WO2017022962A1 - Ripk 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Ripk 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • compositions for the prevention or treatment of immune diseases comprising a RIPK inhibitor as an active ingredient.
  • a method for treating a disease caused by an excessive immune response is to alleviate or reduce various symptoms caused by the disease by administering an immunosuppressant alone or in combination.
  • Immunosuppressants refer to a variety of substances used to reduce or block the host's ability to produce antibodies (a humoral immune response) or a cellular immune response to the action of an antigen. Such immunosuppressive agents may be useful for autoimmune diseases such as lupus, rheumatoid arthritis, and skin hypersensitivity reactions such as atopy and allergy as well as organ transplant field. A good immunosuppressant should be able to control the imbalance of the immune response, ensure the safety of the human body, and reduce the incidence of disease recurrence during long-term treatment.
  • immunosuppressive agents include cyclosporin A and FK506, which are compounds derived from natural products with complex chemical structures, which are expensive in terms of supply and demand of raw materials, which are uneconomical and may cause various side effects due to long-term administration. There is a risk. Therefore, there is an urgent need for the development of new immunosuppressive agents capable of economic production with low toxicity and induction of immune tolerance.
  • T cells are one of a group of cells that play a central role in the immune system as a biological defense system against various pathogens.
  • T cells are produced in the thymus of the human body and undergo a series of differentiation processes to differentiate into T cells with unique characteristics.
  • T cells which have completed differentiation, are largely divided into type 1 helper cells (Th1) and type 2 according to their function. It is divided into helper cells (Th2).
  • Th1 cells the main function of Th1 cells is involved in cell mediated immunity
  • Th2 cells are involved in humoral immunity
  • these two cell populations are balanced with each other so that they are not activated with each other.
  • immune diseases can be attributed to the imbalance between these two immune cells, for example, when the activity of Th1 cells is abnormally increased, autoimmune diseases may occur, and the activity of Th2 cells is abnormally increased. It is known that immune diseases occur due to hypersensitivity reactions.
  • Tregs immunoregulatory T cells
  • Th17 cells are known to be formed through a process similar to the differentiation of Treg cells during the differentiation of undifferentiated T cells. In other words, differentiation of Treg cells and Th17 cells occurs in the presence of TGF- ⁇ in common, but does not require IL-6 in Treg cells, whereas IL-6 is present in combination with TGF- ⁇ in Th17 cells. Differentiate in situations where In addition, differentiated Th17 cells are characterized by the secretion of IL-17.
  • Th17 cells Unlike Treg cells, Th17 cells have been found to be involved in the forefront of inflammatory reactions seen in immune diseases, maximizing the signal of inflammatory responses and accelerating disease progression. Therefore, in the case of autoimmune diseases which are not controlled by Treg cells among autoimmune diseases, development of therapeutic agents for autoimmune diseases that target the inhibition of Th17 cell activity has been highlighted.
  • immunosuppressive drugs are immunosuppressants that block signal transduction pathways in T cells. These immunosuppressive agents are toxic, infection, lymphoma, diabetes, tremor, headache, diarrhea, high blood pressure, and nausea. There is a problem that side effects such as renal failure occur.
  • An object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising a receptor interacting serine / threonine protein kinase (RIPK) inhibitor as an active ingredient.
  • RIPK serine / threonine protein kinase
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting bone loss, including an RIPK1 (receptor interacting serine / threonine protein kinase 1) inhibitor as an active ingredient.
  • an RIPK1 receptor interacting serine / threonine protein kinase 1
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune rejection disease comprising an RIPK3 (receptor interacting serine / threonine protein kinase 3) inhibitor as an active ingredient.
  • RIPK3 receptor interacting serine / threonine protein kinase 3
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising a receptor interacting serine / threonine protein kinase (RIPK) inhibitor as an active ingredient.
  • RIPK serine / threonine protein kinase
  • the RIPK inhibitor may be a RIPK1 inhibitor or a RIPK3 inhibitor.
  • the receptor interacting serine / threonine protein kinase 1 (RIPK1) inhibitor is a substance that specifically binds to the RIPK1 gene and inhibits the expression of RIPK1, or specifically binds to the protein of RIPK1 RIPK1 It may be a substance that inhibits the activity of.
  • the RIPK1 may be composed of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the protein of RIPK1 may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the substance that inhibits the expression of RIPK1 may be an antisense oligonucleotide, siRNA or shRNA for the gene of RIPK1.
  • the substance that specifically binds to the protein of RIPK1 to inhibit the activity of RIPK1 may be an antibody or compound against RIPK1.
  • the compound may be Necrostatin 1 or Necrostatin 1s.
  • the receptor interacting serine / threonine protein kinase 3 (RIPK3) inhibitor is a substance that specifically binds to the RIPK3 gene and inhibits the expression of RIPK3, or specifically binds to the protein of RIPK3 RIPK3 It may be a substance that inhibits the activity of.
  • the RIPK3 is a composition comprising the nucleic acid sequence of SEQ ID NO.
  • the protein of RIPK3 may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the substance that inhibits the expression of RIPK3 may be an antisense oligonucleotide, siRNA or shRNA for the gene of RIPK3.
  • the substance that specifically binds to the protein of RIPK3 to inhibit the activity of RIPK3 may be an antibody or compound against RIPK3.
  • the compound may be GSK'872.
  • the immune disease is rheumatoid arthritis, osteoarthritis, asthma, asthma, dermititis, psoriasis, cystic fibrosis, late organ transplantation and chronic Post transplantation late and chronic solid organ rejection, M ⁇ ltiple Sclerosis, systemic lupus erythematosus, Sjogren syndrome, Hashimoto thyroiditis, polymyositis, scleroderma (scleroderma), Addison disease, vitiligo, pernicious anemia, glomer ⁇ lonephritis and p ⁇ lmonary fibrosis, Inflammatory Bowel
  • Autoimmune Diabetes Autoimmune
  • Diabetes Diabetic retinopathy
  • Rhinitis Ischemia-reperfusion injury
  • COPD Chronic obstructive p ⁇ lmonary diseases
  • Graves disease Gastrointestinal allergies, Conjunctivitis, Atherosclerosis, Coronary
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting bone loss, including a receptor interacting serine / threonine protein kinase 1 (RIPK1) inhibitor as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting bone loss including a receptor interacting serine / threonine protein kinase 1 (RIPK1) inhibitor as an active ingredient.
  • RIPK1 receptor interacting serine / threonine protein kinase 1
  • the RIPK1 inhibitor may be Necrostatin 1 or Necrostatin 1s.
  • the RIPK1 inhibitor may have the effect of inhibiting the formation and differentiation of osteoclasts.
  • the disease that can be treated by inhibiting bone loss may be osteoporosis, Paget's bone disease, rickets, osteomalacia or degenerative bone disease, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune rejection disease comprising a receptor interacting serine / threonine protein kinase 3 (RIPK3) as an active ingredient.
  • RIPK3 receptor interacting serine / threonine protein kinase 3
  • the RIPK3 inhibitor may be GSK'872.
  • the immune rejection disease is graft rejection of an organ or tissue; Xenotransplant rejection of an organ or tissue; Or allograft rejection.
  • the present invention comprises the steps of treating the candidate material to a cell or tissue comprising the RIPK1 gene or RIPK1 protein; And measuring the expression level of RIPK1 gene or the amount of RIPK1 protein or RIPK1 protein activity.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating an immune disease comprising administering to a subject a RIPK inhibitor.
  • a method of preventing or treating an immune disease of the present invention comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of a RIPK inhibitor of the present invention.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular individual can be determined by the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet, time of administration, It is desirable to apply differently depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the various factors and similar factors well known in the medical arts, including drugs used with or concurrent with the specific composition. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above matters.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, and cats.
  • the present invention also provides a method for inhibiting bone loss, comprising administering a RIPK1 inhibitor to a subject.
  • a method of preventing or treating an immune disease of the present invention comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of a RIPK inhibitor of the present invention.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular individual can be determined by the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet, time of administration, It is desirable to apply differently depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the various factors and similar factors well known in the medical arts, including drugs used with or concurrent with the specific composition. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above matters.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, and cats.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating an immunorejective disease comprising administering to a subject a RIPK3 inhibitor.
  • a method of preventing or treating an immune disease of the present invention comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of a RIPK inhibitor of the present invention.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular individual can be determined by the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet, time of administration, It is desirable to apply differently depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the various factors and similar factors well known in the medical arts, including drugs used with or concurrent with the specific composition. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above matters.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, and cats.
  • the present invention clarifies that the RIPK inhibitor can be used as a novel therapeutic agent for immune diseases.
  • Treatment of the RIPK inhibitor in an animal model in which the immune disease is induced has shown that the symptoms of the disease are alleviated and improved.
  • Inflammatory cytokines and diseases It has been shown that the production of human cytokines is inhibited while the production of anti-inflammatory cytokines is increased. Therefore, the present invention has the effect of finding RIPK as a new target for the treatment of immune diseases and utilizing RIPK inhibitors as new therapeutic agents.
  • Figure 2 shows the results of analyzing the RIPK1 expression in the synovial tissue obtained from patients of normal donor, Osteoarthritis (Osteoarthritis) and Rheumatoid arthritis through a microarray (Microarray).
  • Figure 3 shows the results of ELISA analysis of expression levels of IL-17 (a), IFN- ⁇ (b) and IL-10 (c) cytokines by RIPK1 inhibitor treatment in splenocytes of mice stimulated with anti-CD3. It is shown.
  • Figure 4 shows the results of ELISA analysis of the expression level of TNF- ⁇ (a) and IL-10 (b) cytokines by RIPK1 inhibitor treatment in splenocytes of mice stimulated with lipopolysaccharide (LPS).
  • LPS lipopolysaccharide
  • Figure 6 shows that after treatment with the RIPK1 inhibitor in the collagen-induced rheumatoid arthritis animal model, serum was obtained from each experimental group to express the expression levels of CII specific Total IgG (a), CII specific IgG1 (b) and CII specific IgG2a (c) in ELISA. The result analyzed is shown.
  • Figure 7 shows the results of analyzing the cytotoxicity according to the treatment of the RIPK1 inhibitor by MTT assay.
  • FIG. 8 shows the results of analyzing the differentiation inhibitory effect of Th17 cells according to RIPK1 inhibitor treatment, and shows the result of analyzing the number of Th17 cells by Fluorescence-activated cell sorting (FACS).
  • FACS Fluorescence-activated cell sorting
  • FIG. 9 shows the results of counting the number of stained TRAP + cells and stained TRAP + cells as an effect of inhibiting the differentiation of osteoclasts (osteoclast) according to RIPK1 inhibitor treatment.
