularly, when hzVSF was applied, the keratin-producing region almost disappeared, and the lesion site was reduced by 90% or more (FIG. 24).
  • Patient 3 had a lesion on the right shin of the right leg and applied hzVSF once on the first day (September 17, 2016), and lesion area decreased more than 50% on the second day after September 19, 2016 And an excellent therapeutic effect of hzVSF was confirmed (Fig. 25).
  • the VSF of the present invention i.e., hzVSF prepared in Example 5
  • exhibits VR expression such as psoriasis, chronic simplex poisoning, rosacea, simple herpes, circular eczema, water warts, warts, atopic dermatitis
  • the present invention can be used effectively as a composition for prevention and treatment of skin diseases expressing VR and the like.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질, 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 서열번호 1의 펩타이드를 발현하는 피부 질환에 대하여 적용되어 피부 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있으므로, 구체적인 원인이 밝혀지지 않은 다양한 피부 질환에 대한 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 피부 외용제, 피부 질환의 예방 또는 치료 방법, 치료 용도, 의약, 화장료, 의약외품 또는 피부 외용제를 제조하기 위한 용도 등에 관한 것이다.
피부질환은 사람을 포함하는 동물의 피부에서 나타나는 모든 이상소견을 의미하는데, 현대 사회에서는 산업화가 고도화됨에 따라 각종 유해물질로 인해 과거에는 발생하지 않았던 다양한 피부 질환이 발병하고 있다. 특히 피부는 세월이 지남에 따라 피부 세포의 증식작용이나 신진대사작용이 약화되어 피부조직의 탄력이 줄거나 주름이 발생하는 자연적인 노화가 진행되며, 그 이외에도 직사광선에 장시간 노출되거나, 화상, 찰과상 등의 원인에 의해서도 다양한 피부병변이 발생하여 건강한 피부를 해치기도 한다. 이렇게 자연적인 노화나 사고에 의한 피부병변은 인간 신체의 최외각에 존재하는 피부의 방어 기능 저하를 일으켜, 바이러스, 미생물 또는 박테리아 등에 의한 감염 등의 원인을 제공하며, 이로 인해 다양한 피부 질환이 발생한다.
구체적인 원인이 밝혀지지 않은 대표적 질환인 아토피성 피부염은 대부분 유아기나 소아때 발생하여 호전과 악화를 반복하는 만성 염증성 피부질환으로, 감염, 정신적인 스트레스, 계절과 기후변화, 자극 및 알레르겐에 의해 악화될 수 있다. 이러한 아토피 피부염은 면역학적인 이상이 관여하는 유전적인 질환으로 생각되고 있으나, 아직 구체적인 병인론이 밝혀지지 않았으며, 다른 피부 질환인 건선, 만성단순태선 등 역시 명확한 발병 원인이 밝혀지지 않은 상황이다.
이처럼 아토피성 피부염, 건선, 만성단순태선, 장미색 비강진, 등과 같이 구체적인 원인이 밝혀지지 않은 피부 질환에 대해서는, 현재는 화학 약물로 구성된 항염증제, 항바이러스제, 또는 식물 추출물이나 천연물 유래 화합물 등으로 치료하는 것이 대다수이다. 예를 들어, 한국등록특허공보 제10-1741281호에서는 "Ａ3 아데노신 수용체 작동약 (ＩＢ-ＭＥＣＡ/ＣＦ-101)을 포함하는 건선 치료를 위한 제약학적 조성물"을, 한국공개특허공보 제10-2017-0041149호에서는 "효소분해 아로니아 추출물 및 와송 추출물을 함유하는 아토피 피부 개선용 조성물"을 개시하고 있다.
그러나, 이러한 치료법으로는 해당 피부 질환이 완치될 확률이 높지 않고, 환부의 피부 조직 및 피부 세포만을 표적으로 하는 치료제가 아닌 점에서 치료 효율이 다소 떨어지며, 부작용 발생 가능성이 비교적 높다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 예의 노력한 결과, 구체적인 발병 원인이 밝혀지지 않은 다양한 피부염 환자의 피부 조직에 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질, 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 처리할 경우, 상기와 같은 피부 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의, 피부 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 피부 질환을 예방 또는 치료하는 의약을 제조하기 위한, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은, 피부 질환을 개선하는 화장료, 의약외품, 또는 피부 외용제를 제조하기 위한, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질, 보다 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 비멘틴 유래 펩타이드를 발현하는 피부 질환에 대하여, 피부 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있으므로, 구체적인 원인이 밝혀지지 않은 다양한 피부 질환에 대한 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 chimeric VSF의 제조를 위한 벡터의 모식도이다.
도 2는 chimeric VSF의 모식도이다.
도 3은 chimeric VSF의 발현을 확인한 도이다.
도 4는 VSF의 scFv의 DNA 서열을 나타낸 도이다.
도 5는 VSF의 scFv를 벡터에 클로닝한 모식도이다.
도 6은 VSF의 scFV를 정제하여 확인한 도이다.
도 7은 인간화 항체인 hzVSF의 제조를 위한 벡터의 모식도이다.
도 8은 본 발명의 인간화 항체인 hzVSF의 모식도이다.
도 9는 인간화 항체인 hzVSF의 발현을 확인한 도이다.
도 10은 인간화 항체인 hzVSF_var13의 물성을 확인한 환원 및 비환원 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 인간화 항체인 hzVSF_var13의 물성을 확인한 LC/MS 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 인간화 항체인 hzVSF_var13의 물성을 확인한 SEC-HPLC 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 인간화 항체인 hzVSF_var13의 물성을 확인한 IF (Isoelectric focusing)를 나타낸 도이다.
도 14는 51명의 혈액 기증자 중 KLH, hzVSF_var12 및 hzVSF_var13에 반응하여 T 세포의 증식이 일어난 기증자의 수를 나타내는 도이다.
도 15는 인간화 항체인 hzVSF의 대표적인 변이체인 hzVSF_var12 및 hzVSF_var13 에 대한 51명의 T 세포 증식 반응의 정도를 나타낸 도이다.
도 16은 KLH, hzVSF_var12 및 hzVSF_var13에 의해 유도된 T 세포 증식을 평균 SI 값으로 나타낸 도이다.
도 17은 사람의 정상 조직과 VSF간의 반응성 조사결과를 나타낸 도이다.
도 18은 다양한 피부질환에서의 VR 발현을 확인한 도이다.
도 19는 장미색 비강진, 대상포진, 만성단순태선, 단순포진, 원형습진 및 물사마귀 피부질환에서의 VR 발현을 확인한 것이다.
도 20은 건선, 사마귀, 아토피 피부염 및 접촉성 피부염 피부질환에서의 VR 발현을 확인한 것이다.
도 21은 1번 건선 환자에 대한 VSF의 치료 효능을 확인한 도이다.
도 22는 2번 건선 환자에 대한 VSF의 치료 효능을 확인한 도이다.
도 23은 1번 만성단순태선 환자에 대한 VSF의 치료 효능을 확인한 도이다.
도 24는 2번 만성단순태선 환자에 대한 VSF의 치료 효능을 확인한 도이다.
도 25는 3번 만성단순태선 환자에 대한 VSF의 치료 효능을 확인한 도이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 비멘틴은 VIM 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 세포 내 소기관 (organelle)을 지지하고 위치에 고정시키는 기능을 하는 것으로, 주로 세포의 골격, 단백질의 이동 및 세포신호전달에 관여함이 알려져 있다. 본 발명에서는 이러한 비멘틴이 정상적인 세포에서는 세포 외부로 발현되지 않으나, 구체적인 원인이 밝혀지지 않은 다양한 피부질환 환자의 피부 조직에서는 세포 외부로 발현되는 것을 확인하였으며, 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적인 항체와 같이 이에 결합할 수 있는 물질을 처리할 경우, 다양한 피부질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 상기 비멘틴 유래 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 "비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질"은 상기 비멘틴 유래 펩타이드와 결합능을 갖는 물질로서, 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다.
