WO2011115456A2 - 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제 - Google Patents

자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제 Download PDF

Info

Publication number
WO2011115456A2
WO2011115456A2 PCT/KR2011/001900 KR2011001900W WO2011115456A2 WO 2011115456 A2 WO2011115456 A2 WO 2011115456A2 KR 2011001900 W KR2011001900 W KR 2011001900W WO 2011115456 A2 WO2011115456 A2 WO 2011115456A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tnfr2
fusion protein
tweakr
arthritis
tweakr fusion
Prior art date
Application number
PCT/KR2011/001900
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2011115456A3 (ko
Inventor
박영우
조기원
유석호
유정
김동진
윤선하
송은정
이은경
오진미
조규원
조미라
김호연
박미경
오혜좌
박진실
우윤주
변재경
유준걸
Original Assignee
한국생명공학연구원
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원, 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to US13/635,868 priority Critical patent/US8916525B2/en
Publication of WO2011115456A2 publication Critical patent/WO2011115456A2/ko
Publication of WO2011115456A3 publication Critical patent/WO2011115456A3/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing and treating autoimmune diseases containing a double antagonist against TNF- ⁇ and TWEAK as an active ingredient.
  • the immune system protects the body from harmful foreign antigens.
  • antigens include bacteria, viruses, toxins, cancer cells and blood and tissues from other people or animals.
  • the immune system produces antibodies to destroy these harmful substances.
  • autoimmune disorders occur, the immune system cannot distinguish between organs of its healthy body and harmful antigens, destroying normal tissues, and this reaction is called autoimmune disease.
  • These reactions appear to be hypersensitivity reactions, but in the case of allergies they react to foreign substances that do not harm the body, but when autoimmune disorders occur, normal tissues of the body occur. It is not clear what causes the immune system to distinguish between organs and antigens in the body, but it is hypothesized that microorganisms or drugs, such as bacteria, cause illness in people born with genes susceptible to autoimmune diseases.
  • Types of autoimmune diseases include Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Addison's disease, type 1 diabetes, autoimmune arthritis, systemic lupus erythematosus, dermatitis, show Sjogren syndrome, Lupus erythematosus, Multiple sclerosis, Myasthenia gravis, Reactive arthritis, Graves' disease and Celiac disease sprue).
  • Treatment of the autoimmune response is aimed at regulating the autoimmune response and restoring impaired immune function of the body, which differs in the method of treatment depending on the type of various autoimmune diseases. For example, if you have a problem with blood, you need to have a blood transfusion. If you have a problem with your bones, joints, or muscles, you may need exercise or other functional therapy. Drugs are also prescribed to regulate the immune system's response. Immunosuppressive medicine is called immunosuppressive medicine. Prednisone, a corticosteroids drug, and cyclophosphamide and azathioprine, a nonsteroidal drug, are used. , And tacrolimus.
  • autoimmune arthritis is an autoimmune disease of unknown origin, despite a high prevalence of 21 million people, or about 1% of the world's population.
  • Autoimmune arthritis is a systemic chronic inflammatory finding in which the pathological symptoms are mainly symmetric in the diarthrodial joint and, in severe cases, are serious diseases leading to joint failure.
  • it also penetrates the joints and surrounding tissues, as well as organs, and can lead to osteoporosis, lungs, skin and eyes. It causes poor quality and makes life impossible for normal people.
  • Tumor necrosis factor is a pleiotropic cytokine, which plays an important role in the immune system as well as an inflammatory response, and in patients with joint and Crohn's disease of autoimmune arthritis. It is found in the colon and has also been reported to play an important role in the osteoclast process.
  • the therapeutic agents are designed to bind to ligands belonging to the TNF superfamily to inhibit signaling or to interfere with the binding between the TNF ligand and the receptor in order to inhibit the action of TNF acting as a etiology.
  • the development has been made by using a single antibody against TNF ligand and using a synthetic protein.
  • infliximab binds to soluble and transmembrane forms of TNF, and has chimeric with murine variable regions and human IgG1 and ⁇ constant regions, which neutralize the biological activity of TNF by inhibiting the binding of TNF and its receptor. It is an antibody.
  • the structure of infliximab is similar to that of naturally occurring antibodies.
  • Entracept is a fusion protein consisting of the extracellular domain of the p75 TNF receptor and the hinge and Fc domains of human IgG1.
  • These infliximab, entracept, and adalimumab are the first biological treatments certified for the treatment of autoimmune arthritis.
  • Targeting other cytokines other than TNF has led to the development of therapeutic agents, and the treatment of Disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs) that inhibit interleukin targets IL-6 or IL-1. Although it is under development, it does not appear to be superior to TNF therapeutics.
  • DMARDs Disease-modifying antirheumatic drugs
  • TWEF TNF-related weak inducer of apoptosis
  • TWEAK TNF-related weak inducer of apoptosis
  • TWEAK is a derivative of apoptosis, a ligand belonging to the TNF superfamily, and has various cells such as anti-inflammatory response, angiogenesis and cell division. It is a cytokine that regulates the response.
  • the side effects of treatment include the administration of an anti-TNF treatment, which stops the mechanism of TNF, thereby increasing the risk of fungal or bacterial infection due to dysfunction in the immune system, and in particular, increases the risk of latent pulmonary tuberculosis.
  • Demyelinating disorders are known to lead to multiple sclerosis or hematologic malignancies, and according to the Rheumatoid Society, patients with autoimmune arthritis who have received anti-TNF treatments have received conventional treatments. Compared to this, skin cancer is more likely to develop.
  • autoimmune arthritis therapies do not appear in all patients. Two-thirds of the treated patients are effective, and one-third are not effective. This confirms the limitation of treatment depending on the patient's medical history or genetic factors. Moreover, not only the pain caused by the disease, but also the side effects that may be caused when the therapeutic agent is administered, and the safety problem are to be solved. In pregnant women with autoimmune arthritis, the safety of the fetus has been discussed when receiving anti-TNF therapy. In addition, the diagnostic problem that can predict the efficacy and side effects of therapeutic agents remains a challenge for some patients.
  • TNF- ⁇ alpha, alpha
  • TWEAK TNFR2-TWEAKR which antagonizes the production of TNFR2-TWEAKR, inhibits the secretion of inflammatory cytokines by releasing IL-17 inflammatory cytokines and RORc when treated with Th17 cells. It was confirmed that the secretion of IL-10 protein, an anti-inflammatory cytokine secreted from autoimmune protective cells, was increased, and RANKL, which is known to be associated with bone destruction, increased with a significant correlation with TWEAK.
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein As well as the therapeutic effect of arthritis of TNFR2-TWEAKR fusion protein, as well as the expression of Treg cells, which are immunosuppressive cells, to confirm the therapeutic effect of autoimmune arthritis, the possibility of the TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention as a therapeutic agent for autoimmune diseases Confirming, and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a composition for the prevention and treatment of autoimmune diseases containing TNF- ⁇ (alpha, alpha) and TWEAK fusion protein, and an active ingredient thereof.
  • the present invention provides a TNFR2 (Tumor necrosis factor receptor type 2) protein or a fragment comprising the extracellular region of the TNFR2 and TNF-related weak inducer of apoptosis receptor (TWEAKR) protein or the extracellular TWEAKR Provided are fusion proteins to which fragments comprising regions are linked.
  • TNFR2 Tumor necrosis factor receptor type 2
  • TWEAKR apoptosis receptor
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • the present invention also provides a transformant transformed into a host cell with an expression vector comprising a polynucleotide encoding a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of autoimmune diseases containing TNFR2-TWEAKR fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method of treating an autoimmune disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-TWEAKR fusion protein to an individual suffering from an autoimmune disease.
  • the present invention also provides a method for preventing an autoimmune disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • the present invention provides a TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention for use as a medicament for preventing and treating autoimmune diseases.
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein of the present invention is a composition that antagonizes TNFR2 and TWEAK known as the etiology of autoimmune arthritis, one of autoimmune diseases, and is an inflammatory cytokine than TNFR2-Fc and TWEAKR-Fc.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein does not only show remarkable efficacy when compared to TNFR2-Fc and TWEAKR-Fc.
  • TIAFR2-TWEAKR fusion exhibits the effect of alleviating joint infiltration, inflammation and cartilage destruction in the CIA arthritis-induced mouse model, and increases the expression of Treg cells, which are immunosuppressive cells, to treat autoimmune arthritis.
  • Protein can be usefully used as an active ingredient of a composition having a prophylactic and therapeutic effect of an autoimmune disease.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of TWEAKR-Fc in which the TWEAKR gene was cloned into the expression vector pYK602-HIS-Fc.
  • Figure 2 shows the result of Western blot using purified protein A beads and Western blot confirming the expression of TWEAKR-Fc cloned into the expression vector pYK602-HIS-Fc, followed by HIS antibody. to be:
  • BSA bovine serum albumin used as a control
  • F228 product using TWEAKR F228 primer
  • F448 product with TWEAKR F448 primer.
  • Figure 3 is a diagram showing the structure of TNFR2 cloned TNFR2 gene in the expression vector pYK602-HIS-Fc.
  • Figure 4 shows the result of Western blot using purified protein A beads and Western blot confirming that TNFR2 cloned into expression vector pYK602-HIS-Fc was expressed using protein A beads:
  • BSA bovine serum albumin used as a control
  • F227 product with TNFR2 F227 primer.
  • FIG. 5 is a diagram showing the structure of the TNFR2-TWEAKR fusion protein cloned with the expression vector pYK602-HIS-Fc TWEAKR gene and TNFR2 gene.
  • Figure 6 shows the structure of a PCR primer to prepare a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • Figure 7 shows the results of Western blot confirming the expression of the TNFR2-TWEAKR fusion protein cloned into the expression vector pYK602-HIS-Fc:
  • CD24 control
  • F227 product using TNFR2 F227 primer
  • F227-2 product using F227-2 primer to generate TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • TTNFR2-TWEAKR fusion protein cloned into expression vector pYK602-HIS-Fc is expressed.
  • the purified TNFR2-TWEAKR fusion protein was purified using protein A beads, followed by Western blot using HIS antibody:
  • CD24 control; And
  • F227-2 product using F227-2 primer to generate TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • Figure 9 is a diagram showing the Western blot showing the results of the purification of the TNFR2-TWEAKR fusion protein in large quantities:
  • Fc control vector control with Fc domain
  • TNFR2-Fc group expressing TNFR2 including the Fc domain
  • TWEAKR-Fc group expressing TWEAKR containing an Fc domain
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein group expressing TNFR2-TWEAKR fusion protein with Fc domain;
  • BSA bovine serum albumin used as a control.
  • FIG. 10 is a diagram measuring binding affinity between the purified TNFR2-TWEAKR fusion protein and its ligand, TNF- ⁇ and TWEAK.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating the expression of TWEAK, TWEAKR, IL-17 and RANKL in synovial tissue of patients with autoimmune arthritis.
  • FIG. 12 shows the results of RT-PCR confirming the expression of IL-21, IL-17, RORc, and ⁇ -actin after treatment with TNFR2-TWEAKR fusion protein in the differentiation process of Th17 cells, TNFR2, It is a graph showing the amount of inflammatory cytokines IL-17 secreted when treated with TWEAKR-Fc and TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • Figure 13 is a graph showing the amount of anti-inflammatory cytokine IL-10 secreted after treatment of TNFR2-TWEAKR fusion protein in the differentiation of Th17 cells.
  • Figure 14 is a graph showing the amount of TWEAK and RANKL in serum and synovial fluid of patients with autoimmune arthritis.
  • FIG. 15A is a graph showing clinical scores observed when TNFR2-TWEAKR fusion protein or Enbrel was administered to CIA arthritis-induced mice; FIG.
  • CIA collagen induced arthritis
  • TNFR2-TWEAKR-Fc group administered with TNFR2-TWEAKR fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel group administered with Enbrel, an arthritis treatment agent, in a CIA arthritis animal model;
  • FIG. 15B is a graph showing the incidence observed when the TNFR2-TWEAKR fusion protein or Enbrel was administered to CIA arthritis-induced mice; FIG.
  • CIA collagen induced arthritis
  • TNFR2-TWEAKR-Fc group administered with TNFR2-TWEAKR fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • Figure 16 shows the arthritis alleviation effect of CN arthritis-induced mice of the TNFR2-TWEAKR fusion protein by immunohistochemical staining:
  • CIA collagen induced arthritis
  • TNFR2-TWEAKR-Fc group administered with TNFR2-TWEAKR fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • Figure 17 shows the reduction of inflammation in CIA arthritis-induced mice of the TNFR2-TWEAKR fusion protein by immunohistochemical staining:
  • CIA collagen induced arthritis
  • TNFR2-TWEAKR-Fc group administered with TNFR2-TWEAKR fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • 6th 6 administrations of TNFR2-TWEAKR fusion protein or Enbrel;
  • CIA collagen induced arthritis
  • TNFR2-TWEAKR-Fc group administered with TNFR2-TWEAKR fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • Figure 19 is a measure of Th17 and Treg expression in the spleen of CIA arthritis induced mice by immunostaining:
  • CIA collagen induced arthritis
  • TNFR2-TWEAKR-Fc group administered with TNFR2-TWEAKR fusion protein in a CIA arthritis animal model
  • Enbrel A group of animals receiving Enbrel, a therapeutic agent for arthritis, in a CIA arthritis animal model.
  • the invention relates to a fragment comprising a TNFR2 (Tumor necrosis factor receptor type 2) protein or a fragment comprising an extracellular region of the TNFR2 and a fragment comprising a TNF-related weak inducer of apoptosis receptor (TWEAKR) protein or an extracellular region of the TWEAKR.
  • TNFR2 Tumor necrosis factor receptor type 2
  • TWEAKR TNF-related weak inducer of apoptosis receptor
  • the fragment including the extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide including amino acids 23 to 179 of amino acid number 2, but is not limited thereto.
  • the fragment including the extracellular region of TWEAKR in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably a polypeptide comprising amino acids 28-76 of amino acid SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the TNFR2-TWEAKR fusion protein is more preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably comprises a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domain domains.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of TNFR2, the extracellular water-soluble domain of TWEAKR, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein of the present invention is prepared by a method comprising the following steps:
  • step 8 performing PCR using the generated colonies of step 8);
  • the preparation of the vector is preferably performed using a PCR from a DNA library, and the DNA library is preferably used in the liver, placenta, pancreas and liver tissue, but It is not limited to this.
  • the expression vector including the polynucleotide encoding the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably pYK602-HIS-Fc, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a transformant transformed into a host cell with an expression vector comprising a polynucleotide encoding a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • the fragment including the extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide including amino acids 23 to 179 of amino acid number 2, but is not limited thereto.
  • the fragment including the extracellular region of TWEAKR in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably a polypeptide comprising amino acids 28-76 of amino acid SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the TNFR2-TWEAKR fusion protein is more preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably comprises a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domain domains.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of TNFR2, the extracellular water-soluble domain of TWEAKR, but is not limited thereto.
  • the transformant comprising a polynucleotide encoding the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably E. coil DH5 ⁇ , but is not limited thereto.
  • PCR was performed to amplify the TWEAKR gene and the TNFR2 gene in order to subcloning TWEAKR and TNFR2 into the pYK602-HIS-Fc expression vector.
  • Each amplified PCR product was ligated to the pYK602-HIS-Fc expression vector to construct TNFR2-Fc and TWEAKR-Fc (see FIGS. 1 and 3).
  • the resulting protein and the expression of the purified protein were confirmed (see FIGS. 2 and 4).
  • TWEAKR and TNFR2 genes were amplified by PCR using a DNA library mixture as a template, and a primer for amplifying the TNFR2-TWEAKR fusion protein was prepared using the amplified product as a template (see FIG. 5).
  • Polynucleotides encoding the -TWEAKR fusion protein were amplified using PCR.
  • the amplified PCR product was ligated to the pYK602-HIS-Fc expression vector to construct a TNFR2-TWEAKR fusion protein (see FIG. 6). After transfecting the constructed TNFR2-TWEAKR fusion protein into 293E cells, the resulting protein and the purified protein were confirmed (see FIGS. 7 and 8).
  • the present invention also provides a composition for the prevention and treatment of autoimmune diseases containing a TNFR2-TWEAKR fusion protein as an active ingredient.
  • a fragment including an extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide including amino acids 23 to 179 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment including the extracellular region of TWEAKR in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably a polypeptide comprising amino acids 28-76 of amino acid SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the TNFR2-TWEAKR fusion protein is more preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably comprises a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domain domains.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of TNFR2, the extracellular water-soluble domain of TWEAKR, but is not limited thereto.
  • the autoimmune diseases include autoimmune arthritis, lupus, myasthemia gravis, ankylosing spondylitis, thyroid dysfunction, hypothyroidism, ulcerative colitis, Crohn's disease, heart valve disease, multiple sclerosis, systemic scleroderma (Scleroderma), autologous It is preferably any one selected from the group consisting of immune hepatitis, and more preferably autoimmune arthritis, but is not limited thereto.
  • the receptor activator of nuclear factor kappa B ligand expressed in the synovial tissues of autoimmune arthritis patients and osteoarthritis (OA) patients TWEAK, TWEAKR, IL-17 and nuclear factor kappa B ligands. , RANKL
  • TWEAK, TWEAKR, IL-17 and RANKL nuclear factor kappa B ligands. , RANKL
  • the protein secretion amount of the anti-inflammatory cytokine IL-10 was measured using the ELISA method. And compared to TWEAKR-Fc, it was confirmed that the increase even more when treated with the TNFR2-TWEAKR fusion protein (see Figure 13). In addition, as a result of measuring the amount of TWEAK and RANKL in serum and synovial fluid of autoimmune arthritis patients and OA patients, it was confirmed that the serum and synovial fluid increased significantly in correlation (see FIG. 14). .
  • the mouse model TNFR2-TWEAKR according to the present invention in order to confirm the in vivo arthritis treatment effect of the TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention, by producing a CIA arthritis-induced mouse model, the mouse model TNFR2-TWEAKR according to the present invention As a result of administering the fusion protein, an arthritis therapeutic effect was observed (see FIG. 15), which specifically relieves joint infiltration, inflammation and cartilage destruction (see FIG. 16), as well as reducing the expression of inflammatory factors (FIG. 17), the production of CII specific IgG2a administered to prepare the arthritis-inducing mice was reduced (see FIG. 18).
  • the treatment or palliative effect of arthritis was similar to or better than that of Enbrel used as a therapeutic agent for arthritis.
  • Th17 CD4 +
  • Treg CD25 + Foxp3 +
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein reduces the production of inflammatory cytokines IL-17, and significantly reduces TNFR2-Fc and TWEAKR-Fc, and reduces the production of the anti-inflammatory cytokines IL-10, TNFR2-Fc and TWEAKR-.
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention as an active ingredient for the prevention and treatment of autoimmune diseases It can be usefully used as.
  • the therapeutically effective amount of the TNFR2-TWEAKR fusion protein may vary depending on several factors, such as the method of administration, the site of interest, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in humans, the dosage should be determined in an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from an effective amount determined through animal testing. These considerations should be considered when determining the effective amount, for example, Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; And E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more commonly used in biological agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are not particularly limited so long as they are suitable for in vivo delivery of a TNFR2-TWEAKR fusion protein, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components can be mixed and used as needed. Conventional additives can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.
  • the composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the protein, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the composition may be parenterally administered (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) or orally, depending on the desired method, and the dosage may be weight, age, sex, health condition, diet, administration of the patient. The range varies depending on the time, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dosage of the composition according to the present invention is 0.001 ⁇ g to 10 mg / kg, preferably 0.01 ⁇ g to 10 mg / kg, and more preferably, divided into once to several times a day.
  • the present invention also provides a method of treating an autoimmune disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-TWEAKR fusion protein to an individual suffering from an autoimmune disease.
  • the present invention also provides a method for preventing an autoimmune disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • a fragment including an extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide including amino acids 23 to 179 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment including the extracellular region of TWEAKR in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably a polypeptide comprising amino acids 28-76 of amino acid SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the TNFR2-TWEAKR fusion protein is more preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably comprises a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domain domains.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of TNFR2, the extracellular water-soluble domain of TWEAKR, but is not limited thereto.
  • the autoimmune diseases include autoimmune arthritis, lupus, myasthemia gravis, ankylosing spondylitis, thyroid dysfunction, hypothyroidism, ulcerative colitis, Crohn's disease, heart valve disease, multiple sclerosis, systemic scleroderma (Scleroderma), autologous It is preferably any one selected from the group consisting of immune hepatitis, and more preferably autoimmune arthritis, but is not limited thereto.
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein reduces the production of inflammatory cytokines IL-17, and significantly less than TNFR2-Fc and TWEAKR-Fc, and reduces the production of the anti-inflammatory cytokines IL-10 than TNFR2-Fc and TWEAKR-Fc. Since it has a further increasing effect, it can be usefully used as a method for treating autoimmune disease, comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a TNFR2-TWEAKR fusion protein.
  • the therapeutically effective amount of TNFR2-TWEAKR fusion protein may vary depending on several factors, such as the method of administration, site of interest, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in humans, the dosage should be determined in an appropriate amount in consideration of both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount used in humans from an effective amount determined through animal testing. These considerations should be considered when determining the effective amount, for example, Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; And E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
  • compositions of the present invention may also include carriers, diluents, excipients or combinations of two or more commonly used in biological agents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers are not particularly limited so long as they are suitable for in vivo delivery of a TNFR2-TWEAKR fusion protein, for example, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.
  • Compounds, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and one or more of these components can be mixed and used as needed. Conventional additives can be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may be additionally added to formulate into main dosage forms, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by a suitable method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990).
  • composition of the present invention may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions.
  • the composition of the present invention comprises 0.0001 to 10% by weight of the protein, preferably 0.001 to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
  • the composition may be parenterally administered (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) or orally, depending on the desired method, and the dosage may be weight, age, sex, health condition, diet, administration of the patient. The range varies depending on the time, the method of administration, the rate of excretion and the severity of the disease.
  • the daily dosage of the composition according to the present invention is 0.001 ⁇ g to 10 mg / kg, preferably 0.01 ⁇ g to 10 mg / kg, and more preferably, divided into once to several times a day.
  • the present invention provides a TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention for use as a medicament for preventing and treating autoimmune diseases.
  • a fragment including an extracellular region of TNFR2 is preferably a polypeptide including amino acids 23 to 179 of amino acid sequence SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the fragment including the extracellular region of TWEAKR in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably a polypeptide comprising amino acids 28-76 of amino acid SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably has an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, the TNFR2-TWEAKR fusion protein is more preferably composed of 200 to 250 amino acids, but is not limited thereto.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably comprises a fragment derived from the constant domain of the heavy chain of the antibody, but is not limited thereto.