  • Figure 10 shows the results of ELISA analysis of the expression level of IL-17 (a) and TNF- ⁇ (b) cytokines according to RIPK1 inhibitor treatment in spleen cells of mice stimulated with anti-CD3 or lipopolysaccharide (LPS) will be.
  • FIG. 11 shows ELISA analysis of expression levels of TNF- ⁇ (a) and IL-17 (b) cytokines following RIPK1 inhibitor treatment in anti-CD3 stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). One result is shown.
  • Figure 12 shows the results of analysis by ELISA the amount of IL-17 cytokine expression according to the RIPK3 inhibitor treatment in the splenocytes of anti-CD3 stimulated mice.
  • Figure 13 shows the results of measuring the weight of the mouse to determine the effect of inhibiting inflammatory bowel disease according to the RIPK3 inhibitor treatment in the mouse (B6) model of inflammatory bowel disease.
  • WT control group
  • IBD Inflammatory bowel disease animal model not treated with RIPK3 inhibitors
  • RIPK3 inhibitor the group treated with RIPK3 inhibitor.
  • Figure 14 shows the results of measuring the proliferation of T cells in order to determine the effect of suppressing allogeneic response (alloresponse) according to the RIPK3 inhibitor treatment.
  • Example 1 In normal and arthritis tissues RIPK1 (Receptor-interacting serine / threonine-protein kinase 1) Expression Analysis
  • the present inventors analyzed the expression level of RIPK1 in joint tissues of normal mice and arthritis-induced arthritis by immunohistochemical staining in order to analyze the expression changes of RIPK1 in the normal state and disease-induced state.
  • arthritis-induced mice were mixed 1: 1 with type II collagen (CII) and CFA (complete Freund's adjuvant) in DBA / 1J mice, and injected 100 ⁇ g of CII per mouse at 50 ⁇ l dose into the tail base.
  • arthritis-induced mice were prepared by injecting a mixture of CII and CFA 1: 1 at 100 ⁇ g / 50 ⁇ l in a second manner, and the normal mice used DBA / 1J mice not treated with CII. .
  • Example 1 The results of Example 1, based on the fact that the expression of RIPK1 in the animal model that the expression of RIPK1 is increased compared to normal at the induction of immune diseases, to confirm whether the actual clinical results show the same, normal osteoarthritis patients and The synovial tissues obtained from rheumatoid arthritis patients were analyzed for the expression level of RIPK1 through microarray analysis.
  • RIPK1 was found to be associated with the induction of immune diseases
  • the present inventors examined the effects of the inhibition of RIPK1 on the treatment of immune diseases, and the effects of modulating inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines by RIPK1 inhibitors. was analyzed.
  • Splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with T-cell-activated anti-CD3 were treated with RIPK1 inhibitor Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037) at concentrations of 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively, for 48 hours. After culturing, the culture medium was collected, and the expression levels of the representative inflammatory cytokines IL-17 and inflammatory cytokines IFN- ⁇ and the anti-inflammatory cytokines IL-10 were confirmed by ELISA analysis.
  • biotinylated anti-IL-17, anti-IFN- ⁇ , and anti-IL-10 were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and then diluted and added to ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate. The reaction was carried out for 2 hours.
  • the control group was a group that stimulated the cells only with anti-CD3 and treated nothing.
  • IL-17 pathogenic cytokines
  • IFN- ⁇ inflammatory cytokines
  • the compound that inhibits RIPK1 can be used as a therapeutic agent for treating immune diseases.
  • the present inventors treated splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with LPS (lipopolysaccharide), which is a macrophage activation condition, and treated with RIPK1 inhibitor Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037) at concentrations of 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively. After 48 hours, the cultures were collected and the expression levels of representative inflammatory cytokines TNF- ⁇ and anti-inflammatory cytokines IL-10 were confirmed by ELISA analysis. Specifically, for ELISA analysis, 96-well plate was first coated with anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 at 2 ⁇ g / ml, and after the reaction, nonspecific binding was blocked with blocking solution (1% BSA / PBST).
  • TNF- ⁇ and IL-10 recombinant were serially diluted by 1/2, which was used as a standard reagent.
  • the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the control group used a group that stimulated the cells only with LPS and did not process anything.
  • the group treated with the RIPK1 inhibitor under conditions that activate macrophages significantly inhibited the production of TNF- ⁇ , an inflammatory cytokine induced by LPS, compared to the group not treated with the anti-inflammatory cytokine. It did not appear to affect IL-10 (FIG. 4).
  • RIPK1 inhibitors suppressed the production of inflammatory cytokines, but did not inhibit the production of anti-inflammatory cytokines.
  • RIPK1 inhibitors were actually administered to mouse animals that caused autoimmune diseases, the following experiments were conducted to determine if they had an effective therapeutic effect.
  • IL-10 knockout to prepare mice with arthritis. Induced arthritis-induced mouse model by inducing collagen-induced arthritis (CIA) in mice with type II collagen, and then using necrostatin-1 (Selleckchem, S8037), an intraperitoneal RIPK1 inhibitor, 3 times a week The arthritis index was analyzed after administration at 0.02mg / mice.
  • Blood was obtained from the mice administered with the RIPK1 inhibitor for 4 weeks in the mice used in the experiment in Example 5, and serum was separated again, and then the expression levels of CII specific Total IgG, CII specific IgG1, and CII specific IgG2a were expressed in ELISA. Analyzed by.
  • RIPK1 inhibitors can increase anti-inflammatory antibodies such as Th2 and inhibit the production of inflammatory antibodies such as Th1.
  • splenocytes of normal mice were treated with concentrations of 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, and 10 ⁇ M of the RIPK1 inhibitor Necrostatin 1, respectively, and then cultured for 3 days, and MTT powder (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) was added to 0.5 in PBS. Dissolved in mg / ml and treated 50 ⁇ l each was incubated for 4 hours. Then, after centrifugation at 1300rpm, 5 minutes, 4 ° C 120 ⁇ l of the supernatant was removed and 50 ⁇ l of DMSO was added and the absorbance was measured at 540 nm.
  • MTT powder Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide
  • splenocytes of normal mice were treated with anti-CD3, anti-CD28, anti-IFN- ⁇ , anti-IL-4, IL-6 and TGF- ⁇ to induce differentiation of Th17 cells.
  • Necrostatin 1, a RIPK1 inhibitor was treated with 10 ⁇ M and cultured for 3 days. Thereafter, the cells were collected and stained using anti-mouse CD4 PerCP-Cyanine5.5 and anti-mouse IL-17 FITC antibodies, followed by FACS (Fluorescence-activated cell sorting, BD FACS calibur TM ), and a FlowJo program. It was analyzed using.
  • the inventors conducted an experiment to determine whether the osteoclast differentiation is inhibited by the RIPK1 inhibitor. Specifically, induction of CIA with Type II Collagen in IL-10 knockout mice was induced into arthritis-induced mouse model, and then RIPK-1 inhibitor (Necrostatin 1) intraperitoneally three times a week from 10 days after initial immunization. ) At 20 mg / kg and 10 mg / kg, and 50 ng / ml of receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor at the end of the experiment. ), And then treated with RIPK1 inhibitor Necrostatin 1 at 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, and then examined for TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase) positive cells.
  • TRAP Transartrate-resistant acid phosphatase
  • the RIPK1 inhibitor has an effect of inhibiting osteoclast differentiation and is effective in the treatment of bone diseases.
  • Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297) was used for splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with anti-CD3, a T cell active condition, or with LPS (lipopolysaccharide), a macrophage activation condition. ) was treated at a given concentration, and cultured for 48 hours, and the culture solution was collected to confirm the expression level of the inflammatory cytokine IL-17 and the inflammatory cytokine TNF- ⁇ by ELISA analysis.
  • 96-well plates were first coated with 2 ⁇ g / ml of anti-IL-17 and anti-TNF- ⁇ , and then non-specific binding was blocked with a blocking solution (1% BSA / PBST) after the reaction. . Thereafter, IL-17 and TNF- ⁇ recombinant were serially diluted by 1/2, which was used as a standard reagent. The cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-IL-17 and anti-TNF- ⁇ were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the cells were stimulated with anti-CD3 or LPS and treated with nothing.
  • the present inventors treated the RIPK1 inhibitor Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297) with a given concentration in anti-CD3 stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with T cell active conditions, and then cultured for 48 hours.
  • the culture medium was collected to confirm the expression levels of inflammatory cytokines TNF- ⁇ and anti-inflammatory cytokines IL-10 through ELISA analysis.
  • ELISA analysis first, 96-well plate was coated with anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 at 2 ⁇ g / ml, and after the reaction, nonspecific binding was blocked with blocking solution (1% BSA / PBST). .
  • TNF- ⁇ and IL-10 recombinant were serially diluted by 1/2, which was used as a standard reagent.
  • the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the control group was a group that stimulated the cells only with anti-CD3 and treated nothing.
  • the group treated with the RIPK1 inhibitor had an effect of inhibiting the inflammatory cytokine TNF- ⁇ , and the anti-inflammatory cytokine IL-10 increased compared to the group not treated. (FIG. 11).
  • the present inventors treated splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with anti-CD3, a T cell active condition, at a given concentration after treatment with the RIPK3 inhibitor GSK'872 (Calbiochem , 530389) at a given concentration.
  • the culture medium was collected and the expression level of the inflammatory cytokine IL-17 was confirmed by ELISA analysis. Specifically, for ELISA analysis, first coated with anti-IL-17 in a 96 well plate at 2 ⁇ g / ml, and then blocked the non-specific binding with a blocking solution (1% BSA / PBST) after the reaction. Thereafter, IL-17 recombinant was serially diluted by 1/2 and used as a standard reagent.
  • the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, biotinylated anti-IL-17 was reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with an ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the control group was a group that stimulated the cells only with anti-CD3 and treated nothing.
  • the present inventors attempted to confirm the therapeutic effect by administering a RIPK3 inhibitor to an animal model of mouse induced inflammatory bowel disease.
  • inflammatory bowel disease animal model was prepared by adding 3% DSS (dextran sulfate sodium) to the negative of C57BL6 mice. Body weight was measured at the start of DSS drug administration, and at the same time, RSKK inhibitor GSK'872 (Calbiochem , 530389) was orally administered and the experiment was conducted.
  • the RIPK3 inhibitor did not restore weight to the control group (WT, wild type) in mice induced with inflammatory bowel disease, but it was confirmed that the body weight was slightly increased than that of the inflammatory bowel disease mouse (FIG. 13).