본 발명에서 서열번호 1의 분리된 펩타이드는 비멘틴의 아미노산 142번 내지 294번의 위치에 해당하는 것으로, 본 발명의 항체 또는 이의 단편이 결합할 수 있는 한, 상기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질은, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편, 화합물, 펩타이드, 또는 엡타머인 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 항체는 이에 제한되지 않으나, 그 예로 마우스 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
본 발명의 상기 인간화 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 항원과 직접적으로 결합하는 마우스의 단클론 또는 단일클론 항체의 가변 영역의 상보성 결정 부위를 인간 항체 골격에 이식하여, 본래의 마우스 항체의 친화도 및 특이성을 유지하면서 인체 내에서 HAMA (human anti-mouse antibody)반응을 억제하는 우수성을 갖고 있다. 더욱이, de-immunization 방법을 이용해 면역원성을 낮춘 인간화 항체로서, 인간에게 투여 시 면역원성을 현저하게 낮추어 안전한 제제로 사용될 수 있다. 즉, 이는 서열번호 1의 펩타이드 부위가 외부로 노출된 세포에 반응하여 영향을 주면서도 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)을 일어나지 않게 하여 목적 세포를 보다 효율적으로 치료할 수 있다. 아울러, 면역원성 감소에 의해 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 또한, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다.
본 발명에서 상기 서열번호 1의 분리된 펩타이드에 특이적으로 결합하는 마우스 항체는 "mVSF(mouse Virus Suppressing Factor)"로 통칭될 수 있고, 키메라 항체는 "chVSF(chimeric Vrus Suppressing Factor)"로 통칭될 수 있으며, 인간화 항체는 "hzVSF (humainzed Virus Suppressing Factor)"로 통칭될 수 있다. 본 발명에서 용어, 인간화 항체 hzVSF 또는 이의 변이체는 서로 혼용될 수 있으며, hzVSF는 hzVSF 야생형 (hzVSF_wt) 및 hzVSF의 변이체 (예를 들어, hzVSF_var1, hzVSF_v1 또는 hzVSF_1 등으로 표기)와 혼용될 수 있다.
상기 서열번호 1의 분리된 펩타이드는 에피토프를 포함하는 항원 영역으로, 항체 또는 이의 단편과 결합되어 본 발명과 유사한 기능을 나타낼 수 있는 한, 비멘틴 아미노산의 142번 내지 211번 또는 211번 내지 294번일 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. 비멘틴은 VIM 유전자에 의해 코딩되는 단백질로, 세포 내 소기관 (organelle)을 지지하고 위치에 고정시키는 기능을 하는 것으로, 주로 세포의 골격, 단백질의 이동 및 세포신호전달에 관여함이 알려져 있으며, 암 마커로 사용됨이 알려져 있으나, 이에 결합할 수 있는 항체가 피부 질환에 대한 치료 용도가 있음에 대해서는 전혀 알려진 바 없었다.
본 발명의 서열번호 1의 분리된 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 피부 질환이 발병한 환자의 피부 세포에 특이적으로 반응하는 것으로, 상기 질환이 발병한 부위의 피부 조직 또는 피부 세포에서 VSF (Virus suppressing factor)의 수용체, 즉 VR이 외부로 나타나, 이에 결합하는 것이다. 이와 같은 본 발명의 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 구체적인 발병 원인이 밝혀지지 않은 다양한 피부 질환에 대한 예방 또는 치료 분야에 있어서 유용하게 사용할 수 있다.
상기 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은, 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드의 9 번째, 45 번째, 54 번째, 76 번째, 94 번째 또는 129 번째 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로 서열번호 1의 펩타이드의 9 번째, 45 번째, 54 번째, 76 번째, 94 번째 및 129 번째 아미노산 잔기에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으나, 서열번호 1의 분리된 펩타이드에 특이적으로 결합하는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 항체 불변영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 여기에서 사용되는 용어 "단편," "펩타이드의 결합 단편" 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv 또는 scFv를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
구체적으로, 상기 펩타이드의 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이들의 이량체, 미니바디(minibodies), 디아바디(diabodies) 및 다량체(multimer) 또는 이중 특이성 항체 단편인 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리는 3개의 다변 가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, 이하 "FR"이라 함)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
또한, 상기와 같은 본 발명의 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.
본 발명의 인간화 항체는 이에 제한되지는 않으나, 인간 면역글로불린 γ4를 기반으로 인간화될 수 있으며, 보체 결합성이 없어 CDC를 일으키지 않는 장점이 있을 수 있다.
상기 인간화 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 서열번호 2로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 3 또는 서열번호 14 (서열번호 3의 9번째 아미노산인 쓰레오닌이 아스파르트산으로 치환)로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 4 또는 서열번호 15 (서열번호 4의 4번째 아미노산인 쓰레오닌이 아르파라긴으로 치환)로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 6, 서열번호 16 (서열번호 6의 3번째 아미노산인 쓰레오닌이 아스파르트산으로 치환), 서열번호 17 (서열번호 6의 3번째 아미노산인 쓰레인오닌이 아스파르트산으로, 6번째 아미노산인 알라닌이 글리신으로 치환), 또는 서열번호 18 (서열번호 6의 3번째 아미노산인 쓰레인오닌이 아스파르트산으로, 5번째 아미노산인 류신이 아르기닌으로, 6번째 아미노산인 알라닌이 글리신으로 치환)로 기재된 경쇄 CDR2; 및 서열번호 7 또는 서열번호 19 (서열번호 7의 6번째 아미노산인 세린이 쓰레오닌으로 치환)로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편일 수 있다.
또한, 상기 인간화 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 인간의 FR (framework region)을 포함하며, 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31로 기재된 인간 면역글로불린 감마일 수 있으며, 또는 서열번호 20으로 기재된 중쇄 FR1 (Framework region 1); 서열번호 21로 기재된 중쇄 FR2; 서열번호 22 또는 서열번호 28 (서열번호 22의 8번째 아미노산인 라이신이 쓰레오닌으로, 10번째 아미노산인 이소류신이 알라닌으로 치환)로 기재된 중쇄 FR3; 및 서열번호 23으로 기재된 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 24로 기재된 경쇄 FR1; 서열번호 25로 기재된 경쇄 FR2; 서열번호 26으로 기재된 경쇄 FR3; 및 서열번호 27로 기재된 경쇄 FR4를 포함하는, 경쇄 가변 영역일 수 있다.
상기 인간화 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편은 구체적으로, (a) 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 5, 서열번호 6, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3; (b) 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 5, 서열번호 16, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3; (c) 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 5, 서열번호 17, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3; (d) 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 5, 서열번호 18, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3; (e) 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 5, 서열번호 18, 및 서열번호 19로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3; (f) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 5, 서열번호 6, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3; (g) 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 28, 및 서열번호 23으로 각각 기재된 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 및 서열번호 5, 서열번호 6, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3 및 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 각각 기재된 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4; (h) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 28, 및 서열번호 23으로 각각 기재된 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 및 서열번호 5, 서열번호 6, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3 및 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 각각 기재된 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4; (i) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 28, 및 서열번호 23으로 각각 기재된 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 및 서열번호 5, 서열번호 6, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3 및 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 각각 기재된 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4; (j) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 28, 및 서열번호 23으로 각각 기재된 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 및 서열번호 5, 서열번호 18, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3 및 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 각각 기재된 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4; (k) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 28, 및 서열번호 23으로 각각 기재된 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 및 서열번호 5, 서열번호 18, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3 및 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 각각 기재된 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4; (l) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 28, 및 서열번호 23으로 각각 기재된 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 및 서열번호 5, 서열번호 18, 및 서열번호 19로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3 및 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 각각 기재된 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4; (m) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 15로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 28, 및 서열번호 23으로 각각 기재된 중쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4, 및 서열번호 5, 서열번호 18, 및 서열번호 19로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3 및 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 및 서열번호 27로 각각 기재된 경쇄 FR1, FR2, FR3 및 FR4; 또는 (n) 서열번호 2, 서열번호 14, 및 서열번호 4로 각각 기재된 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 및 중쇄 CDR3, 및 서열번호 5, 서열번호 16, 및 서열번호 7로 각각 기재된 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2, 경쇄 CDR3를 포함하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편일 수 있다.