  • the Fc domain included in the TNFR2-TWEAKR fusion protein is preferably selected from the group consisting of IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, more preferably including all or part of the CH2 and CH3 constant domain domains.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein preferably includes all or part of the constant domain region of the heavy chain of the antibody at the carboxyl- and amino-terminus of TNFR2, the extracellular water-soluble domain of TWEAKR, but is not limited thereto.
  • the autoimmune diseases include autoimmune arthritis, lupus, myasthemia gravis, ankylosing spondylitis, thyroid dysfunction, hypothyroidism, ulcerative colitis, Crohn's disease, heart valve disease, multiple sclerosis, systemic scleroderma (Scleroderma), autologous It is preferably any one selected from the group consisting of immune hepatitis, and more preferably autoimmune arthritis, but is not limited thereto.
  • TWEAKR-Fc expression vector a mixed DNA library of kidney, placenta, pancreas and liver (purchased from 21C Frontier Human GENE Bank, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) Clone ID: Ku012783, Plate No. UG-0134-G10, vector : F228 forward primer (SEQ ID NO: 4: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAGCAAGCGCCAGGCACCGC-3 '), F228 reverse primer (SEQ ID NO: 5: 5'-), containing a restriction enzyme SfiI sequence for expressing the TWEAKR gene, using pCNS) as a template TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3 ').
  • PCR conditions were that the total reaction solution was 50 ⁇ l, the template was added to 100 ng, 2.5 units of pfu polymerase (Gennote, Korea), 10 pmole / 50 ⁇ l of the forward and reverse primer, respectively, and the remaining volume Fill 50 mL of the reaction solution with distilled water, and repeat the cycle 30 times at 94 ° C for 2 minutes, 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds to amplify the gene, and then react for 10 minutes at 72 ° C. Got.
  • the amplified PCR products and vectors were digested with SfiI restriction enzyme and reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then purified using a gel purification kit (QIAGEN, # 28706, USA).
  • a gel purification kit QIAGEN, # 28706, USA.
  • the plasmids are transformed into E. coli DH5 ⁇ , and then sprinkled on LB plates containing ampicillin, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 16 hours. After colony generation, the colonies were pooled into LB medium containing 10 ⁇ l ampicillin, and then colony PCR was used to make 4-5 ⁇ l of the PCR template, followed by PCR, whereby the TWEAKR gene was subcloned into the expression vector. It was confirmed.
  • TWEAKR-Fc TWEAKR-Fc after planting 293E cells with 500 ml of DMEM and 50 ml of FBS, planting cells in a 150 mm plate (plate) (# 430599, Corning, USA) to cover an area of 70 to 80% 20 ⁇ g of the expression vector and 40 ⁇ g of PEI (polyethylenimine) (# 23966, Polysciences, USA) were mixed at a ratio of 1: 2, reacted at room temperature for about 20 minutes, and then dropped onto cells for transfection. After 16-20 hours, the cells were replaced with 20 ml of DMEM medium containing no serum, and the supernatants of the cells were walked once every 2-3 days. After the supernatant was obtained, after centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, only the supernatant was transferred to a new bottle and stored until purification at 4 ° C.
  • plate 150 mm plate
  • PEI polyethylenimine
  • a total of 600 ml of the supernatant was purified on 10, 150 mm plates on days 3, 5, and 7.
  • the whole supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m top-filter (# PR02890 Millipore USA) and then 500 ⁇ l protein A beads (# 17-1279-03, GE) packed in a 5 ml column. healthcare, Sweden).
  • 0.1 M glycine hydrochloric acid (Glycine-HCl) (# G7126, Sigma, USA) using a Peri-start pump, combined with 0.9 ml / min at 4 ° C overnight, and then washing the column with 100 ml or more PBS. Elution was carried out in 6 fractions with and neutralized with 1 M Tris (# T-1503-5KG. Sigma.
  • a mixed DNA library of kidney, placenta, pancreas and liver purchased from 21C Frontier Human GENE Bank, Korea Institute of Biotechnology) Clone ID: hMU013725, plate No.
  • IRAU-86-H09, vector : pDNR-LIB as a template
  • the forward primer SEQ ID NO: 8: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3 '
  • the reverse primer SEQ ID NO: 9: 5'-
  • Sfi I sequence for expressing the TNFR2 gene
  • the gene was amplified to the following conditions using TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3 '), treated with SfiI restriction enzymes, and then subcloned into the pYK602-HIS-Fc vector.
  • PCR condition was that the total reaction solution was 50 ⁇ l, the template was added to 100 ng, 2.5 units of pfu polymerase (Gennote, Korea), 10 pmole / 50 ⁇ l of the forward and reverse primer, respectively, the remaining volume was distilled water 50 ⁇ l of the reaction solution was prepared, followed by 30 cycles of 94 ° C., 2 min, 94 ° C., 30 sec, 55 ° C., 30 sec, and 72 ° C. for 1 min. Got.
  • the amplified PCR products and vectors were digested with SfiI restriction enzyme and reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then purified using a gel purification kit.
  • the ratio of the amplified PCR product and the vector was 3 (150 ⁇ g): 1 (50 ⁇ g), and 1 ⁇ l T4 DNA ligase and 2 ⁇ l 10 ⁇ ligase buffer were mixed.
  • the total reaction solution was 20 ⁇ l. Ligation was performed at 16 hours.
  • the ligated plasmid was transformed into E. coli DH5 ⁇ , sprinkled on LB plates containing ampicillin, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 16 hours. After colony generation, colonies were pooled in LB medium containing 10 ⁇ l ampicillin, and then, 4-5 ⁇ l of the PCR template was used as a colony PCR method, and PCR was performed. Thus, the TNFR2 gene was expressed as pYK602-HIS-Fc. It was confirmed that the expression vector is subcloned (FIGS. 3 and 4).
  • the cells After planting 293E cells with 500 ml of DMEM and 50 ml of FBS, the cells were planted to a 70 mm to 80% area in a 150 mm plate, and 20 ⁇ g of TNFR2-Fc expression vector and 40 ⁇ g of PEI were added as 1: After mixing at a ratio of 2 and reacting at room temperature for about 20 minutes, the cells were dropped and transfected. After 16-20 hours, the cells were exchanged with 20 ml of DMEM medium without serum, and the supernatant of the cells was walked every 2 to 3 days. After the supernatant was obtained, after centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, only the supernatant was transferred to a new bottle and stored until purification at 4 ° C.
  • a total of 600 ml of the supernatant was purified on 10, 150 mm plates on days 3, 5, and 7.
  • the whole supernatant was filtered using a 0.22 ⁇ m top-filter and then bound to 500 ⁇ l of Protein A beads packed in a 5 ml column.
  • the column was washed with 100 ml or more of PBS, eluted into 6 fractions using 0.1 M glycine hydrochloric acid, eluted with 1 M Tris (pH 9.0).
  • TNFR2-Fc was quantified, 2-3 fractions of TNFR2-Fc were collected and concentrated using amicon ultra, and the buffer was exchanged about 10 times with PBS (# 70011, Gibco, USA).
  • a forward primer and a reverse primer comprising a restriction enzyme SfiI sequence for expressing TNFR2 and the gene (SEQ ID NO: 10: 5'-GCGGTGCCTGGCGCTTGCTCCGTGCAGACTGCATCCATGCT-3 ') to amplify the TNFR2 gene and forward primer (SEQ ID NO: 11: 5'-AGCATGGATGCAGTCTGCACGGAGCAAGCGCCAGGCACCGC-3') under conditions to amplify the TWEAKR gene.
  • the PCR products were subcloned into the pYK602-HIS-Fc vector by PCR of two PCR products with a total of 100 ng as a template at a ratio of 1: 1 and three primers.
  • the PCR conditions used were 50 ⁇ l of the total reaction solution, 100 ng of the template, 2.5 units of pfu polymerase (Genotech, Korea), 10 pmole / 50 ⁇ l of the forward and reverse primers respectively, and the remaining volume. 50 ⁇ l of the reaction solution was filled with distilled water, and then repeated for 30 cycles at 94 ° C. 2 minutes, 94 ° C. 30 seconds, 55 ° C. 30 seconds, and 72 ° C. for 1 minute to amplify the gene, followed by reaction at 72 ° C. for 10 minutes. PCR products were obtained.
  • the amplified PCR products and vectors were digested with SfiI restriction enzyme and reacted at 37 ° C. for 4 hours, and then purified using a gel purification kit.
  • the ratio of the amplified PCR product and the vector was 3 (150 ⁇ g): 1 (50 ⁇ g), and 1 ⁇ l T4 DNA ligase and 2 ⁇ l 10 ⁇ ligase buffer were mixed.
  • the total reaction solution was 20 ⁇ l and the temperature was 16 ° C. Ligation was performed at 16 hours.
  • the ligated plasmid was transformed into E. coli DH5 ⁇ , sprinkled on LB plates containing ampicillin, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 16 hours. After colony generation, the colonies were pooled in LB medium containing 10 ⁇ l ampicillin, and then, using colony PCR method, 4 to 5 ⁇ l of them were used as PCR templates, and PCR was performed to encode TNFR2-TWEAKR fusion proteins. It was confirmed that the polynucleotide was subcloned into the pYK602-HIS-Fc expression vector.
  • the cells After planting 293E cells with 500 ml of DMEM and 50 ml of FBS, the cells were planted to a 70-80% area in a 150 mm plate, and 20 ⁇ g of TNFR2-TWEAKR fusion protein and 40 ⁇ g of PEI were 1: After mixing at a ratio of 2 and reacting at room temperature for about 20 minutes, the cells were dropped and transfected. After 16-20 hours, the cells were exchanged with 20 ml of DMEM medium without serum, and the supernatant of the cells was walked every 2 to 3 days. After the supernatant was obtained, after centrifugation at 5000 rpm for 10 minutes, only the supernatant was transferred to a new bottle and stored until purification at 4 ° C.
  • a total of 1 mg of TNFR2-TWEAKR fusion protein was obtained at 380 ⁇ g / ml.
  • Transfection was performed when 293E cells were 80% to 90% full in 150 mm plates (# 430599, Corning, USA).
  • the ratio of PEI: TNFR2-TWEAKR fusion protein is 2: 1, and 20 micrograms of plasmid DNA amount and 40 micrograms of PEI are put into a 150 mm plate normally.
  • 1 mL of serum-free media was added to the solution containing PEI and plasmid DNA.
  • the mixture was briefly mixed using Vortex, allowed to react at room temperature for about 20 minutes, and then 1 mL was dispensed on a 150 mm plate. .
  • reaction was carried out for 24 hours in a CO 2 incubator at 37 ° C., and then 150 mm plates were washed with PBS to remove PEI and plasmid DNA. Serum free media was dispensed into a 150 mm plate with about 20 ml and incubated in a CO 2 incubator for 24 hours.
  • Table 1 sample Expression Expression vector 1.0 mg / l TNFR2-Fc 0.6 mg / l TWEAKR-Fc 0.6 mg / l TNFR2-TWEAKR fusion protein 0.6 mg / l
  • Culture supernatants were filtered using a 0.22 ⁇ m Top-filter, and then transferred to sterile 1 L bottles for purification in a low temperature room. Purification was performed using a Peristart-pump and the purification column was washed for 30 minutes with PBS at a rate of 2 ml / min using an injector. After washing, the protein A beads were packed in a column. When the volume of the supernatant was 1 L, about 700 ⁇ l of protein A beads were packed. After the packing of the protein A beads was washed again with 50 ml of PBS. The culture supernatant was then placed in a column. The rate was 1 ml / min and bound overnight.
  • Chromo-LAL to measure bacterial endotoxin of the purified protein cat # C0031, CAPE COD.
  • the reference toxin (CSE, control standard bacterial endotoxin; cat # E0005, CAPE COD) used as a control was prepared by diluting 2 times from 1 EU / ml to a minimum concentration of 0.03125 EU / ml.
  • 100 ⁇ l of LAL was added to 100 ⁇ l of LRW (LAL reagent water, cat # WP1001, CAPE COD) as a negative control, and 100 ⁇ l of LAL was added to 100 ⁇ l of reference toxin (CSE) at a concentration of 0.125 EU / ml.
  • CSE reference toxin
  • 100 ⁇ l of LAL was prepared in 100 ⁇ l of the sample diluted to a constant concentration of 50 ⁇ g / ml with LRW.
  • a product positive control experiment was performed to confirm the interference of the samples.
  • 50 ⁇ l of the diluted sample was prepared by adding 50 ⁇ l of 0.125 EU / ml standard toxin (CSE) and 100 ⁇ l of LAL.
  • the reference value was determined using a protocol file (Chromo LAL setting.pda) when measured with a VersaMax microplate reader (Molecular devices). The plate was preliminarily preheated to 37 ° C. for 10 minutes before starting the experiment. The OD was measured by starting the protocolized file at the same time as processing the LAL. The standard curve is written in X / Log EU / mL and Y-axis Log Onset time, and the cytotoxicity of the sample is automatically calculated in software and displayed in EU / mL. When the R 2 value of the standard curve was more than 0.98, the reliability of the measured value was placed.
  • EndoTrap Red (cat # 83-009U, Lonza) column was used to remove the cytotoxicity of the purified fusion proteins.
  • the column is washed twice with 3 ml of regeneration buffer and then twice with the same amount of equilibration buffer.
  • the sample was then applied and the fractions started to be received. At this time, the flow rate of the sample was 0.5 to 1 ml / min, and the remaining sample in the column was applied by applying 1 ml of equilibration buffer.
  • the cytotoxicity test was carried out in the same manner as in Experimental Example ⁇ 1-1> to confirm the results.
  • the blocking buffer was removed from the ELISA plate, and each purified protein was prepared at 100 nM in 100 ⁇ l of blocking buffer, and serial dilution was performed at a dilution of 1/4. The reaction was carried out for 2 hours. Then wash the plate 5 times with 200 ⁇ l PBS and 2 ⁇ l of secondary antibody anti-Human Fc-HRP (# 31413, Thermo, USA) in 4 ml containing 1% skim milk. After mixing in PBS, put 200 ⁇ l per well in an ELISA plate and reacted for 1 hour at room temperature.
  • the secondary antibody on the ELISA plate was removed, washed five times with 200 ⁇ l of PBS, and 10 ⁇ l of hydrogen peroxide solution (H 2 O 2, # H1009-100ML, Sigma, USA) and 10 mL of PC buffer [5.1 g Citric acid monohydrate, 7.3 g sodium phosphate (pH 5.0) / l, and one OPD tablet (# P8787-100TAB Sigma USA) were mixed to make a total solution of 100 ⁇ l. Put in. After the reaction solution was added, the reaction was allowed to proceed for 10 minutes in a dark state at room temperature, and the color development was confirmed. The reaction was terminated by adding 50 ⁇ l of a stop buffer to stop the reaction, and the wavelength of 490 nm in the ELISA reader. Kd value was measured at.
  • the TNF- ⁇ ligand showed a high binding force with TNFR2-Fc and TNF- ⁇ and TNFR2-TWEAKR-Fc, but showed a low binding force with TWEAKR-Fc.
  • the TWEAK ligand showed a low Kd value between the TWEAKR-Fc and the TNFR2-TWEAKR fusion protein, thereby confirming a high binding force and a low binding force with TNFR2-Fc (Table 5 and FIG. 10).
  • Table 5 sample TNF- ⁇ (Kd value) TWEAK (Kd value) TNFR2-Fc 1.080 37.89 TWEAKR-Fc 46.13 0.6414 TNFR2-TWEAKR fusion protein 1.724 0.1217
  • TWEAKR TWEAK receptor
  • RNKL receptor activator of nuclear factor kappa B ligand
  • the bound antibody was removed, washed with 50 ml PBS, and then reacted with 100 ⁇ l of streptavidin bound with a biotin-bound secondary antibody and peroxidase. It was then developed by DAB and observed with an optical microscope (Tokyo, Japan).
  • Ficoll Anagenital Staline
  • diluted blood ratio of 1: 4 to float the blood so as not to mix in the picol layer and centrifuged for 30 minutes at 2000rpm, 20 °C and peripheral blood in the smoke layer Monocytes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) were isolated.
  • Peripheral blood mononuclear cells described in Experimental Example ⁇ 4-1> were used in cell culture medium RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum in 48-well plates with 5 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ l cells (Nalge Nunc International, IL, USA). ), TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc and TNFR2-TWEAKR fusion proteins were treated at 10 ⁇ g / ml for 1 hour. After 1 hour, the cells were transferred to the bottom of the cells using a pipette and transferred to 48-well plates coated with 0.3 ⁇ g / ml of anti-CD3 (BD Pharmingen, San Diego, Calif., USA), and peripheral blood mononuclear cells.
  • RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum in 48-well plates with 5 ⁇ 10 5 cells / 500 ⁇ l cells (Nalge Nunc International, IL, USA).
  • PCR Reverse transcription polymerase chain reaction
  • the reaction compound for RT-PCR was 25 ⁇ l in total for each sample, and the composition of the solution was 2.5 ⁇ l of 10 ⁇ reaction buffer, 2.5 ⁇ l of 0.5 mM dNTP, 0.3 ⁇ l of Taq (Takara, shinga, Japan) and target forward and 2 ⁇ l of reverse primer, 1 ⁇ l of cDNA and 14.7 ⁇ l of distilled water were used, respectively.
  • Dual-bay thermal cycler system MJ Research
  • Distilled water was used instead of the cDNA extracted as a negative control to confirm that there was no PCR contamination through the PCR product was not observed.
  • IL-21 was repeated for 30 minutes at 94 °C 30 seconds, 56 °C 30 seconds, 72 °C 30 seconds after the denaturation process of 94 °C 3 minutes, and then the reaction was performed at 72 °C for 7 minutes for extension.
  • IL-17 amplification conditions were 94 °C 3 minutes denaturation process, 94 °C 1 minute, 56 °C 1 minute, 72 °C 1 minute the reaction was repeated 30 times and then the reaction was carried out for 7 minutes at 72 °C.
  • RORc and ⁇ -actin were denatured at 94 ° C. for 3 minutes, the reactions were repeated 30 times and 26 times for 94 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds, and 72 ° C 30 seconds, respectively.
  • the amplification product obtained by the polymerase reaction was subjected to electrophoresis on a 1.5% agarose gel containing ethidium bromide, followed by gel-Doc 2000 (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA).
  • the amplified product was quantified by concentration measurement using Quantity-One (Bio-rad) program. This value was converted into the ratio with ⁇ -actin to compare the mRNA expression level between each cell group.
  • the primer sequences used are as follows:
  • the amplification products were converted according to the ⁇ -actin expression ratio and compared with each mRNA expression level.
  • IL-17 (R & D Systems) antibody 100 ⁇ l of IL-17 (R & D Systems) antibody was added at 1 ⁇ g in a well of 96-well plate for Sandwich ELISA, followed by reaction at room temperature for 2 hours. Then, 1% bovine serum albumin (BSA) was mixed in 0.05% PBST. 200 ⁇ l of blocking buffer was added and the reaction was carried out at room temperature for 2 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • Human recombinant IL-17 (R & D Systems) to be used as a standard was used in a well of 100 ⁇ l at a concentration of 5,000 to 78.125 pg / ml each. 50 ⁇ l / well of the cell culture supernatant to be measured together with the standard was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • phosphate disodium salt hexahydrate (PNPP) / DEA solution was added at 50 mg / well at a concentration of 1 mg / ml to react. After the reaction, 50 ⁇ l / well of 0.2N NaOH was added thereto to stop the reaction, and the absorbance was measured at a wavelength of 405 nm.
  • PNPP phosphate disodium salt hexahydrate
  • Th17 cells increased the product of IL-17 protein under differentiation stimulation conditions.
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein was treated with TNFR2-Fc and TWEAKR-Fc 10 ug / ml. Rather, it was confirmed that the production of IL-17 was reduced more effectively (FIG. 12).
  • Treg cells To determine whether the TNFR2-TWEAKR fusion protein may have a synergistic effect on the action of Treg, an immunosuppressive cell that inhibits Th17 cell responses and balances autoantigens and protects against autoimmunity, Treg cells The anti-inflammatory cytokine IL-10 protein produced at was measured using the ELISA method.
  • IL-10 (R & D Systems) antibody 100 ⁇ l of IL-10 (R & D Systems) antibody was added to 1 ⁇ g of 2-10 ⁇ l / ml of Sandwich ELISA, followed by reaction at room temperature for 2 hours, followed by mixing 1% bovine serum albumin (BSA) with 0.05% PBST. 200 ⁇ l of blocking buffer was added and the reaction was carried out at room temperature for 2 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • Human recombinant IL-10 (R & D Systems) to be used as a standard sample was used in a well of 100 ⁇ l / ml at a concentration of 5,000 to 78.125 pg / ml each. 100 ⁇ l / well of the cell culture supernatant to be measured together with the standard sample was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the cells were washed four times with 300 ⁇ l of 0.05% PBST, diluted with biotin-conjugated anti-human IL-10 (R & D Systems) at a concentration of 200 ng / ml, and placed in 50 ⁇ l / well for 2 hours at room temperature. I was.
  • Osteotomy one of the major symptoms of autoimmune arthritis, is caused by increased bone erosion due to excessive osteoclast production, and RANKL, a major factor in osteoclast differentiation, is increased by cytokines such as TNF and IL-1. It is. Accordingly, to investigate the relationship between TWEAK and RANKL, the amount of TWEAK and RANKL in serum and synovial fluid of autoimmune arthritis patients was measured by ELISA method.
  • RANKL capture antibody was diluted in PBS to 100 ⁇ g / ml 1 ⁇ g / ml concentration was put 100 ⁇ l in ELISA plate and reacted for 12 hours at room temperature.
  • the capture antibody dilution solution was removed and washed four times with 300 ⁇ l wash buffer [0.05% Tween-20 in PBS]. After washing, 300 ⁇ l blocking buffer [1% BSA in PBS] was added to each well and reacted at room temperature for 1 hour. After 1 hour, four washes with 300 ⁇ l wash buffer.
  • RANKL protein For use as a standard, 1 ⁇ g / ml of RANKL protein was diluted in diluent [0.05% Tween-20, 0.1% BSA in PBS] to a concentration of 2 ng / ml, which was diluted 5% sequentially to 0 ng / ml. 100 ⁇ l each of the sample to be measured and the prepared standard were placed in an ELISA plate and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction, the cells were washed four times, and 100 ⁇ g / ml of the detection antibody was diluted to 0.5 ⁇ g / ml in the diluent. Then, 100 ⁇ l of each antibody was added thereto and reacted at room temperature for 2 hours.
  • TWEAK The measurement of TWEAK was carried out by diluting 100 ⁇ g / ml of the capture antibody to PBS so that the concentration was 0.5 ⁇ g / ml, and adding 100 ⁇ l to the ELISA plate for 12 hours at room temperature.
  • the capture antibody dilution solution was removed and washed four times with 300 ⁇ l wash buffer. After washing, 300 ⁇ l blocking buffer was added to each well and reacted at room temperature for 1 hour. After 1 hour, four washes with 300 ⁇ l wash buffer.
  • 1 ⁇ g / ml of RANKL protein was diluted in diluent to a concentration of 2 ng / ml and this was sequentially diluted to 0 ng / ml.
  • the mixture was washed four times and reacted by adding 100 ⁇ l of a Phosphate Disodium salt Hexahydrate (PNPP) / DEA solution at a concentration of 1 mg / ml. After the reaction, 100 ⁇ l of 0.2 N NaOH was added to stop the reaction, and the absorbance was measured at 405 nm.
  • PNPP Phosphate Disodium salt Hexahydrate
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein was administered to the collagen-induced arthritis CIA (collagen induced arthritis) mouse model to confirm the therapeutic effect.
  • CII type II collagen
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • IP intraperitoneal injection
  • the arthritis evaluation was based on the mean arthritic index by Rosolinec et al., And the average score divided by 4 was added according to the following scale, and the average obtained by summing the values obtained by three observers in each mouse was used. do. The number of outbreaks was scored with 25% of one foot and the number of swollen feet:
  • mice to which TNFR2-TWEAKR fusion protein and Enbrel were administered to the CIA arthritis-induced mice used in Experimental Example 7 were collected, and the degree of joint infiltration, inflammation and destruction of cartilage was confirmed by immunohistochemical staining. It was.
  • mice to which the TNFR2-TWEAKR fusion protein and Enbrel were administered to the CIA arthritis-induced mice used in Experimental Example 7 were collected and observed for expression of inflammatory factors using immunohistochemical staining.
  • CIA arthritis-induced mice used in Experimental Example 7 were immunized with a single administration of type II collagen (CII). Thereafter, the TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention was injected three times a week for three weeks, a total of nine times. According to the injection process, the change in the content of CII in the blood was measured.
  • CII type II collagen
  • CII Type II Collagen
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • IgG blocking buffer 200 ⁇ l was added per well, and the reaction was performed at room temperature for 1 hour. Thereafter, the serum of the experimental group and the control group was diluted and 50 ⁇ l each was reacted at room temperature for 1 hour. After washing five times with an IgG washing buffer, anti-mouse IgG HRP was diluted 1: 75,000 and 50 ⁇ l per well was added and allowed to react at room temperature for 1 hour. After the reaction, the cells were washed 5 times with IgG washing buffer, and then reacted with a TMB substrate solution. Then, the color change was stopped using 1N H 2 SO 4 . Measured.
  • Th17 and Treg factors of CIA arthritis-induced mice injected with the TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention the spleen tissue of the mouse used in Experimental Example 7 was collected and Th17 (CD4 + IL- 17+) cells and Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 +) cells were observed by confocal staining.
  • ⁇ Experiment 7> The spleen of the CIA arthritis-induced mouse was taken and embedded in an OCT compound, and the tissue rapidly cooled using liquid nitrogen was attached to the slide with a thickness of 7 ⁇ m using a frozen slicer. Sections attached to the slides were fixed with acetone and blocked nonspecific reactions for 30 minutes with 10% normal goat serum. Staining of the Treg markers CD4, CD25, Foxp3 was performed using PE-labeled anti-CD4 antibody, Allophycocyanin-labeled anti-CD25 antibody (Biolegend), FITC-labeled anti-Foxp3 Ab antibody, respectively.
  • the Th17 markers CD4 and IL-17 were used as biotinylated anti-CD4 antibodies (BD Biosciences) and PE-labeled anti-IL-17 antibodies. After diluting the antibodies at a ratio of 1: 100 in PBS (pH 7.5), the tissues attached to the slides were reacted overnight at 4 ° C, and the next day, streptavidin was added to the tissues using the biotinylated anti-CD4 antibody. (streptavidin) cy-3 was reacted at room temperature for 2 hours. After washing three times with PBS, the stained tissue was observed using confocal microscopy (LSM 510 Meta. Zeiss, Gottingen, Germany).
  • compositions of the present invention are given below.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • the TNFR2-TWEAKR fusion protein of the present invention reduces the secretion of the inflammatory cytokine IL-17 protein, increases the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 protein, and this effect is TNFR2-Fc , TNFR2-TWEAKR fusion protein showed better effect than TWEAKR-Fc single protein, and the expression of RANKL and TWEAK in synovial membrane of autoimmune arthritis patients was not only increased significantly but also in animal induced arthritis (CIA) arthritis model.
  • CIA animal induced arthritis
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein When the TNFR2-TWEAKR fusion protein according to the present invention is administered, joint invasion, inflammation and cartilage destruction are alleviated, and the expression of Treg cells, which are immunosuppressive cells, is increased, indicating a therapeutic effect of autoimmune arthritis.
  • Treg cells which are immunosuppressive cells
  • TNFR2-TWEAKR fusion protein can be usefully used as an active ingredient of a composition having a prophylactic and therapeutic effect of autoimmune diseases.