  • RIPK3 inhibitors inhibit the rejection of tissue transplantation. Specifically, in vitro, a 1 ⁇ 10 5 normal recipient (Balb / c, responder) CD4 + T cell and 1 ⁇ 10 5 radiation (1 homogeneous) or donor per 96 wells Splenocytes from which T cells derived from (C57BL / 6, stimulator, allogeneic) were removed were mixed and cultured to induce homologous reaction. In addition, GSK'872 (Calbiochem , 530389), a RIPK3 inhibitor, was treated with 1 ⁇ M and 10 ⁇ M together and incubated for 72 hours. The T cell proliferation response of the cells cultured 16 hours before the completion of the culture was confirmed by treatment with 3H thymidine and the cell proliferation was measured by measuring the amount of 3H thymidine with a b counter.
  • the RIPK3 inhibitor has an effect of inhibiting alloresponse compared to the control group (FIG. 14).
  • the RIPK3 inhibitor can effectively induce the treatment of diseases by transplantation by effectively inhibiting post-transplant rejection and allogeneic response of T cells that may occur during transplantation.
  • RIPK1 receptor interacting serine / threonine protein kinase 1
  • PRRS pathogen recognition receptor
  • antisense oligonucleotide refers to DNA or RNA or derivatives thereof that contain nucleic acid sequences complementary to the sequence of a particular mRNA, and binds to the complementary sequence in the mRNA to translate the mRNA into a protein. It acts to inhibit.
  • Antisense sequence of the present invention refers to a DNA or RNA sequence that is complementary to the mRNA of the gene and capable of binding to the mRNA, and wherein the mRNA is translated, translocated into the cytoplasm, maturation or any other overall biological May inhibit the essential activity for the function.
  • the antisense nucleic acid may be modified at the position of one or more bases, sugars or backbones to enhance efficacy (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol ., 5, 3, 343-55, 1995).
  • the nucleic acid backbone can be modified with phosphorothioate, phosphoroester, methyl phosphonate, short chain alkyl, cycloalkyl, short chain heteroatomic, heterocyclic intersaccharide linkages and the like.
  • antisense nucleic acids may include one or more substituted sugar moieties.
  • Antisense nucleic acids can include modified bases.
  • Modified bases include hypoxanthine, 6-methyladenine, 5-methylpyrimidine (particularly 5-methylcytosine), 5-hydroxymethylcytosine (HMC), glycosyl HMC, gentobiosil HMC, 2-aminoadenine, 2 Thiouracil, 2-thiothymine, 5-bromouracil, 5-hydroxymethyluracil, 8-azaguanine, 7-deazaguanine, N6 (6-aminohexyl) adenine, 2,6-diaminopurine, etc. There is this.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may be chemically bound to one or more moieties or conjugates that enhance the activity and cellular adsorption of the antisense nucleic acids.
  • Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro in conventional manner to be administered in vivo or to allow antisense oligonucleotides to be synthesized in vivo.
  • One example of synthesizing antisense oligonucleotides in vitro is to use RNA polymerase I.
  • One example of allowing antisense RNA to be synthesized in vivo is to allow the antisense RNA to be transcribed using a vector whose origin is in the opposite direction of the recognition site (MCS). Such antisense RNA is desirable to ensure that there is a translation stop codon in the sequence so that it is not translated into the peptide sequence.
  • RNA interference refers to the RNA Interference, in Korean, it means the meaning of RNA interference.
  • RNA interference is a specific gene suppression phenomenon that is well conserved among most organisms. It is thought to be a type of gene monitoring mechanism used by cells to defend against viral infections, to suppress transposons, or to remove abnormal mRNAs.
  • gene suppression by small RNA is called RNA interference in a broad sense, and RNA interference in a narrow sense means mRNA degradation by siRNA.
  • RNA interference may refer to a technique for inhibiting genes using siRNA.
  • siRNA refers to a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (International Patent Nos. 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 and 00/44914). Since siRNA can inhibit expression of a target gene, it is provided as an efficient gene knock-down method or gene therapy method.
  • the siRNA molecule of the present invention may have a structure in which a sense strand (a sequence corresponding to the mRNA sequence of the marker gene) and an antisense strand (a sequence complementary to the mRNA sequence) are positioned opposite to each other to form a double chain.
  • the siRNA molecules of the present invention may have a single chain structure with self-complementary sense and antisense strands.
  • siRNAs are not limited to completely paired double-stranded RNA moieties paired with RNA, but can be paired by mismatches (the corresponding bases are not complementary), bulges (there are no bases corresponding to one chain), and the like. Parts that do not achieve may be included.
  • the siRNA terminal structure can be either blunt or cohesive, as long as the expression of the marker gene can be suppressed by the RNAi effect, and the adhesive terminal structure has a 3'-terminal protrusion structure and a 5'- end. Both terminal protruding structures are possible.
  • the siRNA molecules of the present invention may have a form in which a short nucleotide sequence is inserted between self-complementary sense and antisense strands, in which case the siRNA molecule formed by expression of the nucleotide sequence is subjected to intramolecular hybridization.
  • a hairpin structure is formed, and as a whole, a stem-and-loop structure is formed.
  • This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active siRNA molecule capable of mediating RNAi.
  • the method for preparing siRNA is to directly synthesize siRNA in vitro and then introduce it into the cell through a transformation process, and to siRNA expression vector or PCR-derived siRNA expression cassette prepared to express siRNA in the cell. There is a method of conversion or infection.
  • compositions of the present invention comprising gene specific siRNAs may include agents that promote intracellular influx of siRNAs.
  • Agents that promote the influx of siRNA into the cell generally can be used agents that promote the influx of nucleic acids. Examples of these include the use of liposomes or the lipophilic of one of many sterols, including cholesterol, cholate and deoxycholic acid. It can be combined with a carrier.
  • poly-L-lysine poly-L-lysine
  • spermine spermine
  • polysilazane polysilazane
  • PEI polyethylenimine
  • PEI polyethylenimine
  • polydihydroimidazolenium polydihydroimidazolenium
  • polyallylamin Cationic polymers such as polyallylamine and chitosan
  • succinylated PLL, succinylated PEI, polyglutamic acid, and polyaspa may be used.
  • Anionic polymers such as polyaspartic acid, polyacrylic acid, polymethacylic acid, dextran s ⁇ lfate, heparin, hyaluronic acid, etc. Can be used.
  • the antibody may be coupled (eg covalently) with an existing therapeutic agent directly or indirectly through a linker or the like.
  • Therapeutic agents that can be combined with the antibody include, but are not limited to, radionuclide such as 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In, etc.
  • Biological response variants or drugs such as methotrexate, adriamycin, and lympokine such as interferon; Toxins such as lysine, abrin, diphtheria and the like; Heterofunctional antibodies, ie antibodies that bind to other antibodies and bind their complexes to both cancer cells and agonist cells (eg, K cells such as T cells); and natural, ie, non- It can be associated with associated or non-complexed antibodies.
  • Biological response variants or drugs such as methotrexate, adriamycin, and lympokine such as interferon
  • Toxins such as lysine, abrin, diphtheria and the like
  • Heterofunctional antibodies ie antibodies that bind to other antibodies and bind their complexes to both cancer cells and agonist cells (eg, K cells such as T cells); and natural, ie, non- It can be associated with associated or non-complexed antibodies.
  • Bones support the soft tissues and weight of the body and surround internal organs to protect internal organs from external shocks. It is also one of the important parts of the human body that not only structurally supports muscles or organs, but also stores calcium and other essential minerals such as phosphorus and magnesium in the body. Therefore, the bones of grown adults do not stop, and until the day of their death, the bones of the old bones are removed and replaced with new bones. This is called bone remodeling. This bone remodeling is essential to repair the bone's microscopic damage caused by growth and stress and to maintain proper bone function.
  • Osteoblasts produce RANKL (receptor activator of NF- ⁇ B ligand, hereinafter referred to simply as 'RANKL') and osteoprotegerin (OPG), its decoy receptor.
  • RANKL receptor activator of NF- ⁇ B ligand, hereinafter referred to simply as 'RANKL'
  • OPG osteoprotegerin
  • 'NFAT' nuclear factor of activated T cells
  • 'ERK' extracellular signal-regulated kinase
  • NF- ⁇ B NF- ⁇ B
  • p38 MAP kinase a key transcription factor that regulates osteoclast differentiation in osteoclast progenitor cells by intracellular calcium signaling by RANKL stimulation.
  • cytokines such as NF- ⁇ B ligand activator (RANKL) and macrophage colony stim ⁇ lating factor (M-CSF)
  • RNKL NF- ⁇ B ligand activator
  • M-CSF macrophage colony stim ⁇ lating factor
  • composition according to the present invention can be used as a pharmaceutical composition that can prevent and treat immune diseases, bone diseases that can be caused by bone loss, and immunorejection diseases, wherein the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically does not cause allergic or similar reactions, such as gastrointestinal disorders, dizziness, and the like.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, carriers for oral administration such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like, and parenteral administration such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following documents (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in a suitable form according to methods known in the art together with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various parenteral or oral dosage forms according to known methods, and isotonic aqueous solution or suspension is preferable as an injectable formulation as a typical parenteral dosage form.
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer.
  • formulations for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, pills and capsules.
  • compositions formulated in such a manner can be administered in a effective amount via several routes, including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • the term 'effective amount' refers to an amount exhibiting a prophylactic or therapeutic effect when administered to a patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected depending on the route of administration, subject to administration, age, gender weight, individual difference and disease state.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the degree of disease, preferably 1 to 10,000 g / weight kg / day, more preferably 10 to 1000 mg / weight kg
  • the effective dose of / day may be repeated several times a day.
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with known compounds having the effect of preventing, ameliorating or treating immune diseases.
  • the present invention comprises the steps of treating the candidate material to a cell or tissue comprising the RIPK1 gene or RIPK1 protein; And measuring the expression level of RIPK1 gene or the amount of RIPK1 protein or RIPK1 protein activity.
  • the method according to the present invention is a method for discovering a new therapeutic agent for immune diseases using RIP-1, wherein the "candidate" is an expression of RIPK1 gene, RIPK1 protein or RIPK1 protein activity.
  • the sample may include, but is not limited to, a compound, protein, peptide, oligonucleotide or natural product extract.
  • Treatment of the candidate material may be preferably performed by treating the candidate material with cells or tissues containing the RIPK1 gene or RIPK1 protein and then culturing the candidate material.
  • the increase in the intracellular level of the RIPK1 protein means that the expression of the RIPK1 gene is increased or the degradation of the RIPK1 protein is inhibited and the amount of the RIPK1 protein is increased.
  • the RIPK1 gene expression involves the transcription and translation of the RIPK1 gene into proteins. Therefore, when the candidate substance reduces the expression of the RIPK1 gene and the protein level in the cell, the candidate substance may be determined as a novel therapeutic agent for immune diseases.