상기 (a) 항체는 hzVSF_WT, (b) 항체는 hzVSF_var1, (c) 항체는 hzVSF_var2. (d) 항체는 hzVSF_var3, (e) 항체는 hzVSF_var4, (f) 항체는 hzVSF_var5, (g) 항체는 hzVSF_var6, (h) 항체는 hzVSF_var7, (i) 항체는 hzVSF_var8, (j) 항체는 hzVSF_var9, (k) 항체는 hzVSF_var10, (l) 항체는 hzVSF_var11, (m) 항체는 hzVSF_var12, (n) 항체는 hzVSF_var13을 각각 포함할 수 있다.
상기 인간화 항체 및 상기 펩타이드의 결합 단편은 이에 제한되지 않으나, 각각 서열번호 10 및 서열번호 12; 서열번호 32 및 서열번호 34; 서열번호 36 및 서열번호 38; 서열번호 40 및 서열번호 42; 서열번호 44 및 서열번호 46; 서열번호 48 및 서열번호 50; 서열번호 52 및 서열번호 54; 서열번호 56 및 서열번호 58; 서열번호 60 및 서열번호 62; 서열번호 64 및 서열번호 66; 서열번호 68 및 서열번호 70; 서열번호 72 및 서열번호 74; 서열번호 76 및 서열번호 78; 또는 서열번호 80 및 서열번호 82로 기재된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편일 수 있다.
상기 마우스 항체는 구체적으로, 서열번호 137로 기재된 중쇄 CDR1; 서열번호 138로 기재된 중쇄 CDR2; 및 서열번호 139로 기재된 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 134로 기재된 경쇄 CDR1; 서열번호 135로 기재된 경쇄 CDR2; 서열번호 136으로 기재된 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있으며, 더욱 구체적으로, 서열번호 9로 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8로 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 키메라 항체는 구체적으로 서열번호 141 또는 서열번호 142로 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 140으로 기재된 경쇄 가변 영역을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 구체적으로, 서열번호 146 또는 서열번호 148로 기재된 중쇄 및 서열번호 144로 기재된 경쇄를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 scFv는 이에 제한되는 것은 아니나, mVSF를 안전성을 위해 제조한 scFv 역시 포함될 수 있다. 그 예로, 도 4에 기재된 서열에 의해 제조된 scFv일 수 있다. 또한, 서열번호 131로 기재된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 133으로 기재된 경쇄 가변 영역이 링커로 연결된 형태일 수 있다. 또한, 서열번호 130의 염기 서열로 코딩되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 132의 염기 서열로 코딩되는 경쇄 가변 영역이 링커로 연결된 형태일 수 있다. 이와 같은 scFv는 E. coli 발현 벡터내에 서열번호 150의 염기서열로 클로닝될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명자들은 hzVSF_wt, 3개의 얼터너티브(alternative) 및 이의 13개의 변이체인 인간화 항체를 제조하였다 (실시예 5). 아울러, FDA 승인을 받아 시판 중인 의약품과 면역원성을 비교한 결과, 면역원성이 가장 낮은 인간 항체인 Humira와 유사한 수준의 면역원성을 나타내는 것을 확인하여 (표 7), 피부 질환 치료제로 사용시 야기될 수 있는 부작용 없이 안전한 의약품, 의약외품, 피부 외용제 등으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, hzVSF_wt 변이체를 이용하여 T 세포 분석을 통해 T 세포의 증식에 크게 영향을 주지 않는 것을 확인하여(표 8), 임상에 사용할 때 면역원으로 작용하여 부작용을 일으킬 가능성이 낮다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 상기 피부 질환은 장미색 비강진, 대상포진, 만성단순태선, 단순포진, 원형습진, 물사마귀, 건선, 사마귀, 아토피 피부염 또는 접촉성 피부염일 수 있으며, 구체적으로 만성단순태선, 또는 건선일 수 있다. 다만, 본 발명의 상기 피부 질환은 피부 조직 또는 피부 세포에서 VR이 발현되는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 다양한 피부질환이 발생한 피부 조직에서는 서열번호 1의 비멘틴 유래 펩타이드가 발현되나, 정상세포에서는 발현되지 않음을 확인하였다 (도 17). 또한, 본 발명의 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질이 실제 건선 또는 만성단순태선이 발병한 환자에 대해서도, 피부 질환에 대한 우수한 치료 효능을 나타냄을 검증하여 (도 21 내지 도 25), 원인이 밝혀지지 않은 다양한 피부 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 다른 치료제는 인터페론일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있으며, 상기 "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질, 서열번호 1의 펩타이드, 항체, 펩타이드 결합 단편, 피부질환, 예방에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질이 실제 건선 또는 만성단순태선이 발병한 환자에 대해서도, 우수한 치료 효능을 나타냄을 검증하여 (도 21 내지 도 25), 원인이 밝혀지지 않은 다양한 피부 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질, 서열번호 1의 펩타이드, 항체, 펩타이드 결합 단편, 피부질환, 예방에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공한다.
상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질, 서열번호 1의 펩타이드, 항체, 펩타이드 결합 단편, 피부질환, 예방에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어 "피부 외용제"는 일반적으로 피부 외용에 사용하는 물질 전반을 포함하는 포괄적인 개념으로, 상기 약학 조성물을 포함하는 제형의 비제한적인 예로는 경고제(PLASTERS), 로션제(LOTIONS), 리니멘트제(LINIMENTS), 액제(LIQUIDS AND SOLUTIONS), 에어로솔제(AEROSOLS), 엑스제(EXTRACTS), 연고제(OINTMENTS), 유동엑스제(FLUIDEXTRACTS), 유제(EMULSIONS), 현탁제(SUSPESIONS), 캅셀제(CAPSULES), 크림제(CREAMS), 연질, 경질 젤라틴 캅셀, 첩부제, 또는 서방화제제가 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제는 상용되는 무기 또는 유기의 담체, 부형제 및 희석제를 가하여 고체, 반고체 또는 액상의 형태로 제제화된 비경구 투여제일 수 있다. 상기 비경구 투여를 위한 제재로는 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 패취, 스프레이, 현탁제 및 유제로 이루어진 군에서 선택되는 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 외용제에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
각 제형에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기한 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물을, 이를 필요로 하는 개체에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 도포하는 단계를 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 피부 질환을 치료하는 방법은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 상기 피부 질환이 발병되거나 발병 의심이 있는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 피부 질환이 치료되는 개체는 제한 없이 포함한다.
이때, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의, 피부 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 질환을 예방 또는 치료하는 의약을 제조하기 위한, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 피부 질환을 개선하는 화장료, 의약외품, 또는 피부 외용제를 제조하기 위한, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: VSF (Virus suppressing factor)의 제조
실시예 1-1: chVSF (chimeric VSF)의 제조
마우스 VSF(mVSF)의 주요 기능적 부분이 단세포군 항체인 것으로 가정하고, 이와 인간면역글로불린을 유전자조작법으로 교잡 (chimerization)하여 마우스/인간 교잡 항체 (chAb)를 만들었다.
구체적으로, 교잡 항체를 만들기 위하여, 마우스 VSF의 경쇄 및 중쇄의 불변 영역 (constant region)을 인간면역항체 (κ, γ2 또는 γ4)의 불변 영역으로 대체하였다. chVSF는 pCAGGS 벡터를 주형으로 하여 발현벡터를 만들었다 (도 1). mVSF의 가변 중쇄 (mVH)(서열번호 9)는 SacI과 KpnI 제한효소 부위를 포함하여 PCR로 증폭하였다. 가변 경쇄 (mVL)(서열번호 8)는 ClaI과 XhoI 제한효소 부위를 포함하여 PCR법으로 증폭하였다. PCR에 사용된 프라이머는 표 1에 기재된 프라이머를 이용하였으며, PCR 조건은 94 ℃에서 45초, 60 ℃에서 45초, 72 ℃에서 45초로 35 사이클을 수행하고, 72℃ 에서 10분간 진행하였다.