Abstract

본 발명은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 주요 병인으로 알려진 TNF-α와 TWEAK에 대한 이중 길항제의 역할을 하는 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 Th17 세포에 처리하였을 때, 염즘성 사이토카인 IL-17의 분비가 감소되었으며, Treg 세포에서 생성되는 항염증성 사이토카인 IL-10의 분비가 증가하며, 또한 이러한 효과가 TNFR2-Fc와 TWEAK-Fc 단일 단백질보다 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, CIA 관절염 유발 마우스에서 관절염의 치료 효과뿐만 아니라, 면역 억제 세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가 면역 관절염의 치료효과 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 자가 면역 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제
본 발명은 TNF-α와 TWEAK에 대한 이중 길항제를 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역체계는 해로운 외부물질인 항원(antigen)으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 이러한 항원의 종류로는 박테리아, 바이러스, 독소, 암세포와 다른 사람 혹은 동물로의 혈액과 조직이 이에 해당된다. 면역체계는 이러한 해로운 물질들을 파괴하기 위하여 항체를 생산한다. 그러나 자가 면역에 이상이 생긴 경우, 면역체계는 자신의 건강한 신체의 장기와 해로운 항원을 구분하지 못하여, 정상적인 조직을 파괴하게 되며, 이러한 반응을 자가 면역 질환(autoimmune disease)라고 불린다. 이러한 반응은 과민반응(hypersensitivity reaction)으로 보이나, 알레르기의 경우 신체에 해가 되지 않는 외부 물질에 대해서 반응을 하지만, 자가 면역에 이상이 생긴 경우에는 신체의 정상적인 조직을 대상으로 반응이 일어나게 된다. 면역체계가 신체의 장기와 항원을 구분하지 못하게 된 원인은 확실치 않으나, 박테리아와 같은 미생물 또는 약물이 자가 면역 질환에 걸리기 쉬운 유전자를 가지고 태어난 사람들에게 병을 유발하는 것이라는 가설이 있다.
자가 면역 질환의 종류에는 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 악성 빈혈, 애디슨 병(Addison's disease), 제1형 당뇨, 자가 면역 관절염(Rheumatoid arthritis), 전신 홍반성 루프스(Systemic lupus erythematosus), 피부근염, 쇼그랜 증후군(Sjogren syndrome), 홍반성 루프스(Lupus erythematosus), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 중증 근무력증(Myasthenia gravis), 반응성 관절염(Reactive arthritis), 그레이브즈 병(Grave's disease) 및 셀리악 병(Celiac disease - sprue) 등이 있다.
자가 면역 반응의 치료는 자가 면역 반응을 조절하고, 신체의 손상된 면역기능을 회복시키는 것을 목적으로 이루어지며, 이는 다양한 자가 면역 질환의 종류에 따라 치료의 방법에 차이가 있다. 예를 들어, 혈액에 문제가 생긴 경우에는 수혈을 해야하며, 뼈, 관절 혹은 근육에 문제가 생긴 경우에는 운동 혹은 다른 기능적인 치료를 받아야 한다. 또한 면역 체계의 반응을 조절하기 위해서 약물이 처방된다. 면역억제약(immunosuppressive medicine)이라고 불리며, 사용되고 있는 면역억제약의 종류에는 코르티코스테로이드(corticosteroids) 약물인 프레드니손(prednisone)과 비스테로이드성(nonsteroid) 약물인 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오프린(azathioprine), 및 타크로리무스(tacrolimus) 등이 있다.
자가 면역 질환의 한 종류인 자가 면역 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 전 세계 인구의 약 1%에 해당하는 2,100만 명이 걸려있는 높은 유병률에도 불구하고, 아직까지 발병원인이 알려지지 않은 자가 면역성 질환이다. 자가 면역 관절염은 그 병적 증상이 주로 가동관절(diarthrodial joint)에 대칭적으로 나타나는 전신성 만성염증적 소견을 보이며, 심한 경우 관절의 부전에까지 이르는 심각한 질환이다. 또한 자가 면역의 이상으로 관절의 염증 및 고통뿐만, 관절과 그 주위의 조직, 더불어 여러 장기에까지 침투하여 골다공증, 폐, 피부, 눈으로까지 침범되는 전신장기침범과 고통을 동반하여 환자에게 엄청난 삶의 질 저하를 가져오고 정상인과 같은 생활을 불가능하게 한다.
자가 면역 관절염의 치료는 과거에는 생활습관의 개선이나, 수술, 치료제의 복용으로 발병의 속도를 늦추거나, 고통을 줄이며, 감염의 억제 및 치료에 중점을 두며, 관절의 기능이 향상되는 것에 관해서는 기대하지 않았으나, 근래에 들어서는 관절의 기능적인 회복과 심지어 완치를 목표로 치료하고 있으며, 이는 근 10년 동안 자가 면역 관절염의 치료에 있어서 획기적인 치료법인 항 TNF 길항제들의 개발로 가능하게 되었다.
종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)는 다면발현(pleiotropic) 사이토카인(cytokine)으로서, 염증성 반응뿐만 아니라 면역체계의 중요한 역할을 담당하며, 자가 면역 관절염의 관절 및 크론병(Crohn's disease) 환자의 결장(colon)에서 발견되며, 또한 골파괴(osteoclast) 과정에서 중요한 역할을 한다고 보고되었다. 따라서, 치료제들은 병인으로 작용하는 TNF 의 작용을 억제하기 위하여, TNF 슈퍼패밀리에 속하는 리간드와 결합하여 신호전달을 방해하거나 혹은 TNF 리간드와 수용체간의 결합을 방해하는 역할을 수행하도록 제작되었다. TNF 신호 전달을 억제 하기 위해 TNF 리간드에 대한 단일 항체를 사용하는 방법과 합성 단백질(recombinant protein)을 사용하는 방법으로 개발이 이루어졌다. 레미케이드 (Remicade)사의 인플릭시맙(infliximab), 또는 휴미라(Humira)의 아달리무맙(adalimumab)과 같이 단일 항체의 방식으로 치료를 하는 방법과 CTLA-4 Ig와 엔브렐(Enbrel)의 엔트라셉트(entracept)와 같은 합성 단백질(recombinant protein)을 사용하기도 한다. 보다 구체적으로, 인플릭시맙은 가용성 및 막횡단 형태의 TNF에 결합하여, TNF와 이의 수용체의 결합을 억제함으로써 TNF의 생물학적 활성을 중화시키는, 뮤린 가변 영역 및 인간 IgG1 및 κ 불변 영역을 지니는 키메라 항체이다. 인플릭시맙의 구조는 천연 발생 항체의 구조와 유사하다. 엔트라셉트는 p75 TNF 수용체의 세포외 도메인 및 인간 IgG1의 힌지 및 Fc 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 이러한 인플릭시맙, 엔트라셉트, 아달리무맙은 최초로 자가 면역 관절염 치료제로 인증받은 생물학적 치료제로서 근 10년간 임상에서 높은 효능을 보이며 치료제로서 활용되어왔다. TNF 이외의 다른 사이토카인을 타겟으로도 치료제의 개발로 이어졌으며, 인터루킨(interleukin)을 억제시키는 류미티드 관절염 개선약(Disease-modifying antirheumatic drugs, DMARD) 치료제가 IL-6 혹은 IL-1을 타겟으로 개발 중에 있으나, TNF 치료제보다 뛰어난 효과가 나타나지 않고 있는 실정이다.
트위크(TNF-related weak inducer of apoptosis, TWEAK)는 세포사멸(apoptosis) 유도체로서, TNF 슈퍼패밀리(superfamily)에 속하는 리간드의 한 종류로, 항염증성 반응, 혈관생성과 세포의 분열 등의 다양한 세포반응을 조절하는 사이토카인이다. TWEAK은 콜라겐으로 유도된 관절염(collagen-induced arthritis, CIA) 동물 모델에서 발병전 TWEAK 항체를 처리하여, 그 신호전달을 억제하였을 때, 관절의 염증과 활막 혈관생성과 관절과 뼈의 침식이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(J Immunol. 2006 Aug 15;177(4):2610-20.).
이러한 항 TNF 치료제들은 높은 효능에도 불구하고, 극복되어야 할 많은 문제들이 있다. 치료의 부작용으로는 항 TNF 치료제를 투여받음으로써, TNF의 기작이 정지되며 이에 따라, 면역체계에서 기능 이상으로 진균 혹은 세균의 감염의 위험이 높아지며, 특히 잠복중인 폐결핵의 재발의 위험을 높인다. 탈수초 질환(demyelinating disorders)으로 다발성 경화증, 혹은 혈액암(hematologic malignancies)으로 이어질 위험이 알려져 있으며, 류마티스 학회에 따르면, 항 TNF 치료제들을 투여받은 자가 면역 관절염 환자들의 경우, 기존의 치료제들을 받은 경우에 비해서 피부암이 발병될 가능성이 높다는 보고가 있다.
또한, 자가 면역 관절염 치료제들의 효과는 모든 환자들에게 나타나는 것은 아니다. 치료를 받은 환자의 3분의 2가 치료의 효과가 있으며, 3분의 1의 경우는 효과가 나타나지 않고 있다. 이는 환자의 병력에 따라서, 혹은 유전적인 요인에 따라서 치료의 한계가 있음을 확인해 주고 있다. 더욱이 병으로 인한 고통뿐만 아니라, 치료제를 투여 받았을 때 유발될 수 있는 부작용과, 안전성에 대한 문제는 해결되어야만 하는 문제이다. 자가 면역 관절염을 갖고 있는 임산부의 경우 항 TNF 치료제를 투여 받을 경우, 태아의 안전성에 대한 문제가 거론되어 왔다. 더불어 환자에 따라서 치료제의 효능과 부작용을 예측할 수 있는 진단학적인 문제가 과제로 남아있다.
이에 본 발명자들은 기존 항 TNF 치료제로 사용되고 있는 단일 길항제가 가지고 있는 안전성과 효능성의 단점을 극복할 수 있는 새로운 자가 면역질환의 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, TNF-α(alpha, 알파)와 TWEAK에 대한 길항작용을 하는 TNFR2-TWEAKR을 제작하여, Th17 세포로에 처리하였을 때, IL-17 염증성 사이토카인의 분비 및 RORc의 발현이 감소되는 것을 확인함으로써, TNFR2-TWEAKR의 염증성 사이토카인의 분비 억제 효능을 밝혔으며, 자가 면역 보호 세포에서 분비되는 항염증성 사이토카인인 IL-10 단백질 분비량이 증가시키는 것을 확인하였으며, 골 파괴와 관련이 있는 것으로 알려진 RANKL이 TWEAK와 서로 유의하게 상관관계를 이루면서 증가되는 것을 자가 면역 관절염 환자의 혈청에서 확인하였으며, 아울러 CIA 관절염 유발 마우스에서 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 관절염 치료 효과뿐만 아니라, 면역 억제세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가면역 관절염의 치료 효과를 확인함으로써, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 자가 면역 질환의 치료제로서의 가능성을 확인하며, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TNF-α(alpha, 알파)와 TWEAK 융합 단백질, 및 이를 유효성분으로 함유하는 자가 면역질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편과 TWEAKR(TNF-related weak inducer of apoptosis receptor) 단백질 또는 상기 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환의 예방방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 자가면역 질환 예방 및 치료용 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 제공한다.
본 발명의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 자가 면역 질환의 하나인 자가 면역 관절염의 병인으로 알려진 TNFR2와 TWEAK에 대하여 길항작용을 하는 조성물로서, 기존에 사용되고 있는 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc보다 염증성 사이토카인인 IL-17의 분비를 감소시키며, 또한 항염증성 사이토카인인 IL-10의 분비를 증가시키는 효과가 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc과 비교하였을 때,현저히 뛰어난 효능을 보일 뿐만 아니라, CIA 관절염 유발 마우스 모델에서 관절의 침윤, 염증 및 연골 파괴를 완화시키는 효과를 나타내고, 면역 억제 세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가 면역 관절염의 치료효과 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR융합 단백질은 자가 면역 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 TWEAKR 유전자가 클로닝된 TWEAKR-Fc의 구조를 나타내는 그림이다.
도 2는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TWEAKR-Fc가 발현된 것을 확인한 웨스턴 블랏과 발현된 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 그림이다:
BSA: 대조군으로 사용한 소 혈청 알부민;
F228: TWEAKR F228 프라이머를 사용한 산물; 및
F448: TWEAKR F448 프라이머를 사용한 산물.
도 3은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 TNFR2 유전자가 클로닝된 TNFR2의 구조를 나타내는 그림이다.
도 4는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TNFR2가 발현된 것을 확인한 웨스턴 블랏과 발현된 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 그림이다:
BSA: 대조군으로 사용한 소 혈청 알부민; 및
F227: TNFR2 F227 프라이머를 사용한 산물.
도 5는 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 TWEAKR 유전자와 TNFR2 유전자가 같이 클로닝된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 구조를 나타내는 그림이다.
도 6은 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 제조하기 위한 PCR 프라이머의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블랏한 결과를 나타낸 그림이다:
CD24: 대조군;
F227: TNFR2 F227 프라이머를 사용한 산물; 및
F227-2: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 생성하기 위한 F227-2 프라이머를 사용한 산물.
도 8은 발현벡터 pYK602-HIS-Fc에 클로닝된 TTNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 발현되는 것을 확인한 웨스턴 블랏과. 발현된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 protein A 비드를 이용하여 정제한 후, HIS 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 나타낸 그림이다:
CD24: 대조군; 및
F227-2: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 생성하기 위한 F227-2 프라이머를 사용한 산물.
도 9는 대량으로 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 정제한 결과를 나타낸 웨스턴 블랏을 나타낸 그림이다:
Fc control: Fc 도메인 포함된 벡터 대조군;
TNFR2-Fc: Fc 도메인 포함된 TNFR2를 발현 군;
TWEAKR-Fc: Fc 도메인 포함된 TWEAKR을 발현 군;
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질: Fc 도메인 포함된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 발현 군; 및
BSA: 대조군으로 사용한 소 혈청 알부민.
도 10은 정제한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과 그 리간드인 TNF-α와 TWEAK와의 결합력(Binding affinity)을 측정한 그림이다.
도 11은 자가 면역 관절염 환자의 활막조직에서 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 RANKL의 발현을 관찰한 그림이다.
도 12는 Th17 세포의 분화과정에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, IL-21, IL-17, RORc, β-actin의 발현을 확인한 RT-PCR 결과와, Th17 세포의 분화과정에서 TNFR2, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때, 분비되는 염증성 사이토카인 IL-17의 양을 나타낸 그래프이다.
도 13은 Th17 세포의 분화과정에서 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, 분비되는 항염증성 사이토카인 IL-10의 양을 나타내는 그래프이다.
도 14는 자가 면역 관절염 환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK와 RANKL의 양을 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 치료효과를 확인한 그래프이다:
도 15의 A는 CIA 관절염 유발 마우스에 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여하였을 때 관찰되는 임상학적 수치(Clinical Score)를 나타낸 그래프이다;
↑: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여한 시기;
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
TNFR2-TWEAKR-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군;
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군;
도 15의 B는 CIA 관절염 유발 마우스에 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여하였을 때 관찰되는 발생수(Incidence)를 나타낸 그래프이다;
↑: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여한 시기;
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
TNFR2-TWEAKR-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 16은 면역조직화학염색법을 통한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 완화 효과 확인한 그림이다:
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
TNFR2-TWEAKR-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 17은 면역조직화학염색법을 통한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 염증 감소를 확인한 그림이다:
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
TNFR2-TWEAKR-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 18은 CIA 관절염 유발 마우스의 CII 특이적 IgG2a 생성량을 측정한 그래프이다:
0: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여하기 전;
1st: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여 1회;
6th: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여 6회;
9th: TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 엔브렐(Enbrel)을 투여 9회;
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
TNFR2-TWEAKR-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
도 19는 면역염색법을 통한, CIA 관절염 유발 마우스의 비장의 Th17 및 Treg 발현량을 측정한 그림이다:
CIA: CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 아무것도 투여하지 않은 음성 대조군;
TNFR2-TWEAKR-Fc: CIA 관절염 동물 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군; 및
Enbrel: CIA 관절염 동물 모델에 관절염 치료제인 엔브렐(Enbrel)을 투여한 군.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편과 TWEAKR(TNF-related weak inducer of apoptosis receptor) 단백질 또는 상기 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질을 제공한다.
상기, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번 아미노산의 28번 ~ 76번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 이러한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 200 ~ 250 개의 아미노산으로 구성된 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNFR2, TWEAKR의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:
1) DNA 라이브러리를 주형으로 삼고, TWEAKR 프라이머를 사용하여 PCR(중합효소 연쇄 반응)을 수행하는 단계;
2) DNA 라이브러리를 주형으로 삼고, TNFR2 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;
3) 단계 1)과 단계 2)의 PCR 산물을 주형으로 삼고, TNFR2-TWEAKR의 융합 유전자를 코딩하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하는 단계;
4) 단계 4)의 PCR 산물을 제한효소로 절단하는 단계;
5) pYK-602-HIS-Fc 발현 벡터를 제한효소로 절단하는 단계;
6) 단계 4)와 단계 5)의 제한효소로 절단된 플라스미드를 라이게이션(ligation)하는 단계;
7) 단계 6)의 라이게이션 반응이 완료된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 형질전환하는 단계;
8) 단계 7)의 형질전환 후, LB 플레이트에 접종하는 단계;
9) 단계 8)의 생성된 콜로니(colony)를 이용한 PCR을 수행하는 단계;
10) 단계 9)에서 확인된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 293E 세포에 형질감염(transfection)시키는 단계;
11) 단계 10)의 293E 세포에서 발현된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 세포 배양액으로부터 정제하는 단계;
12) 단계 11)의 정제된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 세포독성을 제거하는 단계; 및
13) 단계 12)의 정제된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 결합능력(Binding affinity)를 확인하는 단계.