  • the expression level of the gene is preferably to measure the level of mRNA, the method for measuring the level of mRNA reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RNase protection assay, Northern Blots and DNA chips, etc., but is not limited thereto.
  • the amount of the protein or the activity of the protein can be measured using an antibody, in which case the marker protein in the biological sample and the antibody specific thereto form a binding, ie, an antigen-antibody complex, and an antigen-antibody complex.
  • the amount of formed can be measured quantitatively through the magnitude of the signal of the detection label.
  • a detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • Analytical methods for measuring protein levels include, but are not limited to, Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, Complement fixation assays, FACS, protein chips, and the like.
  • the method for measuring the expression level of the RIPK1 gene or the amount of the RIPK1 protein or the activity of the RIPK1 protein may be various methods known in the art as described, and preferably, reverse transcription polymerase chain reaction (RT).
  • RT reverse transcription polymerase chain reaction
  • PCR real-time reverse transcription polymerase chain reaction
  • coimmunoprecipitation enzyme-linked immunosorbentassay
  • radioimmunoassay RIA
  • immunohistochemistry western blotting and flow cytometry FACS
  • Example 1 In normal and arthritis tissues RIPK1 (Receptor-interacting serine / threonine-protein kinase 1) Expression analysis
  • the present inventors analyzed the expression level of RIPK1 in joint tissues of normal mice and arthritis-induced arthritis by immunohistochemical staining in order to analyze the expression changes of RIPK1 in the normal state and disease-induced state.
  • arthritis-induced mice were mixed 1: 1 with type II collagen (CII) and CFA (complete Freund's adjuvant) in DBA / 1J mice, and injected 100 ⁇ g of CII per mouse at 50 ⁇ l dose into the tail base.
  • arthritis-induced mice were prepared by injecting a mixture of CII and CFA 1: 1 at 100 ⁇ g / 50 ⁇ l in a second manner, and the normal mice used DBA / 1J mice not treated with CII. .
  • Example 1 The results of Example 1, based on the fact that the expression of RIPK1 in the animal model that the expression of RIPK1 is increased compared to normal at the induction of immune diseases, to confirm whether the actual clinical results show the same, normal osteoarthritis patients and The synovial tissues obtained from rheumatoid arthritis patients were analyzed for the expression level of RIPK1 through microarray analysis.
  • RIPK1 was found to be associated with the induction of immune diseases
  • the present inventors examined the effects of the inhibition of RIPK1 on the treatment of immune diseases, and the effects of modulating inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines by RIPK1 inhibitors. was analyzed.
  • Splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with T-cell-activated anti-CD3 were treated with RIPK1 inhibitor Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037) at concentrations of 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively, for 48 hours. After culturing, the culture medium was collected, and the expression levels of the representative inflammatory cytokines IL-17 and inflammatory cytokines IFN- ⁇ and the anti-inflammatory cytokines IL-10 were confirmed by ELISA analysis.
  • biotinylated anti-IL-17, anti-IFN- ⁇ , and anti-IL-10 were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and then diluted and added to ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate. The reaction was carried out for 2 hours.
  • the control group was a group that stimulated the cells only with anti-CD3 and treated nothing.
  • IL-17 pathogenic cytokines
  • IFN- ⁇ inflammatory cytokines
  • the compound that inhibits RIPK1 can be used as a therapeutic agent for treating immune diseases.
  • the present inventors treated splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with LPS (lipopolysaccharide), which is a macrophage activation condition, and treated with RIPK1 inhibitor Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037) at concentrations of 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, respectively. After 48 hours, the cultures were collected and the expression levels of representative inflammatory cytokines TNF- ⁇ and anti-inflammatory cytokines IL-10 were confirmed by ELISA analysis. Specifically, for ELISA analysis, 96-well plate was first coated with anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 at 2 ⁇ g / ml, and after the reaction, nonspecific binding was blocked with blocking solution (1% BSA / PBST).
  • TNF- ⁇ and IL-10 recombinant were serially diluted by 1/2, which was used as a standard reagent.
  • the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the control group used a group that stimulated the cells only with LPS and did not process anything.
  • the group treated with the RIPK1 inhibitor under conditions that activate macrophages significantly inhibited the production of TNF- ⁇ , an inflammatory cytokine induced by LPS, compared to the group not treated with the anti-inflammatory cytokine. It did not appear to affect IL-10 (FIG. 4).
  • RIPK1 inhibitors suppressed the production of inflammatory cytokines, but did not inhibit the production of anti-inflammatory cytokines.
  • RIPK1 inhibitors were actually administered to mouse animals that caused autoimmune diseases, the following experiments were conducted to determine if they had an effective therapeutic effect.
  • IL-10 knockout to prepare mice with arthritis. Induced arthritis-induced mouse model by inducing collagen-induced arthritis (CIA) in mice with type II collagen, and then using necrostatin-1 (Selleckchem, S8037), an intraperitoneal RIPK1 inhibitor, 3 times a week The arthritis index was analyzed after administration at 0.02mg / mice.
  • Blood was obtained from the mice administered with the RIPK1 inhibitor for 4 weeks in the mice used in the experiment in Example 5, and serum was separated again, and then the expression levels of CII specific Total IgG, CII specific IgG1, and CII specific IgG2a were expressed in ELISA. Analyzed by.
  • RIPK1 inhibitors can increase anti-inflammatory antibodies such as Th2 and inhibit the production of inflammatory antibodies such as Th1.
  • splenocytes of normal mice were treated with concentrations of 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, and 10 ⁇ M of the RIPK1 inhibitor Necrostatin 1, respectively, and then cultured for 3 days, and MTT powder (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) was added to 0.5 in PBS. Dissolved in mg / ml and treated 50 ⁇ l each was incubated for 4 hours. Then, after centrifugation at 1300rpm, 5 minutes, 4 ° C 120 ⁇ l of the supernatant was removed and 50 ⁇ l of DMSO was added and the absorbance was measured at 540 nm.
  • MTT powder Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide
  • splenocytes of normal mice were treated with anti-CD3, anti-CD28, anti-IFN- ⁇ , anti-IL-4, IL-6 and TGF- ⁇ to induce differentiation of Th17 cells.
  • Necrostatin 1, a RIPK1 inhibitor was treated with 10 ⁇ M and cultured for 3 days. Thereafter, the cells were collected and stained using anti-mouse CD4 PerCP-Cyanine5.5 and anti-mouse IL-17 FITC antibodies, followed by FACS (Fluorescence-activated cell sorting, BD FACS calibur TM ), and a FlowJo program. It was analyzed using.
  • the inventors carried out experiments to determine whether the osteoclast differentiation is inhibited by the RIPK1 inhibitor. Specifically, induction of CIA with Type II Collagen in IL-10 knockout mice was induced into arthritis-induced mouse model, and then RIPK-1 inhibitor (Necrostatin 1) intraperitoneally three times a week from 10 days after initial immunization. ) At 20 mg / kg and 10 mg / kg, and 50 ng / ml of receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor at the end of the experiment. ), And then treated with RIPK1 inhibitor Necrostatin 1 at 1 ⁇ M and 10 ⁇ M, and then TRAP (Tartrate-resistant acid phosphatase) positive cells were examined.
  • RIPK-1 inhibitor Necrostatin 1
  • the RIPK1 inhibitor has an effect of inhibiting osteoclast differentiation and is effective in the treatment of bone diseases.
  • Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297) was used for splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with anti-CD3, a T cell active condition, or with LPS (lipopolysaccharide), a macrophage activation condition. ) was treated at a given concentration, and cultured for 48 hours, and the culture solution was collected to confirm the expression level of the inflammatory cytokine IL-17 and the inflammatory cytokine TNF- ⁇ by ELISA analysis.
  • 96-well plates were first coated with 2 ⁇ g / ml of anti-IL-17 and anti-TNF- ⁇ , and then non-specific binding was blocked with a blocking solution (1% BSA / PBST) after the reaction. . Thereafter, IL-17 and TNF- ⁇ recombinant were serially diluted by 1/2, which was used as a standard reagent. The cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-IL-17 and anti-TNF- ⁇ were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the cells were stimulated with anti-CD3 or LPS and treated with nothing.
  • the present inventors treated the RIPK1 inhibitor Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297) with a given concentration in anti-CD3 stimulated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with T cell active conditions, and then cultured for 48 hours.
  • the culture medium was collected to confirm the expression levels of inflammatory cytokines TNF- ⁇ and anti-inflammatory cytokines IL-10 through ELISA analysis.
  • ELISA analysis first, 96-well plate was coated with anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 at 2 ⁇ g / ml, and after the reaction, nonspecific binding was blocked with blocking solution (1% BSA / PBST). .
  • TNF- ⁇ and IL-10 recombinant were serially diluted by 1/2, which was used as a standard reagent.
  • the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-TNF- ⁇ and anti-IL-10 were reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the control group was a group that stimulated the cells only with anti-CD3 and treated nothing.
  • the group treated with the RIPK1 inhibitor had an effect of inhibiting the inflammatory cytokine TNF- ⁇ , and the anti-inflammatory cytokine IL-10 increased compared to the group not treated. (FIG. 11).
  • the present inventors treated splenocytes isolated from C57BL / 6 normal mice stimulated with anti-CD3, a T cell active condition, at a given concentration after treatment with the RIPK3 inhibitor GSK'872 (Calbiochem , 530389) at a given concentration.
  • the culture medium was collected and the expression level of the inflammatory cytokine IL-17 was confirmed by ELISA analysis. Specifically, for ELISA analysis, first coated with anti-IL-17 in a 96 well plate at 2 ⁇ g / ml, and then blocked the non-specific binding with a blocking solution (1% BSA / PBST) after the reaction. Thereafter, IL-17 recombinant was serially diluted by 1/2 and used as a standard reagent.
  • the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours. Thereafter, biotinylated anti-IL-17 was reacted at room temperature for 2 hours, washed three times, and diluted with an ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate, followed by reaction at room temperature for 2 hours.
  • the control group was a group that stimulated the cells only with anti-CD3 and treated nothing.
  • the present inventors attempted to confirm the therapeutic effect by administering a RIPK3 inhibitor to an animal model of mouse induced inflammatory bowel disease.
  • inflammatory bowel disease animal model was prepared by adding 3% DSS (dextran sulfate sodium) to the negative of C57BL6 mice. Body weight was measured at the start of DSS drug administration, and at the same time, RSKK inhibitor GSK'872 (Calbiochem , 530389) was orally administered and the experiment was conducted.
  • the RIPK3 inhibitor did not restore weight to the control group (WT, wild type) in mice induced with inflammatory bowel disease, but it was confirmed that the body weight was slightly increased than that of the inflammatory bowel disease mouse (FIG. 13).