프라이머 서열 서열번호
mVH F cgagctcatgggatggagctggatc 124
mVH R cggtacctgaggagacggtgactg 125
KpnI_delR gggcccttggtggaagctgaggagacggtgactgagg 126
mVL F catcgatatgagtgtgcccactcag 127
mVL R cctcgagtttgatttccagcttgg 128
Xho_modR agatggtgcagccaccgtgcgtttgatttccagcttggtgcc 129
사람의 중쇄(서열번호 11)는 KpnI과 SphI 제한효소 부위를 이용하였으며, 경쇄(서열번호 13)는 XhoI과 BglI제한효소를 이용하여 클로닝을 하였다. 경쇄와 중쇄를 동시에 발현시키기 위하여 IRES (internal ribosome entry site)를 SphI과 ClaI 제한효소 부위를 이용하여 경쇄와 중쇄 사이에 클로닝하였다. 선별마커는 SalI 제한효소 부위에 삽입하였다. 이와 같은 방식으로 도 2의 모식도에 개시된 바와 같은 chVSF 들을 제조하였다.
실시예 1-2: two vector 발현 시스템을 이용한 chVSF 발현
1 ㎎/㎖의 PEI (Polyethyleneimine)를 이용하여 15 ㎍의 pCAGGS-GFP를 HEK 293T 세포에 트랜스펙션하여, 트랜스펙션 정도 및 발현 수준을 확인하였다. 동일한 방법으로 상기 실시예 1-1의 chVSF를 HEK 293T 세포에 트랜스팩션한 후 6시간 후에 배지를 2% FBS를 포함하는 배지로 교체하였다. 3일 마다 세포 배양액을 모아서 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다. 단백질 A 세파로우즈 비드 (nProtein A sepharose bead)를 이용하여 chVSF를 정제하였다. chVSF는 0.2 M 글라이신/염산 버퍼 (Glycine/HCl) (pH 2.5)로 용출하며, 중화 버퍼로는 1 M 트리스-Cl (Tris-Cl)버퍼 (pH 9.0)를 사용하였다. 구체적으로, 1M Tris-Cl 버퍼 (pH 8.0)를 레진 볼륨의 10배로 사용하여 레진이 균질화되게 한 후, VSF 배양액을 컬럼에 통과시켰다. 0.1 M Tris-Cl 버퍼 (pH 8.0)를 컬럼 볼륨의 5배 이상을 흘러주며 세척하였다. 용출은 0.2 M Glycine/HCl 버퍼 (pH 2.5)를 레진 볼륨의 5배로 흘러주며, 중화버퍼를 미리 넣어둔 튜브에 정제된 VSF를 수득하였다. 이 후에 정제된 VSF를 SDS-PAGE로 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, chVSF는 면역글로불린의 특성을 지닌 50 kDa의 중쇄와 25 kDa의 경쇄로 이루어져 있는 구조임을 확인할 수 있었다.
실시예 2: scFv(single-chain variable fragment)의 제조
VSF의 가변 영역을 이용하여 scFv를 제조하였다. scFv는 서열번호 150의 DNA 서열을 가지며, 상기 DNA를 E. coli 발현벡터인 pET-22b(+)에 클로닝하여 scFv를 제조하였다(도 4 및 도 5).
구체적으로 mVSF의 VH와 VL을 링커로 연결하여 scFv를 제작하고, 박테리아 발현 벡터인 pET22b(+)에 삽입한 후, IPTG를 첨가하여 발현을 유도한 뒤, Ni-NTA 컬럼을 이용하여 정제하였다(도 6).
실시예 3: 인간화 항체인 VSF의 제조
상기 실시예 1을 바탕으로 chVSF를 이용하여 인간화 항체인 hzVSF (Humanized VSF)를 제조하였다.
진핵 세포를 사용하여 두 가지 종류의 재조합 단백질을 발현시키고자 할 때 사용하는 발현 시스템 중 하나인 two gene expression vector에 해당하는 pdCMV-dhfr-vector (도 7)를 이용하였다. 상기 벡터는 두 가지 종류의 유전자를 하나의 벡터 내에서 서로 다른 transcription unit으로 구성하여 각각 자체의 프로모터와 polyA signal을 사용하여 발현하는 것으로, 강력한 포유류 발현 프로모터인 CMV (cytomegalovirus) 프로모터를 이용하는 벡터 시스템이다. 이를 이용하여, 도 8의 모식도와 같은 hzVSF를 제조하였다.
이에, 상기 hzVSF의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열번호 10으로, 중쇄 영역을 서열번호 11로, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열번호 12로, 경쇄 영역을 서열번호 13으로 표시하였다.
1 ㎎/㎖의 PEI (Polyethyleneimine)를 이용하여 15 ㎍의 pCAGGS-GFP를 HEK 293T 세포에 트랜스펙션하여, 트랜스펙션 정도 및 발현 수준을 확인하였다. 동일한 방법으로 상기 chVSF 및 hzVSF를 HEK 293T 세포에 트랜스팩션한 후 6시간 후에 배지를 2% FBS를 포함하는 배지로 교체하였다. 3일 마다 세포 배양액을 모아서 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 불순물을 제거하였다. 단백질 A 세파로우즈 비드 (nProtein A sepharose bead)를 이용하여 chVSF 및 hzVSF를 정제하였다. chVSF 및 hzVSF는 0.2 M 글라이신/염산 버퍼 (Glycine/HCl) (pH 2.5)로 용출하며, 중화 버퍼로는 1 M 트리스-Cl (Tris-Cl)버퍼 (pH 9.0)를 사용하였다. 구체적으로, 1 M Tris-Cl 버퍼 (pH 8.0)를 레진 볼륨의 10배로 사용하여 레진이 균질화되게 한 후, VSF 배양액을 컬럼에 통과시켰다. 0.1 M Tris-Cl 버퍼 (pH 8.0)을 컬럼 볼륨의 5배 이상을 흘러주며 세척하였다. 용출은 0.2 M Glycine/HCl 버퍼 (pH 2.5)를 레진 볼륨의 5배로 흘러주며, 중화버퍼를 미리 넣어둔 튜브에 정제된 VSF를 수득하였다. 이 후에 정제된 VSF를 SDS-PAGE로 확인하였으며, 활성은 MVIT assay를 통해 확인하였다.
실험에 사용된 VSF를 표시하면 다음 표 2와 같다.
VSF 종류 발현 세포 mg/ℓ (harvested sup.)
mVSF 마우스 하이브리도마 4.14
*rmVSF HEK293T 5.71
chVSFγ2 HEK293T 5.15
chVSFγ4 HEK293T 7.32
hzVSFγ2 HEK293T 5.01
hzVSFγ4 HEK293T 9.38
*rmVSF: recombinant of mouse VSF
그 결과, 도 9에서 확인할 수 있듯이, chVSFγ2 및 chVSFγ4, hzVSFγ2 및 hzVSFγ4는 면역글로불린의 특성을 지닌 50 kDa의 중쇄와 25 kDa의 경쇄로 이루어져 있는 것을 확인하였다.
실시예 4: 인간화 항체인 VSF의 물성 확인
상기 실시예 3에서 제조한 hzVSF의 물성을 다음과 같이 확인하였다.
실시예 4-1: 기본적인 분자량 패턴 및 순도 확인
환원 및 비환원 SDS-PAGE를 이용하여 분자량 패턴 및 순도를 확인하고자 하였다. 구체적으로, hzVSF_v13을 SDS-PAGE로 분자량에 따라 코마시 염색법 (Coomassie Staining)으로 염색하여 hzVSF_v13의 분자량 및 순도를 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 1 레인은 비환원 젤로서, IgG 항체 (150 kDa)에서 예상되는 위치에 주요 밴드가 관찰되었고, 2 레인은 환원 젤로 IgG 항체의 중쇄 (약 50 kDa)와 경쇄 (약 25 kDa)에서 해당되는 위치에 밴드가 관찰하여, hzVSF_v13가 일반적인 IgG 항체 패턴을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4-2: 분자량, 당 패턴 및 크기 변이 등 확인
hzVSF_v13의 분자량, 당 패턴, 크기 변이 등을 확인하기 위하여 액체크로마토그라피/질량분석 (Liquid Chromtography/Mass Spectrometry)을 수행하였다. 소량의 hzVSF_v13을 HPLC에 주입하여, 피크를 관찰하였다.