본 발명의 제조방법에 있어서, 벡터의 제조는 DNA 라이브러리(library)로 부터 PCR을 이용하여 수행하는 것이 바람직하며, 상기 DNA 라이브러리는 간, 태반, 췌장 및 간 조직에서 제조된 것을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터는 pYK602-HIS-Fc가 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질 전환체를 제공한다.
상기, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번 아미노산의 28번 ~ 76번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 이러한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 200 ~ 250 개의 아미노산으로 구성된 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNFR2, TWEAKR의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체는 E. coil DH5α인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, pYK602-HIS-Fc 발현 벡터에 TWEAKR과 TNFR2을 서브클로닝(subcloning)하기 위하여, PCR을 수행하여 TWEAKR 유전자와, TNFR2 유전자를 증폭하였다. 증폭된 각각의 PCR 산물을 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 라이게이션하여, TNFR2-Fc 및 TWEAKR-Fc를 구축하였다(도 1 및 도 3 참조). 구축한 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc를 293E 세포에 형질감염시킨 후, 생성되는 단백질과, 이를 정제한 단백질의 발현을 확인하였다(도 2 및 도 4 참조).
또한, DNA 라이브러리 혼합을 주형으로 하여 TWEAKR와 TNFR2 유전자를 PCR을 수행하여 증폭시키며, 증폭된 산물을 주형으로 하여, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 증폭한기 위한 프라이머를 제작한 후(도 5 참조), TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 PCR을 이용하여 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 pYK602-HIS-Fc 발현 벡터에 라이게이션 반응을 통해서, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 구축하였다(도 6 참조). 구축한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 293E 세포에 형질감염시킨 후, 생성되는 단백질과, 이를 정제 후 단백질을 확인하였다(도 7 및 도 8 참조).
또한, 제조한 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 대량 제조하기 위하여, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 발현량을 기준으로 293E 세포에 형질감염 한 후, 융합된 단백질들을 정제한 후 이를 확인하였다(표 1, 표 2 및 도 9 참조).
또한, 제조된 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 가지고 있는 세포내독성을 측정한 후, 이를 제거하였다(표 3 및 표 4 참조).
아울러, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 리간드인 TNF-α 또는 TWEAK와의 결합력을 알아보기 위하여 결합 정도(binding affinitty)를 확인하는 실험을 수행하였다. 그 결과, TNFR2-Fc는 TNF-α와 결합력이 높으며, TWEAKR-Fc는 TWEAK와 결합력이 높으며, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNF-α와 TWEAK 두 리간드에 대하여 결합력이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
상기, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번 아미노산의 28번 ~ 76번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 이러한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 200 ~ 250 개의 아미노산으로 구성된 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNFR2, TWEAKR의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염, 루푸스, 중증근무력증(Myasthemia gravis), 강직성 척추염, 갑상선 기능 향진증, 갑상선 기능 저하증, 궤양성 대장염, 크론병, 심장판막증, 다발성 경화증, 전신성 경피증(Scleroderma), 자가 면역성 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 자가 면역 관절염인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시 양태에서는 자가 면역 관절염 환자와 골관절염(Osteoarthritis, OA)환자의 활막 조직에서 발현되는 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 핵 인자 카파비 리간드의 수용체 활성제(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)의 발현량을 비교한 결과, 자가 면역 관절염 환자의 경우, OA 환자보다 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 RANKL의 발현량이 많은 것을 관찰할 수 있었다(도 11참조). 또한, Th17 세포에 <실시예>를 통해서 구축된 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, IL-21, IL-17 및 RORc의 발현이 모두 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 12 참조). 또한, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 각각 처리하였을 때 Th17 세포에서 분비되는 염증성 사이토카인 IL-17의 양의 변화를 ELISA를 이용하여 측정한 결과, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때가 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc를 처리하였을 때와 비교해 현저히 감소된 IL-17의 분비량을 확인할 수 있었다(도 12 참조). 또한, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리한 후, 항염증성 사이토카인 IL-10의 단백질 분비량을 ELISA 방법을 사용하여 측정한 결과, IL-10 단백질의 분비량이 TNFR2-Fc 및 TWEAKR-Fc에 비하여, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때 더욱 증가함을 확인할 수 있었다(도 13 참조). 아울러, 자가 면역 관절염 환자와 OA환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK 및 RANKL의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과, 혈청과 활막액에서 유의하게 상관관계를 이루며 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 14 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 생체내 관절염 치료효과를 확인하기 위하여, CIA 관절염 유발 마우스 모델을 제조하여, 상기 마우스 모델에 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 결과, 관절염 치료효과가 관찰되었으며(도 15 참조), 이는 구체적으로 관절의 침윤, 염증 및 연골 파괴가 완화되며(도 16 참조), 염증 인자의 발현이 감소될 뿐만 아니라(도 17 참조), 상기 관절염 유발 마우스를 제조하기 위하여 투여된 CII 특이적 IgG2a의 생성이 감소되는 효과를 나타냈다(도 18 참조). 이러한, 관절염의 치료 또는 완화 효과는 관절염 치료제로 사용하고 있는 엔브렐(Enbrel)과 유사하거나, 우수한 것을 관찰할 수 있었다. 아울러, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 CIA 관절염 유발 마우스에서, 면역 반응에 관여하는 비장 조직을 채취하여 Th17과 Treg 세포의 발현을 관찰하였을 때, 염증 인자를 발현하는 Th17(CD4+IL-17+)세포의 발현이 감소한 반면, 자가 면역으로부터 보호하는 역할을 하는 면역 억제 세포인 Treg(CD4+CD25+Foxp3+) 세포의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 19 참조).
따라서, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 염증성 사이토카인 IL-17의 생성을 감소시키며 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc보다 더욱 유의하게 감소시키며, 항 염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc보다 더욱 증가시키는 효과를 나타낼 뿐만 아니라, CIA 관절염 유발 마우스 모델에서 자가 면역 관절염의 완화 또는 치료효과를 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 치료학적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.001 ㎍ ~ 10 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ㎍ ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환의 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유요한 양의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환의 예방방법을 제공한다.
상기, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번 아미노산의 28번 ~ 76번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 이러한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 200 ~ 250 개의 아미노산으로 구성된 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNFR2, TWEAKR의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염, 루푸스, 중증근무력증(Myasthemia gravis), 강직성 척추염, 갑상선 기능 향진증, 갑상선 기능 저하증, 궤양성 대장염, 크론병, 심장판막증, 다발성 경화증, 전신성 경피증(Scleroderma), 자가 면역성 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 자가 면역 관절염인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 염증성 사이토카인 IL-17의 생성을 감소시키며 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc보다 더욱 유의하게 감소시키며, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 생성을 TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc보다 더욱 증가시키는 효과를 가지므로,약학적으로 유효한 양의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 치료적학으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 생체내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.001 ㎍ ~ 10 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 0.01 ㎍ ~ 10 ㎎/㎏이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
아울러, 본 발명은 자가면역 질환 예방 및 치료용 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 제공한다.
상기, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번 아미노산의 23번 ~ 179번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에서 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번 아미노산의 28번 ~ 76번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하며, 이러한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 200 ~ 250 개의 아미노산으로 구성된 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 항체의 중쇄(heavy chain)의 불변(constant) 도메인으로부터 유래된 단편을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 포함되는 Fc 도메인(domain)은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게 CH2와 CH3 불변(constant domain) 도메인 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 TNFR2, TWEAKR의 세포외 수용성 도메인의 카르복실- 및 아미노-말단에 항체의 중쇄의 불변(constant) 도메인 영역 전체 또는 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염, 루푸스, 중증근무력증(Myasthemia gravis), 강직성 척추염, 갑상선 기능 향진증, 갑상선 기능 저하증, 궤양성 대장염, 크론병, 심장판막증, 다발성 경화증, 전신성 경피증(Scleroderma), 자가 면역성 간염으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 자가 면역 관절염인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> TWEAKR-Fc 제조
<1-1> TWEAKR-Fc 발현벡터 제조
TWEAKR-Fc 발현 벡터를 제조하기 위하여, 신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA Library(21C Frontier Human GENE Bank(한국생명공학연구원)에서 구입. Clone ID:Ku012783, 플레이트 No. UG-0134-G10, 벡터: pCNS)를 주형으로 사용하여, TWEAKR 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 F228 정방향 프라이머(서열번호 4: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCGAGCAAGCGCCAGGCACCGC-3'), F228 역방향 프라이머(서열번호 5: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3'). F448 정방향 프라이머I(서열번호 6: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCAGTTTGGGGAGCCGGGCATC-3') 및 F448 역방향 프라이머(서열번호 7: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGTGAACCTGGAAGAGTCCGA-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiⅠ 제한효소로 처리한 후, pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝(subcloning)하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕를 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트(gel purification kit)(QIAGEN, # 28706, USA)를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제(#SDL01-R40k, Solgent, Korea)와 2 ㎕ 10×리가아제 버퍼를 섞은 후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션(ligation)을 수행하였다.
라이게이션이 완료된 플라스미드(plasmid)를 E. coli DH5α에 형질변환(transfromation)한 후 암피실린(ampicillin)이 포함된 LB 플레이트에 뿌린(spreading)후 37℃ 배양기에서 16시간 배양시킨다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4 ~ 5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TWEAKR 유전자가 발현벡터에 서브클로닝 됨을 확인하였다.
<1-2> TWEAKR-Fc 발현 및 정제
293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150 ㎜ 플레이트(플레이트)(#430599, Corning, USA)에 70 ~ 80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TWEAKR-Fc 발현벡터 20 ㎍과 PEI(polyethylenimine)(#23966, Polysciences, USA) 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염(transfection)시켰다. 16 ~ 20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 20 ㎖ DMEM 배지로 교환해주며, 세포의 상층액은 2 ~ 3일 마다 한 번씩 걷었다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.
10개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일째에 걷은 상층액 총 600 ㎖을 정제하였다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter(#PR02890 Millipore USA)를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼(column)에 패킹(packing)되어있는 500 ㎕의 protein A 비드(#17-1279-03 ,GE healthcare, Sweden)에 결합시켰다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1 M 글리신 염산(Glycine-HCl)(#G7126, Sigma, USA)을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리(elution)하고, 1 M Tris(#T-1503-5KG. Sigma. USA)(pH 9.0)으로 중화시켰다. 그 다음 TWEAKR-Fc를 정량하고, TWEAKR-Fc의 발현이 있는 분획을 2 ~ 3개 모아 amicon ultra(#UFC805024, Millipore, USA)을 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 TWEAKR-Fc를 960 ㎍/㎕으로 총 1.9 ㎎을 얻었다(도 1 및 도 2).
<실시예 2> TNFR2-Fc 제조
<2-1> TNFR2-Fc 발현벡터 제조
TNFR2-Fc 발현 벡터를 제조하기 위하여,신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA 라이브러리(21C Frontier Human GENE Bank(한국생명공학연구원)에서 구입. Clone ID:hMU013725, 플레이트 No. IRAU-86-H09, 벡터: pDNR-LIB )를 주형으로 사용하여, TNFR2 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 정방향 프라이머(서열번호 8: 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCTTGCCCGCCCAGGTGGCATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 9: 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAATTCAGCTGGGGGGCTGGGGC-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, SfiⅠ 제한효소로 처리한 후, pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝하였다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕ 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제와 2 ㎕ 10× 리가아제 버퍼를 섞은 후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션을 수행하였다.
라이게이션된 플라스미드를 E. coli DH5α에 형질변환한 후 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 뿌린 후 37℃ 배양기에서 16시간 배양시켰다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4 ~ 5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TNFR2 유전자가 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 서브클로닝됨을 확인하였다(도 3 및 도 4).
<2-2> TNFR2-Fc 발현 및 정제
293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150㎜ 플레이트에 70 ~ 80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TNFR2-Fc 발현벡터 20㎍과 PEI 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16 ~ 20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 20 ㎖로 교환해주며, 세포의 상층액은 2 ~ 3일 마다 한 번씩 걷었다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.
10개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일째에 걷은 상층액 총 600 ㎖을 정제하였다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼(column)에 패킹되어 있는 500 ㎕의 protein A 비드에 결합시켰다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇으로 결합시킨 후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1 M 글리신 염산을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리하고, 1 M Tris(pH 9.0)으로 중화시켰다. 그 다음 TNFR2-Fc를 정량하고, TNFR2-Fc가 있는 분획을 2 ~ 3개 모아 amicon ultra를 사용하여 농축한 후 PBS(#70011, Gibco, USA)로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 TNFR2-Fc를 300 ㎍/㎖로 총 235 ㎍을 얻었다.
<실시예 3> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 제조
<3-1> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 발현벡터 제조