  • RIPK3 inhibitors inhibit the rejection of tissue transplantation. Specifically, in vitro, a 1 ⁇ 10 5 normal recipient (Balb / c, responder) CD4 + T cell and 1 ⁇ 10 5 radiation (1 homogeneous) or donor per 96 wells Splenocytes from which T cells derived from (C57BL / 6, stimulator, allogeneic) were removed were mixed and cultured to induce homologous reaction. In addition, GSK'872 (Calbiochem , 530389), a RIPK3 inhibitor, was treated with 1 ⁇ M and 10 ⁇ M together and incubated for 72 hours. The T cell proliferation response of the cells cultured 16 hours before the completion of the culture was confirmed by treatment with 3H thymidine and the cell proliferation was measured by measuring the amount of 3H thymidine with a b counter.
  • the RIPK3 inhibitor has an effect of inhibiting alloresponse compared to the control group (FIG. 14).
  • the RIPK3 inhibitor can effectively induce the treatment of diseases by transplantation by effectively inhibiting post-transplant rejection and allogeneic response of T cells that may occur during transplantation.
  • SEQ ID NO: 1 nucleic acid sequence of the RIPK1 gene
  • SEQ ID NO: 3 nucleic acid sequence of the RIPK3 gene
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of the RIPK3 protein

Abstract

본 발명은 RIPK 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 면역질환이 유발된 질병 조직에서 RIPK의 발현이 증가되는 것을 확인하였고, RIPK 억제제를 면역질환의 동물모델에 투여하는 경우 면역질환의 증상이 완화 및 개선되는 것을 확인함으로써, RIPK 억제제의 면역질환의 예방 또는 치료에 대한 유용성을 규명하였다.

Description

RIPK 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
RIPK 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 면역과민반응으로 인한 질환이 증가하고 있지만, 이러한 질환들의 발생에 대한 근본적인 원인 규명이 충분히 이루어지지 않은 상태이다. 현재 과도한 면역반응에 의한 질환의 치료방법으로는 면역억제제를 단독 또는 병용 투여함으로써 상기 질환에 의해 야기되는 각종 증상을 완화 내지 감소시키는 것이다.
면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다.
현재 사용되고 있는 면역억제제로는 사이클로스포린 A와 FK506 등이 있는데, 이들은 복잡한 화학구조를 가진 천연물 유래의 화합물로서 원료 수급의 측면에서 고비용이 드는 문제점이 있어 비경제적이고, 장기투여로 인해 각종 부작용이 야기될 수 있다는 위험성을 내포하고 있다. 따라서 낮은 독성 및 면역관용 유도와 함께 경제적인 생산이 가능한 새로운 면역억제제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
한편, 각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.
따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 가지 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다.
또한, Treg 세포 이 외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 자가면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.
또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.
따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제 및 치료방법의 개발이 시급하다.
본 발명의 목적은 RIPK(receptor interacting serine/threonine protein kinase) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 RIPK1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 RIPK3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RIPK(receptor interacting serine/threonine protein kinase) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK 억제제는 RIPK1 억제제 또는 RIPK3 억제제인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1) 억제제는 RIPK1 유전자에 특이적으로 결합하여 RIPK1의 발현을 억제하는 물질이거나, RIPK1의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK1의 활성을 억제하는 물질인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK1은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK1의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK1의 발현을 억제하는 물질은 RIPK1의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK1의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK1의 활성을 억제하는 물질은 RIPK1에 대한 항체 또는 화합물인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 Necrostatin 1 또는 Necrostatin 1s 인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3) 억제제는 RIPK3 유전자에 특이적으로 결합하여 RIPK3의 발현을 억제하는 물질이거나, RIPK3의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK3의 활성을 억제하는 물질인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK3은 서열번호 3의 핵산서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK3의 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK3의 발현을 억제하는 물질은 RIPK3의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK3의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK3의 활성을 억제하는 물질은 RIPK3에 대한 항체 또는 화합물인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 GSK'872인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 골관절염, 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Mμltiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerμlonephritis) 및 폐섬유증(pμlmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 허혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pμlmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease) 또는 미토콘드리아 관련 증후군인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 RIPK1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK1 억제제는 Necrostatin 1 또는 Necrostatin 1s 인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK1 억제제는 파골세포의 형성 및 분화를 억제하는 효능를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골 손실 억제를 통해 치료할 수 있는 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증 또는 퇴행성 골질환인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 RIPK3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 RIPK3 억제제는 GSK'872 인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역거부 질환은 기관 또는 조직의 이식편 거부반응; 기관 또는 조직의 이종이식 거부반응; 또는 동종이식 거부반응인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 RIPK1 유전자 또는 RIPK1 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및 RIPK1 유전자의 발현량 또는 RIPK1 단백질의 양 또는 RIPK1 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RIPK 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 면역 질환의 예방 또는 치료 방법은 본 발명의 RIPK 억제제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또한, 본 발명은 RIPK1 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골 손실 억제 방법을 제공한다.
본 발명의 면역 질환의 예방 또는 치료 방법은 본 발명의 RIPK 억제제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또한, 본 발명은 RIPK3 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역거부질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 면역 질환의 예방 또는 치료 방법은 본 발명의 RIPK 억제제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명은 RIPK 억제제를 면역질환의 새로운 치료제로서 사용할 수 있음을 규명한 것으로 면역질환이 유발된 동물모델에 RIPK 억제제를 처리하게 되면 질환의 증상이 완화 및 개선되는 것으로 나타났고, 염증성 사이토카인 및 병인성 사이토카인의 생성이 억제되고 반면 항염증성 사이토카인의 생성은 증가되는 것으로 나타났다. 따라서 본 발명은 면역질환 치료를 위한 새로운 타겟으로 RIPK을 발견하고 RIPK 억제제를 새로운 치료제로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 정상 마우스(Normal) 및 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델(CIA, collagen-induced arthritis)의 관절 조직에서 RIPK1 발현량을 면역조직화학염색법에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정상인(Normal donor), 골관절염(Osteoarthritis) 및 류마티스 관절염(Rheumatoid arthritis)의 환자로부터 수득한 활막조직에서 RIPK1 발현량을 마이크로어레이(Microarray)를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 anti-CD3로 자극된 마우스의 비장세포에서 RIPK1 억제제 처리에 의한 IL-17 (a), IFN-γ (b) 및 IL-10 (c) 사이토카인의 발현량을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스의 비장세포에서 RIPK1 억제제 처리에 의한 TNF-α (a) 및 IL-10 (b) 사이토카인의 발현량을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에 RIPK1 억제제 처리에 의한 관절염 치료 효과를 분석한 것으로서, (a)는 관절염 지수(arthritis score)를 분석한 것이고, (b)는 관절염 발병정도(incidence)를 분석한 것이다.
도 6은 콜라겐 유도 류마티스 관절염 동물모델에 RIPK1 억제제 처리한 후, 각 실험군으로부터 혈청을 수득하여 CII specific Total IgG (a), CII specific IgG1 (b) 및 CII specific IgG2a (c)의 발현량을 ELISA에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 RIPK1 억제제의 처리에 따른 세포 독성여부를 MTT 어세이에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 RIPK1 억제제 처리에 따른 Th17 세포의 분화 억제 효과를 분석한 것으로서 Th17 세포의 수를 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 RIPK1 억제제 처리에 따른 파골세포(osteoclast)의 분화 억제 효과를 분석한 것으로서 염색된 TRAP+ 세포 및 염색된 TRAP+ 세포의 수를 카운팅한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 anti-CD3 또는 LPS(lipopolysaccharide)로 자극된 마우스의 비장세포에서 RIPK1 억제제 처리에 따른 IL-17 (a) 및 TNF-α (b) 사이토카인의 발현량을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 anti-CD3로 자극된 인간 말초단핵구 세포(human peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 RIPK1 억제제 처리에 따른 TNF-α (a) 및 IL-17 (b) 사이토카인의 발현량을 ELISA로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 anti-CD3로 자극된 마우스의 비장세포에서 RIPK3 억제제 처리에 따른 IL-17 사이토카인의 발현량을 ELISA에 의해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 염증성 장질환의 마우스(B6) 모델에서 RIPK3 억제제 처리에 따른 염증성 장질환 억제 효과를 알아보기 위하여 마우스의 체중을 측정한 결과를 나타낸 것이다. WT: 대조군; IBD: 염증성 장질환 동물 모델로서 RIPK3 억제제를 처리하지 않은 군; 및 RIPK3 inhibitor: RIPK3 억제제를 처리한 군.
도 14는 RIPK3 억제제 처리에 따른 동종반응(alloresponse) 억제 효과를 알아보기 위하여 T 세포의 증식정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
실시예 1. 정상조직과 관절염 조직에서의 RIPK1 (Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1) 발현량 분석
본 발명자들은 정상상태와 질환유발 상태 시 RIPK1의 발현변화를 분석하기 위해, 정상 마우스와 관절염이 유도된 마우스의 관절 조직에서 RIPK1의 발현량을 면역조직화학염색법을 수행하여 분석하였다.
먼저, 관절염 유도 마우스는 DBA/1J 마우스에 type II collagen(CII)과 CFA(complete Freund's adjuvant)를 1:1로 혼합하여 마우스당 100μg의 CII를 tail base에 50μl 용량으로 주사하였다. 2주 후, CII와 CFA 1:1로 혼합액을 100μg/50μl로 2차로 주입하는 방법으로 관절염이 유발된 마우스를 제조하여 사용하였고, 상기 정상마우스는 CII를 처리하지 않은 DBA/1J 마우스를 사용하였다.
정상 마우스와 관절염 유도 마우스로부터 수득된 관절 조직을 10% 포르말린으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀에 포매한 후 조직을 7 μm 두께의 절편을 만들어서 슬라이드에 부착하였다. 면역조직 화학염색을 진행하기 전에 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과 후, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수 시켰다. 이때 상기 RIPK1의 발현량을 감지하기 위해서 RIPK1에 대한 항체(Santa Cruz, SC-7881)를 이용하여 면역염색을 수행하였고, 이후 광학현미경으로 분석을 통해 단백질의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 정상 마우스의 관절조직에 비해 류마티스 관절염이 유발된 관절조직에서 RIPK1의 발현이 현저하게 증가되었음을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 골관절염과 류마티스 관절염 환자의 활막조직에서의 RIPK1 발현량 분석
상기 실시예 1의 결과를 통해, RIPK1의 발현이 면역질환 유발시 정상에 비해 증가되어 있는 것을 동물모델로 확인한 사실을 토대로, 실제 임상적으로도 동일한 결과를 보이는지 확인하기 위해, 정상인, 골관절염 환자 및 류마티스 관절염 환자로부터 수득한 활막조직을 대상으로 마이크로어레이(microarray) 분석을 통해 RIPK1의 발현량을 분석하였다.