그 결과, hzVSF_v13는 면역글로불린 G (IgG)의 특성을 나타내는 것을 확인하였다(도 11). Intact Mass에서는 전체 분자량 (약 140 kDa)이 관찰되었고, G0/G0, G0F/G1, G1/G1 등 일반적인 당화된 IgG에서 해당하는 피크의 패턴이 관찰되었다. 또한, 당 제거 후의 중쇄 (약 49 kDa) 및 경쇄 (약 23 kDa)가 관찰되었다. PNGase F 처리로 당쇄가 제거된 중쇄와 PNGase F를 처리하지 않은 중쇄의 분자량을 종합할 때 일반적인 IgG의 glycan 패턴을 확인할 수 있었다 (G0F, G1F, G2F).
실시예 4-3: 순도 및 응집도 확인
hzVSF_v13의 순도와 응집도를 확인하기 위하여 SEC-HPLC를 이용하였다.
SEC-HPLC 조건은 다음과 같다.
- HPLC system: Dionex Ultimate 3000
- Column: Tosoh TSKgel G3000 SWxl
- Mobile phase: phosphate buffer, 0.5 ml/min
- Injection Volume: 10 ㎕
그 결과, 전형적인 IgG 항체의 단량체에 해당하는 위치 (정체시간 약 16분에서) 92.44%의 주요 피크가 관찰되었고, 이량체 위치 (정체시간 약 13분)에서 약 6.84%의 피크가 관찰되었다(도 12).
실시예 4-4: pI 및 charge heterogeneity 확인
hzVSF_v13의 등전하점을 알아보기 위하여, pH 3에서 pH 10까지 구배를 나타내는 젤에서 러닝을 하였다.
그 결과, 도 13에서 나타낸 바와 같이, hzVS_v13의 pI는 7.7로 분석되었고, 주요 밴드 외에 산성 및 염기성 isoform (acidic/basic isoform)도 관찰되었다. 이는 IgG 항체에서 일반적으로 관찰되는 이성체 [isomer (예를 들어, C-말단 영역의 deamination)]에 해당된다.
상기와 같은 결과들은, 본 발명의 인간화 항체인 hzVSF_v13 들이 IgG 항체와 유사한 물성을 나타내는 것을 뒷받침하는 것이다.
실시예 5: 면역원성이 감소된 인간화 항체인 hzVSF의 변이체 제조
실시예 5-1: hzVSF alternative의 제조
상기 실시예 3에서 제조한 hzVSF를 기반으로, 세 개의 alternative를 제조하였다. 각 alternative의 활성은 wild-type의 활성과 비슷하거나 떨어졌다 (0.5 ≤≤ 1 U < 1 mg/ml)(표 3 및 표 4). 각각의 alternative의 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열을 표 3에 각각의 변이체의 FR1 내지 FR4의 아미노산 서열을 표 4에 기재하였다.
항체 CDR1 CDR2 CDR3
hzVSF_WT 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGSTTY A QKF Q G(서열번호 3) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VATNLAD(서열번호 6) QHFYGSPRT(서열번호 7)
hzVSF_a1 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGSTTY A QKF Q G(서열번호 3) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VATNLAD(서열번호 6) QHFYGSPRT(서열번호 7)
hzVSF_a2 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGSTTY A QKF Q G(서열번호 3) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VATNLAD(서열번호 6) QHFYGSPRT(서열번호 7)
hzVSF_a3 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGSTTY A QKF Q G(서열번호 3) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VATNLAD(서열번호 6) QHFYGSPRT(서열번호 7)
항체 FR1 FR2 FR3 FR4
hzVSF_WT 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_a1 중쇄 서열번호 151 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_a2 중쇄 서열번호 20 서열번호 152 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_a3 중쇄 서열번호 151 서열번호 152 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
실시예 5-2: hzVSF 변이체의 제조
상기 실시예 3에서 제조한 hzVSF를 기반으로, 실제 생체 내에서 활용하기 위한 면역원성 감소 및 affinity maturation을 통한 hzVSF 변이체를 제조하였다. 그 결과, 13개의 변이체를 제조하였다 (표 5 및 표 6). 각각의 변이체의 CDR 1 내지 3의 아미노산 서열을 표 5에 각각의 변이체의 FR1 내지 FR4의 아미노산 서열을 표 6에 기재하였다.
hzVSF_var7 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG(서열번호 14) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VATNLAD(서열번호 6) QHFYGSPRT(서열번호 7)
hzVSF_var8 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG(서열번호 14) ETG N RAMD(서열번호 15)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VATNLAD(서열번호 6) QHFYGSPRT(서열번호 7)
hzVSF_var9 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG(서열번호 14) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VA D N RG D(서열번호 18) QHFYGSPRT(서열번호 7)
hzVSF_var10 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG(서열번호 14) ETG N RAMDY(서열번호 15)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VA D N RG D(서열번호 18) QHFYGSPRT(서열번호 7)
hzVSF_var11 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG(서열번호 14) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VA D N RG D(서열번호 18) QHFYG T PRT(서열번호 19)
hzVSF_var12 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG(서열번호 14) ETG N RAMDY(서열번호 15)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VA D N RG D(서열번호 18) QHFYG T PRT(서열번호 19)
hzVSF_var13 중쇄 GYNMN(서열번호 2) NIDPYYGS D TYAQKFQG(서열번호 14) ETGTRAMDY(서열번호 4)
경쇄 RASENIYSNLA(서열번호 5) VA D NLAD(서열번호 16) QHFYGSPRT(서열번호 7)
항체 FR1 FR2 FR3 FR4
hzVSF_WT 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var1 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var2 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var3 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var4 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var5 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var6 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 28(K74T, I76A) 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var7 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 28(K74T, I76A) 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var8 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 28(K74T, I76A) 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var9 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 28(K74T, I76A) 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var10 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 28(K74T, I76A) 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var11 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 28(K74T, I76A) 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var12 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 28(K74T, I76A) 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
hzVSF_var13 중쇄 서열번호 20 서열번호 21 서열번호 22 서열번호 23
경쇄 서열번호 24 서열번호 25 서열번호 26 서열번호 27
상기에서 제조한 13개의 변이체는 야생형에 비해 면역원성이 감소된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5-3: hzVSF 야생형 및 이의 변이체의 epitope count 확인
hzVSF 야생형과 이의 면역원성을 감소시킨 상기 변이체 중 대표적인 변이체인 hzVSF_var12 및 hzVSF_var13의 epitope count와 현재 항체의약품으로 제약시장에서 블록버스터 의약품인 4종의 epitope count를 비교한 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이, 각 HLA class 에서 상대적인 면역원성 가능성을 확인할 수 있었다.
단백질 종류 DRB1 DRB 3/4/5 DQ DP Total
hzVSF w 31 17 1 3 52
hzVSF_var1 30 18 1 3 52
hzVSF_var2 30 17 0 3 50
hzVSF_var3 30 16 0 3 49
hzVSF_var4 28 16 0 3 47
hzVSF_var5 30 16 1 3 50
hzVSF_var6 29 16 1 3 49
hzVSF_var7 28 15 1 3 47
hzVSF_var8 27 14 1 3 45
hzVSF_var9 27 14 0 3 44
hzVSF_var10 26 13 0 3 42
hzVSF_var11 25 14 0 3 42
hzVSF_var12 24 13 0 3 40
hzVSF_var13 29 17 0 3 49
Humira (human) 25 12 4 1 42
Remicade (chimeric) 74 37 3 1 115
Rituxan (chimeric) 65 33 9 3 110
Herceptin (humanized) 40 20 3 1 64
상기 표 7에서 total 값이 높을수록 세계전체인구에서 HLA class Ⅱ에 의한 부작용의 가능성이 높음을 의미한다. 상기 결과를 통해 면역원성이 감소된 본 발명의 hzVSF_var12 및 hzVSF_var13의 epitope count가 전 세계적으로 시판되고 있는 4종의 의약품 중 면역원성이 가장 낮은 Humira와 비슷한 것을 확인할 수 있으며, 이와 같은 결과는 본 발명의 인간화 항체들이 야기할 수 있는 중대한 부작용이 매우 낮을 것임을 시사하는 것으로, 안전한 의약품으로서의 안정성을 뒷받침하는 것이다.