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 발현시키는 발현 벡터를 제조하기 위하여, 신장, 태반, 췌장 및 간의 혼합 DNA Library를 주형으로 사용하여, TNFR2과 유전자를 발현시키기 위한 제한효소 SfiⅠ 서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머(서열번호 10:5'-GCGGTGCCTGGCGCTTGCTCCGTGCAGACTGCATCCATGCT-3')를 사용하여 TNFR2유전자를 증폭하며, TWEAKR 유전자를 증폭시키기 위하여 정방향 프라이머(서열번호 11: 5'-AGCATGGATGCAGTCTGCACGGAGCAAGCGCCAGGCACCGC-3')과 역방향 프라이머를 하기 조건으로 증폭한 후, 두 개의 PCR 산물을 1:1의 비율로 총 100 ng을 주형으로 넣어 세 가지의 프라이머를 넣어 PCR 하여 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 pYK602-HIS-Fc 벡터에 서브클로닝하였다. 사용된 PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, pfu 폴리머라제(제노텍, 한국) 2.5 unit, 정방향과 역방향 프라이머를 각각 10 pmole/50 ㎕ 넣고, 남은 부피를 증류수로 채워 총 50 ㎕의 반응액을 조성한 후, 94℃ 2 분, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분으로 30 사이클 반복하여 유전자를 증폭시킨 후, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
증폭된 PCR 산물 및 벡터를 각각 SfiI 제한효소로 절단하고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 젤 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 증폭된 PCR 산물과 벡터의 비율을 3(150 ㎍):1(50 ㎍)로 하여 1 ㎕ T4 DNA 리가아제와 2 ㎕ 10×리가아제 버퍼를 섞은 후, 총 반응액을 20 ㎕로 하여 16℃에서 16시간 라이게이션을 수행하였다.
라이게이션된 플라스미드를 E.coli DH5α에 형질변환한 후 암피실린이 포함된 LB 플레이트에 뿌린 후, 37℃ 배양기에서 16시간 배양시킨다. 콜로니 생성 후 콜로니를 10 ㎕ 암피실린이 포함된 LB 배지에 풀은 후, 콜로니 PCR 방법을 이용하여, 그 중 4 ~ 5 ㎕를 PCR 주형으로 삼고, PCR을 수행하여, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 pYK602-HIS-Fc 발현벡터에 서브클로닝됨을 확인하였다.
<3-2> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 발현 및 정제
293E 세포를 DMEM 500 ㎖에 FBS가 50 ㎖이 첨가된 배지를 이용하여, 150 ㎜ 플레이트에 70 ~ 80% 면적을 차지할 정도로 세포를 심은 후, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 20 ㎍과 PEI 40 ㎍을 1:2 비율로 혼합하여 상온에 20분 정도 반응시킨 후, 세포에 떨어뜨려 형질감염시켰다. 16 ~ 20시간 경과 후, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지 20 ㎖로 교환해주며, 세포의 상층액은 2 ~ 3일 마다 한 번씩 걷었다. 상측액을 수득한 후, 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리한 후, 상층액만을 새로운 병에 옮겨서 4℃에 정제하기 전까지 보관하였다.
10개의 150 mm 플레이트에서 3일, 5일, 7일째에 걷은 상층액 총 600 ㎖을 정제한다. 전체 상층액을 0.22 ㎛ top-filter를 사용하여 필터한 후, 5 ㎖ 컬럼에 패킹되어 있는 500 ㎕의 protein A 비드에 결합시켰다. Peri-start 펌프를 사용하여 0.9 ㎖/분으로 4℃ 오버나잇(overnight)으로 결합시킨후, 100 ㎖ 이상의 PBS로 컬럼을 세척하여 0.1 M 글리신 염산을 이용하여 6개 분획으로 나누어 용리하고, 1 M Tris(pH 9.0)으로 중화시켰다. 그런 후, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 정량하고, 단백질이 있는 분획을 2 ~ 3개 모아 amicon ultra를 사용하여 농축한 후 PBS로 10 번 정도 버퍼를 교환하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 380 ㎍/㎖로 총 1 ㎎을 얻었다.
<실시예 4> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 대량 정제
<4-1> 형질감염
150 ㎜ 플레이트(#430599, Corning, USA)에 293E 세포가 80% ~ 90%정도 찼을 때 형질감염을 수행하였다. PEI:TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 비율은 2:1로 하여 보통 150 ㎜ 플레이트에 플라스미드 DNA양은 20 ㎍과 PEI는 40 ㎍을 넣는다. 1 ㎖의 혈청이 제거된 배지(Serum free media)에 PEI와 플라스미드 DNA를 혼합한 용액을 넣고 간단히 Vortex를 이용하여 섞어준 후, 20분 정도 상온에서 반응시킨 다음 1 ㎖을 150 ㎜ 플레이트에 분주하였다. 형질감염 효율을 높이기 위해 37℃, CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 반응시킨 다음 PBS로 150 ㎜ 플레이트를 세척하여, PEI와 플라스미드 DNA를 제거하였다. 150 ㎜ 플레이트에 혈청이 제거된 배지(Serum free media)를 20 ㎖ 정도 분주하여 넣은 후 CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양시켰다.
<4-2> 상층액 수득
상층액의 샘플링(Supernatant sampling)은 2일에 1번씩 5회차 까지 상층액을 얻을수 있으며, 150 ㎜ 플레이트 1장에서 얻어지는 상층액은 100 ㎖ 정도였다. 하기 표 1의 시료들(발현벡터, TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질)의 발현량 측정을 참조하여 대량 정제시 어느 정도 정제될 것 인지 예상한 뒤에 필요한 배양액을 계산하였다. TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 및 대조군인 발현벡터를 각각 1 ㎎씩 얻기 위해서 필요한 배양액의 부피는 하기 표 2와 같다(표 1 및 표 2).
표 1
시료 발현량
발현벡터 1.0 mg/ℓ
TNFR2-Fc 0.6 mg/ℓ
TWEAKR-Fc 0.6 mg/ℓ
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 0.6 mg/ℓ
표 2
시료 발현량
발현벡터 1ℓ
TNFR2-Fc 2ℓ
TWEAKR-Fc 2ℓ
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 2ℓ
<4-3> 정제
배양 상층액(culture supernatant)을 0.22 ㎛ Top-filter를 이용하여 필터를 한 후, 멸균된 1ℓ병에 옮겨서 저온실에서 정제를 수행하였다. Peristart-펌프를 이용하여 정제하며, 정제용 컬럼을 인젝터(Injector)를 이용하여 PBS로 2 ㎖/분의 속도로 30분간 세척하였다. 세척이 끝나면 protein A 비드를 컬럼 안에 패킹(packing)해주며, 상층액의 부피가 1ℓ일 경우 protein A 비드를 약 700 ㎕ 패킹하였다. protein A 비드의 패킹이 끝나면 다시 50 ㎖의 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 배양 상층액을 컬럼안에 넣었다. 속도는 1 ㎖/분으로 하고 오버나잇으로 결합시켰다. 다음날, 200 ㎖의 PBS로 2 ㎖/분의 속도로 세척하고, 용리(elution)를 수행하였다. 용리된 단백질의 농도를 확인한 다음, PBS로 버퍼를 교체한 뒤, 4℃에 보관하였다. 그리고, QC test를 위해 10% SDS-PAGE 젤에 걸어 정제도를 확인하였다(도 7, 도 8 및 도 9).
<실험예 1> 정제된 융합 단백질의 세포독성 제거
<1-1> 독성검사
상기 <실시예>에서 제조한 융합 단백질들(TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질)을 정제한 후, 정제된 단백질의 세균내독소(bacterial endotoxin)를 측정하기 위해서 Chromo-LAL(cat# C0031, CAPE COD)을 이용하였다. 대조군으로 사용되는 기준 독소(CSE, control 스탠다드 세균내독소; cat# E0005, CAPE COD)를 1 EU/ml부터 2 배씩 희석하여 최소 농도가 0.03125 EU/㎖이 되도록 준비하였다. 음성 대조군으로 LRW(LAL reagent water, cat# WP1001, CAPE COD) 100 ㎕에 LAL 100 ㎕을 넣어주고, 양성 대조군으로 0.125 EU/ml 농도의 기준 독소(CSE) 100 ㎕에 LAL 100 ㎕를 섞어 실험에 사용하였다. 분석을 위해 LRW로 50 ㎍/㎖의 일정 농도가 되도록 희석한 샘플 100 ㎕에 LAL 100 ㎕를 준비하였다. 추가로 샘플의 간섭확인을 위해 생성물질 양성 대조군 실험을 하는데, 앞서 희석한 샘플 50 ㎕에 0.125 EU/㎖ 기준 독소(CSE)　50 ㎕과　LAL 100 ㎕를 넣어 준비하였다. VersaMax 마이크로플레이트 reader(Molecular devices)로 측정시 프로토콜화 한 파일(Chromo LAL setting.pda)을 이용하여 기준값을 정하였다. 플레이트는 37℃로 10분 정도 예열을 미리 준비한 후 실험을 시작하였다. LAL을 처리함과 동시에 프로토콜화 한 파일을 시작하여 OD를 측정하였다. 스탠다드 Curve는 X축은 Log EU/㎖, Y축은 Log Onset time으로 작성되며, 샘플의 세포내독성 수치는 측정한 OD를 소프트웨어 상에서 자동으로 계산하여 EU/㎖로 표시된다. 스탠다드 curve의 R2 값이 0.98이상 되는 경우에 측정치에 대한 신뢰성을 두었다.
그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 4개의 샘플(발현벡터,TNFR2-Fc ,TWEAKR-Fc및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질)은 세포독성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(표 3).
표 3
정제된 시료 세포독성(EU/㎖)
발현벡터 62.14
TNFR2-Fc 40.33
TWEAKR-Fc 171
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 171.52
<1-2> 세포내독성 제거
정제된 융합 단백질들의 세포내독성을 제거하기 위해 EndoTrap Red(cat# 83-009U, Lonza) 컬럼을 사용하였다. 컬럼을 3 ㎖의 재생(regeneration) 버퍼로 2회 세척한 후, 동량의 평형(equilibration) 버퍼로 2회 세척한다. 그 뒤 샘플을 적용함과 동시에 분획을 받기 시작하였다. 이때 샘플의 유량속도(flow rate)는 0.5 ~ 1 ㎖/분으로 하며, 컬럼 내의 잔여샘플은 평형 버퍼 1 ㎖을 적용하여 받았다. 세포 내 독성의 제거 후, 그 결과를 확인하기 위해 실험예 <1-1> 동일한 방법으로 세포독성 검사를 하였다.
그 결과, 하기 표 4에 나타난 바와 같이 정제된 단백질이 가지고 있는 세포독성의 수치가 모두 감소됨을 확인할 수 있었다(표 4).
표 4
정제된 시료 세포독성(EU/㎖)
발현벡터 3.76
TNFR2-Fc 36.12
TWEAKR-Fc 36.17
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 12.73
<실험예 2> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과 리간드의 결합력 측정
상기 <실시예>에서 제조한 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과 그 리간드인 TNF-a와 TWEAK와 결합하여 길항 작용을 할 수 있을지 알아보기 위하여, 결합력을 측정하는 실험(Binding affinity test)을 수행하였다.
ELISA 플레이트(#439454, Nunc, Denmark)를 이용하여 웰(well)당 100 ng의 TNF-α(#C001-1 MG, enzynomics, Korea)와 TWEAK을 웰당 100 ㎕의 PBS(pH7.4)로 4℃에서 오버나잇으로 코팅을 수행하였다. 코팅이 완료된 ELISA 플레이트에 PBS 200 ㎕에 4% 스킴 밀크(Skim milk)(#232100, Difco, France)를 넣은 용액을 넣고, 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 상온에서 대략 1시간 블로킹 버퍼[4% 스킴 밀크 in PBS]로 블로킹시켰다. 블로킹이 끝나면 ELISA 플레이트에서 블로킹 버퍼를 제거하고, 각각의 정제된 단백질들을 블로킹 버퍼 100 ㎕에 100 nM 농도로 준비한 뒤, 이를 1/4의 희석농도로 순차희석(serial dilution)을 한 다음 상온에서 대략 2시간 반응시켰다. 그 다음, 200 ㎕ PBS로 플레이트를 5회 세척을 해주고 2 ㎕의 2차 항체(secondary antibody)인 anti-Human Fc-HRP(#31413, Thermo, USA)를 1% 스킴 밀크가 함유된 4 ㎖의 PBS에 섞은 다음, ELISA 플레이트에 한 웰당 200㎕씩 넣어 준 다음 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, ELISA 플레이트의 2차 항체를 제거한 후, 200 ㎕의 PBS로 5회 세척해주고 한 웰당 10 ㎕의 과산화수소 용액(H2O2,#H1009-100ML, Sigma, USA)과 10 ㎖의 PC버퍼[5.1 g 구연산 모노하이드레이트(Citric acid monohydrate), 7.3 g 인산나트륨(Sodium phosphate)(pH 5.0)/ℓ]와 OPD 정제(#P8787-100TAB Sigma USA) 1개를 혼합하여 총 100 ㎕의 부피로 만든 반응액을 넣었다. 반응액을 넣은 다음, 상온의 어두운 상태에서 10분간 반응시킨 뒤, 발색을 확인하고, 반응을 중단시키는 STOP 버퍼를 한 웰당 50 ㎕씩 넣어 반응을 종료시키고, ELISA 리더(reader)에서 490 nm의 파장에서 Kd 값을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, TNF-α 리간드는 TNFR2-Fc와 TNF-α와 TNFR2-TWEAKR-Fc와는 높은 결합력을 보였으나, TWEAKR-Fc와는 낮은 결합력 보임을 확인할 수 있었다. TWEAK 리간드는 TWEAKR-Fc와 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질과는 낮은 Kd value를 보임으로써, 높은 결합력을 확인할 수 있었으며, TNFR2-Fc와는 낮은 결합력을 확인할 수 있었다(표 5 및 도 10).
표 5
시료 TNF-α (Kd value) TWEAK (Kd value)
TNFR2-Fc 1.080 37.89
TWEAKR-Fc 46.13 0.6414
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 1.724 0.1217
<실험예 3> 활막조직의 사이토카인의 발현 측정
골치환술을 겪은 자가 면역 환자의 활막 조직에서 TWEAK, TWEAKR(TWEAK receptor) 및 염증성 사이토카인 IL-17과 골파괴에서 주요한 역할을 하는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand)의 발현 정도를 확인하기 위하여 면역조직화학염색법을 이용하였다. 골관절염 환자(osteoarthritis, OA)의 활막 조직을 대조군으로 하여, 자가 면역 환자에게서 활막 조직의 구조를 고정시키기 위해서, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용하여 고정시킨 후, 통상의 방법대로 조직을 파라핀(Parrafin)에 포매한 후, 활막 조직을 절편기를 이용하여 7 ㎛의 두께로 절편을 만들어 슬라이드에 붙였다. 슬라이드에 부착된 절편을 자일렌(xylene)과 에탄올로 탈파라핀과 함수를 시킨후, 3% 과산화수소(H2O2)로 내 인성 과산화효소를 차단시키고 PBS(phosphate-버퍼ed saline, Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA)로 수세하였다. 비 특이적인 반응을 차단할 목적으로 블로킹 용액[10% Normal goat serum] 100 ㎕에 30분 반응시킨 후, 1차 항체(Primary antibody)인 TWEAK, TWEAKR, IL-17 및 RANKL(Santa Cruz, Burlingame, CA, USA)를 1:100으로 희석하여 조직 위에 100 ㎕씩 넣은 후, 4℃에서 16~18시간 반응시켰다. 1차 항체와 반응시킨 후 결합이 안 된 항체를 제거한 후, 50 ㎖ PBS로 수세하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 이차 항체와 과산화 효소가 결합된 스트렙타비딘(streptavidin) 100 ㎕과 반응을 시킨 후 DAB으로 발색시켜 광학현미경(Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과, OA 환자의 조직을 비교군으로 함께 염색하였다. OA 환자와 비교하여 자가 면역 관절염 환자의 조직에서 TWEAK 및 TWEAKR가 매우 높게 발현되었으며, 또한 IL-17과 RANKL의 높은 발현을 확인할 수 있었다(도 11).
<실험예 4> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 염증성 사이토카인 억제 측정
<4-1> 말초혈액 단핵세포 분리
건강인으로부터 헤파린(Heparin) 처리된 주사기를 이용하여 혈액을 체취한 후 PBS와 1:1 비율로 희석하였다. 피콜(Ficoll)(Amercham Biosciences, Burkinghamshire, England)과 희석한 혈액의 비율이 1:4로 되게 하여 피콜 층에 섞이지 않게 혈액을 띄운 뒤에 2000rpm, 20 ℃ 조건으로 30분간 원심분리하여 연막층에서 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 세척한 후 10% 우태아 혈청(Gibco, Burlingame, CA, USA)이 포함된 세포배양액 RPMI 1640(Gibco BRL)에 1×106 세포/㎖ 로 희석하였다.
<4-2> Th17 세포 배양
실험예 <4-1>에 기재된 말초혈액 단핵세포를 10% 우태아혈청이 포함된 세포배양액 RPMI 1640으로 5×105 세포/500 ㎕ 수의 세포로 48웰 플레이트 (Nalge Nunc International, IL, USA)에 분주하여, 이들 세포에 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 및 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 10 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 1시간 배양하였다. 1시간 후, 세포를 파이펫을 사용하여 바닥에 붙은 세포를 뜯어 anti-CD3(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)가 0.3 ㎍/㎖로 코팅 처리된 48웰 플레이트로 옮기고, 말초혈액 단핵세포를 Th17 세포로 분화 유도시키기 위해 IL-6(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 20 ng/㎖, IL-23(R&D Systems) 10 ng/㎖ 그리고 IL-1β(R&D Systems) 5 ng/㎖을 1회 처리하여 37℃, 5% CO2 환경의 배양기에서 72시간 배양하였다. 배양하는 72 시간 동안 배지 교환 및 추가 자극은 하지 않았다.
<4-3> RT-PCR
실시예 <2-2>의 72시간 배양한 세포로부터 총 RNA를 RNA zol-B (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 추출하였다. 총 2 ㎍의 RNA 3 ㎕에 랜덤 프라이머(random primer)(Genotech, Daejeon, Korea) 1 ㎕를 가하여, 70℃에서 5분간 방치한 후 바로 얼음에 넣어 급냉 시키고, 4 ㎕의 5×M-MULV 버퍼, 1㎕의 10 mM dNTP, 0.5㎕ 알엔아제 억제제(RNase inhibitor)(Takara, Shiga, Japan)와 혼합한 후 총 반응액이 19 ㎕가 되도록 증류수 9.5 ㎕를 가하였다. 25℃에서 5분간 반응시킨 후 1 ㎕의 역 전사 효소 M-MULV(Takara, Shiga, Japan)를 처리하여 25℃에서 5분, 42℃에서 60분, 72℃에서 10분간 반응시켜 cDNA를 얻었다.
이렇게 생성된 cDNA산물을 주형으로 하여 역전사 중합효소 연쇄반응(PCR)을 시행하였다. RT-PCR을 위한 반응 화합물은 한 샘플당 총 25 ㎕가 되도록 하였고, 용액의 조성은 10×반응 버퍼 2.5 ㎕, 0.5 mM의 dNTP 2.5 ㎕, Taq 0.3 ㎕(Takara, shinga, Japan) 및 타깃 정방향과 역방향 프라이머를 각각 2 ㎕와 cDNA 1 ㎕ 및 14.7 ㎕의 증류수를 사용하였다. 증폭을 위해 Dual-bay Thermal cycler system(MJ Research)을 사용하였다. 음성 대조군으로 추출한 cDNA 대신 증류수를 사용하여 PCR 산물이 관찰되지않는 것을 통해 PCR 오염이 없음을 확인하였다.
IL-21은 94℃ 3분 변성과정을 거친 후 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초간 반응을 30 회 반복 한 후 신장을 위해 72℃에서 7분간 반응을 실행하였다. IL-17 증폭조건은 94℃ 3분 변성과정을 거친 후 94℃ 1분, 56℃ 1분, 72℃ 1분간 반응을 30 회 반복한 후 72℃에서 7분간 반응을 실행하였다. RORc와 β-actin은 94℃에서 3분간 변성 과정을 거친 후 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초간 반응을 각각 30 회, 26회 반복하였다. 중합효소반응에 의해 얻어진 증폭 산물은 브롬화에티듐(ethidium bromide)이 포함된 1.5% 아가로즈 젤(agarose gel)에 전기 영동을 시킨 후 Gel-Doc 2000(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA)으로 영상을 얻고 Quantity-One(Bio-rad) 프로그램을 이용하여 증폭 산물을 농도 계측법으로 정량하였다. 이 값을 β-actin과의 비율로 환산하여 각 세포군 간의 mRNA 발현 정도를 비교하였다. 사용한 프라이머 서열은 아래와 같다:
IL-21 ;
5'-CTT ACC TGG CAA GAC CAG TAT GA-3'(서열번호 12);
5'-GTA GAA GGC AGG GTC TTC GTA AT-3'(서열번호 13);
IL-17;
5'-TGA AGT GCT GTC TGG AGC AG-3'(서열번호 14);,
5'-TCC TCA GAA TCA TCC ATG TC-3')(서열번호 15);
RORc;
5'-AGT CGG AAG GCA AGA TCA GA-3'(서열번호 16);
5'-CAA GAG AGG TTC TGG GCA AG-3'(서열번호 17);
β-actin;
5'-GGA CTT CGA GCA AGA GAT GG-3'(서열번호 18); 및
5'-TGT GTT GGC GTA CAG GTC TTT G-3'(서열번호 19).
증폭 산물을 β-actin 발현 비율에 따라 환산하여 각 mRNA 발현 정도를 비교하였다.
그 결과, Th17 세포의 분화 조건에서는 염증성 사이토카인인 IL-17 및 IL-21과 Th17 세포의 분화과정에서 발현된다고 보고된 특정 전사인자인 RORc의 mRNA 발현이 높았다. 하지만 동일한 조건의 Th17 세포에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 10 ㎍을 처리한 경우, IL-17, IL-21 및 RORc 유전자의 발현이 현저히 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 12).
<4-4> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 IL-17 감소 측정