그 결과, 정상인에 비해 골관절염 및 류마티스 관절염이 발병하면 RIPK1의 발현량이 실제적으로 증가되었음을 확인하였다(도 2).
실시예 3. RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절효과
RIPK1이 면역질환 유발과 관련성이 있음을 확인함에 따라, 본 발명자들은 RIPK1을 억제하게 되면 면역질환을 치료할 수 있는 효과가 있는지 알아보기 위해, RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절 효과를 분석하였다.
T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037)를 각각 1μM 및 10μM의 농도로 처리한 후, 48시간 배양하였고, 이후 배양액을 수집하여 대표적인 병인 사이토카인인 IL-17과 염증성 사이토카인인 IFN-γ 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-IL-17, anti-IFN-γ, anti-IL-10을 각각 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰고, 이후 IL-17, IFN-γ, IL-10 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)으로 사용하였는데, 여기에 세포배양 상층액을 첨가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후, 바이오티닐(biotinylated) anti-IL-17, anti-IFN-γ, anti-IL-10을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후 ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 다시 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, T 세포가 활성화된 조건에서 RIPK1 억제제를 처리한 군의 경우, RIPK1 억제제를 처리하지 않은 군에 비해, 병인성 사이토카인(IL-17)과 염증성 사이토카인(IFN-γ)의 발현은 감소된 것으로 나타난 반면, 항염 활성을 갖는 사이토카인(IL-10)은 증가한 것으로 나타났다(도 3).
따라서, RIPK1을 억제하는 화합물의 경우, 면역질환을 치료할 수 있는 치료제로서 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 대식세포 활성화 조건에서의 RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 대식세포 활성화 조건인 LPS(lipopolysaccharide)로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037)를 각각 1μM 및 10μM의 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로 ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-TNF-α, anti-IL-10을 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 TNF-α, IL-10 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-TNF-α, anti-IL-10을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 LPS로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, 대식세포를 활성화시키는 조건에서 RIPK1 억제제를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성은 현저하게 억제하는 것으로 나타난 반면, 항염증성 사이토카인인 IL-10에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 4). 즉, RIPK1 억제제의 경우, 염증성 사이토카인의 생성은 억제하였으나, 항염증성 사이토카인의 생성은 억제하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 5. 류마티스 관절염 동물모델을 대상으로 RIPK1 억제제에 의한 치료 효과 분석
RIPK1 억제제가 실제로 자가면역질환이 유발된 마우스 동물에게 투여할 경우, 효과적인 치료 효능이 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.관절염이 유발된 마우스를 제조하기 위해 IL-10 넉아웃(knockout) 마우스에 Type II Collagen으로 CIA(collagen-induced arthritis)를 유도하여 관절염 발병 마우스 모델을 제조한 후, 처음 Immunization 후 10일째부터 1주일에 3회 복강 내 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1 (Selleckchem,S8037)을 0.02mg/mice로 투여한 후 관절염 지수를 분석하였다.
관절염 평가 기준은 다음과 같다.
-평가 기준-
0점: 부종이나 종창이 없다.
1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
5점 이상: 부종과 발적의 증상이 심각하게 계속 진행되는 경우
그 결과, 관절염이 유도된 마우스에 RIPK1 억제제를 투여한 경우, RIPK1 억제제를 투여하지 않은 군에 비해 관절염 지수(arthritis score)가 현저하게 억제되는 것으로 나타났고, 관절염 발병 정도(incidence)도 2.5배 이상 감소하는 것으로 나타났다(도 5).
따라서, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 실제적으로 RIPK1의 활성을 억제할 경우, 면역질환을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. RIPK1 억제제에 의한 항체 조절 효과분석
상기 실시예 5에서 실험에 사용한 마우스들을 대상으로 RIPK1 억제제를 4주간 투여한 마우스로부터 혈액을 수득하고 다시 혈청을 분리한 후, CII specific Total IgG, CII specific IgG1, CII specific IgG2a의 발현량을 ELISA에 의해 분석하였다.
그 결과, RIPK1 억제제를 투여한 마우스의 혈청에서는 CII specific Total IgG의 발현이 감소되었고, Th2 반응과 관련 있는 CII specific IgG1의 발현은 오히려 증가되었다. 또한, Th1 반응과 관련이 있는 CII specific IgG2a의 발현도 감소되었다(도 6).
따라서, RIPK1 억제제는 Th2와 같은 항염증성 항체는 증가시키고 Th1과 같은 염증성 항체의 생성을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. RIPK1 억제제의 세포 독성 여부 확인
본 발명자들은 RIPK1 억제제가 세포 독성을 유발하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 정상 마우스의 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin 1을 각각 0.1μM, 1μM, 10μM의 농도로 처리한 후, 3일 동안 배양하였고, MTT powder(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)를 PBS에 0.5mg/ml로 녹여 50μl씩 처리한 후 4시간을 배야하였다. 그 후, 1300rpm, 5분, 4°C에서 원심분리를 한 후 상층액 120μl을 제거하고 DMSO를 50μl 넣어준 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, RIPK1 억제제를 처리한 군 모두에서 세포 독성이 유발되지 않음을 확인하였고, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM 농도로 처리한 군 모두에서 세포 독성이 유발되지 않는 것으로 나타났다(도 7).
실시예 8. RIPK1 억제제에 의한 Th17 세포의 분화 억제 효과
RIPK1 억제제에 의한 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, Th17 세포의 분화를 유도하기 위하여 정상 마우스의 비장세포(splenocytes)에 anti-CD3, anti-CD28, anti-IFN-γ, anti-IL-4, IL-6 및 TGF-β를 처리하고, RIPK1 억제제인 Necrostatin 1을 10μM 로 처리한 후 3일 동안 세포를 배양하였다. 그 후, 세포를 모은 후 anti-mouse CD4 PerCP-Cyanine5.5 와 anti-mouse IL-17 FITC 항체를 이용하여 염색하고, FACS(Fluorescence-activated cell sorting, BD FACS caliburTM)를 수행하였으며, FlowJo 프로그램을 이용하여 분석하였다.
그 결과, RIPK1 억제제를 처리하는 경우에는 대조군에 비해 Th17 세포로의 분화가 억제되었음을 확인하였다(도 8).
실시예 9. RIPK1 억제제에 의한 파골세포 분화 억제 효과
본 발명자들은 RIPK1 억제제에 의해 파골세포 분화가 억제되는 효과가 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, IL-10 넉아웃(knockout) 마우스에 Type II Collagen으로 CIA를 유도하여 관절염 발병 마우스 모델로 유도한 후, 처음 Immunization 후 10일째부터 1주일에 3회 복강 내에 RIPK-1 억제제(Necrostatin 1)를 20mg/kg 및 10mg/kg으로 투여한 후, 실험종료 시점에 마우스의 골수세포에 50 ng/ml의 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) 과 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)로 자극하고, 이후 RIPK1 억제제인 Necrostatin 1을 1μM, 10μM로 처리한 다음, TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 양성 세포를 조사하였다.
그 결과, RIPK-1 억제제의 파골세포 분화 조절능을 관찰하기 위한 Osteoclastogenesis 분화 실험에서 RIPK-1 억제제를 처리하는 경우에는 골파괴 기전과 관련 있는 TRAP 양성 세포가 농도 의존적으로 감소되었음을 확인하였다 (도 9).
따라서, RIPK1 억제제가 파골세포 분화를 억제할 수 있는 효과가 있고, 골질환의 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 9. RIPK1 억제제에 의한 병인 사이토카인 및 염증성 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극 또는 대식세포 활성화 조건인 LPS(lipopolysaccharide)로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297)를 주어진 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 병인 사이토카인인 IL-17 및 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-IL-17, anti-TNF-α를 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 IL-17, TNF-α recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-IL-17, anti-TNF-α을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3 또는 LPS로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, RIPK1 억제제(Necrostain 1s)를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 병인 사이토카인인 IL-17 및 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현량이 억제되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 10).
실시예 10. RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극된 인간 말초단핵구 세포(human peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297)를 주어진 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-TNF-α, anti-IL-10을 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 TNF-α, IL-10 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-TNF-α, anti-IL-10을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, RIPK1 억제제(Necrostain 1s)를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 염증성 사이토카인인 TNF-α가 억제되는 효과가 있었고, 항염증성 사이토카인인 IL-10은 증가되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 11).
실시예 11. RIPK3 억제제에 의한 병인 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK3 억제제인 GSK'872 (Calbiochem, 530389)를 주어진 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 병인 사이토카인인 IL-17의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-IL-17를 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 IL-17 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-IL-17을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3 로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, RIPK3 억제제를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 병인 사이토카인인 IL-17의 발현량이 현저하게 억제되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 12).
실시예 12. RIPK3 억제제에 의한 염증성 장질환 억제 효과
본 발명자들은 RIPK3 억제제를 염증성 장질환이 유발된 마우스 동물모델에 투여하여 치료효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로 염증성 장질환 동물모델은 C57BL6 마우스의 음수에 3% DSS(dextran sulfate sodium)를 넣어주어 제조되었다. 체중은 DSS 약물의 투여를 시작하는 시점에서 측정되었고, 동시에 RIPK3 억제제인 GSK'872 (Calbiochem, 530389)은 경구투여되어 실험이 진행되었다.
그 결과, 염증성 장질환이 유발된 마우스에 RIPK3 억제제는 대조군(WT, wild type) 정도로 체중을 회복하지는 않았으나, 염증성 장질환 마우스보다는 약간 체중이 증가되었음을 확인하였다 (도 13).
실시예 13. RIPK3 억제제에 의한 동종반응( Alloresponse ) 억제 효과
본 발명자들은 RIPK3 억제제가 조직이식에 대한 거부반응을 억제하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, in vitro에서 96 well의 각 웰 당 1×105개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T cell와 1×105개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator, 동종이형) 유래의 T 세포를 제거한 비장세포를 넣고 혼합 배양시켜 동종반응을 유도하였다. 또한, RIPK3 억제제인 GSK'872 (Calbiochem, 530389)은 1μM 및 10μM을 함께 처리한 후 72시간 배양시켰다. 배양완료 16시간 전에 배양된 세포에서 T 세포 증식 반응 정도를 3H Thymidine을 처리하고 세포증식 정도를 b 카운터로 3H Thymidine의 양을 측정하여 확인하였다.
그 결과, RIPK3 억제제는 대조군에 비해 동종반응(Alloresponse)을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 14).