실시예 5-4: hzVSF 변이체의 T 세포 분석 확인
hzVSF_var12 및 hzVSF_var13의 면역원성을 평가하기 위하여 51명의 건강한 기증자의 혈액을 이용하여, Lonza의 in vitro T 세포 분석으로 본 물질이 T 세포의 증식에 영향을 미치는지를 확인하였다. 각 기증자의 전체 말초혈액 단핵구(Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMC)에 hzVSF_var12, hzVSF_var13 또는 KLH(Keyhole limpet hemocyanin)를 처리한 후, 7일간 배양하였다. KLH는 산소를 운반하는 기능을 하는 메탈로단백질(metalloprotein)로서 항체 생산시 캐리어 단백질로 이용되며, 효과적으로 면역반응을 일으키기 때문에 양성 대조군으로 사용하였다. 이 후 CD3+CD4+Edu+로 염색되는 T 세포의 비율(%)을 측정하였다. 그 결과, KLH는 45 명의 혈액 기증자에서 T 세포의 증식이 일어나 88 %가 반응하였으나, hzVSF_var12 또는 hzVSF_var13에 반응하여 T 세포의 증식을 유도한 개체는 각각 3개체로, 5.8%만이 본 물질에 반응하였다(도 14).
한편, 대조군으로 7일간 배양한 PBMC를 이용하여 KLH, hzVSF_v12 또는 hzVSF_v13에 의해 유도된 T 세포 증식의 자극지수(stimulation index; SI)를 계산하였다. SI값이 2보다 크면 사람에게 적용하였을 때 면역원성이 클 것으로 예상되고, SI 값이 0.5보다 작으면 오히려 T 세포의 증식을 억제하는 것으로 예상된다. 그 결과 hzVSF_v12 및 hzVSF_v13은 1.12 및 1.03의 낮은 값의 SI 값으로, 대부분의 개체에서 0.6 이상 2 이하의 SI 값을 나타내는 것을 확인하였다. 반면에 양성 대조군으로 사용된 KLH는 3.91의 높은 SI 값을 보였다(도 15, 도 16, 및 표 8).
Product(Antigen) Mean SI p-value
hzVSF_var12 1.12 0.008
hzVSF_var13 1.05 0.3229
KLH 3.91 <0.0001
이러한 결과로 hzVSF_v12 및 hzVSF_v13은 실제로 피부 질환에 걸린 환자에게 투여 시 면역원성이 적을 것으로 보이며, 이에 따른 부작용이 낮을 것으로 예상된다.
실시예 6: 사람의 정상 조직과 VSF간의 반응성 조사
이하에서는 상기 실시예 1 내지 5에서 제조 및 확인한 hzVSF (이하, VSF)의 피부 질환에 대한 치료 효과를 다방면으로 확인하고자 하였다.
먼저, 사람의 정상 조직과 VSF간의 반응성을 조사하기 위해, 사람의 주요 장기에 대한 정상조직이 배열 되어있는 슬라이드인 조직마이크로어레이(tissue microarray, TMA)를 이용하여 mVSF로 면역조직화학염색을 수행하였다.
그 결과, 정상 조직들에서는 mVSF로 인한 염색이 전혀 이루어지지 않았다 (도 17). 따라서, 정상 조직에서는 VSF의 수용체인 VR이 발현되지 않으며, VSF는 실질적으로 피부 질환이 발생한 피부 세포에만 작용할 것임을 알 수 있다. 또한, VSF는 정상 조직에 영향을 미치지 않아, 약학 조성물 등으로 사용되더라도 부작용이 낮으며, 약리 효과가 우수할 것임을 알 수 있다.
실시예 7: 다양한 피부질환에서의 VR 발현 확인
상기 실시예 6에서는 정상 조직 (정상 세포)에서는 VR이 발현되지 않음을 확인하였는바, 피부 질환이 발생한 피부 조직에서는 VR이 발현되는지 여부를 확인하고자 하였다.
먼저, 다양한 피부 질환자의 피부조직이 고정된 슬라이드를 이용하여 mVSF로 면역조직화학염색을 수행하였다. 각 단계의 구체적인 실험 방법은 아래와 같다.
실시예 7-1: 파라핀 포매
피부질환자 유래 조직의 피부 시편을 10% NBF(Neutral buffered formalin)에 48시간 고정하였다. 고정된 피부 시편에서 고정액(10% NBF)을 제거한 후 1X PBS에 30분 간 교반기를 이용하여 수세하였다. 1X PBS를 제거한 후 70%, 90%, 100% 알코올에 1시간씩 교반기에서 탈수화 과정을 진행하였다. Xylene : 100% 알콜(1:1)의 용액에서 1시간 동안 투명화 과정 전처리를 진행 하였다. 이후, Xylene을 1시간씩 3번 투명화 과정을 진행 하였으며, 60℃ 에서 녹인 파라핀을 이용하여 1시간 동안 2번의 침투 과정을 진행하였다. 이후, 60 ℃ 오븐에 녹인 파라핀을 12시간 피부 시편에 처리하여 침투 과정을 진행하였다. 파라핀 조각 제조 기계를 이용하여 60 ℃ 로 녹인 파라핀을 몰드에 50% 만 채우고 피부 시편을 넣은 후, 녹인 파라핀을 50% 추가하였다. 그 후 콜드 패드 위에서 1시간, 실험 테이블 위에서 6시간 동안 파라핀 몰드를 건조하였다.
건조가 끝난 후 몰드를 제거하여 파라핀 블록을 얻었으며, 이는 냉장보관(4℃) 하였다. 구체적으로는, 아이스 상자에 얼음을 80% 채운 후 적당량 수돗물을 넣어 차가운 상태를 만든 후, 냉장 보관된 파라핀 블록을 시편이 있는 방향으로 하여 아이스 상자에 넣어 두었다. 이는, 블록 상태가 차가워져 있지 않으면 조직이 갈라져서 올바른 조직을 얻을 수가 없기 때문이다.
이후, 조직 박절기를 이용하여 4 ㎛로 조직을 박절하였고, 이를 50% 알코올에 담근 후 43℃의 항온 수조에 넣었다. slide를 이용하여 박절된 피부 조직을 slide에 붙였다. Slide를 43℃ 로 데워진 히팅 패드 위에 올려서 1시간 동안 건조 후, 냉장보관(4℃ ) 하였다.
실시예 7-2: 헤마톡실린-에오신 염색 (H&E staining)
Xylene에 피부 시편 slide를 10분간 정치하였다. 새로운 Xylene을 채우고, slide를 10분간 정치하였으며, 이후 Xylene : 100% 알코올(1:1)에 3분간 정치하였다. 그 다음, 100%, 95%, 90%, 70%, 50% 알코올에 각각 3분간 정치하여 탈-파라핀 과정을 진행하였다. 이를 흐르는 수돗물에 10분간 수화 시킨 후, 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxylin)을 3분간 정치하여 먼저 핵을 염색을 하였다. 그 후 흐르는 수돗물에서 5분간 수화 과정을 진행하였다.
염색된 헤마톡실린을 제거 하고자 1% 염산(몇 방울)을 첨가하여 탈색하고, 에오신(Eosin)을 3분간 정치하여 주변 조직을 염색하였으며, 흐르는 수돗물에서 3분간 수화 과정을 진행 하였다. 그 다음, 70%, 90%, 95%, 100% 알코올에서 3분간 정치시키고, Xylene에서 5분간 정치한 후 유기용매 봉입제로 봉입하였다. 후드에서 slide를 xylene 냄새가 없어 질 때까지 건조한 후 현미경을 이용하여 조직을 관찰하였다.