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질에 의해 IL-17 단백의 생성 또한 감소하는지 확인하기 위해 실험예 <2-3>에서 배양한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 처리된 Th17 세포의 상층액에서 염증성 사이토카인 IL-17 단백질의 양을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
Sandwich ELISA용 96웰 플레이트에 IL-17(R&D Systems) 항체를 2 ㎍/㎖로 1 웰에 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 0.05% PBST에 섞은 블로킹 버퍼 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 스탠다드로 사용할 인간 재조합 IL-17(R&D Systems)은 각 5,000∼78.125 pg/㎖ 농도로 100 ㎕을 웰에 넣어 사용하였다. 표준시료(standard)와 함께 측정할 세포배양 상층액을 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% PBST 300 ㎕로 4번 세척하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 anti-human IL-17(R&D Systems)을 200 ng/㎖의 농도로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 4번 PBST로 세척하고, 엑스트라아비딘 포스파타아제 접합체(ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate)(Sigma, Louis, MO, USA)를 1：2,000으로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응 후, PBST로 세척한 후, 포스페이트 디소디윰 솔트 헥사하이드레이트(Phosphate Disodium salt Hexahydrate, PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 50 ㎕/웰로 첨가하여 반응시켰다. 반응 후 0.2N NaOH 50 ㎕/웰을 넣어 반응을 멈추고, 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, Th17 세포가 분화 자극 조건하에서 IL-17 단백질의 생성물은 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, TNFR2-Fc와 TWEAKR-Fc 10 ㎍/㎖을 처리한 경우 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리했을 때와 보다, IL-17의 생성이 더욱 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 12).
<실험예 5> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 항염증성 사이토카인 IL-10 생성 측정
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 Th17 세포 반응을 억제함과 동시에 자가 항원에 대한 균형을 유지하고 자가 면역으로부터 보호하는 역할을 하는 면역 억제 세포인 Treg의 작용에 상승효과를 줄 수 있을지 알아보기 위하여, Treg 세포에서 생성되는 항염즘성 사이토카인 IL-10 단백질을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
Sandwich ELISA용 96웰 플레이트에 IL-10(R&D Systems) 항체를 2 ㎍/㎖로 1웰에 100 ㎕을 넣어 상온에서 2시간 반응시킨 후, 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 0.05% PBST에 섞은 블로킹 버퍼 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 2시간 반응시켰다. 표준시료로 사용할 인간 재조합 IL-10(R&D Systems)은 각 5,000∼78.125 pg/㎖ 농도로 100 ㎕/㎖을 웰에 넣어 사용하였다. 표준시료와 함께 측정할 세포배양 상층액을 100 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후 0.05% PBST 300 ㎕로 4번 세척하고, 바이오틴(Biotin)이 결합된 anti-human IL-10(R&D Systems)을 200 ng/㎖의 농도로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 4번 PBST로 세척하고, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate(Sigma, Louis, MO, USA)를 1：2,000으로 희석하여 50 ㎕/웰씩 넣고 실온에서 2시간 반응시키고, PBST로 세척 후 Phosphate Disodium salt Hexahydrate(PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 100 ㎕/웰로 첨가하여 반응 시켰다. 반응 후 0.2 N NaOH 100 ㎕/웰씩 넣어 반응을 멈추고 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, Th17 세포 분화 조건에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 처리하였을 때, TNFR2-Fc 또는 TWEAKR-Fc를 처리한 것에 비해 통계적으로 유의하게 IL-10의 생성이 더욱 증가함을 확인하였다(도 13).
<실험예 6> TWEAK와 RANKL의 상관관계 확인
자가 면역관절염의 주요 증상 중 하나인 골파괴는 과도한 파골세포 생성으로 인해 뼈 침식이 심화되어 발생되며, 파골세포 분화에 주요한 요소인 RANKL이 TNF 및 IL-1과 같은 사이토카인에 의해서 증가되는 것이 보고되어있다. 이에 따라, TWEAK와 RANKL의 관계를 조사하기 위해, 자가 면역 관절염 환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK 및 RANKL의 양을 ELISA 방법으로 측정하였다.
혈청과 활막액에서 TWEAK과 RANKL의 측정은 Peprotech 제품을 사용하였다. RANKL capture 항체는 100 ㎍/㎖을 1 ㎍/㎖ 농도가 되도록 PBS에 희석하여 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 12 시간 반응하였다. capture 항체 희석 용액을 제거하고 300 ㎕ 세척 버퍼[0.05% Tween-20 in PBS]로 4번 세척하였다. 세척 후, 300㎕ 블로킹 버퍼[1% BSA in PBS]를 각 웰에 넣어 1시간 동안 상온에서 반응하였다. 1시간 뒤, 세척 버퍼 300 ㎕로 4번 세척하였다. 스탠다드로 사용하기 위해 RANKL 단백 1 ㎍/㎖을 희석액[0.05% Tween-20, 0.1% BSA in PBS]에 2 ng/㎖ 농도로 희석하고, 이것을 0 ng/㎖까지 5% 순차희석하였다. 측정하고자 하는 샘플과 준비해 둔 스탠다드를 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 2시간 반응하였다. 반응 후, 4번 세척하고 검출 항체 100 ㎍/㎖을 희석액에 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 상온에서 2시간 반응하였다. 4번 세척 후, avidin-HRP conjugate 5.5 ㎕를 희석액 11 ㎖에 1:2000으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 30분간 반응하였다. 반응 후 4번 세척하여 Phosphate Disodium salt Hexahydrate(PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖농도로 100 ㎕ 첨가하여 반응시켰다. 반응 후 0.2N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
TWEAK의 측정은 capture 항체는 100 ㎍/㎖을 0.5 ㎍/㎖ 농도가 되도록 PBS에 희석하여 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 12 시간 반응하였다. capture 항체 희석 용액을 제거하고 300 ㎕ 세척 버퍼로 4번 세척하였다. 세척 후, 300 ㎕ 블로킹 버퍼를 각 웰에 넣어 1시간 동안 상온에서 반응하였다. 1시간 뒤, 세척 버퍼 300 ㎕로 4번 세척하였다. 스탠다드로 사용하기 위해 RANKL 단백 1 ㎍/㎖을 희석액에 2 ng/㎖ 농도로 희석하고 이것을 0 ng/㎖까지 순차희석하였다. 측정하고자 하는 샘플과 준비해 둔 스탠다드를 ELISA 플레이트에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 2시간 반응하였다. 반응 후, 4번 세척하고 검출 항체 100 ㎍/㎖을 희석액에 0.5 ㎍/㎖로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣어 상온에서 2시간 반응하였다. 4번 세척 후, avidin-HRP conjugate 5.5 ㎕를 희석액 11 ㎖에 1:2,000으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 넣고, 상온에서 30분간 반응하였다. 반응 후 4번 세척하여 Phosphate Disodium salt Hexahydrate (PNPP)/DEA 용액을 1 ㎎/㎖ 농도로 100 ㎕ 첨가하여 반응시켰다. 반응 후 0.2 N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 멈추고 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, <실험예 1>의 조직염색 결과와 일치하게 OA환자와 비교하여 자가 면역 관절염 환자의 혈청 및 활막액에서 TWEAK 및 RANKL의 양이 이 서로 유의하게 상관관계를 이룬 것을 확인할 수 있었다(도 14). 이로써, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 이용하여 RANKL을 증가시킨다고 보고된 TNF와 함께 TWEAK을 동시에 억제하는 것은 더 큰 치료 효과를 나타낼 수 있을 것이라 기대된다.
<실험예 7> TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 치료 효과 확인
본 발명에 다른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 관절염 치료효과를 확인하기 위하여, 콜라엔 유도에 의한 관절염 CIA(collagen induced Arthritis)) 마우스 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여하여 치료효과를 확인하였다.
구체적으로, CIA 유도를 시키기 위하여, 6주령 수컷 DBA/1J 마우스(오리엔트바이오)에 complete Freund’s adjuvant (CFA)와 동량으로 섞어준 제2형 교원질(Type II Collagen: CII) 100 ㎍을 꼬리에 주사하여, 1회 면역화 반응을 수행하였다. 6마리씩, 각 실험군으로 나눈 후, 한 주(7일) 뒤부터 TWEAKR/TNFR2-Fc(TNFR2-TWEAKR 융합 단백질) 50 ㎍, Enbrel 100 ㎍을 복강내 주사(intraperitoneal injection, I.P.) 방법으로 주 3회씩 3주간 (총 9회) 주입하였다. 1회 면역화 반응을 시작점으로 하여 관찰자 세 명이 매 주 세 번씩 관절 염증의 위증도를 평가하였다. 관절염 평가는 Rosoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수(mean arthritic index)에 기준하여 아래의 척도에 따라 매긴 점수를 합하여 4로 나눈 평균치를 얻고, 다시 각 마우스에서 3명의 관찰자가 얻은 수치를 합산하여 나눈 평균치를 사용한다. 발생수는 한 발을 25%로 하여 부은 발의 수를 점수화 하였다:
0점 : 부종이나 종창이 없다;
1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적;
2점 : 발목관절에서 족근골 (metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적;
3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적; 및
4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 정제된 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 CIA 유도된 관절염 마우스 모델에 투여한 후, 임상학적 수치(clinical score)와 발생수(incidence)를 관찰하였을 때, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군에서 우수한 관절염 치료효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 효과는 관절염 치료제로 사용되는 Enbrel을 투여한 양성대조군에 비하여 더욱 우수하였다(도 15).
<실험예 8> 면역조직화학염색법을 통한,TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 관절염 완화 효과 확인
상기 <실험예 7>에서 이용한 CIA 관절염 유발 마우스에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 및 Enbrel을 투여한 실험군 마우스의 관절을 채취하여, 면역조직화학염색법을 이용하여 관절의 침윤, 염증 및 연골의 파괴정도를 확인하였다.
구체적으로, 면역염색조직화학염색법을 수행하기 위하여 우선 상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 및 Enbrel을 투여한 CIA 관절염 유발 마우스의 관절을 채취하여, 10% 중성완충포르말린에서 고정시키고, EDTA를 이용하여 뼈를 탈회시켰다. 이어서 파라핀에 포매하여 관절 조직을 7 μm 두께의 절편으로 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본염색을 진행하기 전에 자일렌(xylene)을 이용하여 탈 파라핀 과정을 거쳐 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰으며, 염색과정은 헤마톡실린(haematoxylin)과 에오신(eosin) 염색을 진행하였다. 또한, 연골에 포함된 프로테오글리칸(proteoglycans)을 감지할 수 있는 사파린 O(Safranin O)와 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 방법을 사용하여 염증과 연골조직의 파괴 정도 측정하였다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 CIA 관절염 유발 마우스 모델에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여하였을 때, CIA 관절염 마우스 모델에 비하여 세포의 침윤이 감소되고 있음을 관찰할 수 있었으며, 사파린 O(Safranin O) 및 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 방법을 통하여 염증 및 연골의 파괴 또한 CIA 관절염 마우스에 비하여 완화된 것을 관찰할 수 있었다(도 16).
<실험예 9> 면역조직화학염색법을 통한,TNFR2-TWEAKR 융합 단백질의 CIA 관절염 유발 마우스의 염증 감소 효과 확인
상기 <실험예 7>에서 이용한 CIA 관절염 유발 마우스에 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 및 Enbrel을 투여한 실험군 마우스의 관절을 채취하여, 면역조직화학염색법을 이용하여 염증인자의 발현을 관찰하였다.
우선 상기 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 및 Enbrel을 투여한 CIA 관절염 유발 마우스의 관절을 채취하여, 10% 중성완충포르말린에서 고정시키고, EDTA를 이용하여 뼈를 탈회시켰다. 이어서 파라핀에 포매하여 관절 조직을 7 μm 두께의 절편으로 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본염색을 진행하기 전에 자일렌(xylene)을 이용하여 탈 파라핀 과정을 거쳐 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰다. 면역화학염색법 이용하여 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-α, IL-1β, IL-6과 RANK(Receptor activator of nuclear factor-κB), VEGF(Vascular endothelial growth factor)를 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, CIA 관절염 유발 마우스에 비하여 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군에서 염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 신생혈관 생성의 주요 인자인 VEGF 및 파골세포 분화를 관찰할 수 있는 RANK의 발현은 거의 관찰되지 않았다. 이러한 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여한 군에서 관찰되는 염증성 사이토카인, VEGF, RANK의 발현 양상은 Enbrel을 투여한 군과 유사하였으며, 이를 통하여 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 관절염의 치료에 유용할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 17).
<실험예 10> CIA 관절염 유발 마우스의 CII 특이적 IgG2a 생성량 측정
상기 <실험예 7>에서 이용한 CIA 관절염 유발 마우스는 제2형 교원질(Type II Collagen: CII)을 1회 투여하여 면역화하였다. 그 후, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 주 3회씩 3주간, 총 9회에 걸쳐서 주입하였다. 이렇게 주입하는 과정에 따라, 혈액 중 CII의 함량의 변화를 측정하였다.
DAB 마우스에 complete Freund’s adjuvant (CFA)와 동량으로 섞어준 제2형 교원질(Type II Collagen: CII) 100 ㎍을 꼬리에 주사한 후, 1주일 뒤 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 3주에 걸쳐 총 9회 주입하였다. 그 과정 중, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 주입하기 전(0회), 첫 번째 주입 후, 여섯 번째 주입후, 및 마지막 주입 후 6시간에서 12시간 이내에, 마우스의 눈에서 혈액을 체혈하여 혈청을 획득하였다. CII-specific IgG2a의 양을 측정하기 위해, CII 항체를 1:1,000으로 희석하여 96 웰 플레이트에 코팅하여 2시간 반응시켰다. 코팅버퍼를 제거한 후, IgG 블로킹 버퍼(blocking buffer)를 웰당 200 ㎕씩 넣고, 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, 실험군 및 대조군의 혈청을 희석하여 50 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. IgG 워싱 버퍼(washing buffer)로 5회 세척한 후, anti-mouse IgG HRP를 1:75,000으로 희석하여 웰당 50 ㎕씩 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, IgG워싱 버퍼로 5회 세척한 후, TMB 기질 용액(substrate solution)과 반응시킨 후, 색 변화를 1N H2SO4를 이용하여 정지시킨 후, ELISA 리더기를 사용하여 450nm 파장에서 O.D를 측정하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 어떠한 Fc 융합단백질도 주입되지 않은 CIA 관절염 유발 마우스에서는 시간에 따른 CII-특이적 IgG2a의 양에 변화가 관찰되지 않았으나, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 주입한 군에서는 주입 횟수가 증가할 수록 CII-특이적 IgG2a의 양이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, Enbrel 주입군에서도 1차 주입 후의 측정된 O.D 값이 주입 전에 비하여 약간 증가한 듯 관찰되지만, enbrel 추가 주입 후 생성이 감소되는 경향을 나타냈다(도 18).
<실험예 11> CIA 관절염 유발 마우스의 비장의 Th17 및 Treg 발현량 측정
본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 주입한 CIA 관절염 유발 마우스의 Th17과 Treg인자에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 <실험예 7>에서 이용한 마우스의 비장 조직을 채취하여 Th17(CD4+IL-17+)인 세포 및 Treg(CD4+CD25+Foxp3+)인 세포를 공초점 염색을 통하여 관찰하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 7> CIA 관절염 유발 마우스의 비장을 채취하여 OCT 화합물로 포매시킨 후, 액화질소를 이용하여 급속 냉각시킨 조직을 냉동 절편기를 이용하여 7 μm 두께로 슬라이드에 부착하였다. 슬라이드에 부착한 절편을 아세톤으로 고정 후 10% 정상 염소 혈청으로 30분 간 비특이적 반응을 차단시켰다. Treg 마커인 CD4, CD25, Foxp3의 염색은 각각 PE-표지된 항-CD4 항체, 알로피코시아닌(Allophycocyanin)-표지된 항-CD25 항체(Biolegend), FITC-표지된 항-Foxp3 Ab항체를 이용하여 수행하였고, Th17 마커인 CD4, IL-17은 바이오티닐화 항-CD4 항체(BD Biosciences), PE-표지된 항-IL-17 항체를 사용하였다. 상기 항체들을 PBS(pH 7.5)에 1:100의 비율로 희석한 후, 상기 슬라이드에 부착된 조직과 4℃에서 하룻밤 반응시키고, 다음날 바이오티닐화 항-CD4 항체를 이용한 조직에는 추가로 스트렙타비딘(streptavidin) cy-3을 상온에서 2시간동안 반응시켰다. PBS를 이용하여 3회 세척한 후, 염색된 조직을 공초점 현미경(LSM 510 Meta. Zeiss, Gottingen, Germany)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, CIA 관절염 유발 마우스에 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 주입한 마우스의 비장 조직에서 Foxp3+인 세포의 수가 아무것도 주입하지 않은 CIA 관절염 마우스에 비하여 중가하는 것을 관찰할 수 있었으나, CD4+IL-17+인 Th17의 발현의 경우, TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 또는 Enbrel을 주입한 군에서에서 아무것도 주입하지 않은 CIA 관절염 마우스에 비하여 발현이 감소된 것을 관찰할 수 있었다(도 19).
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 제시한다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
TNFR2-TWEAKR 융합 단백질 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 염증성 사이토카인인 IL-17 단백질의 분비를 감소시키며, 항염증성 사이토카인인 IL-10 단백질의 분비를 증가시키고, 이러한 효과는 TNFR2-Fc, TWEAKR-Fc 단일 단백질보다 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질이 더욱 우수한 효과를 나타내며, 자가 면역 관절염 환자의 활막의 RANKL과 TWEAK의 발현이 서로 유의하게 증가할 뿐만 아니라, CIA(collagen induced Arthritis) 관절염 동물 모델에 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질을 투여하였을 때, 관절의 침윤, 염증 및 연골 파괴가 완화되며, 면역 억제 세포인 Treg 세포의 발현을 증가시켜 자가 면역 관절염의 치료효과 나타내므로, 본 발명에 따른 TNFR2-TWEAKR 융합 단백질은 자가 면역 질환의 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (16)