따라서, RIPK3 억제제가 이식 과정에서 발생할 수 있는 T 세포의 이식 후 거부반응 및 동종반응을 효과적으로 억제하여 이식에 의한 질환 치료를 성공적으로 유도할 수 있다는 사실을 확인하였다.
본 발명에서 RIPK1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1)은 pathogen recognition receptor (PRRS)와 DNA 손상 및 death receptor ligation에 의한 Cell-death 신호 (programmed necrosis) 전달에 관여한다.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 상기 유전자의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, 상기 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sμgar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 "RNAi"는 RNA Interference를 지칭하는 말로, 우리말로 풀이하면 RNA 간섭이라는 뜻을 지니고 있다. RNA 간섭은 대부분의 생물체 사이에서 잘 보존되어 있는 특이적 유전자억제 현상이다. 바이러스 감염에 대한 방어나 트랜스포손을 억제하기 위하여 혹은 비정상적 mRNA를 제거하기 위하여 세포가 사용하는 유전자 감시기작의 일종으로 생각되고 있다. 특히, small RNA에 의한 유전자 억제현상을 넓은 의미에서 RNA간섭이라 하고, 좁은 의미의 RNA 간섭은 siRNA에 의한 mRNA 분해 현상을 뜻한다. 또한 RNA간섭은 siRNA를 이용한 유전자 억제 실험 기술을 뜻하기도 한다.
본 발명에서 "siRNA"라는 용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.
본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(상기 마커 유전자의 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(상기 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 상기 마커 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.
또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.
siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.
또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한, 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI:polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sμlfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.
본 발명에서 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어 그 복합체가 암세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.
뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 뼈의 재형성(bone remodeling)이라고 한다. 이러한 뼈의 재형성은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다.
뼈의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand: 이하 간략하게 'RANKL'이라 함)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of NF-κB: 이하 간략하게 'RANK'라 함)에 결합하면 파골 전구세포가 파골세포로 분화되어 골 흡수(resorption)가 일어난다. 자세하게는 RANKL 자극에 의한 세포내 칼슘 신호 전달로 파골 전구세포에서 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있는 NFAT(nuclear factor of activated T cells: 이하 간단하게 'NFAT'라 함)의 발현이 유도되고, 그 후 세포외 신호조절인산화효소(extracellμlar signal-regμlated kinase: 이하 간단하게 'ERK'라 함), NF-κB, p38 MAP kinase 등의 활성화가 NFAT의 자가증폭(autoamplification)을 유발하여 활성이 지속되는 것이다.
또한, 파골세포의 생성을 위해서는 NF-κB 리간드의 수용체 활성제(RANKL)와 대식세포증식자극인자(macrophage colony stimμlating factor(M-CSF))와 같은 두 종류의 싸이토카인(cytokine)이 필수적인데, 이러한 싸이토카인이 파골세포의 분화를 유도한다(신정민 외, KOREAN J. FOODSCI. TECHNOL. 40(6), 674-679(2008)). 또한, 파골세포 표지 인자로 사용되고 있는 TRAP, 파골세포에 선택적으로 분포하여 골흡수를 일으키는 단백질인 카뎁신 K 및 파골세포의 이동에 중요한 역할을 하는 MMP-9와 같은 활성화된 파골세포에만 특이하게 발현된다.
본 발명에 따른 조성물은 면역질환, 골 손실로 유발될 수 있는 골질환, 및 면역거부질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 면역질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 RIPK1 유전자 또는 RIPK1 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리하는 단계; 및 RIPK1 유전자의 발현량 또는 RIPK1 단백질의 양 또는 RIPK1 단백질의 활성을 측정하는 단계를 포함하는, 면역질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 방법은 새로운 면역질환 질환의 치료제를 RIP-1을 이용하여 발굴할 수 있는 방법으로서, 상기 “후보물질”이란 RIPK1 유전자의 발현량, RIPK1 단백질의 양 또는 RIPK1 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화합물, 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오티드 또는 천연물 추출물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 후보물질의 처리는 바람직하게 RIPK1 유전자 또는 RIPK1 단백질을 포함하는 세포 또는 조직에 후보물질을 처리한 후 배양하는 과정으로 수행할 수 있다.
또한, 상기에서 RIPK1 단백질의 세포 내 수준 증가의 의미는 RIPK1 유전자의 발현이 증가되거나 또는 RIPK1 단백질의 분해가 억제되어 RIPK1 단백질의 양이 증가되는 것을 말한다. 상기 RIPK1 유전자 발현은 RIPK1 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다. 따라서 상기 후보물질이 세포 내에서 RIPK1 유전자의 발현 및 단백질의 수준을 감소기킬 경우, 상기 후보물질을 면역질환의 신규 치료제로 판단할 수 있다.
상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 단백질의 양 또는 단백질의 활성 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.
이와 같이, 상기 RIPK1 유전자의 발현량 또는 RIPK1 단백질의 양 또는 RIPK1 단백질의 활성을 측정하는 방법은 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 바람직하게 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)을 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 정상조직과 관절염 조직에서의 RIPK1 (Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1) 발현량 분석
본 발명자들은 정상상태와 질환유발 상태 시 RIPK1의 발현변화를 분석하기 위해, 정상 마우스와 관절염이 유도된 마우스의 관절 조직에서 RIPK1의 발현량을 면역조직화학염색법을 수행하여 분석하였다.
먼저, 관절염 유도 마우스는 DBA/1J 마우스에 type II collagen(CII)과 CFA(complete Freund's adjuvant)를 1:1로 혼합하여 마우스당 100μg의 CII를 tail base에 50μl 용량으로 주사하였다. 2주 후, CII와 CFA 1:1로 혼합액을 100μg/50μl로 2차로 주입하는 방법으로 관절염이 유발된 마우스를 제조하여 사용하였고, 상기 정상마우스는 CII를 처리하지 않은 DBA/1J 마우스를 사용하였다.
정상 마우스와 관절염 유도 마우스로부터 수득된 관절 조직을 10% 포르말린으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀에 포매한 후 조직을 7 μm 두께의 절편을 만들어서 슬라이드에 부착하였다. 면역조직 화학염색을 진행하기 전에 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과 후, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수 시켰다. 이때 상기 RIPK1의 발현량을 감지하기 위해서 RIPK1에 대한 항체(Santa Cruz, SC-7881)를 이용하여 면역염색을 수행하였고, 이후 광학현미경으로 분석을 통해 단백질의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 정상 마우스의 관절조직에 비해 류마티스 관절염이 유발된 관절조직에서 RIPK1의 발현이 현저하게 증가되었음을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 골관절염과 류마티스 관절염 환자의 활막조직에서의 RIPK1 발현량 분석
상기 실시예 1의 결과를 통해, RIPK1의 발현이 면역질환 유발시 정상에 비해 증가되어 있는 것을 동물모델로 확인한 사실을 토대로, 실제 임상적으로도 동일한 결과를 보이는지 확인하기 위해, 정상인, 골관절염 환자 및 류마티스 관절염 환자로부터 수득한 활막조직을 대상으로 마이크로어레이(microarray) 분석을 통해 RIPK1의 발현량을 분석하였다.
그 결과, 정상인에 비해 골관절염 및 류마티스 관절염이 발병하면 RIPK1의 발현량이 실제적으로 증가되었음을 확인하였다(도 2).
실시예 3. RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절효과
RIPK1이 면역질환 유발과 관련성이 있음을 확인함에 따라, 본 발명자들은 RIPK1을 억제하게 되면 면역질환을 치료할 수 있는 효과가 있는지 알아보기 위해, RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절 효과를 분석하였다.
T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037)를 각각 1μM 및 10μM의 농도로 처리한 후, 48시간 배양하였고, 이후 배양액을 수집하여 대표적인 병인 사이토카인인 IL-17과 염증성 사이토카인인 IFN-γ 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-IL-17, anti-IFN-γ, anti-IL-10을 각각 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰고, 이후 IL-17, IFN-γ, IL-10 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)으로 사용하였는데, 여기에 세포배양 상층액을 첨가하고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후, 바이오티닐(biotinylated) anti-IL-17, anti-IFN-γ, anti-IL-10을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후 ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 다시 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, T 세포가 활성화된 조건에서 RIPK1 억제제를 처리한 군의 경우, RIPK1 억제제를 처리하지 않은 군에 비해, 병인성 사이토카인(IL-17)과 염증성 사이토카인(IFN-γ)의 발현은 감소된 것으로 나타난 반면, 항염 활성을 갖는 사이토카인(IL-10)은 증가한 것으로 나타났다(도 3).
따라서, RIPK1을 억제하는 화합물의 경우, 면역질환을 치료할 수 있는 치료제로서 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 대식세포 활성화 조건에서의 RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 대식세포 활성화 조건인 LPS(lipopolysaccharide)로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1 (Selleckchem, S8037)를 각각 1μM 및 10μM의 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로 ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-TNF-α, anti-IL-10을 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 TNF-α, IL-10 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-TNF-α, anti-IL-10을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 LPS로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, 대식세포를 활성화시키는 조건에서 RIPK1 억제제를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 LPS로 유도된 염증성 사이토카인인 TNF-α의 생성은 현저하게 억제하는 것으로 나타난 반면, 항염증성 사이토카인인 IL-10에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 4). 즉, RIPK1 억제제의 경우, 염증성 사이토카인의 생성은 억제하였으나, 항염증성 사이토카인의 생성은 억제하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 5. 류마티스 관절염 동물모델을 대상으로 RIPK1 억제제에 의한 치료 효과 분석
RIPK1 억제제가 실제로 자가면역질환이 유발된 마우스 동물에게 투여할 경우, 효과적인 치료 효능이 있는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.관절염이 유발된 마우스를 제조하기 위해 IL-10 넉아웃(knockout) 마우스에 Type II Collagen으로 CIA(collagen-induced arthritis)를 유도하여 관절염 발병 마우스 모델을 제조한 후, 처음 Immunization 후 10일째부터 1주일에 3회 복강 내 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1 (Selleckchem,S8037)을 0.02mg/mice로 투여한 후 관절염 지수를 분석하였다.
관절염 평가 기준은 다음과 같다.
-평가 기준-
0점: 부종이나 종창이 없다.
1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
5점 이상: 부종과 발적의 증상이 심각하게 계속 진행되는 경우
그 결과, 관절염이 유도된 마우스에 RIPK1 억제제를 투여한 경우, RIPK1 억제제를 투여하지 않은 군에 비해 관절염 지수(arthritis score)가 현저하게 억제되는 것으로 나타났고, 관절염 발병 정도(incidence)도 2.5배 이상 감소하는 것으로 나타났다(도 5).