실시예 7-3: 면역조직화학 염색 (Immunohistochemistry, IHC)
Xylene에 피부 시편 slide를 10분간 정치하였다. 새로운 Xylene을 채우고, slide를 10분간 정치하였으며, 이후 Xylene : 100% 알코올(1:1)에 3분간 정치하였다. 그 다음, 100%, 95%, 90%, 70%, 50% 알코올에 각각 3분간 정치하여 탈-파라핀 과정을 진행하였다. 이를 흐르는 수돗물에 10분간 수화 시킨 후, 3% 과산화수소에 5분간 정치하고, PBS로 3분씩 2번 수세하였다. Retrieval buffer에 slide를 넣은 후 전자레인지(95℃)에서 10분간 끓이고 (조직이 마르지 않게 buffer가 끓어서 넘치면 부족한 buffer를 채워 주었다), 실온에서 30분간 buffer를 식혔다. 이를 PBS로 3분씩 2번 수세하였다. 1% BSA(Bovine Serum Albumin)를 1xTBST(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)를 이용하여 만든 후 실온에서 1시간 정치하였다. mVSF(1:50)와 함께 4 ℃ 항습 챔버에서 하루 밤 동안 배양하였다. 1xTBST로 10분씩 3번 수세하였다. HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG 항체(1:2000;)와 함께 30분 동안 상온에서 배양하였다. 1xTBST로 10분씩 3번 수세하였다. 이후, DAB(Diaminobenzidine) : 과산화수소(1:20) 용액에 5분간 정치하여 색원체(chromogen)를 검출하였으며, 해리스 헤마톡실린(Harris Hematoxylin)을 30초간 정치하여 핵을 염색 하고, 흐르는 수돗물에서 수화 과정을 진행하였다. 마지막으로, 수용성 봉입제를 이용하여 봉입하였다.
실시예 7-4: 피부질환 환자의 피부조직에서의 VR 발현 확인 결과
상기와 같은 방법으로, 다양한 피부 질환자의 피부조직에서 VSF의 수용체이면서, 피부 질환이 발생한 피부 세포에서만 발현되는 바이오마커인 VR의 발현을 면역조직화학염색을 통해 확인하였다.
구체적으로, 피부 질환 환자의 피부조직에 펀치 생검을 하여, 상기 방법으로 파라핀 블록을 만들었으며, 이에 H&E 염색을 수행하고 mVSF로 면역조직화학염색을 수행하여 VR 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 18 내지 도 20에서 볼 수 있듯이, 10 명의 장미색비강진 환자의 모든 피부조직에서 VR이 발현되었으며, 그 외 대상포진, 만성단순태선, 단순포진 환자의 피부 조직에서는 VR이 90% 이상 발현되었다. 또한, 원형습진, 물사마귀, 건선, 사마귀, 아토피피부염, 접촉성 피부염 환자의 피부조직에서도 67% 이상의 VR 발현율을 보였으며, 최종적으로 총 110건의 피부질환자의 피부조직에서 88건, 즉 80%의 발현율로 VR이 발현됨을 확인하였다.
따라서, 현재까지 구체적이고도 정확한 발병원인이 밝혀지지 않은 피부질환인 장미색비강진, 만성단순태선, 원형습진, 건선, 아토피 피부염 등의 피부 조직에서는 상기 VSF와 결합할 수 있는 VR이 발현되므로, VSF를 처리하여 상기 피부질환에 대한 치료 효과를 기대할 수 있음을 알 수 있다.
이에, 피부 질환 환자에 대한 VSF의 치료 효과를 보다 구체적으로 확인하고자 하였다.
실시예 8: 건선 및 만성단순태선 환자에서 VSF의 치료 효능 평가
실제 피부질환 환자를 대상으로 VSF의 치료 효과를 확인하고자 하였다.
본 평가는 보다 객관적인 효능 평가를 위해 피부과 전문의의 주도하에 진행 되었으며, hzVSF의 도포를 자발적으로 요구한 환자에 적용하였다.
hzVSF의 효능 평가는 1회 도포시 PBS에 녹아있는 5 mg/ml의 hzVSF를 50 ㎕씩 사용하였으며, 피부과 전문의가 육안으로 치료 효과를 평가하였다.
실시예 8-1: 건선 환자에 대한 VSF의 치료 효능 확인
대상이 되는 1번 건선 환자는 오른쪽 다리에 건선이 있었으며 초진(2016년 8월 17일)에서 무릎쪽의 병변 부위에 hzVSF를 도포하고 2016년 8월 29일, 2016년 9월 7일에 추가적으로 도포하였다.
그 결과, 2016년 9월 15일 관찰 시, 다른 부위에 비해 hzVSF를 도포한 무릎 부위에서 현저한 치료효과가 확인되었으며, 2016년 9월 15일 4회째 도포 후 약 한달 후인 2016년 10월 20일에 병변 부위를 관찰한 결과, 도포 부위의 병변 부위가 90% 이상 감소함을 확인하였다 (도 21).
따라서, 상기 실시예 5에서 제조한 hzVSF는 건선과 같이 VR을 발현하는 피부질환에 대해 우수한 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
한편, 2번 건선환자는 등에 건선이 있었으며 초진(2016년 8월 19일)시 생검을 하여 hzVSF의 수용체인 VR의 발현을 조직면역염색법을 통해 확인하여, VR 발현 정도를 확인하였으며, 초진시 등의 병변부위에 hzVSF를 도포하였으며 5일 후인 8월 24일 관찰 시 각질 생성 정도와 발적의 정도가 50% 이상 감소하였다 (도 22). 따라서, 2번 환자의 경우에서도 우수한 치료 효과를 확인하였다.
실시예 8-2: 만성단순태선 환자에 대한 VSF의 치료 효능 확인
1번 만성단순태선 환자는 오른쪽 다리에 병변 부위가 있었으며 초진(2016년 8월 7일)시 정강이쪽의 병변 부위에 hzVSF를 도포하였고 5일에 한번씩 도포하여 3회 도포 후인 2016년 8월 22일에 관찰 한 결과, 각질 생성 정도 및 발적 정도가 70% 이상 억제됨을 확인하였다 (도 23).
이후, 발목 쪽의 병변 부위에도 도포를 하였다. 구체적으로 정강이 부위는 2016년 9월 2일까지 총 6회 도포하고 한달 후인 2016년 10월 2일 관찰한 결과, 질환의 재발 없이 치료 효과가 유지됨을 확인하였다. 발목 쪽은 2016년 9월 2일까지 총 3회 투여하고 한달 후인 2016년 10월 2일 관찰한 결과 병변 부위가 50% 이상 감소됨을 확인하였다 (도 23).
2번 만성단순태선 환자는 양쪽 다리의 발목에 병변 부위가 있었으며 초진(2016년 8월 7일)시 병변 부위에 hzVSF를 도포하였다. 2016년 8월 19일에 두 번째 도포하고 약 6주 후인 2016년 9월 30일에 관찰 한 결과 거의 완치에 가까운 치료 효과를 보였다. 특히, hzVSF를 도포함에 따라 각질 생성부위가 거의 사라졌으며, 병변 부위가 90% 이상 감소하는 치료 효과가 나타났다 (도 24).
3번 만성단순태선 환자는 오른쪽 다리의 정강이에 병변 부위가 있었으며 초진(2016년 9월 17일)시 hzVSF를 1회 도포하였으며 이틀 후인 2016년 9월 19일 관찰 시 병변 부위가 50% 이상 감소함을 확인하여, 마찬가지로 hzVSF의 우수한 치료 효과를 확인하였다 (도 25).
이를 종합하면, 본 발명의 VSF, 즉 실시예 5에서 제조한 hzVSF는 건선, 만성단순태선, 장미색 비강진, 단순포진, 원형습진, 물사마귀, 사마귀, 아토피 피부염, 접촉성 피부염과 같이, VR을 발현하는 피부질환에 적용될 경우 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있는바, VR을 발현하는 피부 질환에 대한 예방 및 치료용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있음을 알 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편, 화합물, 펩타이드, 또는 엡타머인 것인, 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항체는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체인 것인, 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 펩타이드의 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, 이들의 이량체, 미니바디(minibodies), 디아바디(diabodies) 및 다량체(multimer) 또는 이중 특이성 항체 단편인 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 피부 질환은 장미색 비강진, 대상포진, 만성단순태선, 단순포진, 원형습진, 물사마귀, 건선, 사마귀, 아토피 피부염 또는 접촉성 피부염인 것인, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 피부 질환은 만성단순태선, 또는 건선인 것인, 약학 조성물.
  7. 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편, 화합물, 펩타이드, 또는 엡타머인 것인, 화장료 조성물.
  9. 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편, 화합물, 펩타이드, 또는 엡타머인 것인, 의약외품 조성물.
  11. 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제.
  12. 제12항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질은 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편, 화합물, 펩타이드, 또는 엡타머인 것인, 피부 외용제.
  13. 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 질환의 예방 또는 치료 방법.
  14. 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의, 피부 질환의 예방 또는 치료 용도.