  1. TNFR2(Tumor necrosis factor receptor type 2) 단백질 또는 상기 TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편과 TWEAKR(TNF-related weak inducer of apoptosis receptor) 단백질 또는 상기 TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편이 연결된 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 200 ~ 250개의 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제 1항에 있어서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2번의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제 1항에 있어서, TNFR2의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 23번 ~ 179번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  6. 제 1항에 있어서, TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3번의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  7. 제 1항에 있어서, TWEAKR의 세포외 영역을 포함하는 단편은 서열번호 3으로 기재된 아미노산 서열 중 N 말단으로부터 28번 ~ 76번째 아미노산을 포함하는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  8. 제 1항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  10. 제 9항의 발현 벡터를 숙주세포에 형질전환시킨 형질 전환체.
  11. 제 1항의 융합 단백질을 유효성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 및 치료용 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 자가 면역 질환은 악성빈혈, 제1형 당뇨, 자가 면역 관절염, 루프스, 다발성 경화증, 반응성 관절염 및 피부근염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 자가 면역 질환은 자가 면역 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 약학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 자가 면역 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환 치료방법.
  15. 약학적으로 유효한 양의 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 자가 면역 질환의 예방방법.
  16. 자가면역 질환 예방 및 치료용 의약으로 사용하기 위한 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 융합 단백질.
PCT/KR2011/001900 2010-03-19 2011-03-18 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제 WO2011115456A2 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/635,868 US8916525B2 (en) 2010-03-19 2011-03-18 TNF-A and TWEAK dual antagonist for the prophylaxis and treatment of autoimmune diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100024699A KR101004362B1 (ko) 2010-03-19 2010-03-19 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제
KR10-2010-0024699 2010-03-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2011115456A2 true WO2011115456A2 (ko) 2011-09-22
WO2011115456A3 WO2011115456A3 (ko) 2012-01-26