따라서, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 실제적으로 RIPK1의 활성을 억제할 경우, 면역질환을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. RIPK1 억제제에 의한 항체 조절 효과분석
상기 실시예 5에서 실험에 사용한 마우스들을 대상으로 RIPK1 억제제를 4주간 투여한 마우스로부터 혈액을 수득하고 다시 혈청을 분리한 후, CII specific Total IgG, CII specific IgG1, CII specific IgG2a의 발현량을 ELISA에 의해 분석하였다.
그 결과, RIPK1 억제제를 투여한 마우스의 혈청에서는 CII specific Total IgG의 발현이 감소되었고, Th2 반응과 관련 있는 CII specific IgG1의 발현은 오히려 증가되었다. 또한, Th1 반응과 관련이 있는 CII specific IgG2a의 발현도 감소되었다(도 6).
따라서, RIPK1 억제제는 Th2와 같은 항염증성 항체는 증가시키고 Th1과 같은 염증성 항체의 생성을 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. RIPK1 억제제의 세포 독성 여부 확인
본 발명자들은 RIPK1 억제제가 세포 독성을 유발하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 정상 마우스의 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin 1을 각각 0.1μM, 1μM, 10μM의 농도로 처리한 후, 3일 동안 배양하였고, MTT powder(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)를 PBS에 0.5mg/ml로 녹여 50μl씩 처리한 후 4시간을 배야하였다. 그 후, 1300rpm, 5분, 4°C에서 원심분리를 한 후 상층액 120μl을 제거하고 DMSO를 50μl 넣어준 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, RIPK1 억제제를 처리한 군 모두에서 세포 독성이 유발되지 않음을 확인하였고, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM 농도로 처리한 군 모두에서 세포 독성이 유발되지 않는 것으로 나타났다(도 7).
실시예 8. RIPK1 억제제에 의한 Th17 세포의 분화 억제 효과
RIPK1 억제제에 의한 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 있는지를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, Th17 세포의 분화를 유도하기 위하여 정상 마우스의 비장세포(splenocytes)에 anti-CD3, anti-CD28, anti-IFN-γ, anti-IL-4, IL-6 및 TGF-β를 처리하고, RIPK1 억제제인 Necrostatin 1을 10μM 로 처리한 후 3일 동안 세포를 배양하였다. 그 후, 세포를 모은 후 anti-mouse CD4 PerCP-Cyanine5.5 와 anti-mouse IL-17 FITC 항체를 이용하여 염색하고, FACS(Fluorescence-activated cell sorting, BD FACS caliburTM)를 수행하였으며, FlowJo 프로그램을 이용하여 분석하였다.
그 결과, RIPK1 억제제를 처리하는 경우에는 대조군에 비해 Th17 세포로의 분화가 억제되었음을 확인하였다(도 8).
실시예 9. RIPK1 억제제에 의한 파골세포 분화 억제 효과
본 발명자들은 RIPK1 억제제에 의해 파골세포 분화가 억제되는 효과가 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, IL-10 넉아웃(knockout) 마우스에 Type II Collagen으로 CIA를 유도하여 관절염 발병 마우스 모델로 유도한 후, 처음 Immunization 후 10일째부터 1주일에 3회 복강 내에 RIPK-1 억제제(Necrostatin 1)를 20mg/kg 및 10mg/kg으로 투여한 후, 실험종료 시점에 마우스의 골수세포에 50 ng/ml의 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) 과 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor)로 자극하고, 이후 RIPK1 억제제인 Necrostatin 1을 1μM, 10μM로 처리한 다음, TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase) 양성 세포를 조사하였다.
그 결과, RIPK-1 억제제의 파골세포 분화 조절능을 관찰하기 위한 Osteoclastogenesis 분화 실험에서 RIPK-1 억제제를 처리하는 경우에는 골파괴 기전과 관련 있는 TRAP 양성 세포가 농도 의존적으로 감소되었음을 확인하였다 (도 9).
따라서, RIPK1 억제제가 파골세포 분화를 억제할 수 있는 효과가 있고, 골질환의 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 9. RIPK1 억제제에 의한 병인 사이토카인 및 염증성 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극 또는 대식세포 활성화 조건인 LPS(lipopolysaccharide)로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297)를 주어진 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 병인 사이토카인인 IL-17 및 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-IL-17, anti-TNF-α를 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 IL-17, TNF-α recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-IL-17, anti-TNF-α을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3 또는 LPS로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, RIPK1 억제제(Necrostain 1s)를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 병인 사이토카인인 IL-17 및 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현량이 억제되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 10).
실시예 10. RIPK1 억제제에 의한 염증성 사이토카인 및 항염증성 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극된 인간 말초단핵구 세포(human peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에 RIPK1 억제제인 Necrostatin-1s (Calbiochem, 504297)를 주어진 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 항염증성 사이토카인인 IL-10의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-TNF-α, anti-IL-10을 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 TNF-α, IL-10 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-TNF-α, anti-IL-10을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, RIPK1 억제제(Necrostain 1s)를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 염증성 사이토카인인 TNF-α가 억제되는 효과가 있었고, 항염증성 사이토카인인 IL-10은 증가되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 11).
실시예 11. RIPK3 억제제에 의한 병인 사이토카인의 조절분석
본 발명자들은 T 세포 활성 조건인 anti-CD3로 자극한 C57BL/6 정상 마우스로부터 분리한 비장세포(splenocytes)에 RIPK3 억제제인 GSK'872 (Calbiochem, 530389)를 주어진 농도로 처리한 후, 48시간 배양하고, 배양액을 수집하여 병인 사이토카인인 IL-17의 발현량을 ELISA 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, ELISA 분석을 위해, 먼저 96 well 플레이트에 anti-IL-17를 2μg/ml로 코팅한 후, 반응 후 차단용액 (1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 IL-17 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 이를 표준시약(Standard)로 사용하였고 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 바이오티닐(biotinylated) anti-IL-17을 2시간 동안 실온에서 반응시키고 3회 세척 후, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. 대조군은 anti-CD3 로만 세포를 자극하고 아무것도 처리하지 않은 군을 사용하였다.
그 결과, RIPK3 억제제를 처리한 군은 처리하지 않은 군에 비해 병인 사이토카인인 IL-17의 발현량이 현저하게 억제되는 효과가 있음을 확인하였다 (도 12).
실시예 12. RIPK3 억제제에 의한 염증성 장질환 억제 효과
본 발명자들은 RIPK3 억제제를 염증성 장질환이 유발된 마우스 동물모델에 투여하여 치료효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로 염증성 장질환 동물모델은 C57BL6 마우스의 음수에 3% DSS(dextran sulfate sodium)를 넣어주어 제조되었다. 체중은 DSS 약물의 투여를 시작하는 시점에서 측정되었고, 동시에 RIPK3 억제제인 GSK'872 (Calbiochem, 530389)은 경구투여되어 실험이 진행되었다.
그 결과, 염증성 장질환이 유발된 마우스에 RIPK3 억제제는 대조군(WT, wild type) 정도로 체중을 회복하지는 않았으나, 염증성 장질환 마우스보다는 약간 체중이 증가되었음을 확인하였다 (도 13).
실시예 13. RIPK3 억제제에 의한 동종반응(Alloresponse) 억제 효과
본 발명자들은 RIPK3 억제제가 조직이식에 대한 거부반응을 억제하는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, in vitro에서 96 well의 각 웰 당 1×105개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T cell와 1×105개의 방사선으로 조사시킨 수여자(동종동형) 또는 공여자(C57BL/6, stimulator, 동종이형) 유래의 T 세포를 제거한 비장세포를 넣고 혼합 배양시켜 동종반응을 유도하였다. 또한, RIPK3 억제제인 GSK'872 (Calbiochem, 530389)은 1μM 및 10μM을 함께 처리한 후 72시간 배양시켰다. 배양완료 16시간 전에 배양된 세포에서 T 세포 증식 반응 정도를 3H Thymidine을 처리하고 세포증식 정도를 b 카운터로 3H Thymidine의 양을 측정하여 확인하였다.
그 결과, RIPK3 억제제는 대조군에 비해 동종반응(Alloresponse)을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 14).
따라서, RIPK3 억제제가 이식 과정에서 발생할 수 있는 T 세포의 이식 후 거부반응 및 동종반응을 효과적으로 억제하여 이식에 의한 질환 치료를 성공적으로 유도할 수 있다는 사실을 확인하였다.
1. 서열번호 1: RIPK1 유전자의 핵산 서열
2. 서열번호 2: RIPK1 단백질의 아미노산 서열
3. 서열번호 3: RIPK3 유전자의 핵산 서열
4. 서열번호 4: RIPK3 단백질의 아미노산 서열

Claims (22)

  1. RIPK(receptor interacting serine/threonine protein kinase) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 RIPK 억제제는 RIPK1 억제제 또는 RIPK3 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 RIPK1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1) 억제제는 RIPK1 유전자에 특이적으로 결합하여 RIPK1의 발현을 억제하는 물질이거나, RIPK1의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK1의 활성을 억제하는 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 RIPK1은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 RIPK1의 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 RIPK1의 발현을 억제하는 물질은 RIPK1의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 RIPK1의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK1의 활성을 억제하는 물질은 RIPK1에 대한 항체 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 화합물은 Necrostatin 1 또는 Necrostatin 1s 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 2 항에 있어서,
    상기 RIPK3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3) 억제제는 RIPK3 유전자에 특이적으로 결합하여 RIPK3의 발현을 억제하는 물질이거나, RIPK3의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK3의 활성을 억제하는 물질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 RIPK3은 서열번호 3의 핵산서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 RIPK3의 단백질은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 RIPK3의 발현을 억제하는 물질은 RIPK3의 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 RIPK3의 단백질에 특이적으로 결합하여 RIPK3의 활성을 억제하는 물질은 RIPK3에 대한 항체 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 화합물은 GSK'872 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 골관절염, 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Mμltiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerμlonephritis) 및 폐섬유증(pμlmonary fibrosis), 염증성 장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 허혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pμlmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이, 소동맥 질환, 이식편대숙주질환(graft-versus-host disease) 및 미토콘드리아 관련 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. RIPK1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1) 억제제를 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 약학적 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 RIPK1 억제제는 Necrostatin 1 또는 Necrostatin 1s 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 RIPK1 억제제는 파골세포의 형성 및 분화를 억제하는 효능를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 골 손실 억제를 통해 치료할 수 있는 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증 및 퇴행성 골질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. RIPK3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3) 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 RIPK3 억제제는 GSK'872 인 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서,
    상기 면역거부 질환은 기관 또는 조직의 이식편 거부반응; 기관 또는 조직의 이종이식 거부반응; 또는 동종이식 거부반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
PCT/KR2016/007396 2015-07-07 2016-07-07 Ripk 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 WO2017022962A1 (ko)

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