  15. 피부 질환을 예방 또는 치료하는 의약을 제조하기 위한, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
  16. 피부 질환을 개선하는 화장료, 의약외품, 또는 피부 외용제를 제조하기 위한, 서열번호 1의 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도.
PCT/KR2017/013706 2017-08-31 2017-11-28 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물 WO2019045182A1 (ko)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA3074437A CA3074437C (en) 2017-08-31 2018-08-30 Composition for preventing and treating skin disease comprising material specifically binding to vimentin-derived peptide
PCT/KR2018/010049 WO2019045477A1 (ko) 2017-08-31 2018-08-30 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
US16/636,834 US11649277B2 (en) 2017-08-31 2018-08-30 Method for treating skin diseases using a humanized antibody that binds to vimentin
AU2018326106A AU2018326106B2 (en) 2017-08-31 2018-08-30 Composition For Preventing And Treating Skin Disease Comprising Material Specifically Binding To Vimentin-Derived Peptide
JP2020511948A JP7323197B2 (ja) 2017-08-31 2018-08-30 ビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する物質を含む皮膚疾患の予防及び治療用組成物
EP18850204.1A EP3677274A4 (en) 2017-08-31 2018-08-30 COMPOSITION FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF SKIN DISEASES WITH A SUBSTANCE SPECIFICALLY BINDING VIMENTINE PEPTIDES
RU2020109504A RU2751486C1 (ru) 2017-08-31 2018-08-30 Композиция для предупреждения и лечения заболевания кожи, содержащая вещество, специфично связывающееся с пептидом, имеющим происхождение из виментина
CN201880056565.8A CN111148529A (zh) 2017-08-31 2018-08-30 用于预防和治疗皮肤疾病的包含特异性结合波形蛋白衍生肽的物质的组合物
JP2021181413A JP2022023216A (ja) 2017-08-31 2021-11-05 ビメンチン由来のペプチドに特異的に結合する物質を含む皮膚疾患の予防及び治療用組成物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2017-0110924 2017-08-31
KR20170110924 2017-08-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019045182A1 true WO2019045182A1 (ko) 2019-03-07

Family

ID=65525756

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/013706 WO2019045182A1 (ko) 2017-08-31 2017-11-28 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
PCT/KR2018/010049 WO2019045477A1 (ko) 2017-08-31 2018-08-30 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/010049 WO2019045477A1 (ko) 2017-08-31 2018-08-30 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물

Country Status (9)

Country Link
US (1) US11649277B2 (ko)
EP (1) EP3677274A4 (ko)
JP (2) JP7323197B2 (ko)
KR (1) KR102141694B1 (ko)
CN (1) CN111148529A (ko)
AU (1) AU2018326106B2 (ko)
CA (1) CA3074437C (ko)
RU (1) RU2751486C1 (ko)
WO (2) WO2019045182A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109355294B (zh) * 2018-11-16 2022-06-28 温州医科大学附属第一医院 特异性识别Vimentin的核酸适配体及其应用
CN112843222B (zh) * 2021-01-21 2023-01-31 暨南大学 Ankrd22蛋白在制备治疗或延缓自身免疫性疾病的产品中的应用
WO2024075844A1 (ja) * 2022-10-07 2024-04-11 株式会社ナノエッグ 炎症性皮膚疾患の検出及び重症度の判定方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040259112A1 (en) * 2002-12-13 2004-12-23 Aurelium Biopharma Inc. Vimentin directed diagnostics and therapeutics for multidrug resistant neoplastic disease
KR20160146579A (ko) * 2015-06-10 2016-12-21 주식회사 이뮨메드 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3829226B2 (ja) * 1999-07-07 2006-10-04 独立行政法人理化学研究所 ビメンチンの切断産物に対する抗体
US7670604B2 (en) * 2002-12-13 2010-03-02 Aurelium Biopharma, Inc. Vimentin directed diagnostics and therapeutics for multidrug resistant neoplastic disease
WO2007046463A1 (ja) * 2005-10-21 2007-04-26 Fancl Corporation アトピー性皮膚炎マーカーとその利用技術
IL200753A (en) 2009-09-06 2015-06-30 Can Fite Biopharma Ltd Pharmaceutical preparation containing ib – meca for the treatment of psoriasis
WO2013109185A1 (en) * 2012-01-19 2013-07-25 Vilara Ab Novel antibodies
WO2016118921A1 (en) * 2015-01-24 2016-07-28 Abbvie, Inc. Compositions and methods for treating psoriatic arthritis
WO2016200220A1 (ko) 2015-06-10 2016-12-15 주식회사 이뮨메드 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
KR20170041149A (ko) 2015-10-06 2017-04-14 최용호 아토피 피부 개선용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040259112A1 (en) * 2002-12-13 2004-12-23 Aurelium Biopharma Inc. Vimentin directed diagnostics and therapeutics for multidrug resistant neoplastic disease
KR20160146579A (ko) * 2015-06-10 2016-12-21 주식회사 이뮨메드 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DU, N. ET AL.: "Cell Surface Vimentin Is an Attachment Receptor for Enterovirus 71", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 88, no. 10, May 2014 (2014-05-01), pages 5816 - 5833, XP055334906, DOI: doi:10.1128/JVI.03826-13 *
HOFMANN, I. ET AL.: "Interference in Vimentin Assembly in Vitro by Synthetic Peptides Derived from the Vimentin Head Domain", JOURNAL OF CELL SCIENCE, vol. 101, 1992, pages 687 - 700, XP002407636 *
LIANG, J.-J. ET AL.: "Vimentin Binding Is Critical for Infection by the Virulent Strain of Japanese Encephalitis Virus", CELLULAR MICROBIOLOGY, vol. 13, no. 9, 2011, pages 1358 - 1370, XP055333701, DOI: doi:10.1111/j.1462-5822.2011.01624.x *

Also Published As

Publication number Publication date
JP7323197B2 (ja) 2023-08-08
JP2020532518A (ja) 2020-11-12
AU2018326106B2 (en) 2022-03-31
KR102141694B1 (ko) 2020-08-05
US11649277B2 (en) 2023-05-16
RU2751486C1 (ru) 2021-07-14
CA3074437C (en) 2023-08-15
CA3074437A1 (en) 2019-03-07
EP3677274A1 (en) 2020-07-08
WO2019045477A1 (ko) 2019-03-07
EP3677274A4 (en) 2021-06-16
KR20190024831A (ko) 2019-03-08
AU2018326106A1 (en) 2020-03-05
CN111148529A (zh) 2020-05-12
JP2022023216A (ja) 2022-02-07
US20200362020A1 (en) 2020-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015058573A1 (zh) 拮抗抑制程序性死亡受体pd-1与其配体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2015133817A1 (ko) B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
WO2018030806A1 (ko) 항체 중쇄불변부위 이종이중체에 융합된 사이토카인 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
WO2016137108A1 (en) Novel antibody binding to tfpi and composition comprising the same
WO2014077648A1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2019045477A1 (ko) 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
WO2014090053A1 (zh) 拮抗抑制血管内皮细胞生长因子与其受体结合的单克隆抗体及其编码序列与用途
WO2022039490A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2011115456A2 (ko) 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제
WO2020101365A1 (ko) 안정성이 향상된 항 c-met 항체 또는 그의 항원 결합 단편
WO2022085905A1 (ko) SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2016199964A1 (ko) 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
AU2018237024B2 (en) Anti-CEACAM1 antibody and use thereof
WO2021060837A1 (en) Anti-mers-cov antibody and use thereof
WO2012137993A1 (en) Antibodies against angiopoietins 1 and 2, and their use
WO2020004937A1 (ko) 항-bcma 항체-약물 접합체 및 그 용도
WO2020022782A1 (ko) 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2014021693A2 (ko) Tm4sf5 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 및 이의 용도
WO2020250204A1 (ko) 신규 cthrc1에 특이적 항체 및 이의 용도
WO2018026249A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2016200220A1 (ko) 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
WO2020138868A1 (ko) 타입 1 인터페론 중화 fc-융합 단백질 및 이의 용도
WO2019022274A1 (ko) Pauf 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2023214778A1 (ko) 항-cd300c 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 그의 퇴행성 뇌 질환 예방 또는 치료용 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17923184

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17923184

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1