Family

ID=43513450

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2011/001900 WO2011115456A2 (ko) 2010-03-19 2011-03-18 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제

Country Status (3)

Country Link
US (1) US8916525B2 (ko)
KR (1) KR101004362B1 (ko)
WO (1) WO2011115456A2 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111100211A (zh) * 2019-01-30 2020-05-05 武汉九州钰民医药科技有限公司 一种Fc融合蛋白及其应用
CN112618698A (zh) * 2019-10-08 2021-04-09 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1711282B (zh) 2002-10-30 2010-05-26 健泰科生物技术公司 Il-17产生的抑制
AU2008290567B2 (en) 2007-08-17 2011-05-12 Novartis Ag Cyclic depsipeptides
AR086168A1 (es) 2011-04-20 2013-11-27 Novartis Ag Procesos para la elaboracion de depsipeptidos macrociclicos e intermediarios
US8680054B2 (en) 2011-04-20 2014-03-25 Novartis Ag Suspension type topical formulations comprising cyclic depsipeptide
US8987413B2 (en) 2012-10-09 2015-03-24 Novartis Ag Aldehyde acetal based processes for the manufacture of macrocyclic depsipeptides and new intermediates
US9067978B2 (en) 2012-10-09 2015-06-30 Novartis Ag Solution phase processes for the manufacture of macrocyclic depsipeptides and new intermediates

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020110853A1 (en) * 1999-12-20 2002-08-15 Wiley Steven R. TWEAK receptor
WO2006043972A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-27 Amprotein Corporation Chimeric protein
US20080175896A1 (en) * 2006-12-01 2008-07-24 Winkles Jeffrey A Tweak-pseudomonas exotoxin a fusion protein for cancer therapy
WO2010003118A1 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
WO2010003108A2 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. TNF-α ANTAGONIST MULTI-TARGET BINDING PROTEINS

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003251633A1 (en) 2002-07-01 2004-01-19 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Il-21 as a regulator of immunoglobin production
WO2007009233A2 (en) 2005-07-18 2007-01-25 University Of Manitoba Peptide-based cytokine vaccines in the treatment of autoimmune and inflammatory diseases

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020110853A1 (en) * 1999-12-20 2002-08-15 Wiley Steven R. TWEAK receptor
WO2006043972A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-27 Amprotein Corporation Chimeric protein
US20080175896A1 (en) * 2006-12-01 2008-07-24 Winkles Jeffrey A Tweak-pseudomonas exotoxin a fusion protein for cancer therapy
WO2010003118A1 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Tgf-b antagonist multi-target binding proteins
WO2010003108A2 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. TNF-α ANTAGONIST MULTI-TARGET BINDING PROTEINS

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111100211A (zh) * 2019-01-30 2020-05-05 武汉九州钰民医药科技有限公司 一种Fc融合蛋白及其应用
CN112618698A (zh) * 2019-10-08 2021-04-09 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂
CN112618698B (zh) * 2019-10-08 2021-10-08 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的注射制剂

Also Published As

Publication number Publication date
KR101004362B1 (ko) 2010-12-28
WO2011115456A3 (ko) 2012-01-26
US8916525B2 (en) 2014-12-23
US20130017226A1 (en) 2013-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011115456A2 (ko) 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＴＷＥＡＫ 이중 길항제
WO2017023138A1 (ko) 키메라 항원 수용체 및 키메라 항원 수용체가 발현된 t 세포
WO2017022962A1 (ko) Ripk 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2018030806A1 (ko) 항체 중쇄불변부위 이종이중체에 융합된 사이토카인 및 이를 포함하는 약제학적 조성물
WO2020218829A1 (ko) 플라젤린 융합 단백질 및 이의 용도
WO2011142514A1 (ko) Pias3을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2022039490A1 (en) Anti-b7-h4/anti-4-1bb bispecific antibodies and use thereof
WO2018026248A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질(pd-1)에 대한 신규 항체 및 이의 용도
WO2018208011A2 (ko) β-아밀로이드 단백질의 응집을 억제하는 생체친화적 펩타이드
WO2011115458A2 (ko) 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＩＬ－２１ 이중 길항제
WO2021107689A1 (ko) Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 면역관문 억제제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
WO2017034244A1 (ko) 중추신경계 질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 펩타이드 및 이를 유효성분으로 하는 중추신경계 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
WO2016199964A1 (ko) 분리된 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 상기 펩타이드의 결합 단편
WO2019045477A1 (ko) 비멘틴 유래 펩타이드에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 피부질환 예방 및 치료용 조성물
WO2020022782A1 (ko) 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2022119380A1 (ko) 신규한 ace2 변이체 및 그의 이용
WO2020117017A1 (ko) 항 c-met 아고니스트 항체 및 이의 용도
WO2020138868A1 (ko) 타입 1 인터페론 중화 fc-융합 단백질 및 이의 용도
WO2020117019A1 (ko) 항 c-met 아고니스트 항체 및 이의 용도
WO2022085905A1 (ko) SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2019132610A1 (ko) Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도
WO2019093807A2 (ko) Il-17a 에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2022050521A1 (ko) Ace2 결합력이 감소된 코로나바이러스 유래 수용체 결합 도메인 변이체 및 이를 포함하는 백신 조성물
WO2013077618A1 (ko) 항 ｋｉａａ１１１４ 항체를 유효성분으로 함유하는 ｋｉａａ１１１４ 과발현에 의해 야기되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021066612A2 (ko) 종양 표적화 단백질 또는 이의 단편 및 그것에 결합하는 항체 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11756587

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13635868

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11756587

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2